Summary
Под адекватной анестезией сердце мыши было экстернализовано через межреберное пространство, и инфаркт миокарда был успешно индуцирован путем перевязки левой передней нисходящей артерии (LAD) с использованием материалов, легко доступных в большинстве лабораторий.
Abstract
Инфаркт миокарда (ИМ) является одной из ведущих причин смерти. Модели инфаркта миокарда широко используются для изучения патомеханизмов постинфаркта миокарда и оценки новых терапевтических средств. Для индуцирования инфаркта миокарда использовались различные методы (например, лечение изопротеренолом, криотравма, перевязка коронарных артерий и т. д.). По сравнению с лечением изопротеренолом и криотравмой, перевязка коронарных артерий может лучше отражать ишемический ответ и хроническое ремоделирование после ИМ. Однако традиционные методы перевязки коронарных артерий у мышей технически сложны. В настоящем исследовании описывается простой и эффективный процесс индукции инфаркта миокарда у мышей с помощью легкодоступных материалов. Кожа грудной клетки мыши была вскрыта под стабильным наркозом. Сердце было немедленно экстернализовано через межреберье после тупого разделения большой и малой грудных мышц. Левая передняя нисходящая ветвь (LAD) была перевязана швом 6-0 в 3 мм от ее источника. После перевязки LAD окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (ТТС) указывало на успешную индукцию инфаркта миокарда и временные изменения размера рубцов после ИМ. Между тем, результаты анализа выживаемости показали явную смертность в течение 7 дней после инфаркта миокарда, в основном из-за разрыва сердца. Кроме того, эхокардиографическая оценка после инфаркта миокарда продемонстрировала успешную индукцию сократительной дисфункции и ремоделирования желудочков. После освоения модель ИМ может быть установлена на мышах в течение 2-3 минут с помощью легкодоступных материалов.
Introduction
Инфаркт миокарда (ИМ) является одной из основных причин смерти и инвалидности во всем мире 1,2,3,4,5. Несмотря на своевременную реперфузию, в настоящее время не существует эффективных методов лечения ремоделирования сердца после инфаркта миокарда. Соответственно, были предприняты значительные усилия по механистическому исследованию и терапевтической эксплуатации ИМ 6,7,8. Следует отметить, что создание моделей ИМ является необходимым условием для достижения этих целей.
Предложено несколько методов (например, лечение изопротеренолом, криотравма, перевязка коронарных артерий и т.д.) для индуцирования моделей инфаркта миокарда у мелких животных. Лечение изопротеренолом является простым методом индукции инфаркта миокарда, но оно не может индуцировать инфаркт целевой области9. Криоповреждение приводит к некрозу миокарда за счет образования кристаллов льда и разрушения клеточной мембраны, а не к прямой ишемии10. В отличие от этого, перевязка коронарных артерий позволяет точно контролировать место окклюзии и протяженность области инфаркта и точно повторяет реакцию ремоделирования после инфаркта11,12. Перевязка коронарных артерий обычно выполняется после интубации, искусственной вентиляции легких и торакотомии, что технически сложно13,14. Сообщалось о нескольких модифицированных протоколах перевязки коронарных артерий (например, без вентиляции), которые потенцировали индукцию инфаркта миокарда, но подробные визуальные демонстрации отсутствуют15,16,17. Эти проблемы создают значительный финансовый и технический барьер для групп, желающих заниматься исследованиями с использованием моделей ИМ. В данном докладе представлен подход к индукции инфаркта миокарда у мышей. Нынешний метод прост, экономит время и использует хирургические инструменты и оборудование, которые можно найти в большинстве лабораторий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты, связанные с работой с животными, проводятся со всеми необходимыми разрешениями Комитета по этике благополучия лабораторных животных больницы Жэньцзи, Шанхайского университета Цзяотун, Школа медицины (R52021-0506). В исследовании использовались самки и самцы мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель.
1. Подготовка упрощенного анестезиологического оборудования (ОПЦИОНАЛЬНО)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это дополнительная предоперационная установка, которая может быть заменена титруемой анестезией, как указано в разделе 2. Следует проконсультироваться с институциональным комитетом по этике животных и ветеринаром (ветеринарами), прежде чем адаптировать эту систему в процедурах для животных.
- Возьмите центрифужную пробирку объемом 15 мл и сделайте надрез перпендикулярно длинной оси пробирки примерно в 3 см от отверстия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разрез превышает половину окружности просвета трубки, чтобы клапан можно было успешно вставить. - Просверлите отверстия (диаметр 2 мм) на стенке трубки центрифуги между разрезом и отверстием трубы.
- Отрежьте подходящий по размеру кусок клапана из пластикового листа и вставьте клапан в вырез на стенке трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клапан можно использовать для контроля скорости высвобождения изофлурана путем изменения глубины введения. - Внутри вытяжного шкафа разрежьте нижнюю часть трубки и подключите ее к подаче кислорода. Поместите ватный тампон к нижнему концу пробирки, добавьте на ватный тампон 0,5 мл изофлурана (как получено, см. Таблицу материалов) и закройте клапан.
- Проверьте эффективность анестезии, замаскировав мышей трубками, приготовленными, как описано выше. Контролируйте частоту дыхания и глубину анестезии по реакции на щипки пальцев ног.
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания менее 10 раз/10 с указывает на чрезмерную анестезию, и глубина введения клапана должна быть отрегулирована. Для всех процедур, связанных с анестезией, необходимо использовать газовый фильтр, заполненный листами активированного угля (рис. 1A-i), а операцию следует проводить в капюшоне.
2. Оперативная подготовка и анестезия
- Подготовьте и простерилизуйте все необходимые инструменты в день операции, включая пару щипцов, микро-москитный гемостат, пару хирургических ножниц, две пары иглодержателей, шелковый хирургический шовный материал 4-0, шелковый хирургический шовный материал 6-0, газовый фильтр и источник света (см. Таблицу материалов) (Рисунок 1A).
- Наденьте хирургическую маску и стерильные перчатки.
- Нанесите крем для депиляции на грудь мыши и подождите 1 минуту. Аккуратно сотрите крем для депиляции и волосы влажной марлей.
- Удерживайте мышь доминирующей рукой после депиляции. Индуцируют анестезию путем вдыхания парообразного изофлурана (4%) с подачей кислорода (1 л/мин) и поддерживают 2-3% изофлурана.
- Подтвердите адекватную анестезию отсутствием реакции на щипок пальца ноги.
- Нанесите стерильный крем для глаз на оба глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы.
- Закрепите мышей на операционной платформе в положении лежа на спине. Трижды приложите к груди тампоны с повидон-йодом (см. таблицу материалов) и накройте продезинфицированную грудную клетку стерильной простыней.
3. Индукция инфаркта миокарда
- Смените загрязненные перчатки, чтобы обеспечить стерильность.
- Сделайте разрез кожи 0,5 см по линии, соединяющей мечевидную мышцу и подмышечную впадину, после локальной блокады лидокаином.
- Тупо разделите большую грудную и малую грудные мышцы с помощью щипцов и микро-москитного гемостата, чтобы обнажить четвертое межреберье.
- Откройте четвертое межреберье с помощью микро-москитного гемостата.
- Экстернализуйте сердце, подталкивая сердце к четвертому межреберью указательным пальцем левой руки.
- Левой рукой закрепите сердце, а левую переднюю нисходящую ветвь наложите шов 6-0 на расстоянии 3 мм от его начала.
- Быстро поместите сердце обратно в грудную полость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно безопасно экстернализировать сердце менее чем на 30 секунд. - Откачайте воздух из грудной полости легким нажатием на грудную полость вручную.
- Закройте мышечный слой над ребрами шелковым швом 6-0.
- Закройте кожу шелковым швом 4-0.
- Положите мышей на подушечку (37 °C) сразу после операции.
- Вводите бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг) подкожно каждые 4-6 часов, чтобы уменьшить послеоперационную боль на срок до 72 часов.
- Верните прооперированных мышей в клетки после полного выздоровления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши полностью выздоровеют в течение 3-5 минут после операции. - Внимательно следите за мышами и обеспечьте влажный корм на срок до 7 дней.
4. Заготовка тканей
- Приносили в жертву мышей в разные моменты времени после установления ИМ при вывихе шейки матки.
- Закрепите принесенных в жертву мышей на операционной платформе в положении лежа на спине.
- Сделайте вентральный разрез (~3-4 см) в верхней части живота. Отрежьте ребра с обеих сторон грудной полости, и удалите диафрагму.
- Перфузии сердца 10 мл холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS, 4 °C) путем внутрижелудочковой инъекции.
- Соберите сердце, отрезав корень аорты, и сразу же храните сердце при температуре -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: По опыту авторов, окрашивание ТТС можно проводить в течение двух недель после хранения. - Окрасьте сердце 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (ТТС).
- Замороженное сердце нарезать на льду ломтиками толщиной 1 мм с помощью бритвенных лезвий.
- Подготовленные сердечные срезы инкубируют в 1% растворе ТТС (растворенном в 1х ПБС) при 37 °С в течение 10-15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 15-минутной инкубации выбросьте раствор TTC и погрузите окрашенные ломтики сердца в 1x PBS.
- Сфотографируйте срезы с помощью цифровой камеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол эксперимента и некоторые критические этапы показаны на рисунке 1. Упрощенное анестезиологическое оборудование индуцировано анестезией. Как показано на рисунке 2А, индуцированная анестезия была стабильной, что отражалось в регулярной частоте дыхания (варьировалась от 90 до 107 вдохов/мин у испытуемых мышей). После перевязки коронарных артерий анализ окрашивания ТТС показал успешную индукцию инфаркта миокарда и временные изменения размера рубца после инфаркта миокарда (рис. 2B). Между тем, результаты анализа выживаемости показали явную смертность в течение 7 дней после инфаркта миокарда у самцов и самок мышей C57BL/6J (рис. 2C,D). Разрыв желудочков (56% у самцов мышей; 40% у самок мышей) был частой причиной смерти после инфаркта миокарда. Кроме того, эхокардиографическая оценка после инфаркта миокарда продемонстрировала успешную индукцию сократительной дисфункции и ремоделирование желудочков (рис. 2E, F).
Рисунок 1: Материалы и критические этапы модифицированных методов индукции инфаркта миокарда . (A) Хирургические инструменты и материалы, необходимые для этого протокола. (а) Шелковый шов 4-0. (b) 6-0 шелковый шов. (c) Щипцы. (d) Ножницы. (Д-Ж) Иглодержатели. (g) Микро-комарный гемостат. (h) Источник света. (i) Газовый фильтр. (B) Репрезентативные изображения, показывающие основные этапы индуцирования инфаркта миокарда у мышей. а) Мышь была закреплена после анестезии, и на место операции был нанесен повидон-йод. (b) Место операции задрапировано. в) разрез 0,5 см в месте операции после локальной блокады лидокаином. (d) Обнаженные ребра. Стрелкой обозначены ребра. (e) Рассекли большую грудную и малую грудные мышцы, чтобы обнажить четвертое межреберье. (f) Экстернализированное сердце. (Г-Х) Перевязанный LAD шелковым швом 6-0. Стрелка указывает на LAD. (i) Сердце помещается обратно в грудную полость. (j) Воздух был эвакуирован из грудной полости. (k) Мышечный слой закрывается над ребрами шелковым швом 6-0, а кожа закрывается шелковыми швами 4-0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гистологические и функциональные изменения после перевязки коронарных артерий. (А) Частота дыхания у мышей, обезболиваемых упрощенным наркозным оборудованием (n=10). (B) Результаты окрашивания ТТС срезов сердца (по 4 среза от каждого сердца) были собраны в разные моменты времени после ИМ. Белая область указывала на инфарктную область, а красная область показывала жизнеспособный миокард. (C) Кривая Каплана-Мейера показывает уровень смертности после инфаркта миокарда у самцов мышей (n=20 на группу). (D) Кривая Каплана-Мейера показывает уровень смертности после инфаркта миокарда у самок мышей (n=20 на группу). (E) Репрезентативные изображения эхокардиографического анализа в различные моменты времени после инфаркта миокарда (симуляция, 3 дня, 7 дней, 21 день и 28 дней после инфаркта миокарда). (F) Количественный анализ значений фракции выброса левого желудочка (ФВЛЖ), фракционного укорочения левого желудочка (LVFS), конечного систолического диаметра левого желудочка (LVsD) и конечного диастолического размера левого желудочка (LVdD) в указанных группах (n=5 в группе). **p<0.01 или ***p<0.001 vs. притворство; ##p<0.01 или ###p<0.001 vs. Через 3 дня после ИМ. Для статистического анализа был проведен односторонний дисперсионный анализ с помощью постфактум теста Tukey HSD (Honestly Significant Difference). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем отчете был продемонстрирован простой протокол индукции инфаркта миокарда у мышей с легкодоступными материалами, который был модифицирован по сравнению с методом, описанным в Gao16. Мышиные модели инфаркта миокарда незаменимы для механистического исследования и скрининга лекарственных препаратов на постинфарктную дисфункцию и ремоделирование12. Среди существующих методов индукции инфаркта миокарда наиболее часто практикуется перевязка коронарных артерий. Перевязка коронарных артерий достоверно повторяет ишемический характер инфаркта миокарда и приводит к заживлению рубцов и ремоделирующей реакции, аналогичной клиническому сценарию18,19. Тем не менее, традиционный протокол перевязки коронарных артерий включает интубацию, вентиляцию легких и широкое вскрытие грудной клетки, что является технически сложным и трудоемким процессом. В последние годы сообщалось о различных протоколах перевязки коронарных артерий, которые в некоторой степени потенцировали возникновение инфаркта миокарда15,16,17. В настоящем исследовании был представлен простой и эффективный протокол с использованием хирургических инструментов и оборудования, которые можно найти в большинстве лабораторий.
Критические действия и устранение неполадок
Для оптимальной производительности в практике этого метода стоит отметить несколько ключевых шагов. Для экстернализации сердца грудную полость не следует сильно сдавливать, что негативно скажется на коронарном кровотоке и затенит коронарную артерию, что приведет к невидимости коронарной артерии и неудаче перевязки LAD. Более того, это может привести к тяжелому повреждению легких. В большинстве случаев легкое надавливание на правую сторону грудной стенки позволяет успешно экстернализовать сердце через открытое межреберье. Иногда чувство сопротивления во время экстернализации сердца может указывать на несовпадение верхушки сердца и межреберного отверстия. Эту проблему можно решить небольшими движениями микро-комарного гемостата вдоль срединно-подмышечной линии. Еще одним важным моментом является адекватная эвакуация остаточного воздуха из грудной полости перед наложением швов на мышцы и кожу. Если этого не сделать, это увеличит послеоперационную смертность от пневмоторакса.
Преимущества и ограничения
Традиционные методы перевязки коронарных артерий требуют интубации, искусственной вентиляции легких, перерезания ребер и непросты для идентификации коронарных артерий из-за высокой частоты сердечных сокращений. Эти проблемы значительно увеличивают время операции и увеличивают смертность, связанную с операцией. По сравнению с традиционными методами, модифицированный протокол имеет следующие преимущества: (1) он экономит время (т.е. от анестезии, перевязки LAD до успешного наложения швов на кожу проходит около 3 минут); (2) Необходимые хирургические инструменты и материалы легко доступны в большинстве лабораторий. Однако существенным ограничением этого уникального метода является ограниченное время, отведенное для перевязки LAD после экстернализации сердца из-за отсутствия механической вентиляции легких. Таким образом, для новичков можно ожидать высокой смертности, вызванной пневмотораксом. Исходя из опыта авторов, экстернализация сердца в течение менее 30 с хорошо переносится всеми испытуемыми мышами. Этого времени достаточно для того, чтобы опытный специалист завершил индукцию инфаркта миокарда с низкой периоперационной летальностью (<5%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), Шанхайской программы выдающихся академических лидеров (18XD1402400), Комиссии по науке и технологиям муниципалитета Шанхая (201409005200), Шанхайской программы талантов Пуцзяна (2020PJD030) и Китайского фонда постдокторантуры (2020M671161, BX20190216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA | T8877-25G | TTC staining |
| 4-0 silk suture | YUANKANG | 4-0 | Surgical instrument |
| Autoclave | HIRAYAMA | HVE-50 | Sterilization for the solid |
| Buprenorphine | Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd. | H10940181 | reduce post-operative pain |
| Centrifugation tube | Biological Hope | 1850-K | 15ML |
| Depilatory cream | ZIKER BIOTECHNOLOGY | ZK-L2701 | Depilation agent for laboratory animals |
| Forcep | RWD | F12028 | Surgical instrument |
| Gas filter | ZHAOXIN | SA-493 | Operator protection |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | Used for anesthesia |
| Light source | Beijing PDV | LG-150B | Operating lamp |
| Micro-mosquito hemostat | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Needle | BINXIONG | 42180104 | Surgical instrument |
| Needle and the 6-0 silk suture | JIAHE | SC086 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32030 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32010 | Surgical instrument |
| Povidone-iodine swabs | SingleLady | GB26368-2010 | Skin disinfection |
| Scissors | CNSTRONG | JYJ1030 | Surgical instrument |
| Sterile eye cream | Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H10940177 | prevent corneal dryness |
| Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals | VisualSonics | Vevo 2100 | Echocardiographic analysis |
References
- Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074 (2018).
- Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
- Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
- Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
- Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
- Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
- Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
- vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
- Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
- Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
- Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
- Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).
