Summary
Aquí, describimos el uso del método de imagen de molécula única, cortinas de ADN, para estudiar el mecanismo biofísico de los condensados EWS-FLI1 que se ensamblan en el ADN.
Abstract
Los genes de fusión resultantes de la translocación cromosómica se han encontrado en muchos tumores sólidos o leucemia. EWS-FLI1, que pertenece a la familia de oncoproteínas de fusión FUS/EWS/TAF15 (FET), es uno de los genes de fusión más frecuentemente involucrados en el sarcoma de Ewing. Estas proteínas de fusión de la familia FET típicamente albergan un dominio de baja complejidad (LCD) de proteína FET en su extremo N y un dominio de unión al ADN (DBD) en su extremo C. Se ha confirmado que EWS-FLI1 forma condensados biomoleculares en sus loci de unión objetivo debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, y estos condensados pueden reclutar ARN polimerasa II para mejorar la transcripción génica. Sin embargo, no está claro cómo se ensamblan estos condensados en sus sitios de unión. Recientemente, se aplicó un método biofísico de una sola molécula, DNA Curtains, para visualizar estos procesos de ensamblaje de condensados EWS-FLI1. Aquí, se discuten el protocolo experimental detallado y los enfoques de análisis de datos para la aplicación de cortinas de ADN en el estudio de los condensados biomoleculares que se ensamblan en el ADN objetivo.
Introduction
La regulación transcripcional es un paso crucial para la expresión génica precisa en las células vivas. Muchos factores, como la modificación cromosómica, los factores de transcripción (TF) y los ARN no codificantes, participan en este complicado proceso 1,2,3. Entre estos factores, los TF contribuyen a la especificidad de la regulación transcripcional al reconocer y unirse a secuencias específicas de ADN conocidas como promotores o potenciadores y posteriormente reclutar otras proteínas funcionales para activar o reprimir la transcripción 4,5,6,7. La forma en que estos TF logran buscar sus sitios objetivo en el genoma humano e interactuar con el ADN recubierto con histonas y proteínas de unión al ADN no histonas ha dejado perplejos a los científicos durante décadas. En los últimos años, se han construido varios modelos clásicos para el mecanismo de búsqueda de objetivos de los TF para describir cómo se "deslizan", "saltan", "saltan" o "transfieren intersegmentos" a lo largo de la cadena de ADN 8,9,10,11. Estos modelos se centran en el comportamiento de búsqueda en el ADN de una sola molécula de TF. Sin embargo, estudios recientes muestran que algunos TF se someten a separación de fase líquido-líquido (LLPS) ya sea solos en el núcleo o con el complejo mediador12. Las gotitas observadas de TFs están asociadas con las regiones promotoras o potenciadoras, destacando el papel de la formación de condensado biomolecular en la transcripción y el genoma tridimensional13,14,15. Estos condensados biomoleculares están vinculados a compartimentos carentes de membrana in vivo e in vitro. Se forman a través de LLPS, en el que las biomacromoléculas modulares y las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) de proteínas son dos fuerzas impulsoras principales de las interacciones multivalentes16. Así, los TF no sólo buscan ADN, sino que también funcionan sinérgicamente dentro de estos condensados 4,17,18. Hasta la fecha, la propiedad biofísica de estos condensados de transcripción en el ADN sigue sin estar clara.
Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo aplicar un método de molécula única, DNA Curtains, para obtener imágenes directas de la formación y dinámica de los condensados de transcripción formados por TF en ADN in vitro. DNA Curtains, una plataforma de imágenes in vitro de alto rendimiento para estudiar la interacción entre las proteínas y el ADN, se ha aplicado en la reparación del ADN 19,20,21, la búsqueda de objetivos22 y LLPS 17,23,24. La célula de flujo de las cortinas de ADN está recubierta con bicapas lipídicas biotiniladas para pasivar la superficie y permitir que las biomoléculas se difundan en la superficie. Los patrones en zigzag nanofabricados limitan el movimiento del ADN. Los sustratos de ADN lambda biotinilados pueden alinearse a lo largo de los bordes de la barrera y ser estirados por el flujo de amortiguación orientado. Las mismas secuencias inicial y final de todas las moléculas permiten el seguimiento de la proteína en el ADN y describen la distribución de la posición de los eventos de unión25,26. Además, la combinación de cortinas de ADN con microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) ayuda a minimizar el ruido de fondo y detectar señales a nivel de molécula única. Por lo tanto, las cortinas de ADN podrían ser un método prometedor para investigar la dinámica de la formación de condensado de transcripción en motivos de ADN. Este artículo describe el ejemplo de una oncoproteína de fusión de la familia FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, generada por translocación cromosómica. El ADN lambda que contiene 25× GGAA, la secuencia de unión de EWS-FLI127, se utilizó como sustrato de ADN en los experimentos DNA Curtains para observar cómo las moléculas EWS-FLI1 se someten a LLPS en el ADN. Este manuscrito discute el protocolo experimental y los métodos de análisis de datos en detalle.
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Protocol
1. Preparación de la mezcla maestra de bicapa lipídica
- Enjuague los viales de vidrio con agua de doble destilación (ddH2O) y etanol al 99% y séquelos en un horno de secado a 60 °C.
- Hacer la mezcla maestra de lípidos disolviendo 1 g de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 100 mg de lípidos reaccionados por polietilenglicol (PEGilated) (18:1 de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxi (polyethylene glycol)-2000] (sal de amonio) (PEG2000 DOPE) y 25 mg de lípidos biotinilados (18:1 de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sal de sodio) (Biotinyl Cap DOPE)) en 10 mL de cloroformo.
- Preparar 1 ml de alícuotas de la mezcla maestra lipídica por vial y almacérselas a -20 °C en viales de vidrio limpio.
NOTA: Guarde el lípido disuelto en viales de vidrio y cubra la tapa del vial con parafilm durante el almacenamiento.
2. Preparación de solución liposomal
- Enjuague un vial de vidrio de 2 ml conddH2Oy etanol al 99% y séquelo bien en un horno de secado a 60 °C.
- Enjuague una jeringa de vidrio de 250 μL con cloroformo y luego transfiera 200 μL de la mezcla maestra de lípidos al vial de vidrio seco.
- Utilice una pistola pulverizadora de nitrógeno para que fluya N2 suavemente mientras gira continuamente el vial en una dirección.
NOTA: ElN2 ayudará a evaporar el cloroformo, y los lípidos residuales formarán una película delgada en la pared del vial de vidrio. Ajuste la corriente de nitrógeno para que sea muy suave al principio y aumente el flujo cuando aparezca una película blanca en el vial; Complete este proceso de evaporación en 5 minutos. - Transfiera el vial de vidrio a un horno de secado al vacío a temperatura ambiente (RT) durante 16-24 h para eliminar completamente el cloroformo de los lípidos.
- Añadir 2 ml de tampón lipídico fresco (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y 100 mM de NaCl) al vial de vidrio y disolver los lípidos a RT durante 2 h. Vortex la solución varias veces y transfiérala a un tubo de cultivo de polipropileno de 5 ml.
- Sonicar la solución lipídica en hielo con un sonicador de micropuntas para formar pequeñas vesículas unilamelares, utilizando los siguientes ajustes: 6 s on-12 s off (20% de amplitud) durante 6 ciclos, luego 6 s on-6 s off (30% de amplitud) durante 3 ciclos, finalmente 10 s on (40% de amplitud).
NOTA: El aumento de temperatura durante la sonicación podría resultar en el estallido de espuma y destruir los liposomas. Por lo tanto, verifique el estado de la espuma y la temperatura y reponga el hielo con frecuencia. - Filtrar los liposomas a través de un filtro de jeringa de nylon de 0,22 μm, alícuota, y almacenarlo a 4 °C.
NOTA: Como su movilidad disminuye con el almacenamiento prolongado, los liposomas deben usarse en 2-3 meses o prepararse recién antes de su uso.
3. Clonación de secuencias y biotinilación de ADN lambda
- Inserción de los motivos de unión en el ADN lambda
- Digiera el fragmento objetivo que contiene los motivos de unión y el ADN Lambda con NheI y XhoI. Ligate el fragmento objetivo con ADN Lambda usando ligasa T4 durante la noche en RT.
- Cultivo de células E.coli VCS257 en medio LB libre de antibióticos hasta que el OD600 alcance 0,6. Conservar las bacterias a 4 °C para su uso posterior.
- Calentar la solución de ligadura a 65 °C durante 20 min para desnaturalizar la ligasa T4.
- Descongelar el extracto de fago lambda, mezclarlo con el producto ligado suavemente pipeteando con puntas romas e incubar la mezcla a RT durante 2 h.
- Añadir 500 μL de tampón SM (50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl y 8 mM de MgCl2, filtrado a través de un filtro de 0,22 μm) y 20 μL de cloroformo en la mezcla de envasado a partir del paso 3.1.4, mezclar bien y centrifugar la solución.
NOTA: La actividad del extracto de envase puede mantenerse a 4 °C durante períodos prolongados. - Preparar la mezcla de reacción mezclando 10 μL de extracto de envase con 90 μL de tampón SM y 100 μL de células VCS257 (del paso 3.1.2) juntos, e incubar la mezcla a 37 °C durante 15 min.
NOTA: La concentración de la solución de envasado depende de la densidad de las placas de fagos al día siguiente; Se puede diluir o agregar según sea necesario. - Tome ~ 5 ml de agar superior derretido (22 g / L de caldo NZCYM con 15 g / L de agar) en un tubo de 15 ml. Tan pronto como el agar superior se enfríe a ~42 °C, añadir la mezcla de reacción (a partir del paso 3.1.6) lentamente con una pipeta roma y verter el líquido en una placa de agar LB sin antibióticos. Mantener la placa en una incubadora a 37 °C durante la noche.
- Confirmar las placas positivas entre las placas de fagos transparentes en la placa superior de agar mediante PCR. Transfiera las placas positivas a una nueva placa de agar superior con una pipeta y manténgala en una incubadora a 37 °C durante la noche.
- Añadir 400 μL de células VCS257 en 400 μL de tampón que contenga 10 mM de MgCl 2 y 10 mM de CaCl2, inocular una placa en esta mezcla celular e incubarla en un agitador de 37 °C a 250 rpm durante 15 min.
- Añadir 800 μL de esta suspensión que contiene la placa del fago a 200 ml de caldo NZCYM en un matraz de 2 L e incubar en un agitador a 37 °C a 125 rpm.
- Medir OD600 de la suspensión bacteriana después de ~4 h de cultivo. Tenga en cuenta que el valor OD600 aumentará primero y luego caerá a un mínimo en ~ 0.2. Detenga la incubación cuando el valor de OD 600 esté a punto de aumentar nuevamente, agregue500 μL de cloroformo y agite a 80 rpm durante otros 5 minutos.
NOTA: El aumento de OD600 después del valle ocurrirá rápidamente; por lo tanto, el valor de OD600 debe medirse con más frecuencia cuando disminuye a 0,3 para evitar el crecimiento excesivo de células VCS257 en el cultivo. - Transfiera el cultivo de fagos a una botella de 500 ml, agregue 11.7 g de NaCl y agite la botella. Incubar la botella en hielo durante 10 min.
- Transfiera la suspensión por igual en cuatro tubos de 50 ml. Centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 10 min.
NOTA: Todos estos pasos de centrifugación de la sección 3.1 deben realizarse a 4 °C. - Transfiera los sobrenadantes a cuatro tubos nuevos de 50 ml y centrifugar nuevamente a la misma velocidad durante 5 minutos.
- Recoger los sobrenadantes, añadir un 10% (p/v) de polvo PEG8000 y rotar a 4 °C para incubar durante 30 min.
- Centrifugar las suspensiones del paso 3.1.15 a 12.000 x g durante 15 min para obtener los gránulos de fagos.
- Resuspenda los gránulos en 1 ml de tampón de dilución de fagos (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl y 10 mM MgCl2) en cuatro tubos y vierta los 4 ml de estas mezclas en un tubo de 50 ml.
- Añadir RNasa A (10 mg/ml) y DNasa I (4 mg/ml) a concentraciones finales de 20 μg/ml y 5 μg/ml e incubar a 37 °C durante 30 min para degradar el exceso de ácidos nucleicos.
- Añadir 4,5 ml de Tris-HCl de 300 mM (pH 7,5), 2,76 ml de ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) 0,5 M, 1,67 ml de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% y 75 μL de proteinasa K (10 mg/ml) en el tubo, e incubar a 65 °C durante 10 min.
- Añadir 4,5 ml de acetato de potasio 3 M preenfriado e incubar en hielo durante 10 min.
- Centrifugar a 8.000 x g durante 10 min, y girar el sobrenadante durante 5 min adicionales a 10.000 x g.
- Añadir un 70% de volumen de isopropanol al sobrenadante recogido (a partir del paso 3.1.21) con suficiente mezcla, incubar a RT durante 2 min, y luego centrifugar a 8.000 x g durante 10 min. Deseche el isopropanol y gire de nuevo durante 5 min.
NOTA: El pellet de ADN se untará antes de la primera centrifugación de 10 minutos; El pellet se concentrará en el fondo del tubo después de la segunda centrifugación de 5 minutos. - Lave el ADN precipitado con 2-3 ml de etanol al 70% y vuelva a girar hacia abajo durante 1 minuto. Secar el pellet a 4 °C durante 2 h y, a continuación, resuspender el ADN en 500 μL de tampón TE (10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) y 1 mM EDTA) durante la noche a RT.
- Transfiera el ADN a un tubo de 1,5 ml y gírelo a 18.000 x g durante 3 minutos. Transfiera el ADN a un nuevo tubo de 1,5 ml. Alícuota el ADN Lambda purificado y almacénelo a -20 °C.
- Preparación de ADN biotina-lambda
- Derretir 50 μL de ADN Lambda purificado con motivos clonados a 65 °C durante 10 min.
NOTA: Como el ADN lambda tiene ~ 48 kbp de largo, debe calentarse antes del pipeteo para evitar roturas de ADN. - Mezclar 50 μL de ADN Lambda, 1 μL de imprimación de Biotina (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) y 54 μL deddH2Ojuntos. Co-incubar la mezcla a 65 °C durante 5 min y dejar en el banco para que se enfríe a RT.
- Añadir 12 μL de tampón ligasa T4 10x y 3 μL de ligasa T4, e incubar en RT durante varias horas o durante la noche.
- Añadir un volumen igual de mezcla de fenol-cloroformo (1:1) al producto de ligadura, mezclar bien inmediatamente y centrifugar a 12.000 x g durante 2 min a RT.
- Transfiera cuidadosamente la fase acuosa superior que contiene el ADN a un nuevo tubo, agregue un volumen igual de cloroformo, mezcle bien y luego centrifugar a 12,000 x g durante 2 min.
- Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo, agregue un volumen igual de isopropanol y 10% del volumen de acetato de sodio 3 M, e incube a RT durante 2 min. Centrifugar la mezcla a 12.000 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante, lave el pellet con etanol al 75% y luego centrifugar a 12,000 x g durante 5 min.
- Retire el etanol al 75%, seque al aire el ADN en RT durante 10 minutos y use 120 μL de tampón TE para disolver el ADN.
- Añadir 60 μL de tampón A (30% (p/v) PEG8000 y 30 mM MgCl 2) a 120 μL de la solución a partir de la etapa3.2.8, y rotar a 4 °C durante 20-24 h.
- Centrifugar la mezcla a 18.000 g durante 5 min, y retirar el sobrenadante.
- Utilice 180 μL de etanol al 75% preenfriado para lavar el pellet y repita el paso 3.2.10.
- Seque el pellet a RT y use 100 μL de tampón TE150 para disolver el ADN.
- Derretir 50 μL de ADN Lambda purificado con motivos clonados a 65 °C durante 10 min.
4. Barreras en zig-zag nanofabricadas
- Limpie las diapositivas en acetona durante 20 minutos por sonicación y transfiéralas a un nuevo recipiente de vidrio con NaOH 1 M para sonicación durante otros 20 minutos. Mezclar 90 mL de H2SO4 con 30 mL deH2O2, y sumergir los portaobjetos en esta mezcla durante 30 min. Enjuague los portaobjetos con acetona e isopropanol y seque los portaobjetos conN2.
NOTA: La mezcla de H2SO4 yH2O2es un proceso exotérmico; Tome las precauciones de seguridad adecuadas durante la operación. - Cubra el portaobjetos limpio con polimetilmetacrilato (PMMA) 25 kDa, PMMA 49,5 kDa y la capa superior de recubrimiento protector conductor en sucesión. Utilice la litografía por haz de electrones para escribir las barreras en zig-zag (Figura 1A).
- Lave los portaobjetos con ddH2O para retirar la capa protectora conductora y seque los portaobjetos conN2.
- Deposite una capa de 30 nm de cromo (Cr) utilizando una máquina pulverizadora de magnetrón y retire las capas restantes de PMMA con acetona.
NOTA: Una celda de flujo se puede reutilizar para más de 20 experimentos de cortinas de ADN. Para reutilizar la celda de flujo, lávela con etanol, detergente y NaOH.
5. Purificación de la proteína EWS-FLI1
NOTA: La observación de 500 nM EWS-FLI1 en ADN Lambda con 25× motivos GGAA sirve como un buen ejemplo para la aplicación de cortinas de ADN a la formación de condensado. EWS-FLI1 es una proteína de fusión que combina el N-terminal de EWSR1 (1-265) y el C-terminal de FLI1 (220-453). Una etiqueta mCherry se fusionó con el N-terminal de la proteína de fusión EWS-FLI1 para su visualización.
- Clone el gen EWS-FLI1 en un vector pRSF reconstituido o en cualquier otro vector de expresión procariota adecuado.
- Transformar el plásmido que codifica 7x His-mCherry-EWSFLI1 en la cepa E.coli BL21(DE3); cultivar una sola colonia en 5 mL de medio LB a 37 °C durante la noche. Cuando el valor de OD600 alcance 0.6-0.8 después de transferir a 2 L de medio LB, agregue 0.5 mM IPTG y agite el cultivo celular a 18 °C durante 16-18 h.
- Centrifugar el cultivo para eliminar el sobrenadante y resuspender las células con tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M KCl; 1 M urea; 10 mM imidazol; 1.5 mM beta-mercaptoetanol (β-ME); y 5% glicerol).
- Después de la sonicación y centrifugación a 18000 × g durante ~ 30 min, cargue el sobrenadante en la resina Ni-NTA equilibrada en un volumen 5 veces de tampón de lisis, y luego lave la resina con un volumen 10 veces de tampón de lavado (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 M KCl, 1 M urea, 40 mM de imidazol, 1.5 mM β-ME y 5% de glicerol).
- Eluya la proteína unida con 15 ml de tampón de elución (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 M KCl, 1 M urea, 500 mM imidazol, 1.5 mM β-ME y 5% de glicerol) y concentre la elución a ~500 μL.
- Cargue la solución de proteína concentrada en una columna de filtración de gel y analice los productos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. Congelar rápidamente la proteína purificada en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
6. Preparación de una célula de flujo de cortinas de ADN
- Prepare una celda de flujo con barreras nanofabricadas en zig-zag para un experimento de cortinas de ADN y determine la dirección del flujo. Para hacer esto, conecte los tubos de entrada y salida en la dirección correcta.
- Lave la celda de flujo con 2,5 ml de tampón lipídico con dos jeringas de 3 ml. Asegúrese de que no haya burbujas en la celda de flujo.
- Retire la jeringa de la salida e inyecte 1 ml de la solución liposomal (40 μL de caldo de liposomas de la sección 2 y 960 μL de tampón lipídico) tres veces con 5 minutos de incubación después de cada inyección.
- Para la etapa de curación, lave la celda de flujo con 2.5 ml de tampón lipídico lentamente e incube a RT durante 30 minutos.
NOTA: El tiempo de curación puede ser más largo si es necesario; Si aparece alguna burbuja, realice una doble cicatrización repitiendo los pasos 5.3 y 5.4 para eliminar las burbujas. - Preparar 30 ml de tampón de albúmina sérica bovina (BSA) (40 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM de ditiotritol y 0.5 mg/ml de BSA para la pasivación superficial). Después de 30 minutos de curación, lave la celda de flujo con 2,5 ml de tampón BSA desde el lado de salida.
NOTA: El stock de BSA es una solución de 20 mg/ml almacenada a 4 °C y debe usarse dentro de 1-2 semanas. La concentración de BSA en el tampón se puede ajustar de acuerdo con la condición de la superficie. - Inyecte 800 μL de tampón de estreptavidina (10 μL de un stock de estreptavidina de 1 mg/ml, 790 μL de tampón BSA) en la celda de flujo desde el lado de entrada en dos pasos con 10 minutos de incubación después de cada paso.
NOTA: La estreptavidina ancla el ADN en los lípidos debido a su multivalencia al tender un puente entre los lípidos biotinilados y el ADN biotinilado. - Lave la celda de flujo con 2,5 ml de tampón BSA para eliminar todas las moléculas de estreptavidina libres.
- Diluir el ADN Biotina-Lambda con motivos clonados de la sección 3 utilizando tampón BSA (2,5 μL de ADN y 998 μL de tampón BSA). Inyecte Lambda DNA 4 veces lentamente a intervalos de 5 minutos.
- Encienda el microscopio y el sistema científico de semiconductores complementarios de óxido metálico (sCMOS) durante la inyección. Lave el tubo con 10 ml deddH2O. Enjuague el prisma y el conector del tubo con agua, limpiador de cubeta líquido al 2% y etanol al 99%. Prepare el tampón de imágenes agregando KCl y colorante de ADN bicatenario en el tampón BSA para obtener concentraciones finales de 150 mM y 0.5 nM, respectivamente, y tome al menos 20 ml del tampón de imágenes en una jeringa de 30 ml.
- Configure la celda de flujo en la etapa del microscopio y conéctela al sistema microfluídico.
- Use un caudal de 0,03 ml / min para enjuagar las moléculas de ADN a la barrera durante 10 minutos, incubar durante 30 minutos con el flujo detenido y luego apáguelo para permitir que el ADN se difunda lateralmente.
NOTA: El propósito de esta incubación de 30 minutos es permitir que la molécula de ADN se distribuya de manera más uniforme frente a la barrera a través de la difusión simple porque las moléculas de ADN tienden a acumularse en el lado de la barrera que está cerrado a la entrada donde se enjuagan. El tiempo de incubación se puede ajustar según sea necesario.
7. Imágenes de la formación de condensación EWS-FLI1 en cortinas de ADN
- Abra el software de imágenes, busque y marque las posiciones de los 3 × 3 patrones en zigzag en campo claro.
- Encienda el flujo a 0,2 ml/min para teñir el ADN con el tinte de ADN bicatenario durante 10 min.
- Diluir mCherry-EWS-FLI1 con el tampón de imagen a la concentración de 100 nM en 100 μL en el tubo.
- Cargue la muestra de proteína a través de la válvula con una jeringa de vidrio de 100 μL y cambie el caudal a 0,4 ml/min.
- Encienda el láser de 488 nm y escanee previamente cada región para verificar el estado de distribución del ADN; seleccione la región en la que las moléculas de ADN se distribuyen uniformemente. Ajuste la potencia del láser al 10% para el láser de 488 nm y al 20% para el láser de 561 nm. Utilice el medidor de potencia para medir la potencia real del láser cerca del prisma: 4,5 mW para el láser de 488 nm y 16,0 mW para el láser de 561 nm.
- Adquisición de imágenes
- Comience a adquirir imágenes a intervalos de 2 s con láseres de 488 nm y 561 nm simultáneamente.
- Cambie la válvula del modo manual al modo de inyección para permitir que el tampón de imágenes enjuague la muestra de proteína en la celda de flujo después de 60 s.
NOTA: Este proceso tomará ~ 30 s, y el campo de visión se cubrirá con señales mCherry tan pronto como las proteínas EWS-FLI1 lleguen a la celda de flujo. - Para eliminar el EWS-FLI1 libre, siga lavando la celda de flujo con el búfer de imagen durante 5 minutos con solo el láser de 561 nm encendido. Detener el flujo e incubar a 37 °C durante 10 min.
- Encienda el flujo a 0,4 ml / min para permitir que el ADN se extienda y adquiera imágenes a intervalos de 2 s entre diferentes fotogramas para obtener datos de alto rendimiento de la formación de condensado EWS-FLI1.
8. Análisis de intensidad para mCherry-EWS-FLI1
- Importe los datos como secuencias de imágenes en el software ImageJ, seleccione los puntos en 25× sitios GGAA en un cuadrado de 8× 8 píxeles y guarde la imagen en formato .tif.
- Calcula la intensidad como la suma de la intensidad en el cuadrado de 8×8 píxeles, incluyendo todo el puntillo, y elimina el fondo restando la intensidad del fondo en un área del mismo tamaño cerca del cuadrado de 8 x 8 píxeles.
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Representative Results
El esquema de las cortinas de ADN se muestra en la Figura 1A, Figura 1B y Figura 1D. La secuencia diana clonada que contiene 25 repeticiones ininterrumpidas de GGAA se encuentra en el promotor NORB1 en el sarcoma de Ewing. Esta secuencia objetivo es crucial para el reclutamiento de EWS-FLI128. Las moléculas EWS-FLI1 se visualizaron detectando las señales EWS-FLI1 marcadas con mCherry obtenidas con un láser de 561 nm (Figura 1C y Figura 1E). Después de que se estableció un experimento de cortinas de ADN, se pudo visualizar directamente la formación in vitro de condensados biomoleculares de EWS-FLI1 en los 25× sitios GGAA del sustrato de ADN (Figura 1B-E). La especificidad del mCherry-EWS-FLI1 utilizado en cortinas de ADN se confirmó mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética utilizando una plantilla de ADN que contenía 25× GGAA y sin GGAA por separado (Figura 2A). Además, la concentración de EWS-FLI1 se tituló de 20 nM a 500 nM, y se determinó la intensidad de los puntos en los sitios GGAA de 25×. En comparación con la intensidad de mCherry-FLI1DBD, la intensidad de EWS-FLI1 aumentó dramáticamente, mientras que el cambio en la intensidad de FLI1DBD fue insignificante cuando las proteínas se saturaron para cubrir los 25× sitios GGAA. Por lo tanto, estos resultados sugieren fuertemente que EWS-FLI1 formó condensados en el ADN (Figura 2B-E).
Figura 1: Formación de condensado EWS-FLI1 en ADN Lambda que contiene 25× motivos GGAA. a) Esquema de las cortinas de ADN. (B y D) Dos estrategias para detectar condensados EWS-FLI1 (500 nM) ensamblados en ADN Lambda: (B) Mantener el lavado durante 10 minutos;(D) incubar durante 10 min. (C y E) Imagen representativa de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de campo amplio de cortinas de ADN: (C) Estrategia de detección en B; E) Estrategia de detección en D. El ADN C (ii) y E (ii) se amplía para mostrar los puntos distintivos formados en un solo sustrato de ADN. Los sustratos de ADN son ADN Lambda con 25× motivos GGAA. Los números "1, 2, 3, 4" representan diferentes posiciones de puntos en un ADN Lambda, y "3" es donde se clonó la secuencia de microsatélites GGAA del 25×. Barras de escala = 4,9 μm (C, E (i)) y 0,7 μm (C, E (ii)). Esta cifra se ha modificado de 24. Abreviatura: dsDNA = ADN bicatenario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Eventos de enlace del dominio separado de mCherry-EWS-FLI1 en 25× repeticiones GGAA. (A) (i) mCherry-EWS-FLI1. (ii) Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética de mCherry-EWS-FLI1: 306-bp dsDNA marcado con 5' Quasar670 se incubó con mCherry-EWS-FLI1 a diferentes concentraciones a temperatura ambiente durante 30 min en tampón de reacción que contenía 40 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM DTT y0.2 mg / ml de albúmina sérica bovina. Las muestras se cargaron y se ejecutaron en gel de agarosa al 1,3% durante 25 min, 120 V. (B-D) Imágenes de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de campo amplio de GGAA al 25× con cortinas de ADN después de la incubación con 500 nM mCherry (B), 500 nM mCherry-EWSLCD (C) o 500 nM mCherry-FLI1DBD (D). (E) Distribución de intensidad de las señales EWSFLI1 (cian) y FLI1DBD (negro) en la región del sitio objetivo (25× GGAA) frente a la concentración de proteínas. Esta cifra se ha modificado de 24. Abreviaturas: LCD = dominio de baja complejidad; DBD = dominio de unión al ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como los enfoques de una sola molécula son extremadamente sensibles al contenido del sistema de reacción, se debe invertir un esfuerzo adicional para garantizar la buena calidad de todos los materiales y soluciones durante los experimentos de cortinas de ADN, especialmente los lípidos preparados en las secciones 1 y 2 y los tampones utilizados en la sección 5. Se deben usar reactivos de mayor pureza para preparar tampones, y los tampones deben estar recién preparados para el ensayo de molécula única.
Cuando se introdujeron 500 nM de EWS-FLI1 marcado con mCherry en la cámara, aparecieron varios puntos magenta en el ADN de Lambda que contenían las secuencias GGAA de 25×. Observe que hubo una distribución no específica consecutiva de señales magenta en todo el ADN, incluso después de 10 minutos de lavado con tampón en blanco (Figura 1B, C). Curiosamente, las moléculas EWS-FLI1 se reorganizaron en el ADN durante la incubación de 10 minutos sin el flujo amortiguador y se reunieron en varios puntos (Figura 1D, E). Uno de estos puntos se formó en el sitio clonado de 25× GGAA, mientras que todos los demás se formaron en las regiones que contienen una alta densidad de motivos GGAA consecutivos. Este fenómeno sugiere fuertemente que el procedimiento de incubación sin flujo permite que las moléculas EWS-FLI1 busquen los loci y se ensamblen en el ADN más rápido.
Se deben realizar varios experimentos de control para aclarar cómo se formaron estos condensados en las cortinas de ADN. Purificamos mCherry, mCherry-EWSLCD y mCherry-FLI1DBD y seguimos el mismo procedimiento para inyectar estas proteínas en la cámara. Ni mCherry (Figura 2B) ni mCherry-EWSLCD (Figura 2C) dejaron señales en el ADN, lo que indica que el FLI1DBD de EWS-FLI1 era necesario para la interacción con el ADN. Para confirmar que la separación de fases se produjo en cortinas de ADN a concentraciones de proteínas tan bajas, la concentración de mCherry-EWS-FLI1 se tituló de 25 nM a 500 nM, y la intensidad de cada puncta en una molécula de ADN se determinó en el sitio del clon (Figura 2E). Una comparación con la intensidad de la fusión TF FLI1DBD marcada con mCherry reveló que aunque las intensidades de puncta de EWS-FLI1 y FLI1-DBD fueron similares a bajas concentraciones de proteínas, la intensidad de EWS-FLI1 aumentó dramáticamente mientras que la de FLI1DBD permaneció baja incluso cuando la concentración alcanzó 500 nM. Estos resultados sugieren que las moléculas EWS-FLI1 se unen a la secuencia GGAA del 25× y se ensamblan en un condensado a través de interacciones LCD. Un solo FLI1DBD puede unirse a 2x motivos GGAA, y los oligómeros de orden superior se unen a secuencias de baja afinidad altamente repetitivas27. La señal mCherry-FLI1DBD en la secuencia GGAA del 25× era de un grupo de proteínas en lugar de una molécula de proteína individual. Aunque mCherry-FLI1DBD podía unirse a los 25× sitios GGAA, no pudo ensamblarse como condensado en el ADN, lo que confirma que la interacción LCD-LCD era necesaria para la separación de fases (Figura 2D, E).
Los métodos de molécula única permiten a los investigadores estudiar la dinámica dentro de los condensados del factor de transcripción. El método de cortinas de ADN tiene algunas ventajas en comparación con otros métodos de molécula única, como la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET)29, la imagen de súper resolución 30 y la pinza óptica31,32. En primer lugar, el método DNA Curtains permite la reconstitución de la maquinaria de transcripción en ADN genómico largo in vitro y la observación en tiempo real de la formación de condensado de transcripción con adquisición de datos de alto rendimiento. En segundo lugar, las moléculas de ADN alineadas permiten el mapeo de la posición de los condensados en cada cadena de ADN. Por lo tanto, las secuencias de ADN preferidas para la formación de puntos se pueden determinar fácilmente.
Además, la adquisición a largo plazo es factible con cortinas de ADN, lo que permite la medición de la tasa de encendido (k encendido) y la tasa de apagado (kapagado) de un punto. Sin embargo, DNA Curtains tiene algunos defectos técnicos inherentes, lo que requiere que la evidencia de diferentes métodos sea examinada colectivamente. Por un lado, la resolución de las cortinas de ADN solo puede alcanzar 0.18 μm o ~ 1,000 pb porque la plantilla larga de ADN Lambda tiene una restricción con respecto al límite de difracción, lo que puede dificultar la diferenciación de dos señales de fluorescencia vecinas. Por otro lado, el flujo se utiliza para extender el ADN de doble cadena (dsDNA), y la fuerza aplicada sobre la biomolécula puede influir en la propiedad de difusión de las proteínas que se unen al ADN. Las cortinas de ADN de doble anclaje pueden anclar ambos extremos de dsDNA y registrar el movimiento de proteínas sin flujo, lo cual es una solución notable33. En resumen, profundizar nuestra comprensión del ensamblaje dinámico de condensados biomoleculares en el ADN en tiempo real arrojará luz no solo sobre el mecanismo biofísico de LLPS sino también sobre la biología básica de los procesos celulares relacionados con LLPS, como la regulación de la transcripción génica24.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
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