Summary
Dit protocol laat zien hoe de plantengastheer kan worden gebruikt om speekseleiwitten van leafhopper en plantaardige virale eiwitten te detecteren die worden vrijgegeven door leafhopper-vectoren.
Abstract
Insectenvectoren brengen horizontaal veel plantenvirussen van agrarisch belang over. Meer dan de helft van de plantenvirussen wordt overgedragen door hemipteraninsecten die piercing-zuigende monddelen hebben. Tijdens virale overdracht overbrugt het insectenspeeksel de virus-vector-gastheer omdat de speekselvectoren, virussen en de insecteneiwitten de immuunrespons van planten van insecten in plantengastheren activeren of onderdrukken. De identificatie en functionele analyses van speekseleiwitten worden een nieuw aandachtsgebied in het onderzoeksveld van arbovirus-gastheerinteracties. Dit protocol biedt een systeem om eiwitten in het speeksel van leafhoppers te detecteren met behulp van de plantengastheer. De leafhoppervector Nephotettix cincticeps besmet met het rijstdwergvirus (RDV) dient als voorbeeld. Het vitellogenine en het belangrijkste buitenste capside-eiwit P8 van RDV, gevectoreerd door het speeksel van N. cincticeps, kunnen tegelijkertijd worden gedetecteerd in de rijstplant waar N. cincticeps zich mee voedt . Deze methode is toepasbaar voor het testen van de speekseleiwitten die tijdelijk in de plantengastheer worden vastgehouden na insectenvoeding. Er wordt aangenomen dat dit detectiesysteem de studie van hemipteran-virus-plant of hemipteran-plant interacties ten goede zal komen.
Introduction
De vector-host transmissiemodus van arbovirussen, een fundamenteel probleem, bevindt zich op de grens van de biologische wetenschap. Veel plantenvirussen van agrarisch belang worden horizontaal overgedragen door insectenvectoren1. Meer dan de helft van de plantenvirussen wordt overgebracht door hemipteran-insecten, waaronder bladluizen, witte vliegen, leafhoppers, planthoppers en trips. Deze insecten hebben verschillende kenmerken die hen in staat stellen om plantenvirussen efficiënt over te brengen1. Ze bezitten piercing-zuigende monddelen en voeden zich met het sap van floëem en xyleem, en scheiden hun speekselaf 1,2,3,4. Met de ontwikkeling en verbetering van technieken worden de identificatie en functionele analyses van speekselcomponenten een nieuwe focus van intensief onderzoek. De bekende speekseleiwitten in speeksel omvatten tal van enzymen, zoals pectinesterase, cellulase, peroxidase, alkalische fosfatase, polyfenoloxidase en sucrase, onder andere 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . De eiwitten in speeksel omvatten ook elicitoren die de afweerreactie van de gastheer activeren, waardoor de prestaties van insecten veranderen, en effectoren die de afweer van de gastheer onderdrukken, wat de fitheid van insecten verbetert en componenten die pathologische reacties van de gastheer induceren14,15,16,17. Daarom zijn speekseleiwitten vitale materialen voor communicatie tussen insecten en gastheren. Tijdens de overdracht van virussen bevat het speeksel dat wordt afgescheiden door de speekselklieren van piercing-zuigende virulifere insecten ook virale eiwitten. Virale componenten gebruiken de stroom van speeksel om ze vrij te geven van het insect naar de gastheer van de plant. Daarom overbrugt het insectenspeeksel de virus-vector-gastheer tritrofe interactie. Het onderzoeken van de biologische functie van speekseleiwitten die worden uitgescheiden door virulifere insecten helpt om de relatie van virus-vector-gastheer te begrijpen.
Voor dierlijke virussen wordt gemeld dat het speeksel van muggen de overdracht en pathogeniciteit van westnijlvirus (WNV) en denguevirus (DENV) bemiddelt. Het speekseleiwit AaSG34 bevordert de replicatie en overdracht van het dengue-2-virus, terwijl het speekseleiwit AaVA-1 de overdracht van DENV- en Zika-virus (ZIKV) bevordert door autofagie18,19 te activeren. Het speekseleiwit D7 van muggen kan DENV-infectie in vitro en in vivo remmen via directe interactie met de DENV-virionen en recombinant DENV-enveloppe-eiwit20. In plantenvirussen induceert het begomovirus tomaat geelbladkrulvirus (TYLCV) het wittevliegspeekseleiwit Bsp9, dat de WRKY33-gemedieerde immuniteit van de plantengastheer onderdrukt, om de voorkeur en prestaties van witte vliegen te verhogen, waardoor uiteindelijk de overdracht van virussen21 toeneemt. Omdat studies naar de rol die speekseleiwitten van insecten spelen in plantengastheren zijn achtergebleven bij die van dierlijke gastheren, is een stabiel en betrouwbaar systeem om de speekseleiwitten in plantengastheren te detecteren dringend nodig.
Het plantenvirus dat bekend staat als rijstdwergvirus (RDV) wordt overgedragen door de leafhopper Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) met een hoge efficiëntie en op een aanhoudend vermeerderende manier22,23. RDV werd voor het eerst gemeld als overgedragen door een insectenvector en veroorzaakt een ernstige ziekte van rijst in Azië24,25. Het virion is icosaëdrisch en dubbellaags bolvormig en de buitenste laag bevat het P8 buitenste capsid-eiwit22. De circulatieve transmissieperiode van RDV in N. cincticeps is 14 dagen 26,27,28,29,30. Wanneer de RDV bij speekselklieren aankomt, worden virionen vrijgegeven in speeksel-opgeslagen holtes in de speekselklieren via een exocytose-achtig mechanisme23. De vitellogenine (Vg) is de voorloper van het dooiereiwit die essentieel is voor de ontwikkeling van eicellen bij vrouwelijke insecten31,32,33. De meeste insectensoorten hebben ten minste één Vg-transcript van 6-7 kb, dat codeert voor een voorlopereiwit van ongeveer 220 kDa. De eiwitvoorlopers van Vg kunnen meestal worden gesplitst in grote (140 tot 190 kDa) en kleine (<50 kDa) fragmenten voordat ze de eierstok18,19 binnendringen. Eerdere proteomische analyse onthulde de aanwezigheid van de peptiden afgeleid van Vg in het uitgescheiden speeksel van de leafhopper Recilia dorsalis, hoewel hun functie onbekend is (ongepubliceerde gegevens). Onlangs is gemeld dat Vg, dat oraal wordt uitgescheiden door planthoppers, functioneert als een effector om de afweer van planten te beschadigen34. Het is onbekend of de Vg van N. cincticeps ook met speekselstroom aan de plantengastheer kan worden vrijgegeven en vervolgens een rol in de plant kan spelen om de afweer van de plant te verstoren. Om aan te pakken of N. cincticeps speekseleiwitten, zoals Vg, gebruikt om de afweer van planten te remmen of te activeren, is de eerste stap het identificeren van eiwitten die tijdens het voeden aan de plant worden vrijgegeven. Het begrijpen van de methode om de speekseleiwitten in de plant te identificeren is mogelijk essentieel om de functie van speekseleiwitten en de interacties tussen Hemiptera en planten te verklaren.
In het hier gepresenteerde protocol wordt N. cincticeps als voorbeeld gebruikt om een methode te bieden om de aanwezigheid van speekseleiwitten in de plantengastheer te onderzoeken die door insectenvoeding worden geïntroduceerd. Het protocol beschrijft voornamelijk de verzameling en detectie van speekseleiwitten en is nuttig voor verder onderzoek op de meeste hemipterans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De niet-virulifere volwassen leafhoppers werden verspreid in het Vector-borne Virus Research Center in Fujian Agriculture and Forestry University, China.
1. Niet-virulifere insectenkweek
- Voed de volwassenen op rijstzaailingen op in een kubuskooi van 40 cm x 35 cm x 20 cm (lengte x breedte x hoogte). Houd één kant van de kooi bedekt met een insectenbestendig net voor ventilatie.
- Bewaar de kooien met leafhoppers in een incubator met een ingebouwde vochtigheidsregelaar op 26 °C met een relatieve vochtigheid van 60-75% onder een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker.
- Gebruik een aspirator om alle volwassenen voorzichtig uit hun kooi over te brengen naar een nieuwe kooi die elke week verse rijstzaailingen bevat.
- Laat meer dan 200 volwassenen paren en eieren leggen in de rijst.
- Bewaar de oude rijstzaailingen voor de nimfen om tevoorschijn te komen. Breng deze nieuwe niet-virulifere nimfen terug naar het 2-instar-stadium.
2. Virusverwerving en het verzamelen van virulifere insecten
- Breng de 2-instar niet-virulifere nimfen voorzichtig over in een glazen kweekbuis (2,5 cm in diameter bij 15 cm hoog) gedurende 1-2 uur voor uithongering met behulp van de aspirator.
- Laat de nimfen los in een kooi met een RDV-geïnfecteerde rijstplant die in een pot is gekweekt.
- Laat de nimfen zich 2 dagen voeden met de geïnfecteerde rijstplant.
OPMERKING: Geef de rijstplant voorzichtig water en vermijd het wegwassen van de nimfen. De 2-instar nimfen zijn ongeveer 1,6-2 mm lang.
- Breng deze nimfen voorzichtig over naar een nieuwe kooi met verse virusvrije rijstzaailingen met een relatieve luchtvochtigheid van 60-75% onder een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker. Laat de nimfen zich gedurende 12 dagen voeden met de geïnfecteerde rijstplant om de circulerende overdrachtsperiode van RDV te voltooien.
3. Verzameling van speekseleiwitten met behulp van een voederkooi
- Bereid vijf kleine pijpachtige voerkooien voor (2,5 cm in diameter bij 4 cm hoog) waarin het ene uiteinde is bedekt met insectenbestendig gaas.
- Beperk 15-20 leafhoppers in elke voerkooi en bedek vervolgens het andere uiteinde van de kooi met een dunne schuimmat.
- Bevestig een rijstzaailing (5-6 cm hoog) tussen het einde van de kooi en een schuimmat met tapes. Zorg ervoor dat de leafhoppers in de voederkooi zich kunnen voeden met de rijstzaailingen die zijn blootgesteld aan de binnenkant van de kooi.
- Dompel de zaailingwortels onder in water zodat de rijstplant in leven blijft. Laat de leafhoppers zich er 2 dagen mee voeden.
- Haal de leafhoppers uit hun voederkooien en verzamel de rijstzaailingen waarmee ze zich hebben gevoed. Knip de delen van zaailingen buiten de kooi en herstel de voedingsgebieden van zaailingen.
OPMERKING: Dit monster kan maximaal 3 maanden bij -80 °C worden bewaard, als het niet onmiddellijk wordt gebruikt voor detectie.
4. Reagensbereiding
- Los 15,1 g Tris-base, 94 g glycine en 5 g SDS op in 1 L steriel water om 5xTris-glycinebuffer te bereiden. Verdun 200 ml 5xTris-glycinebuffer met 800 ml steriel water om 1xTris-glycinebuffer te bereiden (zie tabel 1 voor buffersamenstelling).
- Los 80 g NaCl, 30 g Tris-base en 2 g KCl op in 1 L steriel water om een 10xTris-gebufferde zoutoplossing (TBS) buffer te bereiden. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C gedurende 15 min.
- Los 8 g SDS, 4 ml ß-mercaptoethanol, 0,02 g broomfenolblauw en 40 ml glycerol op in 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) om 4x eiwitmonsterbuffer te bereiden.
- Meng 800 ml Tris-glycinebuffer met 200 ml methanol om de transferbuffer voor te bereiden.
- Voeg 100 ml 10xTBS-oplossing en 3 ml Tween 20 tot 900 ml steriel water toe om de TBS-buffer met Tween 20 (TBST)-oplossing voor te bereiden.
5. Western blotting om het speeksel en virale eiwitten te detecteren
- Maal 0,1 g van de rijstmonsters met vloeibare stikstof totdat het weefsel een poeder wordt. Voeg 200 μL 4x eiwitmonsterbuffer toe aan het monster en kook het gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en plaats het in een nieuwe injectieflacon. Laad 10 μL van het monster in een SDS-PAGE-gel en voer het gedurende 45-60 minuten in Tris-glycinebuffer op 150 V uit.
OPMERKING: Het residu na centrifugeren kan worden weggegooid.
- Verwijder het supernatant en plaats het in een nieuwe injectieflacon. Laad 10 μL van het monster in een SDS-PAGE-gel en voer het gedurende 45-60 minuten in Tris-glycinebuffer op 150 V uit.
- Doe een nitrocellulosemembraan van 0,45 μm en andere sandwichbenodigdheden gedurende 30 minuten in de transferbuffer.
OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd voordat de gel zijn run heeft voltooid. - Sandwich de gel en breng het gedurende 90-120 minuten over op 100 V in de transferbuffer.
- Neem het membraan en plaats het gedurende 20 minuten in een vetvrije droge melkblokkeringsoplossing in TBST-oplossing. Voeg het specifieke antilichaam tegen RDV P8 of Vg toe aan een 7% oplossing van vetvrije droge melk in TBST. Incubeer met het antilichaam voor het kleuren van het membraan gedurende 2 uur of 's nachts.
- Was het membraan drie keer met TBST-oplossing, met telkens 5 minuten wassen.
- Voeg de geit anti-konijn IgG als secundair antilichaam toe aan 7% vetvrije droge melk met TBST. Incubeer met het antilichaam gedurende 60-90 minuten bij kamertemperatuur.
- Was het membraan met TBST-oplossing driemaal gedurende 5 minuten per keer.
- Gebruik de ECL Western kit voor de chemiluminescente methode. Mix detectiereagentia 1 en 2 in de kit in een verhouding van 1:1 in een buis. Breng het gemengde reagens op het membraan en incubeer de vlek gedurende 5 minuten.
- Giet het overtollige reagens af en maak een colorimetrische foto van de chemiluminescente foto. Combineer ze om de ladder met eiwitbanden te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert alle stappen in dit protocol: insectenkweek, virusverwerving, het verzamelen van speekseleiwitten via rijstvoeding en de western blot. De resultaten van de western blots toonden aan dat specifieke en verwachte banden van ongeveer 220 kDa werden waargenomen in de monsters van het voeden van rijst en speekselklieren van insecten op het membraan geïncubeerd met antilichamen tegen Vg. Daarentegen werd geen band waargenomen in het niet-voedende rijstmonster. Het resultaat in figuur 2 geeft aan dat Vg als speekseleiwit aan de plantgastheer werd vrijgegeven. Op het membraan geïncubeerd met antilichamen tegen RDV P8, werd ook een specifieke en verwachte band van ongeveer 46 kDa waargenomen in de monsters van rijst die was onderworpen aan voeding en de lichamen van virulifere insectenlichamen. Daarentegen werd geen band waargenomen in het niet-voedende rijstmonster en de niet-virulifere leafhopperlichamen, zoals weergegeven in figuur 3. Dit resultaat bewees dat de virale eiwitten ook in de voedende planten konden worden gedetecteerd.
Figuur 1: Overzicht van de stappen in de detectie van speekseleiwitten. De stappen omvatten insectenkweek, virusacquisitie, verzameling van speekseleiwitten via plantenvoeding en western blotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Western blot assay van Vg in planten- en insectenmonsters. Baan 1, niet-voedende planten; Baan 2, virulifere leafhopper-voedende planten; Baan 3, viruliferous leafhopper speekselklieren; Rijstrook M, markering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Western blot assay van P8 in planten- en insectenmonsters. Baan 1, niet-voedende planten; Baan 2, virulifere leafhopper-voedende planten; Baan 3, virulifere leafhopper lichamen; Baan 4, niet-virulifere leafhopper-lichamen; M, marker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buffer | Compositie | Opmerkingen/Beschrijving |
| 5x Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris basis 94 g glycine 5 g SDS in 1 L steriel water |
Voorraad oplossing |
| 1x Tris-glycine buffer | 200 ml 5x Tris-glycine buffer 800 ml steriel water |
Werkoplossing, voor SDS-PAGE |
| 10x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) buffer | 80 gr NaCl 30 g Tris basis 2 g KCl in 1 L steriel water |
Voorraad oplossing |
| TBS met Tween 20 (TBST)-oplossing | 100 ml 10x TBS oplossing 3 ml tween 20 900 ml steriel water |
Werkoplossing |
| 4x eiwitmonsterbuffer | 8 g SDS 4 ml β-mercaptoethanol 0,02 g broomfenol blauw 40 ml glycerol in 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) |
Voor eiwitextractie |
| Buffer voor overdrachten | 800 ml Tris-glycine buffer 200 ml methanol |
Voor eiwitoverdracht |
Tabel 1: Buffers, oplossingen en reagentia die in het onderzoek zijn gebruikt. De samenstelling van de buffers en de oplossingen, samen met hun gebruik, worden vermeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het speeksel dat direct wordt uitgescheiden door de speekselklieren van de piercing-zuigende insecten speelt een cruciale rol omdat het de weefsels van de gastheer en de cross-kingdom biologische factoren van de gastheer voorverteert en ontgift in de gastheren 1,3,4. De cross-kingdom biologische factoren, waaronder elicitors, effectoren en klein RNA, zijn van cruciaal belang voor de communicatie tussen insecten en gastheer14,15,16. Daarom zal het ontdekken van meer variëteiten en functies van speekselcomponenten het begrip van de relatie tussen insecten en gastheren bevorderen. Hier werd een detectiesysteem voor speekseleiwitten in de plantengastheer geleverd, dat verder onderzoek naar de functie van speekseleiwit in plantengastheren mogelijk zal maken.
Dit protocol biedt technieken om de speekseleiwitten van leafhoppers met piercing-zuigende monddelen te detecteren door de voedende planten te verzamelen. Enkele opmerkelijke punten moeten worden opgemerkt om de beste en betrouwbare resultaten te verkrijgen. (1) De virale lading in de geïnfecteerde rijstplanten is van cruciaal belang. De virale titers in rijstplanten hebben direct invloed op de verwerving van insecten. Wanneer de insectenkolonie zeer virulifer is, zal de kans op het verzamelen van virale eiwitten in speeksel in vitro worden verhoogd. Daarom zullen de virale eiwitten die uit het speeksel aan de plantengastheer worden vrijgegeven, veel gemakkelijker te detecteren zijn. Het kiezen van geïnfecteerde planten die significante symptomen vertonen, wordt aanbevolen om als bron voor virussen te dienen. (2) Timing van de detectie. Er wordt aangenomen dat sommige van de speekseleiwitten van voorbijgaande aard zijn in de plantengastheer omdat ze worden blootgesteld aan afbraak door de plantengastheer of verdund in de plant. Onmiddellijke detectie van de voedende planten na de 2-daagse voeding wordt aanbevolen. Er wordt ook verondersteld dat een langere retentietijd beter zou zijn voor sommige specifieke speekseleiwitten in de plant. Daarom kon de detectietiming van sommige speekseleiwitten in verdere studies worden bepaald. (3) Zorg ervoor dat er voldoende replica's zijn. Het aantal insecten dat overleeft, zal afnemen omdat de opgesloten insecten in de voederkooi beperkte activiteit en het vermogen om te voeden hebben. Het gebruik van voldoende replicaties zal helpen om de speekseleiwitten te verrijken. Drie tot vijf replica's zijn meestal voldoende. Als er slechts één replicatie is, zou het beter zijn om 15-20 leafhoppers te beperken om zich te voeden met één rijstzaailing.
Deze representatieve resultaten toonden de aanwezigheid van viraal eiwit P8 in de voedingsplant van virulifere leafhoppers. Er werd onthuld dat het virus vermengd met de stroom van speeksel vrijkomt uit de speekselklieren. Het werd vervolgens vrijgegeven van het insect naar de plantengastheer, waardoor uiteindelijk de virale horizontale transmissie werd voltooid. Het is echter nog onbekend of Vg de rol van uitlokker of effector speelt in het proces van insectenvoeding en of het de immuunrespons van de plantengastheer activeert of onderdrukt. Eerder werd het speeksel van meer dan 10.000 R. dorsalis verzameld via membraanvoeding en geanalyseerd met behulp van LC-MS / MS (ongepubliceerde gegevens). De aanwezigheid van Vg in het speeksel werd geverifieerd, hoewel de functie ervan onbekend is. Hier is bewezen dat Vg ook voorkomt in het speeksel van N. cincticeps en zelfs wordt afgegeven aan de plant. In combinatie met de studies op planthoppers16 wordt aangenomen dat de aanwezigheid van Vg in hemipteranspeeksel universeel is. Een nieuwe bevinding meldt dat de Vg van planthopperspeeksel een effector is om het afweersysteem van de plant te beschadigen34. Meer studies zijn nodig om te onderzoeken of de Vg in de meeste hemipteran speeksel functioneert als een effector. Er wordt aangenomen dat dit protocol een stabiele en betrouwbare methodologie biedt om de aanwezigheid van speekseleiwitten die door leafhoppers in planten worden uitgescheiden, te onderzoeken. Dit protocol zal naar verwachting van toepassing zijn op de detectie van speekseleiwitten van de meeste hemipterans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31772124 en 31972239) en Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).
- Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Wei, T., Li, Y.
- Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps. Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).
- Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae). Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).
- Miles, P. W. Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds. Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).
- Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).
- Miles, P. W., Peng, Z. Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids. Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).
- Will, T., van Bel, A. Physical and chemical interactions between aphids and plants. Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).
- Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments. Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).
- Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).
- Funk, C. J. Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant-insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment. Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. , (2018).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant--insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Sun, P., et al. A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy. Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).
- Sri-In, C., et al. A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).
- Conway, M. J., et al. Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection. Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).
- Wang, N., et al. A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).
- Omura, T., Yan, J. Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors. Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).
- Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus. Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).
- Fukushi, T. Further studies on the dwarf disease of rice plant. Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).
- Miyazaki, N., et al. The functional organization of the internal components of rice dwarf virus. Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).
- Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes. Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).
- Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector. Virology Journal. 12, 211 (2015).
- Chen, Q., et al. Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector. Virus Research. 210, 54-61 (2015).
- Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector. Scientific Reports. 7, 38563 (2017).
- Wei, T., et al. The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures. Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).
- Mao, Q., et al. Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development. mBio. 11 (6), 01142 (2020).
- Tufail, M., Takeda, M.
- Sappington, T. W., Raikhel, A. S. Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).
- Ji, R., et al. Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses. New Phytologist. , (2021).
