Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Одномолекулярная визуализация конденсатов EWS-FLI1, собранных на ДНК

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62974
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы описываем использование метода одномолекулярной визуализации, ДНК-занавесов, для изучения биофизического механизма конденсации конденсатов EWS-FLI1, собирающихся на ДНК.

Abstract

Слияние генов, полученных в результате хромосомной транслокации, было обнаружено во многих солидных опухолях или лейкемии. EWS-FLI1, который принадлежит к семейству FUS/EWS/TAF15 (FET) термоядерных онкопротеинов, является одним из наиболее часто участвующих генов слияния в саркоме Юинга. Эти белки слияния семейства FET обычно содержат домен низкой сложности (LCD) белка FET на их N-конце и ДНК-связывающий домен (DBD) на их C-конце. Было подтверждено, что EWS-FLI1 образует биомолекулярные конденсаты в своих целевых связующих локусах из-за взаимодействий LCD-LCD и LCD-DBD, и эти конденсаты могут рекрутировать РНК-полимеразу II для усиления транскрипции генов. Однако остается неясным, как эти конденсаты собираются в местах их связывания. Недавно для визуализации этих процессов сборки конденсатов EWS-FLI1 был применен одномолекулярный биофизический метод — ДНК-занавески. Здесь обсуждается подробный экспериментальный протокол и подходы к анализу данных для применения ДНК-занавесок при изучении биомолекулярных конденсатов, собирающихся на целевой ДНК.

Introduction

Транскрипционная регуляция является решающим шагом для точной экспрессии генов в живых клетках. Многие факторы, такие как хромосомная модификация, факторы транскрипции (TF) и некодирующие РНК, участвуют в этом сложном процессе 1,2,3. Среди этих факторов ТФ способствуют специфичности транскрипционной регуляции, распознавая и связывая их с конкретными последовательностями ДНК, известными как промоторы или энхансеры, и впоследствии рекрутируя другие функциональные белки для активации или подавления транскрипции 4,5,6,7. То, как этим TF удается искать свои целевые участки в геноме человека и взаимодействовать с ДНК, покрытой гистонами и негистоновыми ДНК-связывающими белками, озадачивало ученых на протяжении десятилетий. За последние несколько лет было построено несколько классических моделей механизма целевого поиска TF, чтобы описать, как они «скользят», «прыгают», «прыгают» или «межсегментный перенос» по цепочке ДНК 8,9,10,11. Эти модели ориентированы на поисковое поведение на ДНК одной единственной молекулы TF. Однако недавние исследования показывают, что некоторые ТФ подвергаются разделению жидкой и жидкой фазы (LLPS) либо отдельно в ядре, либо с помощью медиаторного комплекса12. Наблюдаемые капли ТФ связаны с промоторными или энхансерными областями, подчеркивая роль образования биомолекулярного конденсата в транскрипции и трехмерном геноме 13,14,15. Эти биомолекулярные конденсаты связаны с мембранными отсеками in vivo и in vitro. Они формируются через LLPS, в котором модульные биомакромолекулы и внутренне неупорядоченные области (IDR) белков являются двумя основными движущими силами поливалентных взаимодействий16. Таким образом, TF не только ищут ДНК, но и синергетически функционируют в этих конденсатах 4,17,18. На сегодняшний день биофизические свойства этих транскрипционных конденсатов на ДНК остаются неясными.

Поэтому это исследование было направлено на применение одномолекулярного метода — ДНК-занавесов — для непосредственного изображения образования и динамики транскрипционных конденсатов, образующихся ТФ на ДНК in vitro. DNA Curtains, высокопроизводительная платформа визуализации in vitro для изучения взаимодействия между белками и ДНК, была применена в репарации ДНК 19,20,21, целевом поиске22 и LLPS 17,23,24. Проточная клетка ДНК-занавесок покрыта биотинилированными липидными бислоями, чтобы пассивировать поверхность и позволить биомолекулам диффундировать на поверхности. Нанофабрикованные зигзагообразные паттерны ограничивают движение ДНК. Биотинилированные субстраты лямбда-ДНК могут выравниваться вдоль краев барьера и растягиваться ориентированным буферным потоком. Одни и те же начальные и конечные последовательности всех молекул позволяют отслеживать белок на ДНК и описывают позиционное распределение событий связывания25,26. Кроме того, сочетание ДНК-занавесок с флуоресцентной микроскопией полного внутреннего отражения (TIRFM) помогает минимизировать фоновый шум и обнаруживать сигналы на уровне одной молекулы. Таким образом, ДНК-занавески могут стать перспективным методом исследования динамики образования транскрипционного конденсата на мотивах ДНК. В данной работе описывается пример слияния онкопротеинов семейства FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, генерируемых хромосомной транслокацией. Лямбда-ДНК, содержащая 25× GGAA - связывающая последовательность EWS-FLI127 - использовалась в качестве субстрата ДНК в экспериментах DNA Curtains, чтобы наблюдать, как молекулы EWS-FLI1 подвергаются LLPS на ДНК. В данной рукописи подробно рассматривается экспериментальный протокол и методы анализа данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление липидного бислоя мастер-микса

  1. Промыть стеклянные флаконы двойной дистилляцией (ddH2O) и 99% этанолом и высушить их в сушильной печи при температуре 60 °C.
  2. Получают липидную мастер-смесь, растворяя 1 г 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), 100 мг полиэтиленгликолевых (PEGylated) липидов (18:1 из 1,2-диолеоил-sn-glycero-3-фосфоэтаноламина-N-[метокси (полиэтиленгликоль)-2000] (аммониевая соль) (PEG2000 DOPE) и 25 мг биотинилированных липидов (18:1 из 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(крышка биотинила) (натриевая соль) (Biotinyl Cap DOPE)) в 10 мл хлороформа.
  3. Приготовьте 1 мл аликвоты липидной смеси на флакон и храните их при -20 °C в прозрачных стеклянных флаконах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните растворенный липид в стеклянных флаконах и накрывайте крышку флакона парапленкой во время хранения.

2. Приготовление раствора липосом

  1. Промойте стеклянный флакон объемом 2 мл с ddH2O и 99% этанолом и тщательно высушите его в сушильной печи при температуре 60 °C.
  2. Промыть стеклянный шприц объемом 250 мкл хлороформом, а затем перенести 200 мкл липидной смеси в флакон с сухим стеклом.
  3. Используйте азотный распылитель, чтобы мягко течьN2 , непрерывно вращая флакон в одном направлении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: N2 поможет испарить хлороформ, а остаточные липиды образуют тонкую пленку на стенке стеклянного флакона. Отрегулируйте поток азота, чтобы сначала быть очень мягким и увеличить поток, когда во флаконе появляется белая пленка; завершите этот процесс выпаривания в течение 5 минут.
  4. Переложите флакон со стеклянным флаконом в вакуумную сушильную печь при комнатной температуре (РТ) в течение 16-24 ч для полного удаления хлороформа из липидов.
  5. Добавьте 2 мл свежего липидного буфера (10 мМ Tris-HCl (рН 7,5) и 100 мМ NaCl) во флакон и растворите липиды при RT в течение 2 ч. Вихрьте раствор несколько раз и переложите его в 5 мл полипропиленовой культуральной трубки.
  6. Обработайте раствор липидов ультразвуком на льду с помощью ультразвукового аппарата с микрокончиком, чтобы сформировать небольшие одноцветные везикулы, используя следующие настройки: 6 с на-12 с (амплитуда 20%) в течение 6 циклов, затем 6 с на -6 с (30% амплитуда) в течение 3 циклов, наконец, 10 с вкл .(40% амплитуда).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повышение температуры во время обработки ультразвуком может привести к разрыву пены и разрушению липосом. Поэтому проверяйте состояние пены и температуру и часто пополняйте лед.
  7. Отфильтруйте липосомы через фильтр нейлонового шприца 0,22 мкм, аликвоту, и храните его при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку их подвижность уменьшается при длительном хранении, липосомы должны быть использованы через 2-3 месяца или приготовлены свежими перед использованием.

3. Клонирование последовательности и биотинилирование лямбда-ДНК

  1. Вставка мотивов связывания в лямбда-ДНК
    1. Переварите целевой фрагмент, содержащий мотивы связывания и лямбда-ДНК с NheI и XhoI. Лигировать фрагмент мишени с помощью лямбда-ДНК с помощью Т4-лигазы на ночь при РТ.
    2. Культивируйте клетки E.coli VCS257 в безантибиотиковой среде LB до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,6. Храните бактерии при температуре 4 °C для последующего использования.
    3. Нагревайте раствор для лигирования при 65 °C в течение 20 мин, чтобы денатурировать лигазу T4.
    4. Экстракт лямбда-фага разморозить, аккуратно смешать его с лигированным продуктом путем пипетки тупыми кончиками и инкубировать смесь на RT в течение 2 ч.
    5. Добавьте 500 мкл буфера SM (50 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 100 мМ NaCl и 8 мМ MgCl2, отфильтрованного через фильтр 0,22 мкм) и 20 мкл хлороформа в упаковочную смесь со стадии 3.1.4, хорошо перемешайте и центрифугируйте раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность экстракта упаковки может поддерживаться при 4 °C в течение длительных периодов времени.
    6. Готовят реакционную смесь путем смешивания 10 мкл упаковочного экстракта с 90 мкл буфера SM и 100 мкл клеток VCS257 (со стадии 3.1.2) вместе и инкубируют смесь при 37 °C в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация упаковочного раствора зависит от плотности фаговых бляшек на следующий день; его можно разбавлять или добавлять по мере необходимости.
    7. Возьмите ~5 мл расплавленного верхнего агара (22 г/л бульона NZCYM с 15 г/л агара) в пробирке объемом 15 мл. Как только верхний агар остынет до ~42 °C, добавьте реакционную смесь (из стадии 3.1.6) медленно, используя пипетку с тупым концом, и вылейте жидкость на пластину агара LB без антибиотиков. Храните пластину в инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи.
    8. Подтвердите положительные бляшки среди прозрачных фаговых бляшек на верхней агаровой пластине методом ПЦР. Перенесите положительные бляшки на новую верхнюю агаровую пластину с пипеткой и храните пластину в инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи.
    9. Добавьте 400 мкл клеток VCS257 в 400 мкл буфера, содержащего 10 мМ MgCl2 и 10 мМ CaCl2, инокулируйте одну бляшку в эту клеточную смесь и инкубируйте ее в шейкере 37 °C при 250 об/мин в течение 15 мин.
    10. Добавьте 800 мкл этой суспензии, содержащей фаговую бляшку, к 200 мл бульона NZCYM в колбе объемом 2 л и высиживайте ее в шейкере с температурой 37 °C при 125 об/мин.
    11. Измерьте OD600 бактериальной суспензии после ~4 ч культивирования. Имейте в виду, что значение OD600 сначала повысится, а затем упадет до минимума ~0,2. Остановите инкубацию, когда значение OD600 снова поднимется, добавьте 500 мкл хлороформа и встряхните при 80 оборотах в минуту еще 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение OD600 после впадины произойдет быстро; следовательно, значение OD600 должно измеряться чаще, когда оно уменьшается до 0,3, чтобы избежать чрезмерного роста клеток VCS257 в культуре.
    12. Переложите фаговую культуру во флакон объемом 500 мл, добавьте 11,7 г NaCl и встряхните флакон. Высиживать бутылку на льду в течение 10 мин.
    13. Переложите суспензию поровну в четыре трубки по 50 мл. Центрифугируйте пробирки по 12 000 х г в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти этапы центрифугирования, указанные в разделе 3.1, должны выполняться при температуре 4 °C.
    14. Перенесите супернатанты в четыре новые трубки по 50 мл и снова центрифугу с той же скоростью в течение 5 минут.
    15. Соберите супернатанты, добавьте 10% (мас./об.) порошка PEG8000 и вращайте при 4 °C для инкубации в течение 30 мин.
    16. Центрифугируют суспензии со стадии 3.1.15 при 12 000 х г в течение 15 мин для получения фаговых гранул.
    17. Повторно суспендировать гранулы в 1 мл буфера разбавления фагов (10 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 100 мМ NaCl и 10 мМ MgCl2) в четырех пробирках и перелить все 4 мл этих смесей в трубку объемом 50 мл.
    18. Добавьте РНКазу А (10 мг/мл) и ДНКазу I (4 мг/мл) до конечных концентраций 20 мкг/мл и 5 мкг/мл и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин для разложения избыточных нуклеиновых кислот.
    19. Добавьте в пробирку 4,5 мл 300 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 2,76 мл 0,5 М этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1,67 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 75 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и инкубируйте при 65 °C в течение 10 мин.
    20. Добавить 4,5 мл предварительно охлажденного 3 М ацетата калия и инкубировать на льду в течение 10 мин.
    21. Центрифуга при 8 000 х г в течение 10 мин и вращение супернатанта в течение дополнительных 5 мин при 10 000 х г.
    22. Добавьте 70% объема изопропанола в собранный супернатант (со стадии 3.1.21) при достаточном перемешивании, инкубируйте при RT в течение 2 мин, а затем центрифугу при 8000 х г в течение 10 мин. Отбросьте изопропанол и снова вращайте в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула ДНК будет смазана перед первыми 10 мин центрифугирования; гранулы будут концентрироваться на дне трубки после второй 5-минутной центрифугирования.
    23. Вымойте осажденную ДНК 2-3 мл 70% этанола и снова открутите в течение 1 мин. Высушите гранулу при 4 °C в течение 2 ч, а затем повторно суспендируйте ДНК в 500 мкл буфера TE (10 мМ Tris-HCl (рН 8,0) и 1 мМ ЭДТА) в течение ночи на RT.
    24. Переложите ДНК в пробирку объемом 1,5 мл и раскрутите ее при 18 000 х г в течение 3 минут. Перенесите ДНК в новую трубку объемом 1,5 мл. Аликвоцитируйте очищенную лямбда-ДНК и храните ее при -20 °C.
  2. Биотин-лямбда-препарат ДНК
    1. Расплавить 50 мкл очищенной лямбда-ДНК с клонированными мотивами при 65 °C в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лямбда-ДНК имеет длину ~ 48 кбит/с, ее необходимо нагревать перед пипеткой, чтобы избежать разрывов ДНК.
    2. Смешайте 50 мкл лямбда-ДНК, 1 мкл праймера биотина (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 мкМ) и 54 мкл ddH2Oвместе. Соинкубируйте смесь при 65 °C в течение 5 мин и оставьте ее на скамейке для охлаждения до RT.
    3. Добавьте 12 мкл 10x T4-лигазного буфера и 3 мкл T4-лигазы и инкубируйте в RT в течение нескольких часов или на ночь.
    4. Добавьте равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1) в продукт лигирования, немедленно хорошо перемешайте и центрифугируйте при 12 000 х г в течение 2 мин при РТ.
    5. Аккуратно перенесите верхнюю водную фазу, содержащую ДНК, в новую пробирку, добавьте равный объем хлороформа, хорошо перемешайте, а затем центрифугу при 12 000 х г в течение 2 мин.
    6. Переложить верхнюю водную фазу в новую пробирку, добавить равный объем изопропанола и 10% от объема 3 М ацетата натрия, и инкубировать при РТ в течение 2 мин. Центрифугировать смесь при 12 000 х г в течение 5 мин.
    7. Удалите надосадочное вещество, промыть гранулу 75% этанолом, а затем центрифугировать при 12 000 х г в течение 5 мин.
    8. Удалите 75% этанола, высушите НА воздухе ДНК при RT в течение 10 минут и используйте 120 мкл буфера TE для растворения ДНК.
    9. Добавьте 60 мкл буфера А (30% (мас./об.) ПЭГ8000 и 30 мМMgCl2) к 120 мкл раствора со стадии 3.2.8 и вращайте при 4°С в течение 20-24 ч.
    10. Центрифугируют смесь по 18 000 г в течение 5 мин и удаляют надосадочное вещество.
    11. Используйте 180 мкл предварительно охлажденного 75% этанола для промывки гранул и повторите шаг 3.2.10.
    12. Высушите гранулу при RT и используйте 100 мкл буфера TE150 для растворения ДНК.

4. Нанофабрикованные зигзагообразные барьеры

  1. Очистите слайды в ацетоне в течение 20 минут ультразвуком и переложите их в новый стеклянный контейнер с 1 M NaOH для обработки ультразвуком еще на 20 минут. Смешайте 90 мл H2SO4 с 30 мл H2O2 и погрузите горки в эту смесь на 30 мин. Промойте горки ацетоном и изопропанолом и высушите горкиN2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание H2SO4 и H2O2 является экзотермическим процессом; соблюдать надлежащие меры предосторожности во время операции.
  2. Покрыть очищенную горку полиметилметакрилатом (ПММА) 25 кДа, ПММА 49,5 кДа и верхним слоем проводящего защитного покрытия последовательно. Используйте электронно-лучевую литографию для записи зигзагообразных барьеров (рисунок 1А).
  3. Вымойте слайды с ddH2O, чтобы удалить проводящее защитное покрытие и высушить слайды с помощью N2.
  4. Нанесите 30-нм слой хрома (Cr) с помощью магнетронной напыляющей машины и удалите оставшиеся слои ПММА ацетоном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна проточная клетка может быть повторно использована для более чем 20 экспериментов с ДНК-занавесками. Чтобы повторно использовать проточную ячейку, промыть ее этанолом, моющим средством и NaOH.

5. Очистка белка EWS-FLI1

ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдение 500 нМ EWS-FLI1 на лямбда-ДНК с 25× мотивами GGAA служит хорошим примером для применения ДНК-занавесок для образования конденсата. EWS-FLI1 представляет собой слитый белок, объединяющий N-терминал EWSR1 (1-265) и C-терминал FLI1 (220-453). Метка mCherry была слита с N-терминалом белка слияния EWS-FLI1 для визуализации.

  1. Клонирование гена EWS-FLI1 в восстановленный вектор pRSF или любой другой подходящий вектор экспрессии прокариот.
  2. Преобразовать плазмиду, кодирующую 7x His-mCherry-EWSFLI1, в штамм E.coli BL21(DE3); вырастить одну колонию в 5 мл LB среды при 37 °C за ночь. Когда значение OD600 достигнет 0,6-0,8 после переноса на 2 л среды LB, добавляют 0,5 мМ IPTG и встряхивают культуру клеток при 18 °C в течение 16-18 ч.
  3. Центрифугируют культуру для удаления надосадочного вещества и повторного суспендирования клеток с буфером лизиса (50 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 1 М ККл; 1 М мочевины; 10 мМ имидазола; 1,5 мМ бета-меркаптоэтанола (β-ME); и 5% глицерина).
  4. После обработки ультразвуком и центрифугирования при 18000 × г в течение ~30 мин загружают супернатант на смолу Ni-NTA, уравновешенную в 5-кратном объеме лизисного буфера, а затем промывают смолу 10-кратным объемом промывочного буфера (50 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 1 М ККл, 1 М мочевины, 40 мМ имидазола, 1,5 мМ β-ME и 5% глицерина).
  5. Элюируют связанный белок 15 мл элюционного буфера (50 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 1 М ККл, 1 М мочевины, 500 мМ имидазола, 1,5 мМ β-ME и 5% глицерина) и концентрируют элюирование до ~500 мкл.
  6. Загрузите концентрированный белковый раствор на гелевую фильтрационную колонну и проанализируйте продукты электрофорезом SDS-полиакриламидного геля. Быстро заморозьте очищенный белок в жидком азоте и храните при -80 °C.

6. Подготовка проточной ячейки ДНК-занавесок

  1. Подготовьте проточную ячейку с зигзагообразными нанофабрикатами для эксперимента с ДНК-занавесками и определите направление потока. Для этого подключите входную и выходную трубки в правильном направлении.
  2. Промыть проточную ячейку 2,5 мл липидного буфера с помощью двух шприцев по 3 мл. Убедитесь, что в проточной ячейке нет пузырьков.
  3. Извлекают шприц с выхода и вводят 1 мл раствора липосомы (40 мкл липосом из секции 2 и 960 мкл липидного буфера) три раза с 5 мин инкубации после каждой инъекции.
  4. Для этапа заживления медленно промывайте проточную клетку 2,5 мл липидного буфера и инкубируйте при RT в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время заживления может быть больше, если это необходимо; при появлении пузырьков выполните двойное заживление, повторив шаги 5.3 и 5.4, чтобы удалить пузырьки.
  5. Приготовьте 30 мл буфера сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA) (40 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 2 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтола и 0,5 мг/мл BSA для поверхностной пассивации). После 30 мин заживления промыть проточную ячейку 2,5 мл буфера BSA с выходной стороны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запас BSA представляет собой раствор 20 мг/ мл, хранящийся при 4 °C и должен использоваться в течение 1-2 недель. Концентрация BSA в буфере может регулироваться в соответствии с состоянием поверхности.
  6. Вводят 800 мкл буфера стрептавидина (10 мкл запаса стрептавидина 1 мг/мл, 790 мкл буфера BSA) в проточную ячейку со стороны входа в два этапа с 10 мин инкубации после каждой стадии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стрептавидин закрепляет ДНК на липидах из-за его мультивалентности, соединяя биотинилированные липиды и биотинилированную ДНК.
  7. Промыть проточную ячейку 2,5 мл буфера BSA, чтобы удалить все свободные молекулы стрептавидина.
  8. Разбавьте БИОТИН-Лямбда-ДНК клонированными мотивами из раздела 3, используя буфер BSA (2,5 мкл ДНК и 998 мкл буфера BSA). Вводят лямбда-ДНК 4 раза медленно с интервалом 5 мин.
  9. Включите микроскоп и научную систему комплементарного металлического оксида полупроводника (sCMOS) во время инъекции. Промыть трубку 10 мл ddH2O. Промыть призму и соединитель трубки водой, 2% жидким очистителем кюветы и 99% этанолом. Подготовьте буфер визуализации, добавив KCl и двухцепочечный краситель ДНК в буфер BSA для получения конечных концентраций 150 мМ и 0,5 нМ соответственно, и захватите по меньшей мере 20 мл буфера визуализации в шприц объемом 30 мл.
  10. Установите проточный элемент на ступень микроскопа и подключите его к микрофлюидной системе.
  11. Используйте скорость потока 0,03 мл / мин, чтобы промыть молекулы ДНК к барьеру в течение 10 минут, инкубировать в течение 30 минут с прекращением потока, а затем выключить его, чтобы позволить ДНК диффундировать сбоку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этой 30-минутной инкубации состоит в том, чтобы позволить молекуле ДНК распределяться более равномерно перед барьером посредством простой диффузии, потому что молекулы ДНК имеют тенденцию накапливаться на стороне барьера, которая закрыта для входа, где они смываются. Время инкубации может быть скорректировано по мере необходимости.

7. Визуализация образования конденсации EWS-FLI1 на завесах ДНК

  1. Откройте программное обеспечение для визуализации, найдите и отметьте положения 3 × 3 зигзагообразных узоров под ярким полем.
  2. Включите поток со скоростью 0,2 мл /мин, чтобы окрасить ДНК двухцепочечным красителем ДНК в течение 10 минут.
  3. Разбавляют mCherry-EWS-FLI1 буфером визуализации до концентрации 100 нМ в 100 мкл в пробирке.
  4. Загрузите образец белка через клапан стеклянным шприцем объемом 100 мкл и измените скорость потока до 0,4 мл/мин.
  5. Включите лазер 488 нм и предварительно отсканируйте каждую область, чтобы проверить состояние распределения ДНК; выбрать область, в которой молекулы ДНК распределяются равномерно. Установите мощность лазера на 10% для лазера 488 нм и 20% для лазера 561 нм. Используйте измеритель мощности для измерения реальной мощности лазера вблизи призмы: 4,5 мВт для лазера 488 нм и 16,0 мВт для лазера 561 нм.
  6. Получение изображений
    1. Начните получать изображения с интервалом 2 с одновременно с лазерами 488 нм и 561 нм.
    2. Переключите клапан с ручного режима на режим впрыска, чтобы буфер визуализации смывал образец белка в проточную ячейку через 60 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс займет ~ 30 с, и поле зрения будет покрыто сигналами mCherry, как только белки EWS-FLI1 достигнут проточной клетки.
    3. Чтобы удалить свободный EWS-FLI1, продолжайте промывать проточную ячейку буфером визуализации в течение 5 минут, включив только лазер 561 нм. Остановите течение и инкубируйте при 37 °C в течение 10 мин.
    4. Включите поток со скоростью 0,4 мл /мин, чтобы позволить ДНК расширяться, и получите изображения с интервалом 2 с между различными кадрами для получения высокопроизводительных данных о образовании конденсата EWS-FLI1.

8. Анализ интенсивности для mCherry-EWS-FLI1

  1. Импортируйте данные в виде последовательностей изображений в программное обеспечение ImageJ, выберите пункт на 25× сайтах GGAA в квадрате 8× 8 пикселей и сохраните изображение в .tif формате.
  2. Рассчитайте интенсивность как сумму интенсивности в квадрате 8×8 пикселей, включая всю пунктуацию, и удалите фон, вычитая интенсивность фона в области того же размера вблизи квадрата 8 x 8 пикселей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схема ДНК-занавесок показана на рисунке 1A, рисунке 1B и рисунке 1D. Клонированная целевая последовательность, содержащая 25 непрерывных повторов GGAA, обнаружена в промоторе NORB1 в саркоме Юинга. Эта целевая последовательность имеет решающее значение для набора EWS-FLI128. Молекулы EWS-FLI1 визуализировали путем обнаружения меченых mCherry сигналов EWS-FLI1, полученных с помощью лазера 561 нм (рисунок 1C и рисунок 1E). После проведения эксперимента с ДНК-занавесками можно было непосредственно визуализировать образование in vitro биомолекулярных конденсатов EWS-FLI1 на 25× участках GGAA субстрата ДНК (рисунок 1B-E). Специфичность mCherry-EWS-FLI1, используемого в ДНК-занавесках, была подтверждена электрофоретическим анализом сдвига подвижности с использованием шаблона ДНК, содержащего 25× GGAA и без GGAA отдельно (рисунок 2A). Кроме того, концентрацию EWS-FLI1 титровали от 20 нМ до 500 нМ, и определяли интенсивность пункции на участках GGAA 25×. По сравнению с интенсивностью mCherry-FLI1DBD, интенсивность EWS-FLI1 резко возросла, тогда как изменение интенсивности FLI1DBD было незначительным, когда белки были насыщены для покрытия 25× сайтов GGAA. Таким образом, эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что EWS-FLI1 образовывал конденсаты на ДНК (рисунок 2B-E).

Figure 1
Рисунок 1: Образование конденсата EWS-FLI1 на лямбда-ДНК, содержащей 25× мотивов GGAA. (A) Схема ДНК-занавесок. (B и D) Две стратегии обнаружения конденсатов EWS-FLI1 (500 нМ), собирающихся на лямбда-ДНК: (B) Хранить промывку в течение 10 мин;(D)инкубировать в течение 10 мин. (C и E) Репрезентативное широкоугольное полное внутреннее отражение флуоресцентной микроскопии изображения ДНК-занавесок: (C) Стратегия обнаружения в B; E) Стратегия обнаружения в D. C (ii) и E (ii) ДНК увеличивается, чтобы показать отчетливые пункты, образованные на одном субстрате ДНК. Субстраты ДНК представляют собой лямбда-ДНК с 25× мотивами GGAA. Числа «1, 2, 3, 4» представляют различные положения пункты на одной лямбда-ДНК, а «3» — это место, где была клонирована 25× микроспутниковая последовательность GGAA. Шкала стержней = 4,9 мкм (C, E (i)) и 0,7 мкм (C, E (ii)). Эта цифра была изменена с 24. Аббревиатура: dsDNA = двухцепочечная ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: События связывания отсоединенного домена mCherry-EWS-FLI1 на 25× повторов GGAA. (A)(i) mCherry-EWS-FLI1. ii) Анализ сдвига электрофоретической подвижности mCherry-EWS-FLI1: 306-bp dsDNA, меченую 5' Quasar670, инкубировали с mCherry-EWS-FLI1 при различных концентрациях при комнатной температуре в течение 30 мин в реакционном буфере, содержащем 40 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 150 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ DTT и 0,2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Образцы загружали и запускали на 1,3% агарозном геле в течение 25 мин, 120 В. (B-D) Широкоугольные изображения флуоресцентной микроскопии общего внутреннего отражения 25× GGAA с ДНК-занавесками после инкубации с 500 нМ мЧерри (B), 500 нМ мЧерри-EWSLCD (C) или 500 нМ мCherry-FLI1DBD (D). (E) Распределение интенсивности сигналов EWSFLI1 (голубой) и FLI1DBD (черный) в целевом участке (25× GGAA) по сравнению с концентрацией белка. Эта цифра была изменена с 24. Сокращения: LCD = область низкой сложности; DBD = ДНК-связывающий домен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поскольку одномолекулярные подходы чрезвычайно чувствительны к содержимому реакционной системы, необходимо приложить дополнительные усилия для обеспечения хорошего качества всех материалов и растворов во время экспериментов с ДНК-занавесками, особенно липидов, полученных в разделах 1 и 2, и буферов, используемых в разделе 5. Реагенты более высокой чистоты должны использоваться для приготовления буферов, а буферы должны быть свежеподготовлены для одномолекулярного анализа.

Когда 500 нМ мвечерно-меченый EWS-FLI1 был смыт в камеру, на ДНК Lambda появилось несколько пурпурных пункт, содержащих 25× последовательности GGAA. Обратите внимание, что наблюдалось последовательное неспецифическое распределение пурпурных сигналов по всей ДНК даже после 10 минут промывки пустым буфером (рисунок 1B, C). Интересно, что молекулы EWS-FLI1 были перестроены на ДНК в течение 10-минутной инкубации без буферного потока и собраны в несколько пункт (рисунок 1D,E). Одна из этих пункт была сформирована на клонированном 25× сайте GGAA, в то время как все остальные были сформированы в регионах, содержащих высокую плотность последовательных мотивов GGAA. Это явление убедительно свидетельствует о том, что процедура беспочной инкубации позволяет молекулам EWS-FLI1 искать локусы и быстрее собираться на ДНК.

Необходимо провести несколько контрольных экспериментов, чтобы выяснить, как эти конденсаты образуются на ДНК-занавесках. Мы очистили mCherry, mCherry-EWSLCD и mCherry-FLI1DBD и выполнили ту же процедуру, чтобы ввести эти белки в камеру. Ни mCherry (Рисунок 2B), ни mCherry-EWSLCD (Рисунок 2C) не оставили никаких сигналов на ДНК, указывающих на то, что FLI1DBD EWS-FLI1 был необходим для взаимодействия с ДНК. Чтобы подтвердить, что разделение фаз происходило в ДНК-занавесках при таких низких концентрациях белка, концентрацию mCherry-EWS-FLI1 титровали от 25 нМ до 500 нМ, а интенсивность каждой пункты на одной молекуле ДНК определяли на месте клонирования (рисунок 2E). Сравнение с интенсивностью синтеза TF FLI1DBD, помеченного mCherry, показало, что, хотя интенсивность пункты EWS-FLI1 и FLI1-DBD была одинаковой при низких концентрациях белка, интенсивность EWS-FLI1 резко возросла, в то время как интенсивность FLI1DBD оставалась низкой, даже когда концентрация достигала 500 нМ. Эти результаты свидетельствуют о том, что молекулы EWS-FLI1 связываются с 25× последовательностью GGAA и собираются на ней в конденсат посредством ЖК-взаимодействий. Один FLI1DBD может связывать 2 мотива GGAA, а олигомеры более высокого порядка связываются с очень повторяющимися последовательностями с низким сродством27. Сигнал mCherry-FLI1DBD на 25× последовательности GGAA был из белкового кластера, а не из отдельной белковой молекулы. Хотя mCherry-FLI1DBD мог связывать 25× участков GGAA, он не смог собраться в виде конденсата на ДНК, подтверждая, что взаимодействие LCD-LCD было необходимо для разделения фаз (рисунок 2D, E).

Одномолекулярные методы позволяют исследователям изучать динамику внутри конденсатов транскрипционного фактора. Метод ДНК-занавесей имеет некоторые преимущества по сравнению с другими одномолекулярными методами, такими как одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET)29, визуализация со сверхвысоким разрешением30 и оптический пинцет31,32. Во-первых, метод ДНК-занавесей позволяет воссоздать механизм транскрипции на длинной геномной ДНК in vitro и наблюдение в режиме реального времени за образованием транскрипционного конденсата с получением данных с высокой пропускной способностью. Во-вторых, выровненные молекулы ДНК позволяют отображать положение конденсатов на каждой цепи ДНК. Таким образом, предпочтительные последовательности ДНК для образования пункты могут быть легко определены.

Кроме того, долгосрочное приобретение возможно с помощью ДНК-занавесок, позволяющих измерять скорость включения (kвкл) и вне скорости (kвыключения) одной пунктумы. Тем не менее, ДНК-занавес имеет некоторые врожденные технические дефекты, что требует коллективного изучения доказательств из различных методов. С одной стороны, разрешение ДНК-занавесок может достигать только 0,18 мкм или ~1000-bp, потому что длинный шаблон ДНК Lambda имеет ограничение относительно дифракционного предела, что может препятствовать дифференциации двух соседних флуоресцентных сигналов. С другой стороны, поток используется для расширения двухцепочечной ДНК (dsDNA), и сила, приложенная к биомолекуле, может влиять на диффузионное свойство белков, связывающихся с ДНК. Двойные привязанные днк-занавески могут закреплять оба конца дцДНК и регистрировать движение белков без потока, что является примечательным решением33. Подводя итог, углубление нашего понимания динамической сборки биомолекулярных конденсатов на ДНК в режиме реального времени прольет свет не только на биофизический механизм LLPS, но и на основную биологию клеточных процессов, связанных с LLPS, таких как регуляция транскрипции генов24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами NSFC No 31670762 (Z.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS488LS
561 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS561LS
Agar Rhawn R003215-50g
biotinylated DOPE Avanti 870273P
Bovine Serum Albumin Sigma A7030
Chloroform Amresco 1595C027
Coating Electra 92 Allresist GmbH AR-PC 5090.02 The conductive protective coating
Deoxyribonuclease I bovine Sigma D5139-2MG
DOPC Avanti 850375P
DTT Sigma D9779
Glass coverslip Fisher Scientific 12-544-7
Hellmanex III Sigma Z805939-1EA
KCl Sigma 60130
Lambda DNA NEB N3013S
Lambda Packing Extracts Epicentre MP5120
MgCl2 Sigma M2670
NaCl Sigma s3014
Nanoport Idex N-333-01
NheI-HF NEB R3131S
Nikon Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
NZCYM Broth Sigma N3643-250G
PEG-2000 DOPE Avanti 880130P-1G
PEG-8000 Amresco 25322-68-3
PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% Allresist GmbH AR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOLE 2% Allresist GmbH AR-P 672.02
Prime 95B Scientific CMOS camera PHOTOMETRICS Prime95B
proteinase K NEB P8107S
Silica glass slide G.Finkenbeiner
Six-way injection valve Idex MXP9900-000
Streptavidin Thermo S888 Diluted with ddH2O
Syringe pump Harvard Apparatus Pump11 Elite
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Tris base Sigma T6066
XhoI NEB R0146V
YOYO-1 Iodide (491/509) Invitrogen Y3601 Diluted with DMSO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).

Tags

Биохимия выпуск 175
Одномолекулярная визуализация конденсатов EWS-FLI1, собранных на ДНК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zuo, L., Ding, J., Qi, Z.… More

Zuo, L., Ding, J., Qi, Z. Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA. J. Vis. Exp. (175), e62974, doi:10.3791/62974 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter