Summary
Plaquing är en rutinmetod som används för att kvantifiera levande virus i en population. Även om plaquing ofta lärs ut i olika mikrobiologiska läroplaner med bakterier och bakteriofager, är plaquing av däggdjursvirus mer komplex och tidskrävande. Detta protokoll beskriver de procedurer som fungerar tillförlitligt för regelbundet arbete med herpes simplexvirus.
Abstract
Det finns många publicerade protokoll för att plaquing virus, inklusive referenser inom primär litteratur för metodik. Att plaquing virus kan dock vara svårt att utföra, vilket kräver fokus på dess specifikationer och förfining. Det är en otroligt utmanande metod för nya studenter att behärska, främst för att det kräver noggrann uppmärksamhet åt de minsta detaljerna. Denna demonstration av plaquing herpes simplexvirus bör hjälpa dem som har kämpat med att visualisera metoden, särskilt dess nyanser, genom åren. Även om detta manuskript är baserat på samma principer för standard plaquing metodik, skiljer det sig åt genom att det innehåller en detaljerad beskrivning av (1) hur man bäst hanterar värdceller för att undvika störningar under processen, (2) ett mer användbart visköst medium än agaros för att begränsa diffusionen av virioner, och (3) ett enkelt fixerings- och färgningsförfarande som ger tillförlitligt reproducerbara resultat. Dessutom hjälper den medföljande videon till att visa de finare skillnaderna i processen, som ofta missas när man instruerar andra om att genomföra plackanalyser.
Introduction
Början av virusplackanalyser går tillbaka till de första upptäckterna av virus på 1890-talet1. Tobaksmosaikvirus isolerades först och fördes vidare tobaksblad, där enskilda infektionsfläckar kunde erkännas och kvantifieras som härrörande från en enda, levande virusenhet2, som senare identifierades som en virion2. Senare nyskapande studier med bakterier och bakteriofager fulländade de tekniker som användes för att plackera dessa virus, inklusive bakterier i mitten av loggfasen av tillväxt, seriell utspädning av bakteriofagprover och toppagar med efterföljande visualisering av bokstavliga hål (namngivna plack) i bakteriegräsmattan3.
Plaquing av djurvirus släpade efter den spännande forskning som bedrevs med bakteriofager, främst för att de metoder som krävdes för att odla däggdjursceller i odling inte utvecklades förrän på 1940-talet4. Tillkomsten av växande murina celler i frånvaro av hela värdorganismen4 skapade emellertid en ny era i förmågan att odla och räkna virus. Sådant arbete utvidgades för förökning och kvantitation av Western Equine Encephalomyelitis virus i kycklingceller och poliovirus i mänskliga celler5,6. I takt med att sfären av odlingsbara däggdjursceller expanderade gav mängden olika värdceller för olika virusinfektioner världen ett ymnighetshorn av möjligheter att studera alla slags virus7. Detta inkluderade förökning och kvantifiering av humana herpesvirus, särskilt herpes simplexvirus-1 (HSV-1) och -2 (HSV-2), som orsakar mukokutana lesioner8. Viktigt är att alla plackanalyser är beroende av förekomsten av levande virioner, som kan komma in i värdceller på ett receptormedierat sätt i ett prov9. Oavsett allestädes närvarande och många publikationer om utförandet av plackanalyser5,10,11,12,13,14,15,16 är dessa metoder för HSV-1/-2 en blandning av både konst och vetenskap; man kan inte genomföra analysen utan ordentlig uppmärksamhet på varje detalj i protokollet, och man kan inte heller utföra en framgångsrik analys utan ett kritiellt öga för subtilitet i processen. Detta manuskript visar en av de mest konsekvent reproducerbara metoderna för HSV-1/-2-plackanalyser, med exakta detaljer mot analysens konst som sällan diskuteras.
Detta nuvarande protokoll erhåller levande plackbildande enheter (PFU) för HSV-1 och -2 på ett tillförlitligt sätt. De bästa resultaten erhålls med hjälp av Vero-celler (transformerade afrikanska gröna apa njurepitelceller) vid låg passage (under passage nummer 155) och rutinmässigt odlas i alfa-MEM17 kompletterat med 10% fetal kalvserum (FCS), L-alanyl-L-glutamin och en antibiotika/antimykotisk blandning18. Veroceller förökas vanligtvis i detta medium två till tre gånger per vecka vid en 1/5 utspädning varje gång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer med Vero-cellerna och levande herpesvirus har godkänts av Towson University Institutional Biosafety Committee. Ett generaliserat schema för dessa förfaranden representeras i figur 1.
1. Sådd av Vero-cellerna
- Dagen innan plackanalysen påbörjas, trypsinisera Vero-celler och resuspendera dem i vanliga Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) och komplettera enligt standardmetodik för cellodling19. Resuspend de trypsiniserade cellerna i 10 ml DMEM per T-75-kolv av de sammanflytande Vero-cellerna (~ 107 celler).
DMEM används för plackanalyser istället för alfa-MEM eftersom det saktar celltillväxthastigheten något och gynnar bättre plackanalysresultat. - Räkna cellerna med den metod man föredrar (t.ex. en standardhemocytometer med Trypan Blue-uteslutning)19.
- Frö cellerna vid 4 x 106 celler / platta; för HSV-2, använd 6-brunnsplattor med 2,5 ml DMEM (med tillskott) per brunn; och för HSV-1, använd 12-brunnsplattor med 1,25 ml DMEM (med tillskott) per brunn.
OBS: Antalet celler bör vara konstant oavsett vilken platta som används, även om brunnarnas storlek har betydelse för noggrannheten i plackanalysen. Det är viktigt att få cellerna jämnt fördelade, vilket mest effektivt kan åstadkommas genom att flytta plattan fram och tillbaka, inte på ett cirkulärt sätt. - Låt cellerna växa över natten vid 37 ° C / 5% CO2 i en fuktad inkubator.
OBS: Fuktigheten bibehålls med en kastrull med destillerat vatten som innehåller en algicid i botten av inkubatorn.
2. Provutspädning
- Slutför provutspädningen och tillsatsen av virus till celler i en laboratoriesession.
VARNING: HSV-1 och -2 är smittsamma för människor och måste hanteras under korrekt biosäkerhetsinneslutning (BSL-2). Håll alla material som kommer i kontakt med viruset åtskilda och desinficera med ett kvartärt medel vid 1/256 utspädning (se materialtabell), jodofor, blekmedel eller starkt joniskt tvättmedel (t.ex. SDS) innan du tar bort dem från biosäkerhetsskåpet. - Dagen efter sådd av Vero-cellerna, späd varje virusprov som ska plackas i 1x PBS. använd vanligtvis 10-faldiga utspädningar för mest exakt spårning.
- Gör dessa utspädningar genom 10-4 (för låga koncentrationer av virus) eller genom 10-9 (för förväntningar på högre titerprover) med minst 1 ml av varje prov kvar för själva plackanalysen.
- Håll alla virala utspädningar på is (inte längre än 1 timme) tills du är redo att tillsätta dessa utspädda virusprover till cellerna.
3. Tillsats av virus till cellerna
- Ta bort cellodlingsmediet från en eller två brunnar med pipett.
OBS: Använd inte en aspirator eftersom den tar bort för mycket vätska från cellmonoskiktet och torkar ut cellerna. Ett viktigt övervägande är att säkerställa att cellmonoskiktet förblir hydratiserat under hela experimentets gång. Om cellerna torkar ut kommer de att tvätta av plattan i det sista steget och generera oanvändbara data. Bearbeta därför endast en eller två brunnar åt gången för att minska denna möjlighet. - Tillsätt försiktigt det utspädda virusprovet (100-400 μL och 50-200 μL virusprov används för 6-brunns- respektive 12-brunnsplattor) droppvis till varje monolager och tillsätt dropparna ner på sidan av varje brunn. Upprepa processen för varje en eller två brunnar tills hela plattan är fylld med virusproverna som plackas.
OBS: Att tillsätta dropparna till mitten av brunnen kan oavsiktligt slänga celler från substratet. - Vagga försiktigt hela plattan för hand för att säkerställa att PBS som innehåller viruset täcker hela monoskiktet av celler i varje brunn och placera sedan plattan i en CO2-inkubator vid 37 ° C så att viruset kan adsorberas.
- Var 10: e minut inom 1 timme, ta bort plattan från inkubatorn, rocka den försiktigt igen för att sprida viruset jämnare över varje brunn och placera den sedan tillbaka i inkubatorn.
OBS: Varje experiment kommer att diktera antalet replikat och vilka utspädningar som används; läsarens preferens dikterar det beslutet. - För att minska risken för att oavsiktligt räkna oabsorberad ympning, ta bort virusprovet från brunnarna med 1000 μL pipettspetsar och placera det i en avfallsbägare.
OBS: Återigen utförs denna procedur med endast en eller två brunnar åt gången för att upprätthålla hydrering av cellmonoskiktet. - Placera 2,5 ml av ett metylcellulosaöverlägg (lös upp 5 % metylcellulosa w/w i 100 ml PBS, autoklav i 15 min vid 121 °C och 15 psi på en flytande cykel, tillsätt sedan 375 ml DMEM plus 25 ml FBS).
- När en hel platta innehåller överlägg, placera plattan tillbaka i inkubatorn för att möjliggöra tillväxt i två dagar.
OBS: Om viruset och cellerna får växa i tre dagar, även i DMEM plus kosttillskott, kan en betydande förlust av celler i monolagret resultera, vilket äventyrar de slutliga uppgifterna. - Desinficera avfallsbägaren, vanligtvis med tillsats av blekmedel, en jodofor eller en liknande virucid, innan du tar bort den från biosäkerhetsskåpet.
4. Färgning för plack
- Efter två dagars inkubation, ta bort metylcellulosaöverlägget med en pipett, igen en eller två brunnar i taget och placera den i en avfallskällare.
- Tillsätt ~ 2 ml 1% kristallviolett (se materialtabell) i 50% etanol till varje brunn för att fläcka placken.
OBS: Det är inte nödvändigt att ta bort varje sista droppe av överlägget. - Inkubera plattan med alla brunnar fyllda med fläcken i 30 min vid 37 °C. Desinficera nu avfallsägaren enligt ovan i steg 3.8.
- Tvätta plattorna kraftigt med kranvatten tills avrinningen är klar.
OBS: En mild ström av vatten är inte tillräckligt kraftfull; fullt tryck från en lab-diskbänksfixtur krävs. - Se till att det finns cirka 10-faldiga skillnader i antalet plack över varje utspädningsserie.
- Låt plattorna torka över natten upp och ner, varefter de enskilda placken kan räknas.
5. Räkna plack och bestämma virustiter
- Oavsett tillvägagångssätt (se OBS nedan), multiplicera antalet plack med utspädningsfaktorn (t.ex. om placken räknades i 10-4-brunnen , skulle antalet plack multipliceras med 104).
OBS: Även om det är användbart att räkna inom ett intervall på 10-100 plack5, är det något mer tillförlitligt att räkna brunnar med 30-300 plack och tar hänsyn till ungefär 1/2-loggutspädningar istället för fullloggutspädningar. - Dela detta antal med volymen av ympning (som ovan i steg 3.2) och genomsnittligt alla brunnar som har plack inom det angivna intervallet för att få den mest exakta titern av HSV i det ursprungliga provet.
- Utför beräkningarna i steg 5.3.1 till 5.3.5, med beaktande av användningen av fingerade data i tabell 1.
- Tänk bara på brunnar med 30-300 plack (steg 5.1). I tabell 1 använder du därför endast kolumnen 10–5 för replikaten 1, 2 och 3.
- Ta antalet plack vid den givna utspädningen och multiplicera med den ömsesidiga av utspädningsfaktorn. Därför går 10-5-kolonnen i prov 1 från 81 plack vid 10-5 utspädning till 81 plack gånger 105.
- Dela sedan det numret med volymen (i ml) av virusutspädningen som tillsätts cellerna i den brunnen. Om vi antar att data om HSV-1 i tabell 1 kommer från en 12-brunnsplatta, skulle 0,2 ml vara den lämpligaste mätningen. Därför blir beräkningen från steg 5.3.2 81 x 105 dividerat med 0,2 ml, eller 4,0 x 107 PFU/ml HSV-1.
- Upprepa denna process för alla användbara data och genomsnitt. Utför därför beräkningen i 5.3.2-5.3.3 på alla prover i kolumnen 10-5, förutsatt att de härrörde från samma virusprov och de biologiska replikaten utfördes för att erhålla den mest exakta titermätningen. När det gäller tabell 1, i genomsnitt 4,0 x 107, 2,1 x 107 och 2,6 x 107 PFU/ml för att erhålla en slutlig genomsnittlig titer på 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/ml för detta prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1 visar ett experiment som har optimala resultat. Alla 10-faldiga utspädningar följer en ungefär 10-faldig minskning av plackantalet. Dessa typer av data kan också ses i figur 2, en faktisk plackanalys där det räknebara antalet plack föll i intervallet 10-4 för alla tre replikaten. Detsamma kan ses i figur 3, den övre raden, där det räknebara antalet plack var i 10-3-utspädningen.
Figur 3, nedre raden, visar dock ett helt annat resultat när en plackanalys inte genomförs väl. För det första finns det väldigt få plack synliga från någon utspädning; Därför är uppgifterna oanvändbara. För det andra finns det synliga områden runt toppen där Vero-cellerna helt har lyft från substratet, bevis antingen för att låta cellerna torka ut i processen eller för att pipettera för kraftigt i den regionen av brunnen.
Tabell 2 visar också en uppsättning potentiellt avvikande resultat i plackantal och kräver försiktighetsåtgärder längs vägen. Observera att varken den övre raden eller den nedre raden av replikat följer en regelbunden 10-faldig skillnad i plackantal när man flyttar från en utspädning till nästa; dessa data indikerar användarfel under virusutspädningsprocessen. Dessutom är det inte troligt att en användare exakt skulle räkna över 15 000 plack, så man måste ifrågasätta dessa data. Slutligen kan man notera att i replikat 1, 10-6 utspädning finns det ett plackantal i intervallet 30-300; Ändå, med tanke på den dåliga karaktären hos resten av data i denna replikat, är det osannolikt att antalet 42 plack är ett korrekt antal. Därför är de enda trovärdiga uppgifterna i tabell 2 i replikat 2.
Figur 4 visar samma problem med celler som torkar ut eller hanteras felaktigt under plackanalysen. Figur 4 visar emellertid kritiskt dålig Vero-cellssådd; varje brunn visar mörkare lila fläckar, vilket indikerar att celler inte sprids väl över brunnen och staplas ovanpå varandra i kluster.
Figur 1: Övergripande plackanalysschema. Anpassad från Biorender-mallen, "Viral Plaque Assay Protocol", av BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Plackanalys för HSV-1 i tolvbrunnsplattor. Biologiska replikat utfördes enligt figur 1 på ett prov av HSV-1. Seriella 10-faldiga utspädningar av ett HSV-1-prov (med början vid 10-2-utspädningen) tillsattes till Vero-cellerna , inkuberades och färgades sedan med kristallviolett. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Plackanalys för HSV-2 i sexbrunnsplattor. Biologiska replikat utfördes enligt figur 1 på ett prov av HSV-2. Seriella 10-faldiga utspädningar av ett HSV-2-prov (med början vid 10-2-utspädningen) tillsattes till Vero-celler , inkuberades och färgades sedan med kristallviolett. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Plackanalys för HSV-1 i tolvbrunnsplattor. Biologiska replikat utfördes enligt figur 1 på ett prov av HSV-1. Seriella 10-faldiga utspädningar av ett HSV-1-prov (med början vid 10-2-utspädningen) tillsattes till Vero-celler , inkuberades och färgades sedan med kristallviolett. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Utspädningsfaktorn | ||||
| Replikera | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
Tabell 1: Representativ plakett räknas från en lyckad analys. Seriella utspädningar från varje biologiskt replikat genomfördes; representativa plackantal (med början vid 10-3 utspädningen) visas för varje utspädning.
| Utspädningsfaktorn | ||||
| Replikera | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
Tabell 2: Representativ plakett räknas från en misslyckad analys. Seriella utspädningar från varje biologiskt replikat genomfördes; representativa plackantal (med början vid 10-3 utspädningen) visas för varje utspädning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan plackanalyser är nästan lika gamla som däggdjurscellodling i sig, verkar det som om varje laboratorium har sin egen uppsättning protokoll för att utföra denna grundläggande analys5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . Även om instruktionerna i varje publicerad version av en plackanalys skiljer sig någonsin så lite, belyser få av dessa manuskript de kritiska nyanser som är involverade i att uppnå konsekventa resultat.
Därför finns det vissa delar av detta protokoll som är mer konst än vetenskap. När Vero-celler sås i brunnar för analysen måste de spridas jämnt över brunnen (Figur 4). Alla steg som involverar en vätskeöverföring (t.ex. steg 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 och 4.2) måste göras noggrant för att hålla Vero-cellmonoskiktet hydratiserat (figur 3 och figur 4). Det är också viktigt att inte vidröra botten av brunnen med någon pipett, annars kan cellerna skrapa bort, vilket ytterligare äventyrar de slutliga uppgifterna (figur 4).
Medan metylcellulosa är fördelaktigt som ett överlagringsmaterial för att förhindra diffusion av virioner över hela brunnen, kan alternativ användas. Man kan till exempel använda mikrokristallin cellulosa21,22 eller karboximetylcellulosa21. Oavsett är metylcellulosa ett av de enklaste och billigaste flytande överlagringsmedierna att använda. Man kan också använda ett annat färgämne21 eller fixeringslösning (t.ex. paraformaldehyd)21 för färgningsdelen av protokollet (steg 4), men kristallviolett i 50% etanol är det enklaste och billigaste bland alternativen.
Även om det kan vara helt enkelt att genomföra dessa analyser, kräver de utbildning och övning. Det är väl värt att använda prover som inte är oersättliga för att lära sig denna metod så att man har behärskat tekniken när det är som viktigast.
Plackanalyser själva bör dock endast användas när man behöver räkna bona fide levande virioner. Plaquing är en mycket äldre metod för att mäta viruspartiklar5,10 jämfört med nyare kvantitativa metoder som fluorescensmikroskopi23, ELISA24, enzymatisk aktivitet25,26 eller qPCR27. Dessa senare metoder genererar emellertid surrogatdata som tyder på närvaron av hela virioner, men kan leda till en grov överskattning i livskraftiga partiklar eftersom användaren skulle kvantifiera en indikator på infektion, inte verkliga virioner. Fluorescensmikroskopi mäter infektiösa virioner genom hur många celler som uppvisar närvaron av ett protein uttryckt av viruset men detekterar inte nödvändigtvis fullständiga, replikationskompetenta virioner. ELISA detekterar på samma sätt närvaron av virusproteiner som kan existera utan en fullständigt infektiös virion. Analys av enzymatisk aktivitet, även om den tyder på en intakt virion, visar bara att ett enda aktivt enzym är närvarande och inte återspeglar den sanna smittsamma naturen hos en hel virion. Och qPCR kvantifierar bara kopior av ett viruss genom, oavsett om det genomet är defekt eller inte. Den enda metod som kan jämföras med en plackanalys för att kvantifiera levande virus är en endpoint-utspädningsanalys28, som fortfarande kräver en statistisk uppskattning via Reed-Muench- eller Spearman-Kärber-metoderna29,30,31 för att bestämma virionskoncentrationen.
Medan plackanalyser är en rutinmetod som används i hela virologin, finns det särskilda fall där de inte är den kvantitativa analysen som valts. Till exempel kräver plackanalyser att värdceller fäster vid ett substrat; Om den bästa värdcellen för infektion är icke-vidhäftande kommer plack aldrig att bildas32. Vissa virus växer långsammare än den typiska cellcykeln hos sina värdar, och därför skulle alla spirande plack vara övervuxna av värdcellerna själva21. Plack kan ibland inte bildas bra, bara på grund av den cytopatiska effektens natur, vilket gör bestämningen av bona fide plack till en begränsning21.
Tillvägagångssättet för att plaquing herpesvirus som presenteras här är inte nödvändigtvis unikt. Denna djupgående beskrivning av de mindre försiktighetsåtgärder som är förknippade med en framgångsrik HSV-plackanalys kan dock minska de svårigheter som många användare, särskilt nybörjare, upplever. Oavsett är den beskrivna metoden också i stort sett tillämplig på plackanalyser med många andra virus, inklusive men inte begränsat till picornavirus33, orthomyxovirus34, flavirus35, coronavirus36 och många andra system där en kvantifierbar mängd infektiösa djurvirus krävs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar otaliga studenter i våra laboratorier (PJD och BJM) som har arbetat med oss genom åren för att förfina dessa metoder. Ett särskilt tack till Stan Person, under vars ledning denna metod först utvecklades. Detta arbete stöddes delvis av Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund och NIGMS Bridges till Baccalaureate-bidraget 5R25GM058264. Detta innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health National Institute of General Medical Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Fields Virology. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , Academic Press. (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
