Summary
Mikrofluidbaserte lipid nanopartikkelproduksjonsmetoder (LNP) har vakt oppmerksomhet i legemiddelleveringssystemer (DDS), inkludert RNA-levering. Denne protokollen beskriver fabrikasjon, LNP (siRNA-lastet LNP) produksjon, og LNP evalueringsprosesser ved hjelp av vår opprinnelige mikrofluidiske enhet kalt iLiNP.
Abstract
Utviklingen av funksjonelle lipid nanopartikler (LNPer) er en av de største utfordringene innen legemiddelleveringssystemer (DDS). Nylig har LNP-baserte RNA-leveringssystemer, nemlig RNA-lastede LNPer, tiltrukket seg oppmerksomhet for RNA-terapi. Spesielt ble mRNA-ladede LNP-vaksiner godkjent for å forhindre COVID-19, og førte dermed til paradigmeskiftet mot utviklingen av neste generasjon nanomedisiner. For LNP-baserte nanomedisiner er LNP-størrelsen en betydelig faktor for å kontrollere LNP biodistribusjon og LNP-ytelse. Derfor er en presis LNP-størrelseskontrollteknikk uunnværlig for LNP-produksjonsprosessen. Her rapporterer vi en protokoll for størrelseskontrollert LNP-produksjon ved hjelp av en mikrofluidisk enhet, kalt iLiNP. siRNA-lastede LNPer produseres også ved hjelp av iLiNP-enheten og evalueres ved in vitro-eksperiment . Representative resultater vises for LNP-størrelsen, inkludert siRNA-lastede LNPer, Z-potensial, siRNA-innkapslingseffektivitet, cytotoksisitet og målgenaktiveringsaktivitet.
Introduction
Lipid nanopartikkel (LNP) er en av de mest brukte nanokarrierene for RNA-leveringssystemer. Nylig har mRNA-lastede LNPer blitt godkjent som vaksiner for forebygging av COVID-191,2,3. Generelt spiller størrelsen på LNP en avgjørende rolle i ytelsen til biodistribusjon og legemiddelleveringssystemer (DDS), inkludert genaktivering eller proteinuttrykk4,5,6. Derfor kreves en presis LNP-størrelseskontrollmetode for LNP-produksjonsprosessen.
For produksjon av størrelseskontrollerte LP-er har mikrofluidiske enheter tiltrukket seg oppmerksomhet gjennom årene7. I 2018 ble den første Food and Drug Administration (FDA)-godkjente siRNA-lastede LNPer (f.eks. Onpattro) utviklet ved hjelp av mikrofluidisk enhet8,9. I den mikrofluidbaserte LNP-produksjonsmetoden introduseres en lipidløsning og en vandig løsning separat i mikrofluidisk enhet, og blandes deretter i mikrokanal. For å forbedre blandeeffektiviteten har den kaotiske mikserenheten blitt brukt til LNP-produksjonen10,11,12. Den kaotiske mikserenheten gjør det mulig å produsere LNPer i spesifikk størrelse.
En enkel mikrofluidisk enhet, kalt invasiv lipid nanopartikkelproduksjon (iLiNP), utstyrt med hvelvstrukturer, er utviklet for å kontrollere LNP-størrelsen nøyaktig13,14. Sammenlignet med den kaotiske mikserenheten, var iLiNP-enheten i stand til å kontrollere LNP-størrelsen varierte fra 20 til 100 nm med 10 nm intervaller. I tillegg produserte iLiNP-enheten siRNA-lastet LNPs6, mRNA-lastet LNPs15, ribonucleoprotein-lastet LNPs16 og exosome-lignende LNPs17. Målet med dette dokumentet er å introdusere fabrikasjons- ogsiRNA-lastet LNP-produksjonsprosess av iLiNP-enheten og beskrive LNP-evalueringsprosessen produsert av iLiNP-enheten.
Protocol
1. Fabrikasjon av iLiNP-enheten
MERK: iLiNP-enheten fremstilles ved hjelp av standard soft lithography-metoden18. Den detaljerte fabrikasjonsprotokollen ble rapportert tidligere10,13.
- SU-8 mugg fabrikasjon
- Hell SU-8 3050 på en 3-tommers silisiumskive. Spin frakk silisiumskiven for å oppnå et 100 μm tykt SU-8-lag.
- Stek silisiumskiven ved å sette på en kokeplate ved 65 °C i 5 minutter og 95 °C i 45 minutter.
- Etter baking, plasser silisiumskiven på scenen av et stasjonært maskeløst litografisystem.
- Utsett silisiumskiven for UV-lys ved 365 nm i 1,5 s per posisjon.
MERK: Et desktop maskless litografisystem ble brukt i dette eksperimentet. Systemet eksponerer automatisk UV-lys på et delt bestrålingsområde (en posisjon) av mikrokanal. - Etter UV-bestråling, stek silisiumskiven på varmeplaten ved 65 °C i 1 min og 95 °C i 5 minutter.
- Avkjøl silisiumskiven, og suge deretter inn en SU-8-utvikler i 15 minutter for å fjerne ueksponert SU-8.
- Behandle SU-8-formen med trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan ved hjelp av en tørke- og vakuumpumpe.
- Fabrikasjon av iLiNP-enheten
- Bland silikonbasen og PDMS-herdemiddelet (polydimetylsiloksan) i et 10:1-forhold (m/w).
- Degas blandingen ved hjelp av en vakuumpumpe og en desiccator.
MERK: PDMS ble avgasset ved hjelp av en vakuumpumpe i 10 minutter ved romtemperatur. - Hell avgassede PDMS på SU-8-formen i en 100 mm Petri-tallerken opp til 0,5 til 1 cm tykkelse, etterfulgt av baking i en ovn ved 80 °C i 1 time.
- Avkjøl formen, og skrell deretter PDMS-substratet fra SU-8-formen ved hjelp av en pinsett.
- Hull tre hull (0,5 mm) i PDMS-substratet. Bind PDMS-substratet og et glasssklie ved hjelp av en oksygenplasmarenser for å bygge en iLiNP-enhet (se figur 1)13.
- Koble tre PEEK-kapillærer (I.D. 0,3 mm, O.D. 0,5 mm) til innløpene og utløpet til iLiNP-enheten og herd med en superlim.
MERK: Lengden på PEEK-kapillærene er justerbar og avhenger av eksperimentet.
2. Utarbeidelse av lipidløsninger
- Forbered lipid/etanolløsninger: 13,4 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glysero-3-fosfocholin (POPC), 10 mM 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC), 20 mM 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propan (DOTAP), 5 mM 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-metoksypolyetylenglykol-2000 (DMG-PEG2k) og 20 mM kolesterol. Oppbevar lagerløsningene ved -20 °C før eksperimentet.
- For å produsere siRNA-lastede LNPer, bland DOTAP-, DSPC-, kolesterol- og DMG-PEG2k-løsninger med et molarforhold på 50/10/38,5/1,5. Den totale lipidkonsentrasjonen er justert til 8 mM.
3. Utarbeidelse av vandige løsninger
- Forbered vandige løsninger: 154 mM NaCl (saltvann), 25 mM acetatbuffer ved pH 4.0 ved hjelp av DNase/RNase-fritt destillert vann.
- Filtrer løsningene gjennom 0,2 μm membranfiltre eller sprøytefiltre.
4. Klargjøring av siRNA/bufferløsningen
- Løs opp 70 μg siGL4 i 1 ml 25 mM acetatbuffer (pH 4,0).
MERK: siGL4 brukes til nedslag av luciferase gen.
5. Oppsett av iLiNP-enheten og produksjon av LNPer
MERK: Se figur 1 for skjemaene.
- Fyll 1 ml glasssprøyter med lipid og vandige oppløsninger (fra henholdsvis trinn 3,1 og 4,1 i individuelle sprøyter).
MERK: Juster lipid- og vandig løsningsvolum avhengig av mengden som kreves for LNP-evalueringseksperimentet. - Koble glasssprøytene til PEEK-kapillærene ved hjelp av sprøytekontakter.
- Angi strømningshastigheten til lipid- og vandige løsninger.
MERK: Strømningshastighetsforholdet (FRR) for den vandige fasen til lipidfasen er varierte fra 3:1 til 9:1. - Introduser lipid- og vandige løsninger separat i iLiNP-enheten ved hjelp av sprøytepumper.
- Samle LNP-suspensjoner i et mikrorør fra utløpet til iLiNP-enheten (figur 1).
6. Dialyse av LNP suspensjon og LNP størrelsesmåling
- Dialyze LNP-suspensjonen ved hjelp av en dialysemembran (12-14 kDa MW cutoffs) ved 4 °C over natten mot henholdsvis saltvann eller D-PBS for POPC-LNPer og siRNA-lastede LNPer.
MERK: POPC er ikke oppløst i saltvann (se 2.1). POPC/etanoloppløsning fortynnes med saltvann i iLiNP-enheten. - Samle de dialyzed LNP suspensjoner i mikrorør.
- Pipette 20-30 μL av LNP-suspensjonen til en mikrokvartscelle.
- Mål LNP-størrelsen, LNP-størrelsesfordelingen og polydispersitetsindeksen ved dynamisk lysspredning (DLS).
7. Måling av Z-potensialet til LNP
MERK: For måling av Z-potensial ble en partikkelanalysator (se Materialfortegner) brukt i henhold til produsentens instruksjon.
- Fortynn LNP-suspensjonen oppnådd fra trinn 6.1, 35 ganger med 10 mM HEPES-buffer (pH 7.4).
- Pipette 700 til 1000 μL av den fortynnede LNP-suspensjonen til en kapillærcelle.
- Mål Z-potensialet i henhold til produsentens instruksjon.
8. siRNA innkapslingseffektivitet ved RiboGreen-analyse
MERK: Ribogreen-analysen utføres for å evaluere siRNA-innkapslingen i LNPs19. Ribogreen-analysen kan måle mengden RNAer i og utenfor LNPer med/uten overflateaktivt middel (f.eks. TritonX-100).
- Fortynn 2 mg/ml siGL4 med 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4) til 500 ng/ml siGL4-oppløsning.
- Forbered fortynningsserien (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/ml) siGL4-løsning for å lage en kalibreringskurve for Triton-prøver (+) og Triton-prøver (-).
- Fortynn LNP-fjæringen 100 ganger med 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4).
- Bland følgende for Triton (+)-løsning: 980 μL 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 μL 10 % m/v TritonX-100 og 1,25 μL RiboGreen for 10 brønner med en mikroplate på 96 brønner.
- Bland følgende for Triton (-) oppløsning: 1000 μL 10 mM HEPES (pH 7,4) og 1,25 μL RiboGreen for 10 brønner med en mikroplate på 96 brønner.
- Pipette 100 μL av fortynningsserien av siGL4-løsning og fortynnede LNP-suspensjoner i brønnene til en svart 96-brønns mikroplate.
MERK: Fortynningsserien av siGL4-oppløsning og fortynnede LNP-suspensjoner ble dispensert i fire mikrowells per tilstand. - Pipette 100 μL av deteksjonsløsningen (TritonX-100 (+) eller Triton (-)) inn i brønnene.
MERK: Deteksjonsløsningen (TritonX-100 (+)) ble dispensert i to brønner per prøve per tilstand, og TritonX-100 (-) oppløsningen ble dispensert i de resterende to brønnene per prøvetilstand. - Inkuber mikroplaten i 5 min ved romtemperatur.
- Mål fluorescensintensiteten ved hjelp av en mikroplateleser på en bølgelengde på 475 nm.
- Beregn siRNA-innkapslingseffektiviteten fra følgende ligning19.
9. Cellekultur
- Forbered et vekstmedium som inneholder DMEM, varmeinaktivert 10 % FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin og 400 μg/ml G418.
- Kultur HeLa-celler uttrykker stabilt firefly og Renilla luciferase (HeLa-dluc) i en 100 mm TC-behandlet cellekulturrett som inneholder vekstmediet ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
10. Celle levedyktighet analyse
- Frø 100 μL av en suspensjon av HeLa-celler i vekstmediet (6 x 103 celler / brønn) i en 96-brønns mikroplate.
MERK: Celler ble telt ved hjelp av en celletellerplate og et mikroskop. - Inkuber mikroplaten i 24 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Fortynn de siRNA-lastede LNPene med DMEM (FBS (-)) ved konsentrasjonene på 10 og 100 nM siRNAer.
- Dispenser 100 μL av den fortynnede siRNA-ladde LNP-suspensjonen per brønn.
- Inkuber mikroplaten i 4 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Fjern LNP-suspensjonen og tilsett 100 μL DMEM (FBS (+)).
- Inkuber mikroplaten i 20 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Mål celle levedyktigheten ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett i henhold til produsentens protokoll.
MERK: D-PBS (-) ble brukt som negativ kontroll.
11. Luciferase gen knockdown analyse
- Frø 75 μL av en suspensjon av HeLa-celler i vekstmediet (4,5 x 103 celler/brønn) i en 96-brønns mikroplate.
- Inkuber mikroplaten i 24 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Fortynn de siRNA-lastede LNPene med DMEM (FBS (-)) ved konsentrasjonene på 10 og 100 nM siRNAer.
- Dispenser 75 μL av den fortynnede siRNA-lastede LNP-suspensjonen per en brønn.
- Inkuber mikroplaten i 4 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Fjern LNP-suspensjonen og tilsett 75 μL DMEM (FBS (+)).
- Inkuber mikroplaten i 20 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Mål luciferaseuttrykket ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett i henhold til produsentens protokoll.
MERK: Vi brukte D-PBS (-) som negativ kontroll.
Representative Results
Figur 2A,B viser POPC LNP-størrelsesfordelingen produsert ved ulike strømningsforhold. Den mikrofluidbaserte LNP-tilberedningsmetoden kan kontrollere størrelsen på LNPer etter strømningsforholdene som den totale strømningshastigheten (TFR) og FRR. Sammenlignet med de typiske mikrofluidiske enhetene, inkludert den kaotiske mikserenheten og den strømningsfokuserende mikrofluidiske enheten, aktiverte iLiNP-enheten presis LNP-størrelseskontroll fra 20 til 100 nm (figur 2). Små LNPer dannet ved høye totale strømningshastighetsforhold. I tillegg var LNP-størrelsene som ble dannet ved FRR på 5 mindre enn frr av 3, uavhengig av den totale strømningshastigheten13.
siRNA-lastede LNPer ble også klargjort ved hjelp av iLiNP-enheten (figur 3A). For siRNA-lastet LNP-forberedelse ble DOTAP, en kationisk lipid, brukt til å innkapsle siRNA i LNP-ene effektivt. iLiNP-enheten produserte siRNA-lastede Kationic LNPer i 90 nm størrelse med smal fordeling (figur 3A,B). SiRNA-innkapslingseffektiviteten var 95% på grunn av den elektrostatiske interaksjonen mellom kationisk lipid og negativt ladede siRNAer (figur 3C).
Cytotoksisitet og genaktiveringsaktiviteten til 90 nm størrelse siRNA-lastede LNPer ble evaluert som vist i figur 4 og figur 5. siRNA-lastede LNPer viste cytotoksisitet i en dose på 10 og 100 nM siRNA. Vi bekreftet også at uttrykksnivået for luciferase ble redusert avhengig av siRNA-konsentrasjonen. De siRNA-lastede LNP-ene undertrykte 80% luciferaseuttrykk i en dose på 100 nM siRNA. Effekten av LNP-størrelse på genaktiveringsaktiviteten ble rapportert tidligere6,13,17.
Figur 1: (A) Skjematisk illustrasjon og (B) fotografi av iLiNP-enheten. iLiNP-enheten består av PDMS- og glasssubstrater. iLiNP-enheten er koblet til PEEK-kapillærer med en superlim. Lipid- og siRNA/bufferløsningene introduseres separat i iLiNP-enheten ved hjelp av sprøytepumper. LNP-suspensjonen samles i et mikrorør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: POPC LNP-størrelsesfordelinger produsert av iLiNP-enheten ved de forskjellige strømningshastighetsforholdene (FRR). POPC LNP-størrelsen måles ved dynamisk lysspredning (DLS). POPC-LNPer klargjøres ved å endre den totale strømningshastigheten og FRR: (A) 3 FRR og (B) 5 FRR. Små LNPer dannes ved høye totale strømningshastighetsforhold. I tillegg var LNP-størrelsene dannet ved FRR på 5 mindre enn de ved FRR på 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av siRNA-lastede LNPer. (A) Størrelsesfordeling av siRNA-lastede LNPer. siRNAer (siGL4) er innkapslet i LP-ene ved elektrostatisk interaksjon mellom den kationiske lipiden (DOTAP) og negativt ladede siRNAer. (B) Z-potensialet til de siRNA-lastede LNPene. LNP-suspensjonen ble fortynnet med 10 mM HEPES-buffer (pH 7.4) før målingen. Data representeres som gjennomsnittlig ± SD (Standardavvik). n = 3. (C) siRNA-innkapslingseffektiviteten til DOTAP-baserte LNPer. Innkapslingseffektiviteten ble bestemt av RiboGreen-analysen. Data representeres som gjennomsnittlig ± SD. n = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Cytotoksisitet av siRNA-lastede LNPer. siRNA-lastede LNPer ble fortynnet med DMEM (FBS (-)) for å oppnå siGL4-konsentrasjonene på 10 og 100 nM. LNP-suspensjonene tilsettes HeLa-dLuc-celler og inkuberes i 4 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator . N.T.: Ikke-behandlet (D-PBS(-)). Data representeres som gjennomsnittlig ± SD. n = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Luciferase gen knockdown aktivitet behandlet med siRNA-lastet LNPs. siRNA-lastet LNPs fremstilles på samme måte som celle levedyktighet analyse. Luciferase-uttrykksnivået måles ved hjelp av Dual-Glo Luciferase Assay System. N.T.: Ikke-behandlet (D-PBS(-)). Data representeres som gjennomsnittlig ± SD. n = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
LNP-størrelsen påvirker LNP biodistribusjon, anti-tumor effekt, og genaktivering ytelse. Derfor er LNP-størrelseskontrollmetoden en betydelig teknikk for å produsere DDS nanomedisiner, inkludert RNA-leveringssystemer. Målet med dette papiret er å introdusere iLiNP-enheten for presis størrelsesjustering av LP-er og dens anvendelse på siRNA-lastet LNPs-produksjon. iLiNP-enheten var i stand til å kontrollere LNP-størrelsen varierte fra 20 til 100 nm (figur 2)13. Når strømningsforholdene, for eksempel den totale strømningshastigheten og FRR endres for å kontrollere LNP-størrelsen, bør LNP-suspensjonen samles etter ca. 5 til 10 s for å stabilisere løsningsstrømmen. LNP-suspensjonen som ble samlet inn fra utløpet til iLiNP-enheten, ble oppringt umiddelbart mot bufferløsningen for å fjerne etanol og forhindre LNP-aggregering.
LNP-størrelseskontroll er en av de største utfordringene innen DDS. Generelt trenger den konvensjonelle LNP-produksjonsprosessen, for eksempel lipidfilmhydreringsmetoden, en størrelsesjusteringsprosess etter LNP-produksjonen20. På den annen side kan den mikrofluidbaserte LNPs produksjonsmetoden produsere de størrelseskontrollerte LNP-ene ved å introdusere lipid- og vandige løsninger i den mikrofluidiske enheten6,11,13. Selv om dialyseprosessen er nødvendig for å fjerne etanol fra LNP-suspensjonen, lover en kontinuerlig prosess av mikrofluidisk enhet kombinert med tangentiell strømningssystem automatisering av LNP-produksjonsprosessen14. Ifølge litteraturen var POPC LNP-størrelsene henholdsvis 50-60 nm og 30-60 nm, for den strømningsfokuserende mikrofluidiske enheten21 og den kaotiske mikserenheten, henholdsvis10. Sammenlignet med andre mikrofluidiske enheter muliggjør iLiNP-enheten POPC LNP-størrelseskontroll i et bredt spekter fra 20 til 100 nm.
Fabrikasjonsprosessen til iLiNP-enheten som ble brukt var standard myk litografi. Dermed kan iLiNP-enheten masseprodusert ved rask prototypingsteknikk og forhindre krysskontaminering av løsninger ved å bruke en engangsenhet. iLiNP-enheten kan produsere siRNA-lastede LNPer på samme måte som POPC LNP-produksjonsmetoden. For LNP-produksjonsmetoden som bruker iLiNP-enheten, krever brukeren ingen kompliserte prosedyrer. Av disse grunnene forventes den mikrofluidbaserte LNP-produksjonsmetoden, inkludert iLiNP-enheten, å bli brukt som standard LNP-produksjonsmetoden. Protokollen til dette papiret kan tilpasses andre mikrofluidiske enheter for LNP-produksjon. I tillegg aktiveres produksjonen av MRNA-lastede LNPer også ved å endre siRNA/bufferløsningen til en bufferløsning som inneholder MRNAer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av JST, CREST Grant Number JPMJCR17H1, Japan, JST, PRESTO Grant Number JPMJPR19K8, Japan, JST, SCORE, Japan, Special Education and Research Expenses fra Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology, JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140 og Iketani Science and Technology Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | NOF Corp. | MC-6081 | |
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2K) | NOF Corp. | GM-020 | |
| 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP) | NOF Corp. | CL-8181TA | |
| 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinev (DSPC) | NOF Corp. | MC-8080 | |
| 10 x D-PBS (-) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 048-29805 | |
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 017-00251 | |
| CellTiter-Blue Cell Viability Assay | Promega | G8081 | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667-5G | |
| Desktop maskless lithography system | NEOARK CORPORATION | DDB-701-DL4 | |
| Dialysis membrane | Repligen | 132697 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | Lot: 42G6587K | |
| G418 | Nacalai Tesque | 08973-14 | |
| Glass substrate | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S1111 | |
| Glass syringe | Hamilton | GASSTIGHT 1002 | |
| HeLa cell | HeLa-dluc cells were provided from Dr. Yusuke Sato at Hokkaido University | ||
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 342-01375 | |
| Low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | |
| Oxygen plasma cleaner | Femto Science | CUTE-1MP/R | |
| Penicillin–streptomycin, trypsin (2.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | R11491 | |
| siGL4 | Hokkaido System Science Co., Ltd | The sense and antisense strand sequences of siGL4 are 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT -3' and 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT -3', respectively. |
|
| Silicon wafer | GTC | ||
| SILPOT 184 W/C (PDMS) | Dow Corning Toray Co., Ltd. | silicone base and curing agent are included | |
| Sodium acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 192-01075 | |
| Sodium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 191-01665 | |
| SU-8 3050 | Nippon Kyaku Co., Ltd. | ||
| Syringe connector | Institute of microchemical Technology Co., Ltd. | ISC-011 | |
| Syringe pump | Chemyx | CX07200 | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments | ZEN3600 |
References
- Schoenmaker, L., et al. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. International Journal of Pharmaceutics. 601, 120586 (2021).
- Chung, Y. H., Beiss, V., Fiering, S. N., Steinmetz, N. F. COVID-19 Vaccine frontrunners and their nanotechnology design. ACS Nano. 14 (10), 12522-12537 (2020).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Cabral, H., et al. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nature Nanotechnology. 6 (12), 815-823 (2011).
- Sato, Y., et al. Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery. Journal of Controlled Release. 229, 48-57 (2016).
- Kimura, N., et al. Three-dimensional, symmetrically assembled microfluidic device for lipid nanoparticle production. RSC Advances. 11 (3), 1430-1439 (2021).
- Maeki, M., Kimura, N., Sato, Y., Harashima, H., Tokeshi, M. Advances in microfluidics for lipid nanoparticles and extracellular vesicles and applications in drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 128, 84-100 (2018).
- Akinc, A., et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nature Nanotechnology. 14 (12), 1084-1087 (2019).
- Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Chen, S., Cullis, P. R., vander Meel, R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics. Accounts of Chemical Research. 52 (9), 2435-2444 (2019).
- Maeki, M., et al. Understanding the formation mechanism of lipid nanoparticles in microfluidic devices with chaotic micromixers. PLoS One. 12 (11), 0187962 (2017).
- Maeki, M., et al. A strategy for synthesis of lipid nanoparticles using microfluidic devices with a mixer structure. RSC Advances. 5 (57), 46181-46185 (2015).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, 37 (2012).
- Kimura, N., et al. Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery. ACS Omega. 3 (5), 5044-5051 (2018).
- Kimura, N., et al. Development of a microfluidic-based post-treatment process for size-controlled lipid nanoparticles and application to siRNA delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (30), 34011-34020 (2020).
- Hashiba, A., et al. The use of design of experiments with multiple responses to determine optimal formulations for in vivo hepatic mRNA delivery. Journal of Controlled Release. 327, 467-476 (2020).
- Suzuki, Y., et al. Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus inhibition. Journal of Controlled Release. 330, 61-71 (2020).
- Kimura, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. One-step production using a microfluidic device of highly biocompatible size-controlled noncationic exosome-like nanoparticles for RNA delivery. ACS Applied Bio Materials. 4 (2), 1783-1793 (2021).
- Deng, T., Wu, H., Brittain, S. T., Whitesides, G. M. Prototyping of masks, masters, and stamps/molds for soft lithography using an office printer and photographic reduction. Analytical Chemistry. 72 (14), 3176-3180 (2000).
- Sato, Y., et al. A pH-sensitive cationic lipid facilitates the delivery of liposomal siRNA and gene silencing activity in vitro and in vivo. Journal of Controlled Release. 163 (3), 267-276 (2012).
- Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes. Pharmaceutics. 8 (4), (2016).
- Mijajlovic, M., Wright, D., Zivkovic, V., Bi, J. X., Biggs, M. J. Microfluidic hydrodynamic focusing based synthesis of POPC liposomes for model biological systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 104, 276-281 (2013).
