Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توليد الجينات والضربة القاضية في أنواع Strongyloides عن طريق الحقن المجهري

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/63023
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

تتضمن مجموعة الأدوات الجينومية الوظيفية للديدان الخيطية الطفيلية Strongyloides stercoralis و Strongyloides ratti التحول ، والطفرات بوساطة CRISPR / Cas9 ، و RNAi. سيوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية لإدخال الجينات المحورة ومكونات كريسبر في S. stercoralis و S. ratti.

Abstract

يتكون جنس Strongyloides من أنواع متعددة من الديدان الخيطية المخترقة للجلد مع نطاقات مضيفة مختلفة ، بما في ذلك Strongyloides stercoralis و Strongyloides ratti. S. stercoralis هو نيماتودا بشرية طفيلية تخترق الجلد تصيب ما يقرب من 610 ملايين شخص ، في حين أن طفيلي الفئران S. ratti يرتبط ارتباطا وثيقا ب S. stercoralis وغالبا ما يستخدم كنموذج مختبري ل S. stercoralis. كل من S. stercoralis و S. ratti قابلان بسهولة لتوليد الديدان المحورة والتناسلية والضربة القاضية من خلال تقنية توصيل الحمض النووي الخارجي للحقن المجهري داخل الغدد التناسلية ، وعلى هذا النحو ، ظهرت كأنظمة نموذجية للديدان الطفيلية الأخرى التي لم تكن قابلة بعد لهذه التقنية.

يعيش البالغون الطفيليون Strongyloides في الأمعاء الدقيقة لمضيفهم ويطلقون ذرية في البيئة عبر البراز. بمجرد وصولها إلى البيئة ، تتطور اليرقات إلى بالغين يعيشون بحرية ، ويعيشون في البراز وينتجون ذرية يجب أن تجد وتغزو مضيف جديد. هذا الجيل البيئي فريد من نوعه لأنواع Strongyloides ومشابه بما فيه الكفاية في مورفولوجيا لنموذج الديدان الخيطية الحية الحرة Caenorhabditis elegans بحيث يمكن تكييف التقنيات التي تم تطويرها ل C. elegans للاستخدام مع هذه الديدان الخيطية الطفيلية ، بما في ذلك الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية. باستخدام الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية ، يمكن إدخال مجموعة واسعة من الجينات المحورة في Strongyloides. يمكن أيضا حقن مكونات كريسبر / كاس9 الدقيقة لإنشاء يرقات Strongyloides المتحولة. هنا ، يتم وصف تقنية الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية في Strongyloides ، بما في ذلك إعداد البالغين الذين يعيشون بحرية ، وإجراء الحقن ، واختيار النسل المعدل وراثيا. يتم تضمين صور يرقات Strongyloides المعدلة وراثيا التي تم إنشاؤها باستخدام طفرات CRISPR / Cas9. الهدف من هذه الورقة هو تمكين الباحثين الآخرين من استخدام الحقن المجهري لإنشاء Strongyloides المعدلة وراثيا والمتحولة.

Introduction

منذ فترة طويلة تم التغاضي عن Strongyloides stercoralis كممرض بشري مهم مقارنة بالديدان الخطافية المعترف بها على نطاق واسع والدودة المستديرة Ascaris lumbricoides1. غالبا ما قللت الدراسات السابقة لعبء الدودة بشدة من انتشار S. stercoralis بسبب الحساسية المنخفضة لطرق التشخيص الشائعة ل S. stercoralis2. في السنوات الأخيرة ، قدرت الدراسات الوبائية القائمة على أدوات التشخيص المحسنة أن الانتشار الحقيقي لعدوى S. stercoralis أعلى بكثير مما تم الإبلاغ عنه سابقا ، أي ما يقرب من 610 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم2.

كل من S. stercoralis وأنواع Strongyloides الأخرى ، بما في ذلك طفيلي الفئران المرتبط ارتباطا وثيقا ونموذج المختبر المشترك S. ratti ، لديهم دورة حياة غير عادية مفيدة للدراسات الجينومية التجريبية لأنها تتكون من أجيال طفيلية وحرة (بيئية)3 (الشكل 1). على وجه التحديد ، يمكن لكل من S. stercoralis و S. ratti التنقل عبر جيل واحد من العيش الحر. يتكون جيل العيش الحر من يرقات ما بعد الطفيلية التي تتطور إلى ذكور وإناث بالغين يعيشون بحرية. تتطور جميع ذرية البالغين الذين يعيشون بحرية إلى يرقات معدية ، والتي يجب أن تصيب المضيف لمواصلة دورة الحياة. علاوة على ذلك ، يمكن التلاعب بهذا الجيل البيئي أو الحي الحر تجريبيا في المختبر. نظرا لأن البالغين الذين يعيشون بحرية في Strongyloides و C. elegans البالغين يشتركون في مورفولوجيا مماثلة ، يمكن تكييف تقنيات مثل الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية التي تم تطويرها في الأصل ل C. elegans للاستخدام مع Strongyloides 4,5 البالغين الذين يعيشون بحرية. في حين يتم إدخال الحمض النووي بشكل عام في الإناث البالغات اللواتي يعشن بحرية ، يمكن حقن كل من الذكور والإناث من Strongyloides 6. وبالتالي ، تتوفر أدوات الجينوم الوظيفية لاستجواب العديد من جوانب بيولوجيا Strongyloides. تفتقر الديدان الخيطية الطفيلية الأخرى إلى جيل يعيش بحرية ، ونتيجة لذلك ، فهي ليست قابلة بسهولة للتقنيات الجينومية الوظيفية3.

Figure 1
الشكل 1: دورة حياة سترونغيلويدات ستيركوراليس. تعيش الإناث الطفيلية S. stercoralis في الأمعاء الدقيقة لمضيفيها من الثدييات (البشر ، الرئيسيات غير البشرية ، الكلاب). تتكاثر الإناث الطفيلية عن طريق التوالد العذري وتضع البيض داخل الأمعاء الدقيقة. يفقس البيض بينما لا يزال داخل المضيف إلى يرقات ما بعد الطفيلية ، والتي يتم تمريرها بعد ذلك إلى البيئة مع البراز. إذا كانت يرقات ما بعد الطفيليات من الذكور ، فإنها تتطور إلى ذكور بالغين يعيشون بحرية. إذا كانت يرقات ما بعد الطفيلية أنثى ، فيمكنها إما أن تتطور إلى إناث بالغات يعشن بحرية (تطور غير مباشر) أو يرقات معدية في المرحلة الثالثة (iL3s ؛ تطور مباشر). الذكور والإناث الذين يعيشون بحرية يتكاثرون جنسيا لخلق ذرية مقيدة لتصبح iL3s. في ظل ظروف معينة ، يمكن أن يخضع S. stercoralis أيضا للعدوى الذاتية ، حيث تبقى بعض يرقات ما بعد الطفيلية داخل الأمعاء المضيفة بدلا من المرور إلى البيئة في البراز. يمكن أن تتطور هذه اليرقات إلى يرقات ذاتية العدوى (L3a) داخل المضيف ، وتخترق جدار الأمعاء ، وتهاجر عبر الجسم ، وتعود في النهاية إلى الأمعاء لتصبح بالغين تناسليين. دورة حياة S. ratti متشابهة ، باستثناء أن S. ratti يصيب الفئران وليس لديه دورة عدوى ذاتية. الجيل البيئي هو المفتاح لاستخدام أنواع Strongyloides للدراسات الوراثية. يمكن حقن الإناث البالغات اللواتي يعشن بحرية (P0) بشكل مجهري ؛ ذريتهم ، والتي ستصبح جميعها iL3s ، هي المعدلة وراثيا F1 المحتملة. وقد عدل هذا الرقم من كاستيليتو وآخرين. 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تشترك S. stercoralis في العديد من جوانب بيولوجيتها مع الديدان الخيطية الطفيلية البشرية المعدية المعوية الأخرى ، بما في ذلك غزو المضيف وتعديل المناعة المضيفة. على سبيل المثال ، تصيب الديدان الخطافية البشرية الطفيلية في الأجناس Necator و Ancylostoma أيضا عن طريق اختراق الجلد ، وتتنقل بالمثل عبر الجسم ، وتقيم في النهاية كبالغين طفيليين في الأمعاء الدقيقة7. وبالتالي ، من المحتمل أن تستخدم العديد من الديدان الخيطية المعدية المعوية السلوكيات الحسية الشائعة وتقنيات التهرب المناعي. ونتيجة لذلك ، فإن المعرفة المستقاة من Strongyloides ستكمل النتائج في الديدان الخيطية الأخرى الأقل قابلية للسحب وراثيا وتؤدي إلى فهم أكثر اكتمالا لهذه الطفيليات المعقدة والمهمة.

يحدد بروتوكول الحقن المجهري هذا طريقة إدخال الحمض النووي في الإناث البالغات اللواتي يعشن بحرية في Strongyloides لصنع ذرية معدلة وراثيا ومتحولة. يتم وصف متطلبات صيانة السلالة ، بما في ذلك التوقيت التنموي للديدان البالغة للحقن المجهري وجمع النسل المعدل وراثيا. يتم تضمين البروتوكولات وعرض توضيحي لتقنية الحقن المجهري الكاملة ، إلى جانب بروتوكولات زراعة وفحص النسل المعدل وراثيا ، إلى جانب قائمة بجميع المعدات والمواد الاستهلاكية اللازمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم استخدام الجربلات لمرور S. stercoralis ، واستخدمت الفئران لتمرير S. ratti. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل مكتب الإشراف على البحوث الحيوانية بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (البروتوكول رقم 2011-060-21A) ، الذي يلتزم بمعايير AAALAC ودليل رعاية واستخدام المختبر. يجب إكمال المهام التالية قبل يوم واحد على الأقل من الحقن المجهري: زراعة الديدان ، وإعداد منصات الحقن المجهري ، وإنشاء تركيبات لمزيج الحقن المجهري ، ونشر البكتيريا (E. coli HB101) على ألواح وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) مقاس 6 سم8. تحتاج الإناث اللواتي يعشن بحرية إلى جمع ما لا يقل عن 24 ساعة بعد البراز عند 25 درجة مئوية ليتطورن إلى شباب بالغين قبل أن يتم حقنهن بالميكرو. يجب أن تكون منصات الحقن المجهري جافة تماما. يجب أن تجف الألواح البكتيرية وتنشئ حديقة صغيرة.

1. إعداد شرائح الحقن المجهري: قبل يوم واحد على الأقل من الحقن

ملاحظة: يتم تركيب الديدان على أغطية الحقن المجهري مع منصات أجار جافة للحقن.

  1. اضبط كتلة الحرارة على 90 درجة مئوية.
  2. أضف 5 مل من ddH2O ، ثم 100 ملغ من الأغاروز إلى أنبوب زجاجي من البورسليكات.
  3. سخني مزيج الأغاروز في الأنبوب فوق اللهب حتى يذوب الأغاروز.
  4. ضع الأنبوب في كتلة حرارية محددة عند 90 درجة مئوية للحفاظ على الأغاروز في الحالة السائلة.
  5. أسقط ~ 180 ميكرولتر من محلول الأغاروز على غطاء باستخدام ماصة باستور زجاجية أو ماصة ذات طرف بلاستيكي. قم على الفور بإسقاط غطاء ثان في الأعلى لتسطيح الأغاروز في وسادة رقيقة.
  6. بعد 5-10 ثوان ، قم بإزالة الغطاء العلوي عن طريق تحريك الاثنين بعيدا. حدد الشريحة التي توجد عليها لوحة الأجار وضعها وجها لوجه.
  7. حدد قطعة صغيرة من شظايا الزجاج من غطاء مكسور واضغط عليها برفق في الأجار بالقرب من الحافة العلوية للوسادة باستخدام ملقط (الشكل التكميلي S1).
  8. استمر في صنع منصات الحقن المجهري بمحلول الأغاروز.
  9. جفف وسادات الأغاروز طوال الليل على المقعد أو في الفرن. يخزن في صندوق الغطاء.
    ملاحظة: يمكن استخدام منصات الأغاروز لمدة تصل إلى 2 أشهر ولكنها تستخدم فقط لتشغيل حقن واحد.

2. زراعة Strongyloides للحصول على الديدان للحقن المجهري: 1-2 أيام قبل الحقن

ملاحظة: يمكن العثور على بروتوكول صيانة الإجهاد في المادة التكميلية ، والذي يتضمن وصفا مفصلا لكيفية إصابة الجربلات والجرذان بالديدان الخيطية وحصاد الديدان الخيطية من براز الحيوانات المصابة.

  1. قبل يومين من يوم الحقن ، ضع الحيوانات المصابة 9,10 في أقفاص التجميع بين عشية وضحاها.
  2. في صباح اليوم التالي ، جمع البراز الموبوء وجعل لوحات الفحم البرازي 9,10.
  3. ضع صفيحة على درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح للديدان الحية الحرة بالتطور إلى شباب.
  4. في الليلة السابقة ليوم الحقن ، ضع الحيوانات المضيفة غير المصابة في أقفاص التجميع.
  5. في يوم الحقن ، اجمع البراز غير المصاب لزراعة ما بعد الحقن.

3. جعل مزيج الحقن المجهري: قبل أو في يوم الحقن

ملاحظة: يتكون مزيج الحقن المجهري من البلازميدات ذات الأهمية المخففة إلى التركيز المطلوب في محلول ملحي مخزن مؤقتا بالديدان (BU) (50 mM Na 2 HPO4 ، 22 mM KH2PO4 ، 70 mM NaCl)11.

  1. تحديد تركيز مخزون البلازميد والتركيز المطلوب في مزيج الحقن المجهري (الجدول 1).
مزيج الحقن المجهري: بناء المراسل
مكون تركيز المخزون مبلغ التركيز النهائي
pMLC30 غبا - 3::غف ف 300 نانوغرام/ميكرولتر 1.7 ميكرولتر 50 نانوغرام/ميكرولتر
بو غير متوفر 8.3 ميكرولتر غير متوفر
مجموع 10 ميكرولتر 50 نانوغرام/ميكرولتر
مزيج الحقن المجهري: طفرات كريسبر/كاس9
مكون تركيز المخزون مبلغ التركيز النهائي
pMLC47 الضريبة-4 sgRNA 300 نانوغرام/ميكرولتر 2.7 ميكرولتر 80 نانوغرام/ميكرولتر
pEY11 Ss-tax-4 HDR بلازميد 400 نانوغرام/ميكرولتر 2.0 ميكرولتر 80 نانوغرام/ميكرولتر
pPV540 strCas9 بلازميد 350 نانوغرام/ميكرولتر 1.1 ميكرولتر 40 نانوغرام/ميكرولتر
بو غير متوفر 4.2 ميكرولتر غير متوفر
مجموع 10 ميكرولتر 200 نانوغرام/ميكرولتر
مزيج الحقن المجهري: تكامل piggyBac
مكون تركيز المخزون مبلغ التركيز النهائي
pMLC30 gpa3::gfp 300 نانوغرام/ميكرولتر 2.0 ميكرولتر 60 نانوغرام/ميكرولتر
pPV402 بلازميد الترانسبوساز 450 نانوغرام/ميكرولتر 0.9 ميكرولتر 40 نانوغرام/ميكرولتر
بو غير متوفر 7.1 ميكرولتر غير متوفر
مجموع 10 ميكرولتر 100 نانوغرام/ميكرولتر

الجدول 1: أمثلة على خلطات الحقن المجهري. البلازميدات والتركيزات لثلاثة أمثلة على مزيج الحقن المجهري: واحد لمراسل GPA-3::GFP بناء 10 ، واحد لتعطيل كريسبر / Cas9 بوساطة موضع Ss-tax-4 14,15 ، وواحد للتكامل بوساطة أصبع Bac لبناء Ss-gpa-3::GFP 13,17,18. strCas9 يدل على جين Cas9 المحسن للكودون Strongyloides. تستخدم التركيزات النهائية المدرجة بشكل شائع في خلطات الحقن المجهري Strongyloides.

  1. تمييع البلازميدات في BU إلى حجم إجمالي من 10-20 ميكرولتر.
  2. قم بتدوير المزيج من خلال عمود مرشح على مساحة 5000 × جم لمدة 1-2 دقيقة.
  3. استخدم مزيج الحقن المجهري على الفور أو قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

4. جمع الشباب البالغين Strongyloides للحقن المجهري: صباح يوم الحقن

  1. قم بإعداد جهاز Baermann مع 1 صفيحة فحم برازي من Strongyloides الشباب البالغين (الشكل 2).
    ملاحظة: قد تحتوي صفيحة الفحم البرازي على بعض اليرقات المعدية. تتكون معدات الحماية الشخصية من معطف المختبر والقفازات وحماية العين. لا ينبغي أن يتعرض أي جلد بين القفاز وكم معطف المختبر.

Figure 2
الشكل 2: جهاز بيرمان المستخدم لجمع الديدان الطفيلية من الثقافات10. يتم وضع محتويات صفيحة الفحم البرازي في الجزء العلوي من عمود من الماء الدافئ. تهاجر الديدان إلى الماء وتتجمع في قاع القمع. (أ) لإعداد جهاز Baermann ، يتم تثبيت حامل قمع Baermann على المقعد بمشبك C. يتم إغلاق أنبوب مطاطي متصل بنهاية القمع بمشابك قرصة ، ويتم وضع دلو صيد أسفل الأنبوب للتنقيط. يضاف الماء الدافئ إلى القمع الزجاجي. (ب) ثم يتم تبطين حامل الحلقة البلاستيكية لمزيج البراز والفحم ب 3 قطع من أنسجة المختبر (يسار). يتم استخدام عصا خشبية أو مثبط لسان (وسط) لنقل محتويات صفيحة الفحم البرازي (يمين) إلى حامل الحلقة البلاستيكية. (ج) صورة مقربة لأسفل حامل الحلقة البلاستيكية لمزيج البراز والفحم، تظهر الطبقة المزدوجة من تول النايلون المبطن لأسفل الحامل. (د) ثم يوضع حامل الفحم البرازي في الجزء العلوي من القمع الزجاجي. (ه) يتم ترطيب الأنسجة المختبرية بالماء وإغلاقها فوق مزيج البراز والفحم. يضاف المزيد من الماء الدافئ لغمر الفحم البرازي في الغالب. (و) إعداد بيرمان الكامل، مع غمر ثقافة البراز والفحم تحت الماء الدافئ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قم بتثبيت قمع زجاجي مع أنابيب جمع مطاطية على حامل دائري باستخدام حلقة O وقم بتأمينه بمشبك. أغلق أنبوب المجموعة بمشابك قرصة 2 (الشكل 2A).
  2. ضع دلو صيد أسفل القمع لالتقاط التنقيط.
  3. أضف ماء دافئا (حوالي 40 درجة مئوية) إلى القمع إلى 5 سم أسفل الحافة. تحقق من عدم تسرب النظام.
  4. خط حامل بيرمان ، وهو غربال مصنوع من 2 حلقات بلاستيكية مع طبقتين من معاوضة تول النايلون المؤمنة بينهما ، مع 3 قطع متداخلة من أنسجة المختبر. أضف خليط البراز والفحم إلى حامل بيرمان (الشكل 2B ، C).
  5. ضع حامل Baermann مع خليط البراز والفحم في القمع. قم بطي الأنسجة حول مزيج البراز والفحم وأضف ما يكفي من الماء لغمر معظم الفحم البرازي. لا تملأ أكثر من 2 سم من حافة القمع (الشكل 2D ، E).
  6. ضعي فوق القمع غطاء طبق بتري بلاستيكي بطول 15 سم لاحتواء الرائحة. قم بتسمية القمع حسب الحاجة (الشكل 2F).
  7. انتظر 30 دقيقة إلى 1 ساعة لجمع الديدان من جهاز بيرمان.
  8. امسك أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل تحت الأنابيب المطاطية في الجزء السفلي من القمع. افتح المشابك بعناية في الجزء السفلي لتوزيع 30-40 مل من الماء الذي يحتوي على الديدان في أنبوب 50 مل.
  9. نقل 15 مل من مياه بيرمان التي تحتوي على الديدان إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بتدوير أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل لمدة 1 دقيقة عند ~ 750 × جم (بطيء). بدلا من ذلك ، اسمح للديدان بالجاذبية لمدة 10-15 دقيقة.
  10. إزالة supernatant إلى ~ 2 مل والتخلص من supernatant في حاوية سائلة النفايات مع اليود لقتل أي ديدان.
  11. أضف المزيد من ماء بيرمان إلى أنبوب التجميع سعة 15 مل وكرر الدوران. قم بإزالة supernatant إلى ~ 2 مل وتجاهل كما في الخطوة 4.11.
  12. كرر الخطوتين 4.11 و4.12 حتى يتم جمع جميع الديدان في أنبوب جهاز الطرد المركزي سعة 15 مل. بعد الدوران النهائي ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء.
  13. افحص حبيبات الديدان (40-100 ميكرولتر) في أسفل الأنبوب. إذا لم تكن هناك ديدان مرئية ، فانتظر 1-2 ساعة أخرى وحاول جمع المزيد من الديدان من جهاز بيرمان.
  14. انقل الديدان في أقل قدر ممكن من الماء إلى صفيحة NGM بحجم 6 سم 2٪ مع حديقة من E. coli HB101. استخدم هذه اللوحة كلوحة مصدر للحقن المجهري.
  15. تخلص من مزيج الفحم البرازي عن طريق معالجته باليود المخفف (تخفيف بنسبة 50٪ من يود Lugol في الماء) ، ولفه في فيلم بلاستيكي لالتقاط قطرات ، ووضعه في حاوية نفايات خطرة بيولوجيا.
  16. أضف 10 مل من اليود المخفف إلى دلو الصيد واستنزاف الماء الزائد من بيرمان فيه.
  17. اغسل المكونات القابلة لإعادة الاستخدام (القمع ، دلو الصيد ، حامل البلاستيك مع تول ، الغطاء البلاستيكي ، والمشابك) مع 10٪ من المبيض وشطفها جيدا.

5. سحب وتحميل إبر الحقن المجهري: قبل الحقن مباشرة

  1. تحضير إبر الحقن المجهري عن طريق سحب الأنابيب الشعرية الزجاجية باستخدام مجتذب الإبرة.
    ملاحظة: من الأمثلة على الإعدادات الخاصة بمجتذب إبرة تجاري مزود بخيوط بلاتينية/إيريديوم مقاس 3 مم الحرارة = 810-820، السحب = 800-820، الميكرومتر = 2.5.
  2. عرض النصائح تحت المجهر تشريح. إذا كانت الإبر لها الشكل المطلوب (الشكل 3A-F) ، فاسحب 4-6 إبر (2-3 أنابيب شعرية). لتحقيق شكل الإبرة المناسب ، قم بتغيير الإعدادات حسب الحاجة: اضبط إعدادات الحرارة أو السحب بمقدار 10 وسحب إبر جديدة حتى يصبح شكل المستدق والعمود أكثر ملاءمة.

Figure 3
الشكل 3: إبر الحقن المجهري وأنثى Strongyloides stercoralis البالغة مع تحديد المواقع المثلى للحقن المجهري. (A-F) صور إبر الحقن المجهري. (أ-ب) تفتق العمود (A) وطرف (B) من إبرة التي تم تشكيلها بشكل صحيح للحقن المجهري. الطرف حاد بما يكفي لاختراق البشرة وضيق بما يكفي لعدم التسبب في ضرر مفرط. (C-D) تفتق العمود (C) وطرف (D) لإبرة الحقن المجهري التي تم تشكيلها بشكل غير صحيح للحقن المجهري. الطرف حاد جدا وواسع ، وسوف يسبب أضرارا مفرطة للدودة. (E-F) تفتق العمود (E) وطرف (F) من إبرة من المرجح أن تكون طويلة جدا ونحيلة للعمل للحقن المجهري. الطرف في F يشبه إلى حد كبير الطرف الموجود في D. ومع ذلك ، فإن العمود أضيق ومرن للغاية بحيث لا يمكنه اختراق البشرة بشكل فعال. بالإضافة إلى ذلك ، تسد الإبر النحيلة جدا بسهولة. (ز) صورة للدودة بأكملها موضوعة بشكل صحيح للحقن المجهري، على افتراض أن الإبرة قادمة من اليمين. الأمامي هو أسفل وإلى اليسار. يشار إلى الفرج بواسطة رأس السهم. الغدد التناسلية مرئية على طول الجانب الأيمن من الأنثى. هذه الأنثى لديها بويضة واحدة فقط في رحمها (المشار إليها بالعلامة النجمية). (ح، ط) طرق عرض مكبرة لمواقع الحقن المجهري. زاوية السهم تقترب من زاوية إبرة الحقن. يمكن استخدام الفرج كمعلم. إنه على الجانب الآخر من الدودة من ذراعي الغدد التناسلية. أذرع منحنى الغدد التناسلية حول الأمعاء ، والنهايات مع النوى المنقسمة هي مقابل الفرج. (ح) الذراع الخلفي للغدد التناسلية؛ (I) الذراع الأمامية. يمكن حقن أي من الذراعين أو كليهما. بالنسبة ل H و I ، تكون الاتفاقيات كما في G. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (B ، D ، F ، H ، I) ؛ 100 ميكرومتر (A، C، E، G). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قم بتخزين الإبر المسحوبة في طبق بتري بلاستيكي مقاس 15 سم مع قطعة من الشريط المدلفن لتأمين الإبر وتجنب تراكم الغبار على الأطراف.
  2. ضع قطرة 0.7 ميكرولتر من مزيج الحقن المجهري على الطرف المفتوح من العمود. قم بتعليق الإبرة عموديا على الرف باستخدام قطعة ملفوفة من الشريط لملء العمود المدبب بالمزيج في غضون 10 دقائق. إعداد 2 إبر في وقت واحد في حالة عدم عمل الأول.

6. تحضير المجهر وكسر الإبرة

ملاحظة: يستخدم الحقن المجهري مجهرا مقلوبا بأهداف 5x و 40x مجهزة بإعداد حاقن دقيق للتحكم في حركة الإبرة. يجب وضع المجهر المقلوب على طاولة ثقيلة أو طاولة هواء مضادة للاهتزاز لتقليل الضوضاء الاهتزازية. يتم توصيل حامل إبرة الحاقن الدقيق بغاز النيتروجين الذي يطبق الضغط اللازم لتوصيل مزيج الحقن المجهري. يتم استخدام مجهر تشريح أصغر في مكان قريب لنقل الديدان.

  1. اضبط ضغط خزان الغاز على ~ 40-60 رطل لكل بوصة مربعة لكسر الإبرة وعلى ~ 30-50 رطل لكل بوصة مربعة للحقن الدقيق ، اعتمادا على تدفق السائل.
  2. على المجهر التشريحي ، قم بتغطية شظايا الزجاج على غطاء وسادة الحقن المجهري بزيت الهالوكربون باستخدام اختيار دودة البلاتين القياسية.
  3. ضع غطاء وسادة الحقن المجهري على منظار الحقن المجهري وحدد موقع شظية الزجاج المغطى بالزيت. قم بمحاذاة شظية الزجاج بحيث تكون الحافة عمودية على اتجاه الإبرة لتكون بمثابة السطح المستخدم لكسر الإبرة.
  4. تحقق من أن الإبرة لا تحتوي على فقاعات أو حطام في العمود المدبب باستخدام مجهر التشريح. ثم ، قم بتثبيت الإبرة 1-1.5 سم في الحامل المضغوط.
  5. ضع طرف الإبرة في وسط مجال رؤية المجهر بالعين. ثم تحت التكبير المنخفض ، ضع طرف الإبرة في مجال الرؤية ، عموديا على جانب شظية الزجاج.
  6. قم بالتبديل إلى طاقة عالية وقم بمحاذاة طرف الإبرة مع حافة الزجاج ، بالقرب منه ولكن دون لمسه.
    ملاحظة: عند سحبها، يتم دمج الإبر مغلقة.
  7. لكسر طرف الإبرة للسماح بتدفق السائل، اضغط عليه برفق على جانب قطعة الزجاج مع تطبيق ضغط مستمر من الغاز (الشكل التكميلي S1). بمجرد أن يبدأ السائل في التدفق ، تحقق من شكل الطرف وتأكد من أنه حاد مع سائل سهل التدفق.
    ملاحظة: إذا كان السائل يتدفق بسرعة كبيرة أو كانت النهاية حادة جدا ، فسوف تتلف الديدان أثناء الحقن المجهري (الفيديو 1 والشكل 3A-F).
  8. عندما يتدفق السائل جيدا من الإبرة ، حرك شريحة الحقن المجهري إلى نطاق التشريح وضع قطرات من زيت الهالوكربون 1-2 ميكرولتر على وسادة الأجار لوضع الديدان.
  9. انقل 20-30 شابا بالغا من Strongyloides إلى صفيحة NGM بنسبة 2٪ بدون بكتيريا لمدة 5 دقائق على الأقل لإزالة البكتيريا السطحية الزائدة واختيار الديدان المفردة للحقن المجهري. أضف المزيد من الديدان إلى لوحة NGM حسب الحاجة أثناء الحقن.

7. الحقن الدقيق Strongyloides

  1. استخدم كمية صغيرة من زيت الهالوكربون على اختيار دودة لاختيار أنثى شابة بالغة من Strongyloides مع 1-4 بيضات في الغدد التناسلية من صفيحة NGM 2٪ بدون بكتيريا.
  2. انقل الدودة إلى قطرة صغيرة من الزيت على وسادة الأجار. باستخدام اختيار الدودة ، ضع الدودة بلطف حتى لا يتم لفها وتكون الغدد التناسلية مرئية ويسهل الوصول إليها. لاحظ اتجاه الغدد التناسلية (الشكل 3G).
  3. ضع الدودة في مجال رؤية مجهر الحقن المجهري. تأكد من أن الغدد التناسلية على نفس جانب الإبرة ووضعها بحيث تتصل الإبرة بالغدد التناسلية بزاوية طفيفة (الشكل 3H ، I).
  4. أحضر طرف الإبرة إلى جانب الدودة في نفس المستوى البؤري. استهدف ذراع الغدد التناسلية بالقرب من منتصف الدودة. استخدم الحاقن الدقيق لإدخال الإبرة بلطف في الغدد التناسلية (فيديو 2).
  5. اضغط على الفور على الإبرة لملء ذراع الغدد التناسلية بالكامل بمحلول الحمض النووي. حدد بالعين متى تم حقن كمية كافية من السوائل (فيديو 2).
    ملاحظة: قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 2 ثانية لملء الغدد التناسلية.
  6. قم بإزالة الإبرة وتحقق لتحديد أن الجرح يغلق.
    ملاحظة: الدودة تالفة جدا لإنتاج ذرية إذا برزت الغدد التناسلية من خلال جدار الجسم (الفيديو التكميلي S1).
  7. كرر ذلك مع الذراع الأخرى من الغدد التناسلية إذا كان مرئيا.
  8. عند الانتهاء من الحقن ، تحقق بسرعة من عدم انسداد الإبرة عن طريق الضغط بطرف الإبرة على وسادة أجار. انقل الشريحة مع الدودة المحقونة إلى المجهر التشريحي.
  9. لاستعادة الدودة المحقونة ، ضع أولا بضع قطرات من BU على الدودة لتعويمها من وسادة الأجار.
  10. جمع كمية صغيرة من البكتيريا HB101 على اختيار دودة. المس الدودة مع البكتيريا الملتصقة على الدودة لإزالتها من السائل.
  11. انقل الدودة بلطف إلى لوحة الاسترداد ، وهي لوحة NGM بنسبة 2٪ تحتوي على حديقة HB101.
    ملاحظة: يجب أن تبدأ الدودة في الزحف في غضون دقائق.
  12. بعد حقن عدد قليل من الإناث ، أضف بعض الذكور غير المحقونين من لوحة المصدر.
    ملاحظة: ما لا يقل عن ذكر واحد لكل خمس إناث هو خط أساس جيد؛ يفضل وجود فائض من الذكور.
  13. كرر جميع الخطوات حتى يتم حقن عدد كاف من الإناث للتجربة.
  14. اترك البالغين على لوحة الاسترداد لمدة 1 ساعة على الأقل بعد الحقن للسماح للديدان بالتعافي والتزاوج.

8. استعادة وزراعة Strongyloides حقن

  1. جمع البراز بين عشية وضحاها من الحيوانات المضيفة غير المصابة ، باستخدام نفس البروتوكول كما هو الحال بالنسبة للحيوانات المصابة.
  2. امزج البراز غير الموبوء بكمية صغيرة من الفحم (نسبة البراز إلى الفحم من حوالي 2 إلى 1 لهذه اللوحات).
  3. صب كمية صغيرة من مزيج البراز والفحم في طبق بتري 6 سم مبطن بورق ترشيح رطب. تأكد من أن المزيج لا يلمس غطاء الطبق.
  4. قم بإغراق لوحة الاسترداد ب BU. باستخدام ماصة محددة في 3 ميكرولتر ، انقل الديدان إلى البراز في صفيحة الفحم البرازي. ضع الديدان مباشرة على البراز ، وليس على الفحم.
  5. تحقق من أن البالغين على صفيحة الفحم البرازي باستخدام منظار تشريح.
  6. لزراعة الديدان ، ضع اللوحة في غرفة رطبة ، أي صندوق بلاستيكي بغطاء محكم مبطن بمناشف ورقية رطبة.
    ملاحظة: بعد 2 أيام ، سيكون هناك مزيج من مراحل اليرقات. بعد 5 أيام ، ستكون معظم اليرقات قد تطورت إلى iL3s. ستبقى بعض اليرقات الأصغر سنا. بعد 7 أيام ، يجب أن تكون جميع اليرقات iL3s.

9. جمع وفحص يرقات F 1 لاستعادة الجينات / الضربات القاضية

  1. باستخدام إعداد بيرمان ، اجمع اليرقات من ألواح زراعة البراز والفحم الصغيرة بعد الحقن. للحصول على أكبر عدد ممكن من اليرقات ، انتظر لمدة 2 ساعة على الأقل قبل استعادة الديدان من جهاز بيرمان.
  2. ركز اليرقات في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل كما هو الحال في الخطوات 4.10-4.14 وانقل اليرقات إلى زجاج ساعة صغير باستخدام BU.
  3. إذا تم استخدام اليرقات في التجارب السلوكية ، فاستخدم ألواح NGM بنسبة 2٪ مع حديقة سميكة من HB101 للفحص.
    1. نقل 20-30 يرقات إلى العشب HB101.
      ملاحظة: سوف تبطئ البكتيريا حركة اليرقات.
    2. تحت مجهر تشريح التألق ، حدد اليرقات التي تعبر عن الجين المتحول محل الاهتمام. استخدم اختيار دودة لتحديد اليرقات المعدلة وراثيا ونقلها إلى زجاج ساعة صغير مع BU.
    3. استخدم لوحة HB101 جديدة لفحص مجموعة صغيرة أخرى من اليرقات. عندما يتم جمع ما يكفي من اليرقات للاستخدام التجريبي ، عالج ألواح HB101 والديدان الزائدة باليود المخفف (50٪ من يود Lugol المخفف في الماء) وتخلص منها كنفايات بيولوجية. بدلا من ذلك ، اقتل الديدان الزائدة باستخدام منظف بيت الكلب المركز الذي يحتوي على كلوريد الأمونيوم ألكيل بنزيل.
    4. استخدم الديدان على الفور أو اتركها في زجاج ساعة ضحل في كمية صغيرة من BU بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: قد تصبح الديدان ناقصة الأكسجة إذا كان السائل عميقا جدا. من الممكن أن يؤثر ترك اليرقات في BU بين عشية وضحاها على بعض السلوكيات ؛ لذلك ، استخدم اليرقات للتجارب السلوكية في غضون 6 ساعات.
  4. إذا تم استخدام اليرقات للفحص المجهري وليس للفحوصات السلوكية ، فقم بشل حركة الديدان عن طريق شلل النيكوتين بشكل عكسي للفحص.
    1. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بتسجيل شبكة على الجزء السفلي البلاستيكي للوحة 10 سم من التاكسي الكيميائي12 لتسهيل تتبع موقع الديدان على اللوحة.
    2. إسقاط ~ 3 ميكرولتر من اليرقات في BU في مربع على الشبكة. املأ أكبر عدد ممكن من المربعات حسب الحاجة. لا تستخدم تلك الموجودة بالقرب من حواف اللوحة ، لأن اليرقات قد تزحف إلى جانبي اللوحة.
    3. أضف قطرات 15-20 ميكرولتر من 1٪ من النيكوتين في الماء إلى قطرات الدودة.
      ملاحظة: بعد 4 دقائق ، ستصاب الديدان بالشلل.
    4. فحص الديدان باستخدام مجهر تشريح التألق.
    5. استخدم اختيار دودة لنقل اليرقات المعدلة وراثيا إلى زجاج ساعة صغير مع 1-2 مل من BU.
      ملاحظة: سوف تصاب اليرقات بالشلل لعدة ساعات ويمكن تركيبها بسهولة على شرائح المجهر للفحص المجهري. إذا تركت بين عشية وضحاها في BU ، فسوف يتعافى iL3s ويمكن استخدامه لبعض الفحوصات أو عدوى مضيف الثدييات. ومع ذلك ، قد يؤثر شلل النيكوتين والحضانة بين عشية وضحاها في BU على بعض السلوكيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إذا نجحت التجربة ، فإن يرقات F1 ستعبر عن النمط الظاهري للجين و / أو المتحور (الشكل 4). ومع ذلك ، فإن معدلات التحول متغيرة للغاية وتعتمد على التركيبات ، وصحة الديدان ، وظروف زراعة ما بعد الحقن ، ومهارة المجرب. بشكل عام ، ستنتج التجربة الناجحة يرقات F1 >15 لكل أنثى محقونة ومعدل تحول يبلغ >3٪ لعلامات الفلورسنت. إذا كان العدد الإجمالي للذرية الحية في المتوسط أقل من 10 يرقات / أنثى ، فمن الممكن أن يكون البناء ساما ، وأن اليرقات المتحولة لا تبقى على قيد الحياة. العثور على أعداد كبيرة من بيض الفلورسنت ولكن ليس يرقات الفلورسنت هو مؤشر آخر على أن مزيج الحقن قد يكون ساما. عند تعلم هذه التقنية لأول مرة ، يوصى باستخدام بنية تعبر بشكل جيد ، مثل act-2::mRFPmars ، والتي تدفع التعبير القوي في عضلة جدار الجسم13 (الشكل 4).

عند توليد الطفرات المستهدفة بواسطة CRISPR/Cas9 بوساطة الطفرات، يوصى باستخدام قالب إصلاح يحتوي على act-2::mRFPmars أو act-2::GFP transgene 13 بحيث يمكن تحديد الطفرات المحتملة بناء على التألق 9,14,15. من المهم ملاحظة أنه نظرا لأن Strongyloides تعبر عن الجينات المحورة من صفائف خارج الكروموسومات ، فإن ذرية F1 الفلورية قد تعبر عن mRFPmars أو GFP من الصفيف وحده أو تعبر عن mRFPmars أو GFP من كل من الصفيف و transgene 3,9,16 المتكامل. من الممكن تحديد اليرقات التي من المرجح أن يكون لديها جينات متحولة مدمجة بناء على نمط التعبير الفلوري: التعبير "غير المكتمل" في عضلة جدار الجسم (الشكل 4A) يكون أكثر شيوعا عندما لا يتم دمج الجين المتحول في الجينوم ، في حين أن التعبير المستمر في جميع أنحاء عضلة جدار الجسم (الشكل 4B ) في كثير من الأحيان، ولكن ليس دائما، يشير إلى أن الجين المتحول قد اندمج في الجينوم. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام أنماط التعبير وحدها لتحديد الطفرات بشكل قاطع - قد لا يكون لبعض الديدان ذات التعبير المتسق في جميع أنحاء عضلة جدار الجسم أحداث تكامل. علاوة على ذلك ، لا يمكن لأنماط التعبير التمييز بين الطفرات المتجانسة الزيجوت وتلك غير المتجانسة أو الفسيفساء. وبالتالي ، يجب أن تكون كل دودة من النمط الوراثي PCR9،14،15. عند تعطيل الجينات التي تنتج أنماطا ظاهرية مرئية بسهولة ، قد لا يكون من الضروري استخدام قالب إصلاح. على سبيل المثال ، يؤدي تعطيل جين Strongyloides unc-22 إلى نمط ظاهري "مرتعش" مهيمن ، مع معدلات اضطرابات غير متجانسة أو متماثلة الزيجوت أعلى من 10٪ 9.

Figure 4
الشكل 4: يرقات سترونجيلويدات ستيركوراليس المعدلة وراثيا (A, B) S. stercoralis يرقات تعبر عن الفعل -2::mRFPmars الوراثي المحور، الذي يعبر في عضلة جدار الجسم13. تم دمج الجين المحور في قالب إصلاح لتعطيل الموضع 9 بوساطة كريسبر/كاس9. (أ) يرقة S. stercoralis ذات نمط تعبير غير مكتمل أو "غير مكتمل" act-2::mRFPmars قد يشير إلى تعبير من صفيف خارج الكروموسومات. (ب) S. stercoralis iL3 يعبر عن نمط تعبير act-2::mRFPmars الأكثر اكتمالا الذي قد يشير إلى اضطراب الجينات وتكامل قالب الإصلاح. بالنسبة إلى A و B ، تعرض اللوحات تباين التداخل التفاضلي (يسار) ، والفلورسنت (الوسط) ، والصور المدمجة (اليمنى). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: عرض توضيحي لعملية كسر الإبرة لصنع إبرة قابلة للاستخدام. يتم النقر على طرف الإبرة على حافة شظية زجاجية (كائن في أقصى اليسار). عندما يظهر السائل ، يتم سحب الإبرة إلى الخلف ونقلها إلى أسفل على الأجار. يصل طرف الإبرة إلى نقطة حادة ، ويتدفق السائل بسرعة معتدلة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 2: عرض توضيحي لحقن ناجح. الذراع الخلفي للغدد التناسلية مرئي كهيكل رمادي فاتح على اليمين. يجب أن يكون طرف الإبرة والغدد التناسلية في نفس المستوى البؤري. إذا انزلقت الإبرة فوق الدودة أو تحتها أو على طول الجسم دون الإمساك بها ، فقم بضبط الموقف. طرف الإبرة سوف المسافة البادئة قليلا جدار الجسم. بنقرة سريعة على حامل الإبرة المتصل ب micromanipulator سيدفع الطرف بلطف عبر جدار الجسم وإلى الغدد التناسلية. بمجرد أن تكون الإبرة داخل الغدد التناسلية ، قم بالضغط وحقن محلول الحمض النووي. يجب أن يغمر السائل الغدد التناسلية بشكل واضح. إذا أغلق الجرح عند إزالة طرف الإبرة ، فمن المرجح أن تبقى الدودة على قيد الحياة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

المواد التكميلية: صيانة سلالة Strongyloides. يحدد هذا البروتوكول إجراءات الصيانة ل S. stercoralis في الجربلات و S. ratti في الفئران. ويشمل الجرعة المعدية المستخدمة لكل ديدان خيطية ومضيف. يصاب المضيفون عن طريق الحقن تحت الجلد تحت التخدير. يتم وصف تطور العدوى من المباح إلى ذروة إنتاج اليرقات إلى فقدان المباح لكل مزيج من الديدان الخيطية والمضيف. كما يتم وصف البروتوكول المستخدم لجمع البراز الموبوء وصنع ألواح زراعة الفحم البرازي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S1: صورة لشريحة حقن مجهري تتكون من وسادة أجار مجففة على غطاء مع شظية زجاجية صغيرة لكسر إبرة الحقن المجهري. تتم إضافة مخطط أجار ومخطط شارد هنا للوضوح. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيلم التكميلي S1: عرض توضيحي للحقن مما يؤدي إلى تلف الغدد التناسلية. الذراع الأمامي للغدد التناسلية في التركيز. يظهر تطبيق ضغط طفيف أن المحلول الموجود في الإبرة لا يزال يتدفق بحرية. طرف الإبرة في نفس المستوى البؤري مثل الغدد التناسلية ويهدف إلى زاوية طفيفة. بمجرد إدخال طرف الإبرة ، يتم حقن المحلول في الدودة ويملأ الغدد التناسلية. ومع ذلك ، عند إزالة الإبرة ، تبرز قطعة من الغدد التناسلية من خلال الجرح في البشرة. المواد تتدفق بشكل واضح. من غير المرجح أن تبقى هذه الدودة على قيد الحياة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يفصل بروتوكول الحقن المجهري هذا طرق إدخال تركيبات للطفرات العابرة و CRISPR / Cas9 بوساطة في S. stercoralis و S . ratti. بالنسبة لكل من S. stercoralis و S . ratti ، يخضع البقاء على قيد الحياة بعد الحقن ومعدل التحول أو الطفرات لعدة متغيرات يمكن ضبطها بدقة.

أول اعتبار حاسم للتحول الناجح هو كيفية بناء الجينات المحورة البلازميدية. وقد وجدت الدراسات السابقة أن التعبير عن الجينات المحورة الخارجية في Strongyloides يتطلب استخدام مروجي Strongyloides 5 'و 3' عناصر UTR3,13,19. على غرار تركيبات C. elegans ، تستخدم بنى Strongyloides بشكل عام مروجا خاصا بالجين و UTR شائعا 3 أقدام ، مثل الجين 13 Ss-era-1. قد يكون تحسين الكودون لمنطقة الترميز مهما أيضا للتعبير في Strongyloides. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير Wild Worm Codon Adaptor ، وهو تطبيق قائم على الويب يعمل على تحسين تسلسلات ترميز الكودون ل Strongyloides والديدان الخيطية الأخرى ،20. وأخيرا، على الرغم من عدم اختبارها بدقة في Strongyloides، فقد ثبت أن الإنترونات تزيد من التعبير عن الجينات المحورة الخارجية في كل من C. elegans21 والديدان الخيطية المرتبطة بالحشرات Pristionchus pacificus22 ويفترض أنها تزيد من التعبير في Strongyloides أيضا. يحتوي محول الكودون Wild Worm على خيارات لتضمين ما يصل إلى ثلاثة إنترونات في التسلسل المعدل20.

يؤثر تكوين وتسليم مزيج الحقن المجهري على معدل التحول وبقاء ذرية F1 . تستخدم محلول BU الملحي بشكل روتيني كمخفف للخلطات ، على الرغم من أن استخدام ddH2O هو أيضا خيار. يمكن تعديل تركيزات و / أو نسبة المكونات في المزيج لتحسين معدل التحول. يمكن أن تؤدي التركيزات العالية من البلازميدات ذات الأهمية إلى زيادة معدل التحول ولكن غالبا ما تؤدي إلى عدد أقل من النسل الكلي. إذا لم يلاحظ أي تعبير جيني متحول أو تم العثور على بيض معدل وراثي ميت فقط ، فمن الممكن أن تكون الجينات المحورة سامة ، أو أن هناك شيئا ما في مخزونات البلازميد يسبب وفاة الجينات المحورة. في الحالة الأخيرة ، قد يكون صنع مخزون بلازميد جديد باستخدام طريقة مختلفة (على سبيل المثال ، باستخدام مجموعة إعداد مصغرة مختلفة) كافيا للحصول على المواد المعدلة وراثيا. إضافة ليبوفيكتامين إلى مزيج الحقن المجهري قد يحسن أيضا معدل التحول23.

يؤثر شكل إبرة الحقن المجهري التي تقدم المزيج أيضا على معدلات البقاء على قيد الحياة والتحول (الشكل 3A-F والفيديو 1 والفيديو 2 والفيديو التكميلي S1). يجب أن تكون الإبرة حادة بما يكفي لاختراق البشرة وضيقة بما يكفي لعدم حدوث ضرر مفرط. يوصى بسحب الإبر قبل الاستخدام مباشرة لأن الإبر المخزنة لأكثر من يوم قد تتراكم الحطام وتصبح مسدودة أثناء الحقن المجهري. يمكن استعادة الإناث المحقونات من وسادة الحقن المجهري دون إتلافها ببضع طرق مختلفة. تتمثل إحدى التقنيات في تعويم الديدان من وسادة الحقن في قطرة من BU ، ثم استخدام HB101 على اختيار دودة لجمع الديدان. تشمل التقنيات الأخرى للاسترداد تعويم الديدان في BU وجمعها باستخدام طرف ماصة أو فرشاة طلاء صغيرة أو ببساطة باستخدام اختيار دودة بمفردها لنقل الديدان إلى لوحة استرداد.

إذا لم يتم الحصول على ذرية من الإناث المحقونات ، فهذا يشير إلى أن الإناث المحقونات إما تضررن في عملية الحقن المجهري أو أن ظروف زراعة ما بعد الحقن كانت دون المستوى الأمثل. هناك عدد من حالات زراعة ما بعد الحقن المختلفة التي يمكن تجربتها. تدعم مزارع الفحم البرازي الصغيرة الموصوفة أعلاه بشكل عام بقاء الدودة على قيد الحياة بشكل أفضل من ألواح NGM مع HB101. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب متابعة بقاء الديدان المحقونة وتطور يرقات F1 على ألواح الفحم البرازي ، والبيض غير مرئي على هذه اللوحات. تتمثل إحدى مزايا زراعة الديدان على ألواح NGM باستخدام HB101 بدلا من ألواح الفحم البرازي في السماح بالمراقبة الدقيقة لوضع البيض وتطور اليرقات ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. يمكن أيضا استخدام لوحات V12 مع HB101 لزيادة البقاء على قيد الحياة24. أخيرا ، يمكن استخدام لوحة chemotaxis12 مع بيليه براز الفئران واحد لزراعة S. ratti بعد الحقن. يتم نقل الذكور والإناث المحقونة مباشرة إلى حبيبات براز الفئران. في غضون 5-7 أيام ، يتم جمع الديدان من الأجار والبراز باستخدام جهاز بيرمان ، كما هو موضح أعلاه.

للحصول على Strongyloides البالغين للحقن المجهري ، يمكن تحضين ألواح الفحم البرازي الطازجة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ومع ذلك ، إذا كانت الإناث صغيرة جدا ، فقد لا تنجو من عملية الحقن المجهري. البالغين الذين تم جمعهم من ألواح الفحم البرازي التي تم تحضينها عند 20 درجة مئوية لمدة ~ 48 ساعة هم أكثر عرضة لتحمل عملية الحقن المجهري. ومع ذلك ، نظرا لأن هؤلاء البالغين أكبر سنا من البالغين الذين تم الحصول عليهم من حضانة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية ، فإنهم ليسوا مثل fecund وقد يكون لديهم معدل تحول أقل. قد يفضل المبتدئون البدء بكبار السن ثم التحول إلى البالغين الأصغر سنا قليلا مع تحسن المهارات.

مثل C. elegans ، يمكن لأنواع Strongyloides التعبير عن الجينات المحورة من صفائف خارج الكروموسومات والتركيبات المتكاملة للجينوم في جيل F1 . على عكس C. elegans ، فإن أنواع Strongyloides ستعبر فقط عن الجينات المحورة المتكاملة للجينوم في F2 والأجيال اللاحقة على الرغم من أن المصفوفات خارج الكروموسومات لا تزال قابلة للكشف عنها بواسطة PCR13. يمكن استخدام اليرقات المعدلة وراثيا F1 التي تعبر عن صفائف خارج الكروموسومات للتجارب التي لا تتطلب تكامل الجينوم أو أعدادا كبيرة من الديدان المعدلة وراثيا. قد يكون تكامل الجينوم مطلوبا للتجارب التي تتطلب وضع علامات على الجينات الذاتية أو اختبار أعداد كبيرة من الديدان في الفحوصات القائمة على السكان. هناك طريقتان لتكامل الجينوم للجينات المحورة في Strongyloides: تكامل piggyBac transposon بوساطة17 وتكامل CRISPR / Cas9 بوساطة9. يستخدم التكامل بوساطة الترانسبوسون piggyBac transposase piggyBac لاستهداف البضائع إلى مواقع TTAA في الجينوم26. نظرا لأن شكل TTAA شائع جدا في الجينوم الغني ب AT-rich لأنواع Strongyloides ، فإن التكامل غالبا ما يكون في أكثر من موقع واحد في الجينوم. في المقابل، يمكن استخدام التكامل بوساطة كريسبر/كاس9 لدمج الجينات المحورة في موضع مستهدف محدد9.

يمكن أيضا استخدام نظام CRISPR / Cas9 لتوليد الضربات القاضية الجينية المستهدفة 9,27. نظرا لثراء AT لجينوم Strongyloides ، فإن العثور على مواقع مستهدفة Cas9 قابلة للاستخدام تحتوي على التسلسل الأمثل 5'-N18GGNGG-3' للديدان الخيطية28 يمثل تحديا. في كثير من الأحيان ، لا يوجد سوى موقع واحد أو موقعين في الجين للاستهداف. تتضمن الطريقة المفضلة دمج قالب إصلاح يحتوي على جين متحول مع علامة فلورسنت عن طريق الإصلاح الموجه بالتماثل في الموقع الجينومي ، مما يؤدي إلى تعطيل كامل للجين. يمكن تحديد الضربات القاضية المحتملة من خلال التعبير عن الجين المحور9،14،15،29. ومع ذلك ، فإن التعبير الجيني المحور وحده لا يدل على النمط الوراثي لأن التعبير من المصفوفات مقابل الجينات المحورة المتكاملة غالبا ما لا يمكن تمييزه. وبالتالي ، فإن اليرقات المعدلة وراثيا F1 تتطلب التنميط الجيني اللاحق المخصص لتحديد الضربات القاضية متماثلة الزيجوت9. في حالة عدم وجود قالب إصلاح ، يحدث طفرات الموضع المستهدف بتردد عال ولكن يمكن أن يؤدي إلى عمليات حذف كبيرة9.

على الرغم من أن توليد يرقات F1 المعدلة وراثيا أو المتحولة أمر بسيط نسبيا في S. stercoralis ، إلا أن توليد خطوط مستقرة أمر صعب للغاية بسبب الحاجة إلى مرور المضيف. في المختبر ، الجربيل المنغولي هو مضيف متسامح ل S. stercoralis ولكنه يتطلب جرعة عالية من الديدان لإنشاء عدوى قادرة على إنتاج ما يكفي من يرقات F2 لإنشاء الخط30. فقط حوالي 6 ٪ من اليرقات المعدية تصبح الإناث الطفيلية30. علاوة على ذلك ، إذا كان لليرقات المعدلة وراثيا تعبير صفيف دون تكامل الجينوم ، فلن تنتج النسل المعبر عن الجينات المطلوبة لإصابة مضيف جربيل ثان. لزيادة فرص أن تصبح أعداد كافية من اليرقات المتكاملة للجينوم بالغين طفيليين تناسليين ، يوصى بما لا يقل عن 400-500 يرقات معدلة وراثيا في اللقاح الأولي. قد يكون من الممكن تقليل عدد اليرقات المطلوبة لإثبات عدوى براءة الاختراع عن طريق علاج الجربلات باستخدام بريدنيزون30. ومع ذلك ، من المحتمل أن يكون من الصعب تجميع ما يكفي من الديدان المحورة وراثيا أو المتحولة المتكاملة لإنشاء خط مستقر من S. stercoralis بنجاح. ومع ذلك ، فمن الممكن عادة جمع أعداد كافية من يرقات S. stercoralis F1 المعدلة وراثيا لفحوصات الدودة الواحدة14,15.

يتمتع Strongyloides ratti بميزة واضحة تتمثل في الجدوى الأكبر لتوليد خطوط معدلة وراثيا أو بالضربة القاضيةمستقرة 17,31. الإناث البالغات اللواتي يعشن بحرية S. ratti أقل تحملا لعملية الحقن المجهري من الإناث البالغات اللواتي يعشن بحرية S. stercoralis ؛ تنتج إناث S. ratti عموما يرقات إجمالية أقل من إناث S. stercoralis ، كما أن معدل التحول أقل من31. ومع ذلك ، لا يلزم سوى عدد قليل من يرقات F1 المعدلة وراثيا أو الضربة القاضية لإنشاء خط مستقر من S. ratti. نظرا لأن S. ratti هو طفيلي طبيعي من الفئران ، فإن عددا قليلا فقط من يرقات S. ratti المعدية يكفي لإثبات إصابة براءة اختراع32. وبالتالي ، من الممكن عموما تجميع أعداد كافية من اليرقات المعدلة وراثيا أو المتحولة لإنشاء خط مستقر. نظرا لأن أنواع Strongyloides لن تعبر عن صفائف خارج الكروموسومات بعد جيل F 1 ، فإن يرقات F1 المدمجة فيالجينوم فقط هي التي يمكنها إنتاج خط معدل وراثيا مستقر13. من المستحيل عموما تحديد الديدان ذات الجينات المحورة المتكاملة قبل التنميط الجيني ، لذلك فإن البروتوكول هو جمع جميع يرقات F1 المعدلة وراثيا وحقنها في الفئران. بعض النسبة المئوية الصغيرة من هذه اليرقات سيكون لها حدث التكامل المطلوب. ستشكل هذه اليرقات الأساس للخط المستقر. نظرا لأن طريقة piggyBac غالبا ما تؤدي إلى أكثر من حدث تكامل واحد في أي دودة فردية ، يمكن تحقيق انتقال ما يقرب من 100٪ من الجين المتحول بعد بضع جولات من تمرير اليرقات المعدلة وراثيا من خلال الفئران17.

باختصار ، يمكن استخدام التقنية الموصوفة هنا لتوليد S. stercoralis و S. ratti المعدلة وراثيا أو بالضربة القاضية. وهذا يمكن مجموعة واسعة من التجارب المحتملة ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر التعبير الخاص بالخلية للجينات المحورة ، وتوليد الطفرات ، ووضع العلامات الذاتية للبروتينات لتحديد الوظائف المكانية والزمانية 14،15،29،33،34،35. على المدى الطويل ، يمكن استخدام المعرفة المكتسبة من استخدام Strongyloides المعدلة وراثيا لتطوير استراتيجيات جديدة لمكافحة العدوى البشرية مع S. stercoralis وغيرها من الديدان الخيطية الطفيلية المعوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

كانت pPV540 و pPV402 هدايا طيبة من الدكتور جيمس لوك في جامعة بنسلفانيا. نشكر أسترا براينت على تعليقاتها المفيدة على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل باحثي صندوق بوروز ويلكوم في جائزة التسبب في الأمراض ، وجائزة الباحث في معهد هوارد هيوز الطبي ، والمعاهد الوطنية للصحة R01 DC017959 (E.A.H).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid Sigma-Aldrich N3876-5ML nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) VWR 470121-790 C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE Phenix RBA-500 agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh Ebonex n/a charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh Reade bonechar10x28 charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator Narishige MMN-1 coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters Fisher 07-200-385 microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness Brain Research Lab 4860-1 coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter VWR 82050-918 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod Fisher 12-000-101 stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips VWR 89009-310 for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads Fisher 14-206-62 bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings Fisher 14-050CQ Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe McMaster-Carr 7541A51 glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898-50ML halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD McMaster-Carr 3038K24 tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase VWR 89001-414 Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors Fisher 15-235-101 bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence Leica M165 FC GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder Tritech MINJ-4 microinjection needle holder
microINJECTOR system Tritech MINJ-1 microinjection system
Mongolian Gerbils Charles River Laboratories 213-Mongolian Gerbil gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz VWR 11216-776 Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh) Jo-Ann Fabrics zprd_14061949a nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch Thomas Scientific 1233S72 platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) VWR 62505-007 wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106 QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans Envigo 140 HsdBlu:LE Long Evans rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley Envigo 002 Hsd:Sprague Dawley SD rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" Office Depot 452369 plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches Newco 999589 techboard
Stainless steel raised wire floor Ancare R20SSRWF wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 Office Depot 9587303 spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm Carolina (Science) 741012 watch glasses (small, round)
Stereomicroscope Motic K-400 LED dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite Grainger 53GN16 plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller Sutter P-30/P needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses Fisher S34826 watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps Fisher 05-769-2Q funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator Narishige MM0-4 fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps Fisher S99422 Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) Tritech Research T3308P 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers VWR 82003-820 lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in Carolina (Science) 742300 watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter Fisher 09-805B filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter Fisher 09-805D filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in Fisher 50-821-813 glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade Office Depot 238816 X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1 Zeiss n/a inverted microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
  2. Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
  3. Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482 (2020).
  4. Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
  5. Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
  6. Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
  7. Schafer, T. W., Skopic, A. Parasites of the small intestine. Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  9. Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
  10. Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
  11. Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
  12. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  13. Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
  14. Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
  15. Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
  16. Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
  17. Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
  18. Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
  19. Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
  20. Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
  21. Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
  22. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  23. Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
  24. Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
  25. Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
  26. Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
  27. Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
  28. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  29. Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
  30. Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
  31. Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
  32. Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
  33. Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
  34. Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
  35. Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 176،
توليد الجينات والضربة القاضية في أنواع <em>Strongyloides</em> عن طريق الحقن المجهري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castelletto, M. L., Hallem, E. A.… More

Castelletto, M. L., Hallem, E. A. Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection. J. Vis. Exp. (176), e63023, doi:10.3791/63023 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter