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Biology

पौधे के मेजबान में एक लीफहॉपर वेक्टर के वायरस और लार प्रोटीन का पता लगाना

Published: September 14, 2021 doi: 10.3791/63020
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Vector-borne Virus Research Center, Fujian Province Key Laboratory of Plant Virology, Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University

Summary

यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि लीफहॉपर वैक्टर द्वारा जारी लीफहॉपर और प्लांट वायरल प्रोटीन के लार प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्लांट होस्ट का उपयोग कैसे किया जाए।

Abstract

कीट वैक्टर क्षैतिज रूप से कृषि महत्व के कई पौधों के वायरस को प्रसारित करते हैं। पौधों के आधे से अधिक वायरस हेमिप्टेरन कीड़ों द्वारा प्रेषित होते हैं जिनके मुंह में छेदने-चूसने वाले हिस्से होते हैं। वायरल संचरण के दौरान, कीट लार वायरस-वेक्टर-होस्ट को पुल करती है क्योंकि लार वैक्टर वायरस, और कीट प्रोटीन, पौधों के मेजबान में कीड़ों से पौधों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर या दबाते हैं। लार प्रोटीन की पहचान और कार्यात्मक विश्लेषण आर्बोवायरस-होस्ट इंटरैक्शन के अनुसंधान क्षेत्र में फोकस का एक नया क्षेत्र बन रहे हैं। यह प्रोटोकॉल पौधे के मेजबान का उपयोग करके लीफहॉपर की लार में प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है। राइस ड्वार्फ वायरस (आरडीवी) से संक्रमित लीफहॉपर वेक्टर नेफोटेटिक्स सिंक्टिसेप्स एक उदाहरण के रूप में कार्य करता है। एन सिंक्टिसेप्स की लार द्वारा वेक्टर किए गए आरडीवी के विटेलोजेनिन और प्रमुख बाहरी कैप्सिड प्रोटीन पी 8 का पता चावल के पौधे में एक साथ लगाया जा सकता है । यह विधि लार प्रोटीन के परीक्षण के लिए लागू होती है जो कीट खिलाने के बाद पौधे के मेजबान में क्षणिक रूप से बनाए रखी जाती है। यह माना जाता है कि पता लगाने की इस प्रणाली से हेमिप्टेरन-वायरस-प्लांट या हेमिप्टेरन-प्लांट इंटरैक्शन के अध्ययन को लाभ होगा।

Introduction

अर्बोवायरस का वेक्टर-होस्ट ट्रांसमिशन मोड, एक मौलिक समस्या, जैविक विज्ञान की सीमा पर है। कृषि महत्व के कई पौधों के वायरस क्षैतिज रूप से कीट वैक्टर 1 द्वारा प्रेषित होतेहैं। आधे से अधिक पौधों के वायरस हेमिप्टेरन कीड़ों द्वारा वेक्टर किए जाते हैं, जिनमें एफिड्स, व्हाइटफ्लाई, लीफहॉपर, प्लांटहॉपर और थ्रिप्स शामिल हैं। इन कीटों में अलग-अलग विशेषताएं हैं जो उन्हें पौधों के वायरस को कुशलतापूर्वक संचारित करने मेंसक्षम बनाती हैं। उनके पास भेदी-चूसने वाले मुंह के हिस्से होते हैं और फ्लोएम और जाइलम से रस पर फ़ीड करते हैं, और उनकी लार 1,2,3,4 का स्राव करते हैं। तकनीकों के विकास और सुधार के साथ, लार घटकों की पहचान और कार्यात्मक विश्लेषण गहन अनुसंधान का एक नया केंद्र बन रहे हैं। लार में ज्ञात लार प्रोटीन में कई एंजाइम शामिल हैं, जैसे पेक्टिनस्टरेज़, सेल्युलेज़, पेरोक्सीडेज, क्षारीय फॉस्फेट, पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज, और सुक्राज़, अन्य 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . लार में प्रोटीन में ऐसे कारक भी शामिल होते हैं जो मेजबान रक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं, जिससे कीड़ों के प्रदर्शन में बदलाव होता है, और प्रभावक जो मेजबान रक्षा को दबाते हैं, जो कीट फिटनेस और घटकों को बढ़ाता है जो मेजबान रोग प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं14,15,16,17। इसलिए, लार प्रोटीन कीड़े और मेजबान के बीच संचार के लिए महत्वपूर्ण सामग्री हैं। वायरस के संचरण के दौरान, छेदने वाले-चूसने वाले विरुलिफेरस कीड़ों की लार ग्रंथियों द्वारा स्रावित लार में वायरल प्रोटीन भी होते हैं। वायरल घटक लार के प्रवाह का उपयोग कीट से पौधे के मेजबान तक छोड़ने के लिए करते हैं। इसलिए, कीट लार वायरस-वेक्टर-होस्ट ट्राइट्रोफिक इंटरैक्शन को पुल करती है। विरुलिफेरस कीड़ों द्वारा स्रावित लार प्रोटीन के जैविक कार्य की जांच करने से वायरस-वेक्टर-होस्ट के संबंध को समझने में मदद मिलती है।

पशु वायरस के लिए, यह बताया गया है कि मच्छरों की लार वेस्ट नाइल वायरस (डब्ल्यूएनवी) और डेंगू वायरस (डीईएनवी) के संचरण और रोगजनकता की मध्यस्थता करती है। लार प्रोटीन एएसजी 34 डेंगू -2 वायरस प्रतिकृति और संचरण को बढ़ावा देता है, जबकि लार प्रोटीन एएवीए -1 ऑटोफैगी18,19 को सक्रिय करके डीईएनवी और जीका वायरस (जेडआईकेवी) संचरण को बढ़ावा देता है। मच्छरों का लार प्रोटीन डी 7 डीईएनवी विषाणुओं और पुनः संयोजक डीईएनवी लिफाफा प्रोटीन20 के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से विट्रो और विवो में डीईएनवी संक्रमण को रोक सकता है। पौधों के वायरस में, बेगोमोवायरस टमाटर पीली पत्ती कर्ल वायरस (TYLCV) सफेद मक्खी लार प्रोटीन बीएसपी 9 को प्रेरित करता है, जो पौधे के मेजबान की WRKY33-मध्यस्थता प्रतिरक्षा को दबा देता है, सफेद मक्खियों की वरीयता और प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए, अंततः वायरस21 के संचरण को बढ़ाता है। क्योंकि पौधों के मेजबानों में कीट लार प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन पशु मेजबानों से पीछे रह गया है, पौधे के मेजबानों में लार प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक स्थिर और विश्वसनीय प्रणाली की तत्काल आवश्यकता है।

चावल बौना वायरस (आरडीवी) के रूप में जाना जाने वाला पौधे का वायरस उच्च दक्षता के साथ और लगातार प्रचार तरीके से22,23 के साथ लीफहॉपर नेफोटेटिक्स सिंक्टिसेप्स (हेमिप्टेरा: सिकेडेलिडे) द्वारा प्रेषित होता है। आरडीवी को पहली बार एक कीट वेक्टर द्वारा प्रेषित होने की सूचना मिली थी और एशिया में चावल की गंभीर बीमारी का कारण बनता है24,25. विरियन आइकोसाहेड्रल और डबल-लेयर्ड गोलाकार है, और बाहरी परत में पी 8 बाहरी कैप्सिड प्रोटीन22 होता है। एन. सिंक्टिसेप्स में आरडीवी की परिसंचारी संचरण अवधि 14 दिन 26,27,28,29,30 है। जब आरडीवी लार ग्रंथियों में आता है, तो विषाणुओं को एक्सोसाइटोसिस जैसे तंत्रके माध्यम से लार ग्रंथियों में लार-संग्रहीत गुहाओं में छोड़ दिया जाता है। विटेलोजेनिन (वीजी) मादा कीड़ों 31,32,33 में अंडाणु के विकास के लिए आवश्यक जर्दी प्रोटीन अग्रदूत है। अधिकांश कीट प्रजातियों में 6-7 केबी का कम से कम एक वीजी प्रतिलेख होता है, जो लगभग 220 केडीए के अग्रदूत प्रोटीन को एन्कोड करता है। वीजी के प्रोटीन अग्रदूतों को आमतौर पर अंडाशय 18,19 में प्रवेश करने से पहले बड़े (140 से190 केडीए) और छोटे (<50 केडीए) टुकड़ों में विभाजित किया जा सकता है। पिछले प्रोटिओमिक विश्लेषण ने लीफहॉपर रेसिलिया डोरसैलिस के स्रावित लार में वीजी से प्राप्त पेप्टाइड्स की उपस्थिति का खुलासा किया, हालांकि उनका कार्य अज्ञात है (अप्रकाशित डेटा)। यह नई बताया गया है कि वीजी, जो मौखिक रूप से प्लांटहॉपर से स्रावित होता है, पौधों की सुरक्षा को नुकसान पहुंचाने के लिए एक प्रभावक के रूप में कार्य करता है। यह अज्ञात है कि क्या एन सिंक्टिसेप्स के वीजी को लार प्रवाह के साथ पौधे के मेजबान को भी जारी किया जा सकता है, और फिर पौधे की सुरक्षा में हस्तक्षेप करने के लिए पौधे में भूमिका निभा सकता है। यह पता लगाने के लिए कि क्या एन सिंक्टिसेप्स लार प्रोटीन का शोषण करता है, जैसे कि वीजी, पौधे की सुरक्षा को रोकने या सक्रिय करने के लिए, पहला कदम भोजन के दौरान पौधे को जारी प्रोटीन की पहचान करना है। पौधे में मौजूद लार प्रोटीन की पहचान करने की विधि को समझना लार प्रोटीन के कार्य और हेमिप्टेरा और पौधों के बीच बातचीत को समझाने के लिए संभावित रूप से आवश्यक है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, एन सिंक्टिसेप्स का उपयोग कीट आहार के माध्यम से पेश किए गए पौधे के मेजबान में लार प्रोटीन की उपस्थिति की जांच करने के लिए एक विधि प्रदान करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। प्रोटोकॉल मुख्य रूप से लार प्रोटीन के संग्रह और पता लगाने का विवरण देता है और अधिकांश हेमिप्टेरान्स पर आगे की जांच के लिए सहायक है।

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Protocol

चीन के फुजियान कृषि और वानिकी विश्वविद्यालय में वेक्टर-जनित वायरस रिसर्च सेंटर में गैर-विषाणुजनित वयस्क लीफहॉपर का प्रचार किया गया था।

1. गैर-विषाणुफेरस कीट पालन

  1. 40 सेमी x 35 सेमी x 20 सेमी (लंबाई x चौड़ाई x ऊंचाई) वाले घन पिंजरे में चावल के पौधों पर वयस्कों को पालें। वेंटिलेशन के लिए पिंजरे के एक तरफ के हिस्से को कीट-प्रूफ जाल से ढककर रखें।
    1. लीफहॉपर के साथ पिंजरों को एक इनक्यूबेटर में रखें जिसमें 16 घंटे प्रकाश और 8 घंटे के अंधेरे की फोटोअवधि के तहत 60-75% की सापेक्ष आर्द्रता के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतर्निहित आर्द्रता नियंत्रक हो।
  2. अपने पिंजरे से सभी वयस्कों को धीरे से एक नए पिंजरे में स्थानांतरित करने के लिए एक एस्पिरेटर का उपयोग करें जिसमें प्रत्येक सप्ताह ताजा चावल के पौधे होते हैं।
    1. 200 से अधिक वयस्कों को संभोग करने दें और चावल में अंडे दें।
    2. अप्सराओं को उभरने के लिए पुराने चावल के पौधों को बनाए रखें। इन नए नॉनविरुलिफेरस अप्सराओं को 2-इनस्टार चरण में ले जाएं।

2. वायरस अधिग्रहण और विरुलिफेरस कीड़ों का संग्रह।

  1. एस्पिरेटर का उपयोग करके भुखमरी के लिए 1-2 घंटे के लिए 2-इनस्टार नॉनविरुलिफेरस अप्सराओं को ग्लास कल्चर ट्यूब (व्यास में 2.5 सेमी व्यास और 15 सेमी ऊंचा) में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
    1. अप्सराओं को एक पिंजरे में छोड़ दें जिसमें एक बर्तन में उगाया गया आरडीवी संक्रमित चावल का पौधा होता है।
    2. अप्सराओं को 2 दिनों के लिए संक्रमित चावल के पौधे पर खिलाने दें।
      नोट: चावल के पौधे को सावधानी से पानी दें और अप्सराओं को धोने से बचें। 2-इनस्टार अप्सराएं लगभग 1.6-2 मिमी लंबी होती हैं।
  2. इन अप्सराओं को सावधानीपूर्वक एक नए पिंजरे में स्थानांतरित करें जिसमें 16 घंटे के प्रकाश और 8 घंटे के अंधेरे की फोटोअवधि के तहत 60-75% की सापेक्ष आर्द्रता के साथ ताजा वायरस मुक्त चावल के पौधे होते हैं। आरडीवी की संचारी संचरण अवधि को पूरा करने के लिए अप्सराओं को 12 दिनों के लिए संक्रमित चावल के पौधे पर खिलाने की अनुमति दें।

3. एक फीडिंग पिंजरे का उपयोग करके लार प्रोटीन का संग्रह

  1. पांच छोटे पाइप जैसे फीडिंग पिंजरे (व्यास में 2.5 सेमी व्यास 4 सेमी ऊंचा) तैयार करें जिसमें एक छोर कीट-प्रूफ जाल से ढका हो।
  2. प्रत्येक फीडिंग पिंजरे में 15-20 लीफहॉपर ्स को सीमित करें, और फिर पिंजरे के दूसरे छोर को एक पतली फोम मैट के साथ कवर करें।
    1. पिंजरे के अंत और टेप के साथ फोम मैट के बीच एक चावल अंकुर (5-6 सेमी ऊंचा) ठीक करें। सुनिश्चित करें कि फीडिंग पिंजरे में पत्ते वाले पिंजरे के इंटीरियर के संपर्क में आने वाले चावल के पौधों पर फ़ीड कर सकते हैं।
  3. अंकुर की जड़ों को पानी में डुबोएं ताकि चावल का पौधा जीवित रहे। लीफहॉपर ्स को 2 दिनों के लिए उन पर खिलाने दें।
  4. अपने भोजन पिंजरों से पत्तेदार ों को हटा दें और चावल के पौधों को इकट्ठा करें जिन पर उन्होंने खिलाया था। पिंजरे के बाहर रोपाई के हिस्सों को काटें और रोपाई के भोजन क्षेत्रों को पुनर्प्राप्त करें।
    नोट: यह नमूना अधिकतम 3 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, अगर इसका तुरंत पता लगाने के लिए उपयोग नहीं किया जाता है।

4. अभिकर्मक तैयारी

  1. 5xTris-ग्लाइसिन बफर तैयार करने के लिए 1 लीटर बाँझ पानी में 15.1 ग्राम ट्रिस-बेस, 94 ग्राम ग्लाइसिन और 5 ग्राम एसडीएस घोलें। 1xTris-ग्लाइसिन बफर तैयार करने के लिए 800 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ 5xTris-ग्लाइसिन बफर के 200 mL पतला करें (बफर संरचना के लिए तालिका 1 देखें)।
  2. 10xTris-बफर्ड सेलाइन (TBS) बफर तैयार करने के लिए 1 लीटर बाँझ पानी में 80 ग्राम NaCl, 30 ग्राम ट्राइस-बेस और 2 ग्राम KCl घोलें। 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर घोल को आटोक्लेव करें।
  3. 4x प्रोटीन नमूना बफर तैयार करने के लिए 8 ग्राम एसडीएस, 4 मिलीलीटर बीटा-मर्कैप्टोथेनॉल, 0.02 ग्राम ब्रोमोफेनोल ब्लू, और 40 मिलीलीटर ग्लिसरॉल को 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 6.8) के 40 मिलीलीटर में घोलें।
  4. ट्रांसफर बफर तैयार करने के लिए 200 एमएल मेथनॉल के साथ 800 एमएल ट्रिस-ग्लाइसिन बफर मिलाएं।
  5. ट्वीन 20 (टीबीएसटी) समाधान के साथ टीबीएस बफर तैयार करने के लिए 100 एमएल 10xTBS समाधान और 3 मिलीलीटर ट्वीन 20 से 900 एमएल बाँझ पानी जोड़ें।

5. लार और वायरल प्रोटीन का पता लगाने के लिए पश्चिमी सोख्ता

  1. चावल के नमूनों के 0.1 ग्राम को तरल नाइट्रोजन के साथ पीस लें जब तक कि ऊतक पाउडर न बन जाए। नमूने में 4x प्रोटीन नमूना बफर के 200 μL जोड़ें और इसे 10 मिनट के लिए उबालें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 12,000 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें।
    1. सतह पर तैरनेवाला निकालें और इसे एक नई शीशी में रखें। नमूने के 10 μL को SDS-PAGE जेल में लोड करें, और इसे 45-60 मिनट के लिए 150 V पर Tris-ग्लाइसिन बफर में चलाएं।
      नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद अवशेषों को त्याग दिया जा सकता है।
  2. 30 मिनट के लिए ट्रांसफर बफर में 0.45 μm नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली और अन्य सैंडविच आपूर्ति डालें।
    नोट: यह चरण जेल के चलने से पहले किया जा सकता है।
  3. जेल को सैंडविच करें और इसे ट्रांसफर बफर में 100 वी पर 90-120 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
  4. झिल्ली लें और इसे 20 मिनट के लिए टीबीएसटी घोल में 7% गैर-वसा वाले सूखे दूध अवरोधक समाधान में रखें। टीबीएसटी में गैर-वसा वाले सूखे दूध के 7% समाधान में आरडीवी पी 8 या वीजी के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ें। 2 घंटे या रात भर के लिए झिल्ली को धुंधला करने के लिए एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
  5. टीबीएसटी घोल के साथ झिल्ली को तीन बार धोएं, हर बार 5 मिनट धोने के साथ।
  6. टीबीएसटी के साथ 7% गैर-वसा वाले सूखे दूध में द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी जोड़ें। कमरे के तापमान पर 60-90 मिनट के लिए एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
  7. हर बार 5 मिनट के लिए तीन बार टीबीएसटी घोल के साथ झिल्ली को धोएं।
  8. केमिल्यूमिनेसेंट विधि के लिए ईसीएल वेस्टर्न किट का उपयोग करें। एक ट्यूब में 1: 1 के अनुपात में किट में डिटेक्शन अभिकर्मक 1 और 2 मिलाएं। मिश्रित अभिकर्मक को झिल्ली पर रखें और 5 मिनट के लिए धब्बे को सेने दें।
  9. अतिरिक्त अभिकर्मक को छान ें और केमिल्यूमिनेसेंट चित्र की एक रंगीन तस्वीर लें। प्रोटीन बैंड के साथ सीढ़ी देखने के लिए उन्हें मिलाएं।

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Representative Results

चित्रा 1 इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों को दर्शाता है: कीट पालन, वायरस अधिग्रहण, चावल खिलाने के माध्यम से लार प्रोटीन का संग्रह, और पश्चिमी धब्बा। वेस्टर्न ब्लॉट्स के परिणामों से पता चला है कि वीजी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट की गई झिल्ली पर कीड़ों के चावल और लार ग्रंथियों को खिलाने के नमूनों में लगभग 220 केडीए के विशिष्ट और अपेक्षित बैंड देखे गए थे। इसके विपरीत, गैर-खिलाने वाले चावल के नमूने में कोई बैंड नहीं देखा गया था। चित्रा 2 में परिणाम इंगित करता है कि वीजी को लार प्रोटीन के रूप में पौधे के मेजबान को जारी किया गया था। आरडीवी पी 8 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट की गई झिल्ली पर, चावल के नमूनों में लगभग 46 केडीए का एक विशिष्ट और अपेक्षित बैंड भी देखा गया था, जिसे खिलाने और विरुलिफेरस कीट निकायों के शरीर के अधीन किया गया था। इसके विपरीत, गैर-खिलाने वाले चावल के नमूने और गैर-विषाणुपूर्ण लीफहॉपर निकायों में कोई बैंड नहीं देखा गया था, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। इस परिणाम ने साबित कर दिया कि वायरल प्रोटीन को खिलाने वाले पौधों में भी पता लगाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: लार प्रोटीन का पता लगाने में चरणों का अवलोकन। चरणों में कीट पालन, वायरस अधिग्रहण, पौधों के भोजन के माध्यम से लार प्रोटीन संग्रह और पश्चिमी सोख्ता शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पौधे और कीट के नमूनों में वीजी की पश्चिमी धब्बा परख। लेन 1, गैर-खिलाने वाले पौधे; लेन 2, विरुलिफेरस लीफहॉपर-फीडिंग पौधे; लेन 3, विरुलिफेरस लीफहॉपर लार ग्रंथियां; लेन एम, मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पौधे और कीट के नमूनों में पी 8 की पश्चिमी धब्बा परख। लेन 1, गैर-खिलाने वाले पौधे; लेन 2, विरुलिफेरस लीफहॉपर-फीडिंग पौधे; लेन 3, विरुलिफेरस लीफहॉपर बॉडी; लेन 4, गैर-विषाणुपूर्ण लीफहॉपर शरीर; एम, मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बफ़र संयोजन टिप्पणियाँ/विवरण
5x Tris-glycine बफर 15.1 ग्राम ट्रिस बेस
94 ग्राम ग्लाइसिन
1 लीटर बाँझ पानी में 5 ग्राम एसडीएस		 स्टॉक समाधान
1x Tris-ग्लाइसिन बफर 5x Tris-ग्लाइसिन बफर के 200 mL
800 एमएल बाँझ पानी		 SDS-PAGE के लिए कार्य समाधान
10x ट्रिस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस) बफर 80 ग्राम NaCl
30 ग्राम ट्रिस बेस
2 ग्राम KCl
1 लीटर बाँझ पानी में।		 स्टॉक समाधान
ट्वीन 20 (टीबीएसटी) समाधान के साथ टीबीएस। 100 एमएल 10x TBS समाधान
3 एमएल ट्वीन 20
900 एमएल बाँझ पानी		 कार्य समाधान
4x प्रोटीन नमूना बफर 8 ग्राम एसडीएस
4 एमएल β-मर्कैप्टोइथेनॉल
0.02 ग्राम ब्रोमोफेनॉल नीला
40 एमएल ग्लिसरॉल
40 एमएल में 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 6.8)		 प्रोटीन निष्कर्षण के लिए
स्थानांतरण बफर 800 एमएल ट्रिस-ग्लाइसिन बफर
200 एमएल मेथनॉल		 प्रोटीन हस्तांतरण के लिए

तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बफर, समाधान और अभिकर्मक। बफर की संरचना और समाधान, उनके उपयोग के साथ, सूचीबद्ध हैं।

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Discussion

छेदने वाले-चूसने वाले कीड़ों की लार ग्रंथियों द्वारा सीधे स्रावित लार एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है क्योंकि यह मेजबान ऊतकों और वैक्टर के क्रॉस-किंगडम जैविक कारकों को मेजबान 1,3,4 में पूर्वनिर्धारित और डिटॉक्सीफाई करती है। क्रॉस-किंगडम जैविक कारक, जिसमें उत्प्रेरक, प्रभावक और छोटे आरएनए शामिल हैं, कीट-मेजबान संचार14,15,16 के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, लार घटकों की अधिक किस्मों और कार्यों को उजागर करने से कीड़े और मेजबान के बीच संबंधों को समझने को बढ़ावा मिलेगा। यहां, पौधे के मेजबान में लार प्रोटीन के लिए पता लगाने की एक प्रणाली प्रदान की गई थी, जो पौधे के मेजबान में लार प्रोटीन के कार्य पर आगे की जांच को सक्षम करेगी।

यह प्रोटोकॉल खिलाने वाले पौधों को इकट्ठा करके छेदने-चूसने वाले मुंह के हिस्सों के साथ लीफहॉपर के लार प्रोटीन का पता लगाने की तकनीक प्रदान करता है। सर्वोत्तम और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ उल्लेखनीय बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। (1) संक्रमित चावल के पौधों में वायरल लोडिंग महत्वपूर्ण है। चावल के पौधों में वायरल टिटर्स सीधे कीटों के अधिग्रहण को प्रभावित करते हैं। जब कीट कॉलोनी अत्यधिक विषाणुजनित होती है, तो इन विट्रो में लार में वायरल प्रोटीन एकत्र करने की संभावना बढ़ जाएगी। इसलिए, लार से पौधे के मेजबान को जारी वायरल प्रोटीन का पता लगाना बहुत आसान होगा। संक्रमित पौधों को चुनना जो महत्वपूर्ण लक्षण प्रदर्शित करते हैं, वायरस के स्रोत के रूप में सेवा करने की सिफारिश की जाती है। (2) पता लगाने का समय। यह माना जाता है कि कुछ लार प्रोटीन पौधे के मेजबान में क्षणिक होते हैं क्योंकि वे पौधे के मेजबान द्वारा गिरावट के अधीन होते हैं या पौधे में पतला होते हैं। 2-दिवसीय भोजन के बाद खिलाने वाले पौधों का तत्काल पता लगाने की सिफारिश की जाती है। यह भी अनुमान लगाया गया है कि पौधे में कुछ विशिष्ट लार प्रोटीन के लिए एक लंबा प्रतिधारण समय बेहतर होगा। इसलिए, कुछ लार प्रोटीन का पता लगाने का समय आगे के अध्ययनों में निर्धारित किया जा सकता है। (3) सुनिश्चित करें कि पर्याप्त प्रतिकृतियां हैं। जीवित रहने वाले कीड़ों की संख्या कम हो जाएगी क्योंकि फीडिंग पिंजरे में सीमित कीड़ों में सीमित गतिविधि और खिलाने की क्षमता सीमित होती है। पर्याप्त प्रतिकृति का उपयोग लार प्रोटीन को समृद्ध करने में मदद करेगा। तीन से पांच प्रतिकृतियां आमतौर पर पर्याप्त होती हैं। यदि केवल एक प्रतिकृति है, तो एक चावल के अंकुर पर खिलाने के लिए 15-20 लीफहॉपर को सीमित करना बेहतर होगा।

इन प्रतिनिधि परिणामों ने विरुलिफेरस लीफहॉपर्स के फीडिंग प्लांट में वायरल प्रोटीन पी 8 की उपस्थिति को दिखाया। इसमें सामने आया कि लार के प्रवाह के साथ मिला वायरस लार ग्रंथियों से निकलता है। फिर इसे कीट से पौधे के मेजबान में छोड़ दिया गया, अंततः वायरल क्षैतिज संचरण को समाप्त कर दिया गया। हालांकि, यह अभी भी अज्ञात है कि क्या वीजी कीट खिलाने की प्रक्रिया में उत्प्रेरक या प्रभावक की भूमिका निभाता है और क्या यह पौधे के मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर या दबा ता है या नहीं। इससे पहले, 10,000 से अधिक आर डोरसैलिस की लार को झिल्ली फीडिंग के माध्यम से एकत्र किया गया था और एलसी-एमएस / एमएस (अप्रकाशित डेटा) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। लार में वीजी की उपस्थिति सत्यापित की गई थी, हालांकि इसका कार्य अज्ञात है। यहां, यह साबित हो गया है कि वीजी एन सिंक्टिसेप्स की लार में भी मौजूद है और यहां तक कि पौधे को भी जारी किया जाता है। प्लांटहॉपर्स16 पर किए गए अध्ययनों के साथ, यह माना जाता है कि हेमिप्टेरन लार में वीजी की उपस्थिति सार्वभौमिक है। एक नई खोज की रिपोर्ट है कि प्लांटहॉपर लार का वीजी पौधे की रक्षा प्रणालीको नुकसान पहुंचाने के लिए एक प्रभावक है। यह पता लगाने के लिए अधिक अध्ययन की आवश्यकता है कि क्या अधिकांश हेमिप्टेरन लार में वीजी एक प्रभावक के रूप में कार्य करता है। यह माना जाता है कि यह प्रोटोकॉल पौधों में लीफहॉपर द्वारा स्रावित लार प्रोटीन की उपस्थिति की जांच करने के लिए एक स्थिर और विश्वसनीय पद्धति प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल अधिकांश हेमिप्टेरान्स के लार प्रोटीन का पता लगाने के लिए लागू होने की उम्मीद है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31772124 और 31972239) और फ़ुज़ियान कृषि और वानिकी विश्वविद्यालय (ग्रांट केएसआईएलएक्स 014) से अनुदान द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tris base Roche D609K69032 For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich WXBD0677V For 5×Tris-glycine buffer preparation
SDS Sigma-Aldrich SLCB4394 For 5×Tris-glycine buffer preparation
NaCl Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019318 For 10×TBS buffer preparation
KCl Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10016318 For 10×TBS buffer preparation
ß-mercaptoethanol Xiya Reagent B14492 For 4× protein sample buffer preparation
bromophenol blue Sigma-Aldrich SHBL3668 For 4× protein sample buffer preparation
glycerol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010618 For 4× protein sample buffer preparation
methanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10014118 For transfer buffer preparation
Tween 20 Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY CT30111220 For TBST preparation
non-fat dry milk Becton.Dickinso and company 252038 For membrane blocking, antibodies dilution
goat anti-rabbit IgG Sangon Biotech D110058-0001 Recognization of the primary andtibody
ECL Western kit ThermoFisher Scientific 32209 Chemiluminescent substrate
nitrocellulose membrane Pall Corporation 25312915 For proteins transfer
Buffers and Solutions
Buffer Composition Comments/Description
 5×Tris-glycine buffer 15.1 g Tris base
94 g glycine
 5 g SDS in 1 L sterile water		  Stock solution
1×Tris-glycine buffer 200 mL of 5×Tris-glycine buffer
800 mL sterile water		 Work solution, for SDS-PAGE
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer 80 g NaCl
30 g Tris base
2 g KCl
in 1 L sterile water		 Stock solution
TBS with Tween 20 (TBST) solution 100 mL 10×TBS solution
3 mL Tween 20
900 mL sterile water		 Work solution
4× protein sample buffer 8 g SDS
4 mL ß-mercaptoethanol
0.02 g bromophenol blue
40 mL glycerol
in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		 For protein extraction
Transfer buffer 800 mL Tris-glycine buffer
200 mL methanol		 For protein transfer
Instruments
Bromophenol blue Sigma-Aldrich SHBL3668 For 4x protein sample buffer preparation
Constant temperature incubator Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. PRX-1200B For rearing leafhoppers
Electrophoresis Tanon Science & Technology Co.,Ltd. Tanon EP300 For SDS-PAGE
Electrophoretic transfer core module BIO-RAD 1703935 For SDS-PAGE
glycerol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010618 For 4x protein sample buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich WXBD0677V For 5x Tris-glycine buffer preparation
goat anti-rabbit IgG Sangon Biotech D110058-0001 Recognization of the primary andtibody
High-pass tissue grinding instrument Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. JXFSIPRP-24 For grinding plant tissues
KCl Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10016318 For 10x TBS buffer preparation
methanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10014118 For transfer buffer preparation
Mini wet heat transfer trough BIO-RAD 1703930 For SDS-PAGE
NaCl Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019318 For 10x TBS buffer preparation
nitrocellulose membrane Pall Corporation 25312915 For proteins transfer
non-fat dry milk Becton.Dickinso and company 252038 For membrane blocking, antibodies dilution
Pierce ECL Western kit ThermoFisher Scientific 32209 Chemiluminescent substrate
Protein color instrument GE Healthcare bio-sciences AB Amersham lmager 600 For detecting proteins
SDS Sigma-Aldrich SLCB4394 For 5x Tris-glycine buffer preparation
Tris base Roche D609K69032 For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
Tween 20 Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY CT30111220 For TBST preparation
Vertical plate electrophoresis tank BIO-RAD 1658001 For SDS-PAGE
Water bath Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. XMTD-8222 For boil the protein samples
β-mercaptoethanol Xiya Reagent B14492 For 4x protein sample buffer preparation

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References

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पौधे के मेजबान में एक लीफहॉपर वेक्टर के वायरस और लार प्रोटीन का पता लगाना
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Wang, Y., Wang, X., Li, Z., Chen, Q. Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host. J. Vis. Exp. (175), e63020, doi:10.3791/63020 (2021).

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