Summary
Vi presenterar en icke-invasiv ultraljud teknik för att generera tredimensionella angiografier i ögat utan användning av kontrastmedel.
Abstract
Näthinnan i ögat är en av de mest energikrävande vävnaderna i kroppen och kräver därför hög syretillförsel från en rik blodtillförsel. Kapillär lamina av choroid linjer den yttre ytan av näthinnan och är den dominerande källan till syre i de flesta ryggradsdjur näthinnor. Denna vaskulär säng är dock utmanande att avbilda med traditionella optiska tekniker på grund av sin position bakom den mycket ljusabsorberande näthinnan. Här beskriver vi en högfrekvent ultraljud teknik med efterföljande flöde-förbättring att bild djupa vaskulär sängar (0,5-3 cm) av ögat med en hög spatiotemporal upplösning. Denna icke-invasiva metod fungerar bra hos arter med nukleära röda blodkroppar (icke-däggdjurs- och fosterdjurmodeller). Det möjliggör generering av icke-invasiva tredimensionella angiografier utan användning av kontrastmedel, och det är oberoende av blodflödesvinklar med högre känslighet än Doppler-baserade ultraljudsavbildningstekniker.
Introduction
Den höga ämnesomsättningen på ryggradsdjuret näthinnan medför en inneboende kompromiss mellan två kontrasterande behov; höga blodflöden och en lätt väg utan blodkärl. För att undvika synstörningar av perfusing röda blodkroppar får näthinnan hos alla ryggradsdjur syre och näringsämnen via ett ark kapillärer bakom fotoreceptorerna, choriocapillaris1,2,3. Denna enda källa till näringsämnen och syre medför dock en diffusionsbegränsning för tjockleken på näthinnan4,5, så många visuellt aktiva arter har en mängd utarbetade kärlnätverk för att ge ytterligare blodtillförsel till detta metaboliskt aktiva organ6. Dessa kärlbäddar inkluderar blodkärl som perfusar de inre näthinnans lager hos däggdjur och vissa fiskar4,7,8,9,10, blodkärl på den inre (ljusvända) sidan av näthinnan som finns i många fiskar, reptiler och fåglar4,11,12,13 och motströms vaskulär arrangemang av fisken choroid, choroid rete mirabil, som möjliggör generering av super-atmosfäriska syre partiella tryck14,15,16,17,18,19,20. Trots att dessa ytterligare icke-choroidal vägar för retinal näringstillförsel spelar en viktig roll för att driva de metaboliska kraven för överlägsen vision4, är den tredimensionella anatomin av dessa vaskulär strukturer dåligt förstådd, vilket begränsar vår förståelse av ryggradsdjurets morfologiska utveckling.
Traditionellt har retinal blodtillförsel studerats med hjälp av optiska tekniker, såsom fundus oftalmoskopi. Denna kategori av tekniker ger hög genomströmning icke-destruktiva information om icke-choroidal blodkärl anatomi i högupplösta21 och används därför lätt i klinisk diagnos av avvikelser i retinal fartyg struktur22. Näthinnepigmentet epitel absorberar dock det överförda ljuset och begränsar synfältet i dessa optiska tekniker, vilket ger minskad information om choroidal struktur och funktion utan användning av kontrastmedel21. Liknande djupbegränsningar har erfarenhet av optisk koherenstomografi (OCT). Denna teknik kan generera högupplösta fundus angiographies med hjälp av ljusvågor på den tekniska kostnaden för djup penetration23, medan det förbättrade djupet imaging OCT kan visualisera choroid på bekostnad av retinal imaging kvalitet24. Magnetisk resonans imaging övervinner de optiska begränsningarna av oftalmoskopi och OCT och kan kartlägga vaskulär lager i näthinnan, om än med en låg upplösning25. Histologi och mikrokompatibel tomografi (μCT) upprätthåller den höga upplösningen av de optiska teknikerna och ger information om helögd vaskulär morfologi4, men båda teknikerna kräver okulär provtagning och är därför inte möjliga i kliniken eller sällsynta eller utrotningshotade arter. För att övervinna några av begränsningarna i dessa etablerade näthinneavbildningstekniker presenterar studien här ett ultraljudsprotokoll på sövda djur, där blodrörelser kartläggs i silico på en serie lika fördelade tvådimensionella ultraljudsundersökningar som spänner över ett helt öga genom att tillämpa en jämförbar teknik som tidigare beskrivits för embryonal och kardiovaskulär avbildning26,27, 28 och i OCT angiografi29. Detta tillvägagångssätt möjliggör generering av icke-invasiva tredimensionella djup okulär angiografier utan att använda ett kontrastmedel och öppnar nya vägar för kartläggning av blodflödesfördelningen inom ögat över arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet nedan utfördes med tillstånd från den danska inspektionen för djurförsök inom det danska ministeriet för livsmedel, jordbruk och fiske, Danska veterinär- och livsmedelsförvaltningen (tillståndsnummer 2016-15-0201-00835).
1. Anestesi och ultraljud medium
- Bedöva forskningsdjuret.
OBS: Typ och dos av lämplig anestesi är mycket artberoende. I allmänhet är nedsänkningsbaserade anestetika som MS-222 (etyl 3-aminobensoatmetanol), bensokain (etyl 4-aminobensoat) och propofol (2,6-diisopropylfenol) användbara hos fisk och amfibier som lätt absorberar bedövningen över gälar eller hud (t.ex. 0,05 mg· L-1 bensokain i regnbåge). En rad upplösta föreningar som kan administreras intravenöst, intramuskulärt, intraperitoneally finns tillgängligt för fostervatten, liksom gasbaserade anestetika. Alfaxalon administreras intramuskulärt är användbart hos reptiler (t.ex. 30 mg·kg-1 i ödlor) och isofluran som administreras som gas är användbart hos fåglar (t.ex. 2% i luft för duvor). Se den publicerade litteraturen30,31,32 för en fullständig översikt över tillgängliga anestetika mellan arter. - Testa reflexer i djuret för att bekräfta en optimal anestesinivå. Se till att djuret är helt orörligt under proceduren eftersom det flödesförbättrade ultraljudsproceduren är känslig för rörelsebuller.
- För djup anestesi kan förändra blodflödesmönstren, så utför en dostitrering i uppstartsfasen av ett experiment.
- Öka anestesi doseringen i steg och observera blodflödet i ögat med hjälp av enkelt ljusläge (B-läge) ultraljud.
OBS: En optimal anestesinivå erhålls när djuret är orörligt (utom andning) med synligt okulärt blodflöde.
- Om typen/dosen av bedövningsmedel inte är tillåtande för andningsrörelser, se till att djuret ventilationeras på lämpligt sätt, t.ex.
- Placera djuret i en hållning som möjliggör direkt åtkomst ovanifrån till ögat.
OBS: Beroende på art kan detta vara i antingen en supine eller lateral position. Det kan vara användbart att konstruera en enkel hållanordning med en liten bit icke-reaktiv metall (t.ex. rostfritt stål) och lösa gummiband (se figur 1). - Placera lämpligt ultraljudsmedium på djurets öga. Om skalade ögonlock (ultraljud ogenomträngligt) täcker ögat, förskjut dessa försiktigt med en bomullspinne.
OBS: För vattenlevande arter är det bästa ultraljudsmediet rent tankvatten där djuret vanligtvis bor. För terrestra arter säkerställer en generös mängd ultraljudsgel fria rörelser och avbildning av ultraljudsgivaren (dvs. linjär matrissond) över hela ögats yta. Veterinärsalva på kontralateralt öga krävs för terrestra arter.
2. 2D och 3D okulär ultraljud bild förvärv
- Placera ultraljud givaren medial till ögat i antingen en dorsal/ventral eller rostral/caudal orientering beroende på önskad bildorientering.
- I B-läge, med maximalt skärpedjup, avbilda den mediala och djupaste delen av ögat och se till att alla strukturer av intresse är synliga i bildfältet.
OBS: I vissa arter tar den kristallina linsen upp en jämförelsevis stor del av glaskroppen humor, som kan absorbera ultraljudet, särskilt vid högre frekvenser. - Översätt givaren långsamt till varje sida medan du inspekterar realtidsbilderna. Kontrollera att alla strukturer av intresse är synliga i bildfältet. Om inte, byt till en givare med lägre frekvens och större skärpedjup.
OBS: Följande mittfrekvenser möjliggör följande maximala skärpedjup: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (se tabell 1). Dessa maximala skärpedjup av fältvärden kan dock vara markant lägre om ögat innehåller förkalkade eller andra ultraljudsimpererbara strukturer. - Justera bilddjup, djupförskjutning (avstånd från bildens ovankant till intressestrukturen), bildbredd samt antal och placering av fokuszoner för att täcka önskad region av intresse för alla tre rumsliga dimensioner (t.ex. 1 cm bilddjup, 2 mm djupförskjutning, 1 cm bildbredd, en brännzon).
OBS: Även om specifik namngivning av knappar som justerar dessa parametrar kan variera mellan ultraljudssystem, kommer de flesta system att ha knappar med logiska namn för dessa justeringar. Dessa bild parameter inställningar påverkar vanligtvis intervallet av möjliga tidsmässiga upplösningar av ultraljud förvärv. - Ställ in bildhastigheten i intervallet 50-120 ramar·s-1.
OBS: Den tidsmässiga upplösningen (dvs. tidsintervallet mellan på varandra följande B-skanningar) måste vara tillräcklig för att visa stora pixelintensitetsvariationer i avbildade blodkärl, dvs. den tidsmässiga upplösningen får inte vara för hög. Å andra sidan, för att slutföra en fullständig 3D-inspelning av ögat inom rimlig tid, kan temporal upplösning inte vara för låg. En temporal upplösning som sträcker sig från 50-120 ramar·s-1 är vanligtvis tillräcklig för det flödesförbättrade förfarandet hos de flesta arter. På vissa ultraljudssystem kan denna önskade tidsupplösning erhållas genom att växla mellan lägena "allmän avbildning" (hög rumslig/låg temporal upplösning) och "kardiologi" (låg rumslig/hög temporal upplösning). - Justera 2D-förstärkning till en nivå (~ 5 dB), så anatomiska strukturer är bara synliga i B-lägesförvärvet för att öka signal-till-brus-förhållandet i den efterföljande flödesförbättrade rekonstruktionen.
- Om du vill skaffa en 2D-flödesförbättrad bild i en enda segmentposition översätter du givaren till den här positionen och fortsätter i steg 3.1.
- För att få en 3D-inspelning av en hel region av intresse, t.ex. näthinnan, översätt givaren till en extrem av den intressanta regionen.
- För att bestämma den exakta positionen för den extrema änden av intresseregionen, öka 2D-vinsten kort.
- När korrekt givarens placering är klar sänker du 2D-förstärkningen före registrering för att säkerställa maximalt signal-till-brus-förhållande i den efterföljande flödesförbättrade rekonstruktionen.
- För varje steg (segment) i 3D-inspelningen skaffar du ≥100 bildrutor (optimalt ≥1000-bildrutor).
- Med hjälp av en mikromanipulator eller inbyggd givaremotor översätter du givaren över hela den intresseregion som är av intresse i steg om t.ex. 25 μm eller 50 μm (kom ihåg att notera stegstorleken) och upprepa förvärvet av ≥100 ramar för varje steg.
- Avliva forskningsdjuret enligt institutionens riktlinjer för djurvård.
3. Flödesförbättrad bildrekonstruktion
- Exportera inspelningarna till digital avbildning och kommunikation i medicin (DICOM) filformat (little-endian).
- Om du vill skapa en enda flödesförbättrad bild baserad på en ≥ 100 bildrutor (T) cine-inspelning beräknar du standardavvikelsen på pixelnivå (STD(x,y)) med hjälp av formeln:
Där It(x,y) är pixelns intensitet vid (x,y) pixelkoordin i tid t, och Īt(x,y) är det aritmetiska medelvärdet för I över tid. - Upprepa steg 3.2 för varje segment i 3D-inspelningen.
- Om du vill automatisera processen för beräkning av std- och bildrekonstruktion för flera segment i en 3D-inspelning utför du den här åtgärden i batchläge med t.ex. ImageJ och det kompletterande makroskriptet (Kompletterande fil 1).
- Kombinera alla rekonstruerade segment i en bildstack (kommandot Bilder till stack i ImageJ).
- Ange segmenttjocklek från den stegstorlek som används vid anskaffning (kommandot Egenskaper i ImageJ).
- Spara bildstacken som en 3D TIF-fil.
OBS: Flödesvägda tredimensionella inspelningar av okulära blodkärl kan därefter användas för att skapa volymåtergivningar och bygga digitala och fysiska anatomiska modeller av kärlstrukturer i ögat. Dessa bildbehandlingsalternativ ligger utanför protokollets tillämpningsområde. se de tidigare publicerade artiklarna för mer information33,34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den flödesförbättrade ultraljudstekniken för att avbilda kärlbäddar i ögat kan appliceras i en rad olika arter och har för närvarande använts i 46 olika ryggradsdjur (figur 1, tabell 1). Förekomsten av nukleära röda blodkroppar i ryggradsdjur som inte är vuxna och däggdjur ger positiv kontrast till strömmande blod jämfört med statisk vävnad i cine-inspelningar (Kompletterande fil 2). Men när den analyseras bildruta för bildruta är den tydliga skillnaden mellan blod och omgivande vävnad mindre uppenbar (figur 2A). Den blodflödesförbättringsprocedur som beskrivs i detta protokoll sammanställer i huvudsak en multitidspunktinspelning i 2D-rymden (en skiva gjord av T-ramar ) till en enda bild där de inneboende signalvärdefluktuationerna i pixlar placerade i flödande blod gör en högre standardavvikelse än omgivande statisk vävnad, vilket ger positiv kontrast (figur 2B). För att märkbart förbättra blodkärlskontrasten kan Leta upp tabeller användas för att producera pseudofärgbilder (bild 2C). Vid 3D-förvärv kan flera parallella segment med känt avstånd kombineras till 3D-bilddata (Kompletterande fil 3 och kompletterande fil 4) som kan användas för tredimensionell volymåtergivning (figur 2D) och anatomisk modellering (figur 2E och kompletterande fil 5). Dopplerbaserad ultraljudsavbildning ger också möjlighet att specifikt avbilda blodflödet, men med mindre känslighet än den beskrivna metoden (jämför figur 2G med figur 2H och figur 2I), och viktigt inte om blodflödesorienteringen är direkt eller nära vinkelrätt mot ljudvågens riktning. Det flödesförbättrade förfarandet som beskrivs i detta protokoll är oberoende av orienteringen av blodflödet både i plan och utanför planet.
Den flödesförbättrade ultraljudsproceduren möjliggör blodflödesavbildning i en rad arter med nukleära röda blodkroppar (figur 3A-D). Djupa okulära kärlbäddar som choroid rete mirabile i vissa fiskar kan avbildas om de finns i arten (gul pilspets i figur 2, figur 3B, figur 4). Metoden begränsas av frånvaron av nukleära röda blodkroppar hos vuxna däggdjur där flödesförstärkningsproceduren ger en viss grad av blodflödeskontrast men inte är lika distinkt som hos arter med nukleerade röda blodkroppar (figur 3E, F).
Flödesförbättrat ultraljud är känsligt för rörelsebuller, och t.ex. andningsrörelser kan orsaka bildoskärpa och artefakter som vävnadsgränsförbättring (figur 4A-C, kompletterande fil 6). Prospektiv eller retrospektiv gating kan användas för att justera för rörelsebuller (figur 4D,E).
Figur 1: Exempel på olika arter som lämpar sig för flödesförbättrad ultraljudsundersökning av okulär vaskulatur. B) Sibirisk stör (Acipenser baerii). C) Europeisk havsabborre (Dicentrarchus labrax). D) Clownfjäderrygg (Chitala ornata). (E) Crucian karp (Carassius carassius). F) Embryonal tamkyckling (Gallus gallus domesticus). Det kan vara användbart att konstruera en enkel hållanordning med en icke-reaktiv metallvikt och lösa gummiband (A, C, D). Både stora, orörliga labbbaserade ultraljudsavbildningssystem kan användas för ingreppet (A-D, F) samt små fältoperativa system (E). Vid avbildning av små och mycket temperaturkänsliga arter som inte kan behållas i ett temperaturkontrollerat vattenbad som embryonala fåglar kan avbildning utföras medan provet är inne i inkubatorn (F). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Effekt av flödesförbättring på okulär ultraljudsundersökningar. (A) Exempel på råa B-läge ultrasonografiska bilder av ögat på en guldfisk i en 1000 ram cine inspelning. Medan blodflödet kan observeras i cine-inspelningen (Kompletterande fil 2) är det svårt att se i statiska ramar. (B) Flödesförbättrad gråskalebild (samma segment som i A). Både retinal och post-retinal vaskulär sängar förbättras. (C) Pseudofärgad version av bilden i B med ImageJ Fire Look Up Table. D) Volymuppförd visning av blodflödet i ögat på samma guldfisk som i A-C, baserat på 3D-förvärv. (E) Tvåsegments (näthinne- och post retinala kärl) anatomisk ögonmodell i A-D (för interaktiv modell se kompletterande material 5). (F-I) Rå B-läge ultrasonografisk bild av ögat på en annan guldfisk (F) som jämför färg Doppler baserad flödesavbildning (G) med de flödesförbättrade metoder som beskrivs i detta protokoll (H-I, notera I är ett överlägg av H på F). Gröna pilar indikerar retinala kärl, gula pilspetsar indikerar choroid rete mirabile. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa exempel på flödesförbättrade okulära ultraljudsbilder hos en mängd olika ryggradsdjursarter. A) Senegal bichir (Polypterus senegalus). B) Rödbukig piranha (Pygocentrus nattereri). C) Grön leguan (Leguan leguan). D) Embryonal (dag 18) tamkyckling (Gallus gallus domesticus). (E) Husmus (Mus musculus). F) Brun råtta (Rattus norvegicus). Hos arter med nukleära röda blodkroppar ger flödesförstärkningsproceduren användbara bilder av okulärt blodflöde (A-D), medan det hos vuxna däggdjur (enucleated röda blodkroppar) endast ger begränsad kontrast mellan strömmande blod och omgivande vävnad (E-F). Gröna pilar indikerar näthinnekärl; blå pilspetsar indikerar post-retinal kärl såsom choriocapillaris; gula pilspetsar indikerar choroid rete mirabile. I den sena embryonala inhemska kycklingen kan blodflödet i pecten oculi observeras (lägre grön pil i F). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Andningsrörelser inducerar rörelseljud som kan lindras genom retrospektiv gating. (A-B) Exempel på andningsrörelser i ögat på en europeisk rödspätta (Pleuronectes platessa). Den röda pricken är vid samma bildkoordinat i A (segment 54/410) och B (skiva 92/410), men det kan observeras att ögat har skiftat position (se även cine-inspelning i kompletterande material 6). (C) Försök att utföra flödesförbättringsåtgärden på hela inspelningen av 410 bildrutor misslyckas på grund av rörelsebrus. Vävnadsgränser förbättras artificiellt på grund av rörelser. D) Retrospektiv gating-operation baserad på normaliserad signalintensitet (SI) vid den röda pricken i A-B. Endast ramar med normaliserad SI > 50 (totalt 38 bildrutor), dvs. som indikerar att ögat är i samma position som i B, ingår för flödesförbättringsproceduren. (E) Resulterande bild av retroaktivt gated flödesförbättring förfarande. Jämför med C. I den gated bilden, konstgjorda kant förbättring undviks, och blodflödet i choroid rete mirabile (gul pilspets) kan observeras. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Tabell 1: Förteckning över arter på vilka den flödesförbättrade ultraljudstekniken för att avbilda okulärt blodflöde har använts. Metodens tillämplighet bygger på förmågan att producera en kontrastrik representation av kärlbäddar jämfört med den statiska bakgrunden. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande fil 1: Makroskript för att automatisera flödesförbättringsberäkningar. Skriptet är skrivet på IJ1-makrospråk och kan köras både med hjälp av imagej-makrofunktionen (för inspelning av ett segment) eller ImageJ Batch Process (för 3D-inspelning med flera segment). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Raw B-läge cine inspelning på ögat på en guldfisk (Carassius auratus). Blodflödet kan observeras när videon spelas upp, men inte på en enda bildruta som i figur 2A. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Skiva video genom ögat på en guldfisk (Carassius auratus) av blodflödesförbättrade sektioner. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 4: Tredimensionell TIF-fil av guldfiskens flödesförbättrade öga (Carassius auratus). Bilder har binats med 3 x 3 x 3 för att minimera filstorleken (27-faldig minskning av rumslig upplösning och filstorlek). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 5: Interaktiv 3D-modell av pre- och post-retinal kärl i ögat på en guldfisk (Carassius auratus). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 6: Raw B-läge cine inspelning på ögat på en europeisk rödspätta (Pleuronectes platessa). Notera andningsrörelser. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vaskulär bildbehandling med hjälp av flödesförbättrad ultraljud ger en ny metod för icke-invasiv avbildning av ögats vaskulatur som erbjuder flera fördelar jämfört med nuvarande tekniker men har sina inneboende begränsningar. Den främsta fördelen med flödesförbättrad ultraljud är förmågan att generera okulära angiografier med ett skärpedjup som överstiger näthinnepigmentet epitel, vilket begränsar skärpedjupet i optiska tekniker. Vid ultraljudsavbildning bestäms rumslig upplösning och skärpedjup i slutändan av ultraljudsgivarens frekvens, där högre frekvenser ökar den rumsliga upplösningen, men på bekostnad av ett grundare skärpedjup, vilket innebär att valet av givarefrekvens medför en kompromiss mellan bilddjup och rumslig upplösning. Enligt vår erfarenhet uppnås optimal retinal ultraljud imaging med högfrekventa ultraljud givare (≥50 MHz) i små ögon med bilddjup på <1 cm och lägre frekvensgivare (20-40 MHz) i större ögon med bilddjup på 1,5-3,0 cm. För en 3D-ultraljudsundersökning ställs upplösningen på den extra segmentdimensionen in av stegstorleken mellan skanningar i stacken med 2D-ultraljudsskanningar. Enligt vår erfarenhet är det svårt att genomföra en 3D-skanning med en stegstorlek mindre än 20 μm.
Flödesförbättrad 2D ultraljud har en hög temporal upplösning. Helst krävs ≥ 1000 bildrutor per bild för flödesförbättrad vaskulär avbildning, så minst 8 s krävs per bildsökning. Den tidsmässiga upplösningen minskas avsevärt när du utför 3D-flödesförbättrade ultraljud, där skanningstiden ökar med antalet bilder i 3D-stacken med skanningar. Med tanke på den höga tidsupplösningen visar det flödesförbättrade 2D-ultraljudsarbetsflödet stark potential som en metod för att identifiera tidsmässiga förändringar i relativa blodflödeshastigheter och blodflödesfördelning under experimentell manipulation. Således kan framtida studier använda arbetsflödet för att identifiera hur förändrade miljöförhållanden (t.ex. temperatur, pO2, pCO2) eller farmakologisk administrering påverkar blodflödet i ögat och andra organ.
Ultraljudsarbetsflödet bygger på den positiva kontrasten av nukleära röda blodkroppar från de flesta ryggradsdjur som inte är däggdjur. Således ger de enucleated röda blodkropparna hos vuxna däggdjur och vissa salamanderarter37 för lite kontrast för att effektivt förbättra blodflödet med hjälp av det nuvarande arbetsflödet (figur 3E, F). I traditionella ultraljud arbetsflöden, vaskulär injektion av microbubbles ger tillräckligt hög kontrast för att identifiera vaskulaturen hos däggdjur38, som har använts för att generera vaskulär angiografier av retrobulbar fartyg inom råtta ögat39. Mikrobubblorna spricker dock inom några minuter, så genereringen av 3D-angiografier kräver successiva mikrobubbleinjektioner.
Flödesförbättrat ultraljud beror på sekventiella inspelningar i samma position av ögat, så tekniken är inte möjlig hos vakna djur, där mindre slumpmässiga rörelser kan kompensera bilden och undergräva flödesförbättringsberäkningar. Således måste den nuvarande metoden utföras under korrekt anestesi för immobilisering för att förbättra bildkvaliteten genom att minska slumpmässiga rörelser. Regelbundna rörelser i ögat som uppstår under regelbundna andningsrörelser kan dock kompenseras genom att prospektivt eller retroaktivt gating till djurets ventilationsmönster, så endast skanningsregistrering från samma tidsintervall inom ventilationscykeln används i dataanalysen. Även om bildens retrospektiva gating-metod för att kompensera ventilatoryrörelser avsevärt förbättrar bildens stabilitet, minskar den uttalat antalet ramar som ingår i beräkningen av standardavvikelsen för signalintensitet vilket leder till en minskning av signal-till-brus-förhållandet (jämför figur 4E med figur 2C och figur 2I ). Denna effekt lindras med hjälp av prospektiv gating vid ultraljudsskannern, där bilddata endast förvärvas när djuret är i önskad andningsfas. Detta medför dock en markant ökning av förvärvstiden om önskat antal ramar ≥1000 måste förvärvas.
Vi ser flera tillämpningar inom zoologiska och veterinär forskning för flödesförbättrade ultraljud arbetsflödet för att kartlägga fysiologi och anatomi av ögats vaskulatur. Vaskulaturen av ray-finned fiskar, däggdjur och fåglar är relativt väl beskrivna1,3,4,8,9,12,15,40, men detta är inte fallet för icke-beniga fiskar (käklösa ryggradsdjur och chondrichthyans), amfibier och reptiler, som representerar sina respektive tidigare divergerande systergrupper. Implementering av flödesförbättrad ultraljud på dessa dåligt förstådda djurgrupper och integrera dessa data med kunskap om de mer välstudier grupper kommer att ge grundläggande inblick i utvecklingen av vaskulaturen i ryggradsdjuret ögat. Eftersom ögats vaskulatur är liknande i närbesläktade arter4, kommer sådan detaljerad information om okulär vaskulatur i ett brett spektrum av arter att ge en referenspunkt för veterinärer för att identifiera missbildningar i ögats vaskulatur på grund av utvecklingsdefekter, sjukdomar eller fysiska skador. Dessutom ger förmågan att förvärva 2D-blodflödesinformation med en hög spatiotemporal upplösning medel för att kvantifiera farmakokinetiska effekter på blodflödesfördelningen i djupa kärlbäddar, med stora tillämpningar inom läkemedelsutveckling och testning. Framtida studier på denna teknik bör fokusera på att identifiera injicerbara föreningar som förbättrar kontrasten av blod hos arter med enucleated röda blodkroppar, vilket kommer att utöka tillämpligheten av denna teknik till däggdjur med stora tillämpningar inom biomedicinsk forskning och klinisk diagnostik av vaskulär dysfunktion i ögat och andra djupa vaskulär sängar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några slutförande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har fått finansiering från Carlsbergstiftelsen (CF17-0778; CF18-0658), Lundbeckstiftelsen (R324-2019-1470; R346-2020-1210), Veluxstiftelserna (00022458), A.P. Møller Foundation for the Advancement of Medical Science, Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt Marie Skłodowska-Curie-stipendieavtalet (nr 754513) och Århus universitets forskningsstiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-222 | Sigma | E10521-50G | |
| Benzocaine | Sigma | E-1501 | |
| Propofol | B Braun | 12260470_0320 |
|
| Alfaxalon | Jurox | NA | |
| Isoflurane | Zoetis | 50019100 | |
| Ultrasound scanner | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
- Yu, C. Q., Schwab, I. R., Dubielzig, R. R. Feeding the vertebrate retina from the Cambrian to the Tertiary. Journal of Zoology. 278 (4), 259-269 (2009).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 175-208 (2001).
- Country, M. W. Retinal metabolism: A comparative look at energetics in the retina. Brain Research. 1672, 50-57 (2017).
- Damsgaard, C., et al. Retinal oxygen supply shaped the functional evolution of the vertebrate eye. Elife. , 8 (2019).
- Buttery, R. G., Hinrichsen, C. F. L., Weller, W. L., Haight, J. R. How thick should a retina be? A comparative study of mammalian species with and without intraretinal vasculature. Vision Research. 31 (2), 169-187 (1991).
- Ames, A., Li, Y., Heher, E., Kimble, C. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Chase, J. The Evolution of retinal vascularization in mammals: A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
- Johnson, G. L. Ophthalmoscopic studies on the eyes of mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 254 (794), 207-220 (1968).
- Johnson, G. L. I. Contributions to the comparative anatomy of the mammalian eye, chiefly based on ophthalmoscopic examination. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 194 (194-206), 1-82 (1901).
- Rodriguez-Ramos Fernandez, J., Dubielzig, R. R. Ocular comparative anatomy of the family Rodentia. Veterinary Ophthalmology. 16, 94-99 (2013).
- Copeland, D. E.
- Meyer, D. B. The Visual System in Vertebrates. Handbook of Sensory Physiology. Crescitelli, F. 7, Springer. Berlin, Heidelberg. (1977).
- Potier, S., Mitkus, M., Kelber, A. Visual adaptations of diurnal and nocturnal raptors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 106, 116-126 (2020).
- Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. Active secretion of oxygen into the eye of fish. Nature. 194, 106-107 (1962).
- Damsgaard, C. Physiology and evolution of oxygen secreting mechanism in the fisheye. Comparative Biochemistry and Physiology. 252, 110840 (2021).
- Damsgaard, C., et al. A novel acidification mechanism for greatly enhanced oxygen supply to the fish retina. Elife. 9, (2020).
- Wittenberg, J. B., Haedrich, R. L. The choroid rete mirabile of the fish eye. II. Distribution and relation to the pseudobranch and to the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 137-156 (1974).
- Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. The choroid rete mirabile of the fish eye. I. Oxygen secretion and structure: comparison with the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 116-136 (1974).
- Berenbrink, M. Historical reconstructions of evolving physiological complexity: O2 secretion in the eye and swimbladder of fishes. Journal of Experimental Biology. 210, Pt 9 1641-1652 (2007).
- Berenbrink, M., Koldkjaer, P., Kepp, O., Cossins, A. R. Evolution of oxygen secretion in fishes and the emergence of a complex physiological system. Science. 307 (5716), 1752-1757 (2005).
- Keane, P. A., Sadda, S. R. Retinal imaging in the twenty-first century: State of the art and future directions. Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).
- Yung, M., Klufas, M. A., Sarraf, D. Clinical applications of fundus autofluorescence in retinal disease. International Journal of Retina and Vitreous. 2 (1), 12 (2016).
- Ang, M., et al. Optical coherence tomography angiography: a review of current and future clinical applications. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (2), 237-245 (2018).
- Spaide, R. F., Koizumi, H., Pozonni, M. C. Enhanced depth imaging spectral-domain optical coherence tomography. American Journal of Ophthalmology. 146 (4), 496-500 (2008).
- Shen, Q., et al. Magnetic resonance imaging of tissue and vascular layers in the cat retina. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 23 (4), 465-472 (2006).
- Tan, G. X., Jamil, M., Tee, N. G., Zhong, L., Yap, C. H. 3D reconstruction of chick embryo vascular geometries using non-invasive high-frequency ultrasound for computational fluid dynamics studies. Annals of Biomedical Engineering. 43 (11), 2780-2793 (2015).
- Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ dynamics and fluid dynamics of the HH25 chick embryonic cardiac ventricle as revealed by a novel 4D high-frequency ultrasound imaging technique and computational flow simulations. Annals of Biomedical Engineering. 45 (10), 2309-2323 (2017).
- Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e57089 (2018).
- Jia, Y., et al. Split-spectrum amplitude-decorrelation angiography with optical coherence tomography. Optics Express. 20 (4), 4710-4725 (2012).
- Clarke, K. W., Trim, C. M., Trim, C. M. Veterinary Anaesthesia E-Book. , Elsevier Health Sciences. (2013).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. , Elsevier Science & Technology. (2015).
- West, G., Heard, D., Caulkett, N. Zoo Animal and Wildlife Immobilization and Anesthesia. , John Wiley & Sons, Inc. (2014).
- Lauridsen, H., Hansen, K., Nørgård, M. Ø, Wang, T., Pedersen, M. From tissue to silicon to plastic: three-dimensional printing in comparative anatomy and physiology. Royal Society Open Science. 3 (3), 150643 (2016).
- Lauridsen, H., et al. Inside out: Modern imaging techniques to reveal animal anatomy. PLoS One. 6 (3), 17879 (2011).
- Ruthensteiner, B., Heß, M. Embedding 3D models of biological specimens in PDF publications. Microscopy Research and Technique. 71 (11), 778-786 (2008).
- Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep vascular imaging in the eye with flow-enhanced ultrasound. bioRxiv. , 447055 (2021).
- Mueller, R. L., Ryan Gregory, T., Gregory, S. M., Hsieh, A., Boore, J. L. Genome size, cell size, and the evolution of enucleated erythrocytes in attenuate salamanders. Zoology. 111 (3), 218-230 (2008).
- Greis, C. Quantitative evaluation of microvascular blood flow by contrast-enhanced ultrasound (CEUS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 49, 137-149 (2011).
- Urs, R., Ketterling, J. A., Tezel, G., Silverman, R. H. Contrast-enhanced plane-wave ultrasound imaging of the rat eye. Experimental Eye Research. 193, 107986 (2020).
- Walls, G. L. The vertebrate eye and its adaptive radiation. , Cranbrook Institute of Science. Michigan. (1942).
