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Biochemistry

एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके siRNA-लोडेड लिपिड नैनोकणों का उत्पादन

Published: March 22, 2022 doi: 10.3791/62999
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3, 1, 1, 1
1Division of Applied Chemistry, Faculty of Engineering, Hokkaido University, 2JST PRESTO, 3Graduate School of Chemical Sciences and Engineering, Hokkaido University

Summary

माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित लिपिड नैनोपार्टिकल (एलएनपी) उत्पादन विधियों ने आरएनए वितरण सहित दवा वितरण प्रणालियों (डीडीएस) में ध्यान आकर्षित किया है। यह प्रोटोकॉल निर्माण, LNP (siRNA-लोडेड LNP) उत्पादन, और LNP मूल्यांकन प्रक्रियाओं का वर्णन करता है जो iLiNP नामक हमारे मूल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करता है।

Abstract

कार्यात्मक लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) का विकास दवा वितरण प्रणालियों (डीडीएस) के क्षेत्र में प्रमुख चुनौतियों में से एक है। हाल ही में, एलएनपी-आधारित आरएनए वितरण प्रणालियों, अर्थात्, आरएनए-लोडेड एलएनपी ने आरएनए थेरेपी के लिए ध्यान आकर्षित किया है। विशेष रूप से, एमआरएनए-लोडेड एलएनपी टीकों को कोविड -19 को रोकने के लिए अनुमोदित किया गया था, जिससे अगली पीढ़ी के नैनोमेडिसिन के विकास की दिशा में प्रतिमान बदलाव हुआ। एलएनपी-आधारित नैनोमेडिसिन के लिए, एलएनपी आकार एलएनपी बायोडिस्ट्रिब्यूशन और एलएनपी प्रदर्शन को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। इसलिए, एक सटीक एलएनपी आकार नियंत्रण तकनीक एलएनपी उत्पादन प्रक्रिया के लिए अपरिहार्य है। यहां, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके आकार नियंत्रित एलएनपी उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं, जिसका नाम iLiNP है। siRNA लोड किए गए LNPs भी iLiNP डिवाइस का उपयोग करके उत्पादित किए जाते हैं और इन विट्रो प्रयोग द्वारा मूल्यांकन किए जाते हैं। प्रतिनिधि परिणामों को LNP आकार के लिए दिखाया गया है, जिसमें siRNA-लोडेड LNPs, Z-potential, siRNA encapsulation efficiency, cytotoxicity और target gene silencing activity शामिल हैं।

Introduction

लिपिड नैनोपार्टिकल (एलएनपी) आरएनए वितरण प्रणालियों के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले नैनोकैरियरों में से एक है। हाल ही में, एमआरएनए-लोडेड एलएनपी को कोविड-191,2,3 की रोकथाम के लिए टीके के रूप में अनुमोदित किया गया है। आम तौर पर, एलएनपी का आकार बायोडिस्ट्रिब्यूशन और ड्रग डिलीवरी सिस्टम (डीडीएस) के प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें जीन साइलेंसिंग या प्रोटीन अभिव्यक्ति 4,5,6 शामिल है। इसलिए, LNP उत्पादन प्रक्रिया के लिए एक सटीक LNP आकार नियंत्रण विधि की आवश्यकता है।

आकार नियंत्रित एलएनपी के उत्पादन के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों ने वर्षों से ध्यान आकर्षित किया है7। 2018 में, पहला खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) - अनुमोदित siRNA-लोडेड एलएनपी (जैसे, Onpattro) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 8,9 का उपयोग करके विकसित किया गया था। माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित एलएनपी उत्पादन विधि में, एक लिपिड समाधान और एक जलीय समाधान को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में अलग-अलग पेश किया जाता है, और फिर माइक्रोचैनल में मिलाया जाता है। मिश्रण दक्षता को बढ़ाने के लिए, अराजक मिक्सर डिवाइस का उपयोग LNP उत्पादन 10,11,12 के लिए किया गया है। अराजक मिक्सर डिवाइस विशिष्ट आकार के एलएनपी का उत्पादन करना संभव बनाता है।

एक साधारण माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस, जिसे इनवेसिव लिपिड नैनोपार्टिकल उत्पादन (iLiNP) नाम दिया गया है, जो चकरा संरचनाओं से सुसज्जित है, एलएनपी आकार को ठीक से नियंत्रित करने के लिए विकसित किया गया है13,14। अराजक मिक्सर डिवाइस की तुलना में, iLiNP डिवाइस 10 एनएम अंतराल पर 20 से 100 एनएम तक के एलएनपी आकार को नियंत्रित करने में सक्षम था। इसके अलावा, iLiNP डिवाइस ने siRNA-लोडेड LNPs6, mRNA-लोडेड LNPs15, राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन-लोडेड LNPs16, और एक्सोसोम-जैसे LNPs17 का उत्पादन किया। इस पेपर का उद्देश्य iLiNP डिवाइस के निर्माण और siRNA-लोडेड LNP उत्पादन प्रक्रिया को पेश करना और iLiNP डिवाइस द्वारा उत्पादित LNP मूल्यांकन प्रक्रिया का वर्णन करना है।

Protocol

1. iLiNP डिवाइस का निर्माण

नोट:: iLiNP डिवाइस मानक नरम लिथोग्राफी विधि 18 का उपयोग कर गढ़ा गया है। विस्तृत निर्माण प्रोटोकॉल पहले 10,13 की सूचना दी गई थी।

  1. SU-8 मोल्ड निर्माण
    1. एक 3 इंच सिलिकॉन वेफर पर SU-8 3050 डालो. स्पिन कोट सिलिकॉन वेफर एक 100 μm मोटी SU-8 परत प्राप्त करने के लिए.
    2. सिलिकॉन वेफर को 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 45 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक हॉटप्लेट पर रखकर बेक करें।
    3. बेकिंग के बाद, सिलिकॉन वेफर को डेस्कटॉप मास्कलेस लिथोग्राफी सिस्टम के चरण पर रखें।
    4. सिलिकॉन वेफर को यूवी प्रकाश में 365 एनएम पर 1.5 एस प्रति एक स्थिति के लिए उजागर करें।
      नोट:: इस प्रयोग में एक डेस्कटॉप मास्कलेस लिथोग्राफी सिस्टम का उपयोग किया गया था। सिस्टम स्वचालित रूप से माइक्रोचैनल के एक विभाजित विकिरण क्षेत्र (एक स्थिति) पर यूवी प्रकाश को उजागर करता है।
    5. यूवी विकिरण के बाद, 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर सिलिकॉन वेफर को बेक करें।
    6. सिलिकॉन वेफर को ठंडा करें, और फिर अप्रकाशित एसयू -8 को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए एक एसयू -8 डेवलपर में भिगोएं।
    7. एक desiccator और वैक्यूम पंप का उपयोग कर Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane के SU-8 मोल्ड withvapor का इलाज करें।
  2. iLiNP डिवाइस का निर्माण
    1. सिलिकॉन बेस और polydimethylsiloxane (PDMS) इलाज एजेंट को 10: 1 अनुपात (डब्ल्यू / डब्ल्यू) में मिलाएं।
    2. एक वैक्यूम पंप और एक desiccator का उपयोग कर मिश्रण degas.
      नोट: PDMS कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर degassed था।
    3. 0.5 से 1 सेमी मोटाई तक 100 मिमी पेट्री डिश में SU-8 मोल्ड पर degassed PDMS डालें, इसके बाद 1 घंटे के लिए 80 °C पर एक ओवन में बेकिंग करें।
    4. मोल्ड को ठंडा करें, और फिर एक चिमटी का उपयोग करके SU-8 मोल्ड से PDMS सब्सट्रेट को छील लें।
    5. PDMS सब्सट्रेट में तीन छेद (0.5 मिमी) पंच करें। एक iLiNP डिवाइस बनाने के लिए एक ऑक्सीजन प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करके PDMS सब्सट्रेट और एक ग्लास स्लाइड को बॉन्ड करें ( चित्रा 1)13 देखें।
    6. तीन PEEK केशिकाओं (आईडी 0.3 मिमी, ओ.डी. 0.5 मिमी) को iLiNP डिवाइस के इनलेट्स और आउटलेट से कनेक्ट करें और एक सुपरग्लू के साथ इलाज करें।
      नोट: PEEK केशिकाओं की लंबाई समायोज्य है और प्रयोग पर निर्भर करता है।

2. लिपिड समाधान की तैयारी

  1. लिपिड / इथेनॉल समाधान तैयार करें: 13.4 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 10 mM 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 20 mM 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP), 5 mM 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-3-2-dimyristoyl-rac-glycero-3-3-20 mM-20m-2000 प्रयोग से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर करें।
  2. SIRNA-लोडेड LNPs का उत्पादन करने के लिए, DOTAP, DSPC, कोलेस्ट्रॉल, और DMG-PEG2k समाधानों को 50/10/38.5/1.5 के दाढ़ अनुपात में मिलाएं। कुल लिपिड एकाग्रता को 8 एमएम में समायोजित किया जाता है।

3. जलीय विलयनों की तैयारी

  1. जलीय समाधान तैयार करें: 154 mM NaCl (खारा), 25 mM एसीटेट बफर pH 4.0 पर DNase / RNase मुक्त आसुत जल का उपयोग कर।
  2. 0.2 μm आकार झिल्ली फिल्टर या सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर.

4. siRNA / बफर समाधान की तैयारी

  1. 25 mM एसीटेट बफर (pH 4.0) के 1 mL में siGL4 के 70 μg भंग।
    नोट: siGL4 लूसिफेरस जीन के नॉकडाउन के लिए उपयोग किया जाता है।

5. iLiNP डिवाइस की स्थापना और LNPs के उत्पादन

नोट:: schematics के लिए चित्र 1 देखें।

  1. लिपिड और जलीय समाधानों के साथ 1 एमएल ग्लास सिरिंज भरें (क्रमशः अलग-अलग सिरिंज में चरण 3.1 और 4.1 से)।
    नोट:: LNP मूल्यांकन प्रयोग के लिए आवश्यक राशि के आधार पर लिपिड और जलीय समाधान मात्रा समायोजित करें।
  2. सिरिंज कनेक्टर्स का उपयोग कर PEEK केशिकाओं के लिए ग्लास सिरिंज कनेक्ट करें।
  3. लिपिड और जलीय समाधानों की प्रवाह दर निर्धारित करें।
    नोट: लिपिड चरण के लिए जलीय चरण का प्रवाह दर अनुपात (FRR) 3: 1 से 9: 1 तक है।
  4. सिरिंज पंपों का उपयोग करके iLiNP डिवाइस में लिपिड और जलीय समाधानों को अलग से पेश करें।
  5. iLiNP डिवाइस (चित्रा 1) के आउटलेट से एक माइक्रोट्यूब में LNP निलंबन ले लीजिए।

6. LNP निलंबन और LNP आकार माप के डायलिसिस

  1. एक डायलिसिस झिल्ली (12-14 kDa मेगावाट cutoffs) का उपयोग करके LNP निलंबन को क्रमशः POPC LNPs और siRNA-लोडेड LNPs के लिए खारा या D-PBS के खिलाफ रात भर में 4 °C पर डायलाइज़ करें।
    नोट: POPC खारा में भंग नहीं है (कृपया 2.1 देखें). POPC /इथेनॉल समाधान iLiNP डिवाइस में खारा के साथ पतला है।
  2. microtubes में dialyzed LNP निलंबन ले लीजिए.
  3. एक माइक्रो क्वार्ट्ज सेल के लिए एलएनपी निलंबन के पिपेट 20-30 μL.
  4. गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (DLS) द्वारा LNP आकार, LNP आकार वितरण, और polydispersity सूचकांक को मापें।

7. LNP के Z-potential का मापन

नोट:: Z-potential के मापन के लिए, एक कण विश्लेषक ( सामग्री की तालिका देखें) निर्माता के निर्देश का पालन करते हुए उपयोग किया गया था।

  1. चरण 6.1 से प्राप्त LNP निलंबन को पतला करें, 10 mM HEPES बफर (pH 7.4) के साथ 35 बार।
  2. पिपेट 700 से 1000 μL एक केशिका कोशिका के लिए पतला LNP निलंबन के.
  3. निर्माता के निर्देश के अनुसार Z-potential को मापें।

8. राइबोग्रीन परख द्वारा siRNA encapsulation दक्षता

नोट: Ribogreen परख LNPs19 में siRNA encapsulation का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। Ribogreen परख के साथ / एक surfactant (जैसे, TritonX-100) के बिना LNPs के अंदर और बाहर आरएनए की मात्रा को माप सकते हैं.

  1. 10 mM HEPES बफर (pH 7.4) के साथ siGL4 के 2 mg/ mL को 500 ng/mL siGL4 समाधान के साथ पतला करें।
  2. Triton (+) और Triton (-) नमूनों के लिए अंशांकन वक्र बनाने के लिए siGL4 समाधान की तनुकरण श्रृंखला (0, 12.5, 25, 50, 100, 200 ng /mL) तैयार करें।
  3. 10 mM HEPES बफर (pH 7.4) के साथ LNP निलंबन 100 बार पतला करें।
  4. ट्राइटन (+) समाधान के लिए निम्नलिखित मिश्रण करें: 10 mM HEPES (pH 7.4) के 980 μL, 10% w / v TritonX-100 के 20 μL, और 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के 10 कुओं के लिए राइबोग्रीन के 1.25 μL।
  5. Triton (-) समाधान के लिए निम्नलिखित मिश्रण: 10 mM HEPES (pH 7.4) के 1000 μL और एक 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के 10 कुओं के लिए राइबोग्रीन के 1.25 μL।
  6. SiGL4 समाधान के कमजोर पड़ने की श्रृंखला के पिपेट 100 μL और एक काले 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के कुओं में पतला LNP निलंबन।
    नोट: siGL4 समाधान और पतला LNP निलंबन की कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रति शर्त चार microwells में वितरित किए गए थे।
  7. पिपेट 100 μL का पता लगाने के समाधान (TritonX-100 (+) या Triton (-)) कुओं में.
    नोट: डिटेक्शन समाधान (TritonX-100 (+)) प्रति शर्त प्रति नमूना दो कुओं में वितरित किया गया था, और TritonX-100 (-) समाधान प्रति नमूना स्थिति शेष दो कुओं में वितरित किया गया था।
  8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए माइक्रोप्लेट को इनक्यूबेट करें।
  9. 475 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें।
  10. निम्नलिखित समीकरण 19 से siRNA encapsulation दक्षता की गणना करें।
    Equation 1

9. सेल संस्कृति

  1. DMEM, गर्मी-निष्क्रिय 10% FBS, 100 U / mL पेनिसिलिन, 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 400 μg / mL G418 युक्त एक विकास माध्यम तैयार करें।
  2. संस्कृति HeLa कोशिकाओं stably firefly और रेनिला लूसिफेरस (HeLa-dluc) एक 100 मिमी टीसी-उपचारित सेल संस्कृति पकवान में व्यक्त एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर विकास माध्यम युक्त.

10. सेल व्यवहार्यता परख

  1. एक 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में विकास माध्यम (6 x 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में हेला कोशिकाओं के निलंबन के बीज 100 μL।
    नोट: कोशिकाओं को एक सेल काउंटर प्लेट और माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गिना गया था।
  2. एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट इनक्यूबेट करें।
  3. 10 और 100 nM siRNAs की सांद्रता पर DMEM (FBS (-)) के साथ siRNA-लोड एलएनपी को पतला करें।
  4. पतला siRNA-लोडेड LNP निलंबन प्रति अच्छी तरह से के 100 μL वितरित करें।
  5. एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट इनक्यूबेट करें।
  6. LNP निलंबन निकालें और DMEM (FBS (+)) के 100 μL जोड़ें।
  7. एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट इनक्यूबेट करें।
  8. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता को मापें।
    नोट: D-PBS (-) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था।

11. लूसिफेरस जीन नॉकडाउन परख

  1. एक 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में विकास माध्यम (4.5 x 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में हेला कोशिकाओं के निलंबन के बीज 75 μL।
  2. एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट इनक्यूबेट करें।
  3. 10 और 100 nM siRNAs की सांद्रता पर DMEM (FBS (-)) के साथ siRNA-लोड एलएनपी को पतला करें।
  4. पतला siRNA-लोडेड LNP निलंबन प्रति एक अच्छी तरह से 75 μL वितरित करें।
  5. एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट इनक्यूबेट करें।
  6. LNP निलंबन निकालें और DMEM (FBS (+)) के 75 μL जोड़ें।
  7. एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट इनक्यूबेट करें।
  8. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके लूसिफेरस अभिव्यक्ति को मापें।
    नोट: हमने नकारात्मक नियंत्रण के रूप में डी-पीबीएस (-) का उपयोग किया।

Representative Results

चित्रा 2A, B विभिन्न प्रवाह स्थितियों में उत्पादित POPC LNP आकार वितरण को दर्शाता है। माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित एलएनपी तैयारी विधि कुल प्रवाह दर (टीएफआर) और एफआरआर जैसी प्रवाह स्थितियों द्वारा एलएनपी के आकार को नियंत्रित कर सकती है। अराजक मिक्सर डिवाइस और फ्लो-फोकसिंग माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस सहित ठेठ माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की तुलना में, iLiNP डिवाइस ने 20 से 100 एनएम (चित्रा 2) तक के सटीक एलएनपी आकार नियंत्रण को सक्षम किया। छोटे आकार के एलएनपी उच्च कुल प्रवाह दर की स्थिति में बनते हैं। इसके अलावा, 5 के एफआरआर पर गठित एलएनपी आकार 3 के एफआरआर की तुलना में छोटे थे, कुल प्रवाह दर 13 की परवाह किए बिना।

siRNA-लोडेड LNPs को iLiNP डिवाइस (चित्रा 3A) का उपयोग करके भी तैयार किया गया था। SIRNA-लोडेड LNP तैयारी के लिए, DOTAP, एक कैटिओनिक लिपिड, का उपयोग LNPs में siRNA को प्रभावी ढंग से encapsulate करने के लिए किया गया था। iLiNP डिवाइस ने संकीर्ण वितरण (चित्रा 3A, B) के साथ 90 एनएम आकार के siRNA-लोडेड कैटिओनिक LNPs का उत्पादन किया। सीआरएनए एनकैप्सुलेशन दक्षता 95% थी क्योंकि कैटिओनिक लिपिड और नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए siRNAs (चित्रा 3 C) के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के कारण।

Cytotoxicity और 90 nm आकार के siRNA-लोडेड LNPs की जीन मौन गतिविधि का मूल्यांकन किया गया था जैसा कि चित्र 4 और चित्रा 5 में दिखाया गया है। siRNA-लोडेड LNPs ने 10 और 100 nM siRNA की खुराक पर साइटोटॉक्सिसिटी दिखाई। हमने यह भी पुष्टि की कि siRNA एकाग्रता के आधार पर लूसिफेरस की अभिव्यक्ति का स्तर कम हो गया था। siRNA-लोडेड LNPs ने 100 nM siRNA की खुराक पर 80% लूसिफेरस अभिव्यक्ति को दबा दिया। जीन मौन गतिविधि पर एलएनपी आकार का प्रभाव पहले 6,13,17 बताया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: (ए) योजनाबद्ध चित्रण और (बी) iLiNP डिवाइस की तस्वीर। iLiNP डिवाइस में PDMS और ग्लास सब्सट्रेट शामिल हैं। iLiNP डिवाइस एक superglue के साथ PEEK केशिकाओं से जुड़ा हुआ है। लिपिड और siRNA / बफर समाधान अलग से सिरिंज पंपों का उपयोग करके iLiNP डिवाइस में पेश किए जाते हैं। LNP निलंबन एक माइक्रोट्यूब में एकत्र किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: POPC LNP आकार वितरण iLiNP डिवाइस द्वारा विभिन्न प्रवाह दर अनुपात (FRR) पर उत्पादित। POPC LNP आकार को गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (DLS) द्वारा मापा जाता है। POPC LNPs कुल प्रवाह दर और FRR को बदलकर तैयार किए जाते हैं: (A) 3 FRR और (B) 5 FRR। छोटे आकार के एलएनपी उच्च कुल प्रवाह दर की स्थिति में बनते हैं। इसके अलावा, 5 के एफआरआर पर गठित एलएनपी आकार 3 के एफआरआर की तुलना में छोटे थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: siRNA-लोडेड LNPs का लक्षण वर्णन। (A) siRNA-लोडेड LNPs का आकार वितरण siRNAs (siGL4) को LNPs में कैटिओनिक लिपिड (DOTAP) और नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए siRNAs के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन द्वारा encapsulated किया जाता है। (बी) siRNA-लोडेड LNPs की Z-potential। एलएनपी निलंबन को माप से पहले 10 एमएम HEPES बफर (पीएच 7.4) के साथ पतला किया गया था। डेटा को माध्य ± एसडी (मानक विचलन) के रूप में दर्शाया जाता है। n = 3. (ग) डीओटीएपी-आधारित एलएनपी की सीआरएनए एनकैप्सुलेशन दक्षता। encapsulation दक्षता राइबोग्रीन परख द्वारा निर्धारित किया गया था. डेटा को माध्य के रूप में दर्शाया जाता है ± SD. n = 3. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: siRNA-लोडेड LNPs की साइटोटॉक्सिसिटी। siRNA-लोडेड LNPs को DMEM (FBS (-)) के साथ पतला किया गया था ताकि 10 और 100 nM की siGL4 सांद्रता प्राप्त की जा सके। एलएनपी निलंबन को हेला-डीएलयूक कोशिकाओं में जोड़ा जाता है और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। N.T.: गैर-उपचारित (D-PBS(-)). डेटा को SD. n = 3 ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: लूसिफेरस जीन नॉकडाउन गतिविधि siRNA-लोडेड LNPs के साथ इलाज किया जाता है। siRNA-लोडेड LNPs सेल व्यवहार्यता परख के रूप में एक ही तरीके से तैयार कर रहे हैं। लूसिफेरस अभिव्यक्ति स्तर को दोहरी-ग्लो लूसिफेरस परख प्रणाली का उपयोग करके मापा जाता है। N.T.: गैर-उपचारित (D-PBS(-)). डेटा को माध्य के रूप में दर्शाया जाता है ± SD. n = 3. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

LNP आकार LNP biodistribution, विरोधी ट्यूमर प्रभाव, और जीन मौन प्रदर्शन को प्रभावित करता है। इसलिए, एलएनपी आकार नियंत्रण विधि आरएनए वितरण प्रणालियों सहित डीडीएस नैनोमेडिसिन के उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। इस पेपर का उद्देश्य LNPs के सटीक आकार ट्यूनिंग के लिए iLiNP डिवाइस पेश करना है और siRNA-लोडेड LNPs उत्पादन के लिए इसके आवेदन। iLiNP डिवाइस LNP आकार को नियंत्रित करने में सक्षम था जो 20 से 100 एनएम (चित्रा 2) 13 तक था। जब प्रवाह की स्थिति, जैसे कि कुल प्रवाह दर और एफआरआर को एलएनपी आकार को नियंत्रित करने के लिए बदल दिया जाता है, तो समाधान प्रवाह को स्थिर करने के लिए एलएनपी निलंबन को लगभग 5 से 10 सेकंड के बाद एकत्र किया जाना चाहिए। ILiNP डिवाइस के आउटलेट से एकत्र किए गए LNP निलंबन को इथेनॉल को हटाने और LNP एकत्रीकरण को रोकने के लिए बफर समाधान के खिलाफ तुरंत डायलाइज़ किया गया था।

एलएनपी आकार नियंत्रण डीडीएस के क्षेत्र में प्रमुख चुनौतियों में से एक है। आम तौर पर, पारंपरिक एलएनपी उत्पादन प्रक्रिया, जैसे कि लिपिड फिल्म जलयोजन विधि, को एलएनपी प्रोडक्शन 20 के बाद एक आकार ट्यूनिंग प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित एलएनपी उत्पादन विधि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 6,11,13 में लिपिड और जलीय समाधानों को पेश करके आकार-नियंत्रित एलएनपी का उत्पादन कर सकती है। यद्यपि एलएनपी निलंबन से इथेनॉल को हटाने के लिए डायलिसिस प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, स्पर्शरेखा प्रवाह प्रणाली के साथ मिलकर माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस द्वारा एक निरंतर प्रक्रिया एलएनपी उत्पादन प्रक्रिया 14 के स्वचालन का वादा करती है। साहित्य के अनुसार, POPC LNP आकार 50-60 एनएम और 30-60 एनएम थे, प्रवाह-केंद्रित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 21 और अराजक मिक्सर डिवाइस के लिए, क्रमशः 10। अन्य माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की तुलना में, iLiNP डिवाइस POPC LNP आकार नियंत्रण को 20 से 100 एनएम तक एक विस्तृत श्रृंखला में सक्षम बनाता है।

नियोजित iLiNP डिवाइस की निर्माण प्रक्रिया मानक नरम लिथोग्राफी थी। इस प्रकार, iLiNP डिवाइस को तेजी से प्रोटोटाइप तकनीक द्वारा बड़े पैमाने पर उत्पादित किया जा सकता है और डिस्पोजेबल डिवाइस का उपयोग करके समाधानों के क्रॉस-संदूषण को रोका जा सकता है। iLiNP डिवाइस POPC LNP उत्पादन विधि के रूप में उसी तरह से siRNA-लोड किए गए LNPs का उत्पादन कर सकता है। ILiNP डिवाइस का उपयोग कर LNP उत्पादन विधि के लिए, उपयोगकर्ता किसी भी जटिल कार्यविधियों की आवश्यकता नहीं है। इन कारणों से, iLiNP डिवाइस सहित माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित LNP उत्पादन विधि को मानक LNP उत्पादन विधि के रूप में नियोजित किए जाने की उम्मीद की जाएगी। इस पेपर के प्रोटोकॉल को एलएनपी उत्पादन के लिए अन्य माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, mRNA-लोडेड LNPs का उत्पादन भी siRNA/buffer समाधान को mRNA युक्त बफर समाधान में बदलकर सक्षम किया जाता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को JST, CREST अनुदान संख्या JPMJCR17H1, जापान, JST, PRESTO अनुदान संख्या JPMJPR19K8, जापान, JST, SCORE, जापान, शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से विशेष शिक्षा और अनुसंधान व्यय, JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP19KK0140, और Iketani विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) NOF Corp. MC-6081
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2K) NOF Corp. GM-020
1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP) NOF Corp. CL-8181TA
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinev (DSPC) NOF Corp. MC-8080
10 x D-PBS (-) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 048-29805
Acetic acid FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 017-00251
CellTiter-Blue Cell Viability Assay Promega G8081
cholesterol Sigma-Aldrich C8667-5G
Desktop maskless lithography system NEOARK CORPORATION DDB-701-DL4
Dialysis membrane Repligen 132697
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Lot: 42G6587K
G418 Nacalai Tesque 08973-14
Glass substrate Matsunami Glass Ind., Ltd. S1111
Glass syringe Hamilton GASSTIGHT 1002
HeLa cell HeLa-dluc cells were provided from Dr. Yusuke Sato at Hokkaido University
HEPES FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 342-01375
Low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Sigma-Aldrich D6046-500ML
Oxygen plasma cleaner Femto Science CUTE-1MP/R
Penicillin–streptomycin, trypsin (2.5%) Thermo Fisher Scientific 15140122
Quant-iT RiboGreen RNA Reagent Thermo Fisher Scientific R11491
siGL4 Hokkaido System Science Co., Ltd The sense and antisense strand sequences of siGL4 are 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT
-3' and 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT
-3', respectively.
Silicon wafer GTC
SILPOT 184 W/C (PDMS) Dow Corning Toray Co., Ltd. silicone base and curing agent are included
Sodium acetate FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 192-01075
Sodium chloride FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 191-01665
SU-8 3050 Nippon Kyaku Co., Ltd.
Syringe connector Institute of microchemical Technology Co., Ltd. ISC-011
Syringe pump Chemyx CX07200
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
TritonX-100 Nacalai Tesque 35501-15
UltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific 10977015
Zetasizer Nano ZS  Malvern Instruments ZEN3600

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References

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जैव रसायन अंक 181
एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके siRNA-लोडेड लिपिड नैनोकणों का उत्पादन
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Maeki, M., Okada, Y., Uno, S., Niwa, … More

Maeki, M., Okada, Y., Uno, S., Niwa, A., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. Production of siRNA-Loaded Lipid Nanoparticles using a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (181), e62999, doi:10.3791/62999 (2022).

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