Summary
적절한 마취 하에 쥐의 심장은 늑간 공간을 통해 외부화되었고, 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용하여 좌측 전방 하행 동맥(LAD)을 결찰하여 심근경색을 성공적으로 유도했습니다.
Abstract
심근경색(MI)은 주요 사망 원인 중 하나입니다. MI 모델은 MI 후 리모델링의 병리 메커니즘을 조사하고 새로운 치료제를 평가하는 데 널리 사용됩니다. MI를 유도하기 위해 다양한 방법(예: 이소프로테레놀 치료, 냉동 손상, 관상 동맥 결찰술 등)이 사용되었습니다. 이소프로테레놀 치료 및 냉동 손상과 비교했을 때, 관상동맥 결찰술은 MI 후 허혈 반응 및 만성 리모델링을 더 잘 반영할 수 있습니다. 그러나 생쥐의 관상동맥 결찰술을 위한 전통적인 방법은 기술적으로 어렵습니다. 현재 연구는 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용하여 마우스에서 MI를 유도하는 간단하고 효율적인 프로세스를 설명합니다. 쥐의 흉부 피부는 안정된 마취 하에 절개되었다. 심장은 대흉근(pectoralis major)과 소흉근(pectoralis minor)을 둔하게 분리한 후 늑간 공간을 통해 즉시 외부화되었습니다. 좌측 전방 하행 분지(LAD)는 원점에서 3mm 떨어진 6-0 봉합사로 결찰되었습니다. LAD 결찰 후 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 염색한 결과 MI의 성공적인 유도 및 MI 후 흉터 크기의 시간적 변화를 나타냈습니다. 한편, 생존 분석 결과, MI 후 7일 이내에 주로 심장 파열로 인한 명백한 사망률이 나타났다. 또한, MI 후 심장 초음파 평가는 수축 기능 장애 및 심실 리모델링의 성공적인 유도를 보여주었습니다. 일단 숙달되면 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용하여 2-3분 이내에 마우스에서 MI 모델을 설정할 수 있습니다.
Introduction
심근경색(MI)은 전 세계적으로 사망 및 장애의 중요한 원인중 하나입니다 1,2,3,4,5. 시기적절한 재관류에도 불구하고 현재 MI 후 심장 리모델링을 치료할 수 있는 효과적인 치료법이 부족합니다. 이에 따라 MI 6,7,8에 대한 기계론적 탐색 및 치료 개발에 상당한 노력이 기울여졌습니다. 참고로, MI 모델의 구축은 이러한 목적을 달성하기 위한 전제 조건입니다.
몇몇 방법들(예를 들어, 이소프로테레놀 치료, 냉동 손상, 관상동맥 결찰술 등)이 작은 동물에서 MI 모델을 유도하기 위해 제안되었다. 이소프로테레놀 치료는 MI 유도를 위한 간단한 방법이지만, 표적 부위의 경색을 유도할 수 없다9. 냉동손상은 직접적인 허혈보다는 얼음 결정의 생성과 세포막의 파괴를 통해 심근 괴사를 유발한다10. 이에 반해 관상동맥결찰술은 교합부위와 경색부위의 정도를 정밀하게 조절할 수 있으며, 경색에 따른 리모델링 반응을 충실히 재현할 수 있다11,12. 관상동맥 결찰술은 일반적으로 삽관, 기계 환기 및 개흉술 후에 수행되며, 이는 기술적으로 까다롭습니다13,14. 관상동맥 결찰술(예: 무환기)에 대한 몇 가지 수정된 프로토콜이 보고되었고 MI 유도를 강화했지만 자세한 시각적 시연은 부족합니다15,16,17. 이러한 문제는 MI 모델을 사용하여 연구에 참여하고자 하는 그룹에게 상당한 재정적, 기술적 장벽을 제기합니다. 이 보고서는 마우스에서 MI 유도에 대한 접근 방식을 제시합니다. 현재의 방법은 쉽고, 시간을 절약하며, 대부분의 실험실에서 쉽게 볼 수 있는 수술 도구와 장비를 사용합니다.
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Protocol
동물 실험과 관련된 실험은 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 런지 병원 실험실 동물 복지 윤리위원회(R52021-0506)의 필요한 모든 승인을 받아 수행됩니다. 8-10주 사이의 암컷 및 수컷 C57BL/6J 마우스가 연구에 사용되었습니다.
1. 간이 마취 장비 준비(선택 사항)
알림: 이것은 선택적 수술 전 설정이며 섹션 2에 언급된 대로 적정 가능한 마취로 대체할 수 있습니다. 이 설정을 동물 절차에 적용하기 전에 기관 동물 윤리 위원회와 수의사와 상의해야 합니다.
- 15mL 원심 분리 튜브를 사용하여 개구부에서 약 3cm 떨어진 튜브의 장축에 수직으로 절단합니다.
알림: 밸브가 성공적으로 삽입될 수 있도록 절단이 튜브 루멘의 원형 둘레의 절반보다 큰지 확인하십시오. - 절단부와 튜브 개구부 사이의 원심분리기 튜브 벽에 구멍(직경, 2mm)을 뚫습니다.
- 플라스틱 시트에서 적절한 크기의 밸브 조각을 자르고 튜브 벽의 절단부에 밸브를 삽입합니다.
알림: 밸브는 삽입 깊이를 변경하여 이소플루란의 방출 속도를 제어하는 데 사용할 수 있습니다. - 흄 후드 내부에서 튜브 바닥을 잘라 열고 산소 공급 장치에 연결합니다. 면봉을 튜브 하단 근처에 놓고 면봉에 0.5mL의 이소플루란(얻은 대로, 재료 표 참조)을 넣고 밸브를 닫습니다.
- 위에서 설명한 대로 준비된 튜브로 마우스를 마스킹하여 마취 효능을 테스트합니다. 발가락 꼬집기 반응으로 호흡 속도와 마취 깊이를 모니터링합니다.
알림: 호흡 속도가 10회/10초 미만이면 과도한 마취를 암시하므로 판막의 삽입 깊이를 조정해야 합니다. 마취와 관련된 모든 절차의 경우 활성탄 시트로 채워진 가스 필터를 사용해야 하며(그림 1A-i) 후드 내에서 수술을 수행해야 합니다.
2. 수술 준비 및 마취
- 집게 한 쌍, 미세 모기 지혈제, 수술용 가위 한 쌍, 바늘 홀더 두 쌍, 4-0 실크 수술용 봉합사, 6-0 실크 수술용 봉합사, 가스 필터 및 광원을 포함하여 수술 당일에 필요한 모든 기구를 준비하고 소독합니다( 재료 표 참조)(그림 1A).
- 수술용 마스크와 멸균 장갑을 착용하십시오.
- 제모 크림을 쥐 가슴에 바르고 1분 동안 기다립니다. 제모 크림과 머리카락을 젖은 거즈로 부드럽게 닦아냅니다.
- 제모 후 주로 사용하는 손으로 마우스를 잡습니다. 산소 공급(1L/min)과 함께 기화된 이소플루란(4%)을 흡입하여 마취를 유도하고 2-3% 이소플루란을 유지합니다.
- 발가락 꼬집기 반응이 없는 것으로 적절한 마취를 확인합니다.
- 멸균 아이 크림을 양쪽 눈에 바르면 각막 건조를 예방할 수 있습니다.
- 쥐를 앙와위 자세의 수술 플랫폼에 고정합니다. 포비돈-요오드 면봉( 재료 표 참조)을 흉부에 세 번 바르고 소독된 흉부를 멸균 드레이프로 덮습니다.
3. 심근경색의 유도
- 멸균을 보장하기 위해 오염된 장갑을 교체하십시오.
- 리도카인으로 국소 차단 후 xiphoids와 겨드랑이를 연결하는 선을 따라 0.5cm 피부를 자릅니다.
- 집게와 미세 모기 지혈을 사용하여 가슴 대근육과 가슴 소근육을 뭉툭하게 분리하여 네 번째 늑간 공간을 노출시킵니다.
- 미세 모기 지혈제를 사용하여 네 번째 늑간 공간을 엽니다.
- 왼손 검지로 심장을 네 번째 늑간 공간 쪽으로 밀어 심장을 외부화합니다.
- 왼손으로 심장을 고정하고 원점에서 3mm 떨어진 곳에 6-0 봉합사로 왼쪽 전방 하행 가지를 결찰합니다.
- 심장을 빠르게 흉강에 다시 넣습니다.
알림: 30초 미만 동안 심장을 외부화하는 것이 안전합니다. - 흉강을 수동으로 부드럽게 눌러 흉강 밖으로 공기를 배출합니다.
- 갈비뼈 위의 근육층을 6-0 실크 봉합사로 닫습니다.
- 4-0 실크 봉합사로 피부를 닫습니다.
- 수술 직후 마우스를 패드(37°C)에 놓습니다.
- 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg)을 4-6시간마다 피하 주사하여 최대 72시간 동안 수술 후 통증을 줄입니다.
- 완전히 회복되면 수술한 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.
알림: 마우스는 수술 후 3-5분 이내에 완전히 회복됩니다. - 쥐를 주의 깊게 관찰하고 최대 7일 동안 습식 사료를 제공하십시오.
4. 조직 채취
- 자궁 경부 탈구에 의한 MI 확립 후 다른 시점에서 마우스를 희생합니다.
- 희생된 쥐를 수술 플랫폼에 누운 자세로 고정합니다.
- 상복부에 복부 절개(~3-4cm)를 합니다. 흉강의 양쪽에서 갈비뼈를 자르고 횡격막을 제거합니다.
- 뇌실 내 주사를 통해 10mL의 차가운 인산염 완충 식염수(1x PBS, 4°C)를 심장에 관류합니다.
- 대동맥 뿌리를 잘라 심장을 채취하고 즉시 -80 °C에서 심장을 보관하십시오.
참고: 저자의 경험에 따르면 보관 후 2주 이내에 TTC 염색을 수행할 수 있습니다. - 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 심장을 염색합니다.
- 얼어붙은 심장을 면도날을 사용하여 얼음 위에서 1mm 두께로 자릅니다.
- 준비된 심장 절편을 37°C에서 10-15분 동안 1% TTC 용액(1x PBS에 용해)에서 배양합니다.
알림: 15분 배양 후 TTC 용액을 버리고 염색된 심장 조각을 1x PBS에 담그십시오.
- 디지털 카메라를 사용하여 슬라이스를 촬영합니다.
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Representative Results
실험 프로토콜과 몇 가지 중요한 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 단순화된 마취 장비는 마취를 유도했습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 유도된 마취는 규칙적인 호흡 속도(테스트된 마우스에서 90-107회 호흡/분으로 다양함)에 반영된 바와 같이 안정적이었습니다. 관상동맥 결찰술 후 TTC 염색 분석은 심근경색의 성공적인 유도 및 MI 후 흉터 크기의 시간적 변화를 나타냈습니다(그림 2B). 한편, 생존 분석 결과는 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스에서 MI 후 7일 이내에 명백한 사망률을 보여주었습니다(그림 2C,D). 심실 파열(수컷 생쥐 56%, 암컷 생쥐 40%)은 MI 후 사망의 흔한 원인이었다. 또한, MI 후 심장 초음파 평가는 수축 기능 장애 및 심실 리모델링의 성공적인 유도를 보여주었습니다(그림 2E,F).
그림 1: MI 유도를 위한 수정된 방법의 재료 및 중요한 단계 . (A) 이 프로토콜에 필요한 수술 기구 및 재료. (a) 4-0 실크 봉합사. (b) 6-0 실크 봉합사. (c) 겸자. (d) 가위. (e-f) 바늘 홀더. (g) 미세 모기 지혈제. (h) 광원. (i) 가스 필터. (B) 마우스에서 MI를 유도하기 위한 주요 단계를 보여주는 대표 이미지. (a) 마취 후 마우스를 고정하고 수술 부위에 포비돈-요오드를 도포했습니다. (b) 수술 부위가 드레이프되어 있습니다. (c) 리도카인으로 국소 차단 후 수술 부위를 0.5cm 절개합니다. (d) 노출된 갈비뼈. 화살표는 갈비뼈를 나타냅니다. (e) 가슴 대근육과 가슴 소근육을 절개하여 제4 늑간 공간을 노출시켰다. (f) 외재화된 마음. (GH) 6-0 실크 봉합사로 결찰된 LAD. 화살표는 LAD를 나타냅니다. (i) 심장을 다시 흉강 안으로 넣는다. (j) 공기가 흉강으로부터 배출되었다. (k) 근육층은 6-0 실크 봉합사로 갈비뼈 위를 닫고 피부는 4-0 실크 봉합사로 닫힙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 관상동맥 결찰술 후의 조직학적 및 기능적 변화. (A) 단순화 마취 장비로 마취된 마우스의 호흡 속도(n=10). (B ) 심장 절편(각 심장에서 4개 절편)의 TTC 염색 결과는 MI 이후 다른 시점에서 수집되었습니다. 흰색 영역은 경색 영역을 나타내고 빨간색 영역은 생존 가능한 심근을 나타냅니다. (C) Kaplan-Meier 곡선은 수컷 마우스의 MI 후 사망률(그룹당 n=20)을 보여줍니다. (D ) Kaplan-Meier 곡선은 암컷 마우스의 MI 후 사망률(그룹당 n=20)을 보여줍니다. (E) MI 후 다른 시점(가짜, MI 후 3일, 7일, 21일 및 28일)에서 심장 초음파 분석의 대표 이미지. (F) 표시된 그룹 중 좌심실 박출률(LVEF), 좌심실 분획 단축(LVFS), 좌심실 수축기 말단 직경(LVsD) 및 좌심실 이완기 말단 치수(LVdD) 값의 정량 분석(그룹당 n=5). **p<0.01 또는 ***p<0.001 대 가짜; ##p<0.01 또는 ###p<0.001 대 MI 3일 후. 통계 분석을 위해 사후 Tukey HSD(Honestly Significant Difference) 검정을 사용한 일원 분산 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 보고서는 Gao16에 의해보고 된 방법에서 수정 된 쉽게 구할 수있는 재료를 가진 마우스에서 MI 유도를위한 쉬운 프로토콜을 설명했습니다. Murine MI 모델은 MI 이후 기능 장애 및 리모델링을 위한 기계론적 탐색 및 약물 스크리닝에 없어서는 안 될 필수 요소입니다12. MI 유도를 위한 기존 기술 중 관상동맥 결찰술이 가장 일반적으로 시행되는 방법입니다. 관상동맥결찰술은 심근경색의 허혈적 특성을 충실히 재현하여 임상시나리오18,19와 유사한 흉터 치유 및 리모델링 반응을 유도한다. 그러나 관상동맥 결찰술에 대한 기존 프로토콜은 삽관, 인공호흡 및 흉부의 넓은 개방을 포함하며, 이는 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 지난 몇 년 동안 관상동맥 결찰술에 대한 다양한 프로토콜이 보고되었으며 MI의 확립을 어느 정도 강화했습니다15,16,17. 현재 연구는 대부분의 실험실에서 쉽게 볼 수 있는 수술 도구와 장비를 사용하여 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시했습니다.
중요한 단계 및 문제 해결
이 방법을 연습할 때 최적의 성능을 얻으려면 몇 가지 주요 단계에 주목할 가치가 있습니다. 심장을 외부화하기 위해서는 흉강을 세게 압박해서는 안 되며, 이는 관상동맥 혈류에 부정적인 영향을 미치고 관상동맥을 가려 관상동맥이 보이지 않게 하고 LAD 결찰술의 실패로 이어질 수 있습니다. 또한 심각한 폐 손상을 초래할 수 있습니다. 대부분의 경우 흉벽의 오른쪽을 부드럽게 누르면 열린 늑간 공간을 통해 심장이 성공적으로 외부화됩니다. 때때로, 심장 외부화 중 저항감은 심장 정점과 늑간 개구부의 불일치를 나타낼 수 있습니다. 이것은 중간 겨드랑이 선을 따라 미세 모기 지혈제의 약간의 움직임으로 해결할 수 있습니다. 또 다른 중요한 점은 근육과 피부를 봉합하기 전에 흉강에 남아 있는 공기를 적절하게 배출하는 것입니다. 그렇게 하지 않으면 기흉으로 인한 수술 후 사망률이 증가합니다.
장점과 한계
관상동맥 결찰술을 위한 기존의 방법은 삽관, 기계적 환기, 갈비뼈 절단이 필요하며 높은 심박수로 인해 관상동맥 식별이 쉽지 않습니다. 이러한 문제는 수술 시간을 크게 연장하고 수술 관련 사망률을 증가시킵니다. 기존 방법과 비교했을 때, 수정된 프로토콜은 다음과 같은 장점이 있습니다: (1) 시간을 절약할 수 있습니다(즉, 마취, LAD 결찰에서 성공적인 피부 봉합까지 약 3분 소요). (2) 필요한 수술 도구와 재료는 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있습니다. 그러나 이 독특한 방법의 중요한 한계는 기계적 환기 지원이 부족하기 때문에 심장 외부화 후 LAD 결찰에 허용되는 시간이 제한되어 있다는 것입니다. 따라서 기흉으로 인한 높은 사망률은 초보자에게 예상할 수 있습니다. 저자의 경험에 비추어 볼 때, 30초 미만의 심장 외부화는 테스트된 모든 쥐에 의해 잘 견뎌진다. 이 기간은 숙련된 기술자가 낮은 수술 전후 사망률(<5%)로 MI 유도를 완료하는 데 적합합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), 상하이 우수 학술 지도자 프로그램 (18XD1402400), 상하이시 과학 기술위원회 (201409005200), 상하이 푸장 인재 프로그램 (2020PJD030) 및 중국 박사후 과학 재단 (2020M671161, BX20190216)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA | T8877-25G | TTC staining |
| 4-0 silk suture | YUANKANG | 4-0 | Surgical instrument |
| Autoclave | HIRAYAMA | HVE-50 | Sterilization for the solid |
| Buprenorphine | Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd. | H10940181 | reduce post-operative pain |
| Centrifugation tube | Biological Hope | 1850-K | 15ML |
| Depilatory cream | ZIKER BIOTECHNOLOGY | ZK-L2701 | Depilation agent for laboratory animals |
| Forcep | RWD | F12028 | Surgical instrument |
| Gas filter | ZHAOXIN | SA-493 | Operator protection |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | Used for anesthesia |
| Light source | Beijing PDV | LG-150B | Operating lamp |
| Micro-mosquito hemostat | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Needle | BINXIONG | 42180104 | Surgical instrument |
| Needle and the 6-0 silk suture | JIAHE | SC086 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32030 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32010 | Surgical instrument |
| Povidone-iodine swabs | SingleLady | GB26368-2010 | Skin disinfection |
| Scissors | CNSTRONG | JYJ1030 | Surgical instrument |
| Sterile eye cream | Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H10940177 | prevent corneal dryness |
| Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals | VisualSonics | Vevo 2100 | Echocardiographic analysis |
References
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