Summary
Under tilstrækkelig anæstesi blev musehjertet eksternaliseret gennem det interkostale rum, og myokardieinfarkt blev succesfuldt induceret ved at ligere den venstre forreste nedadgående arterie (LAD) ved hjælp af materialer, der var let tilgængelige i de fleste laboratorier.
Abstract
Myokardieinfarkt (MI) repræsenterer en af de førende dødsårsager. MI-modeller anvendes i vid udstrækning til at undersøge patomekanismerne ved post-MI-remodellering og evaluering af nye behandlinger. Forskellige metoder (fx isoproterenolbehandling, kryoskade, koronararterieligering osv.) er blevet anvendt til at inducere MI. Sammenlignet med isoproterenolbehandling og kryoskade kan koronararterieligering bedre afspejle det iskæmiske respons og kronisk ombygning efter MI. Imidlertid er traditionelle metoder til koronar ligering hos mus teknisk udfordrende. Den aktuelle undersøgelse beskriver en enkel og effektiv proces til induktion af MI i mus med let tilgængelige materialer. Musens brysthud blev skåret åben under stabil anæstesi. Hjertet blev straks eksternaliseret gennem det interkostale rum efter stump adskillelse af pectoralis major og pectoralis minor. Den venstre forreste nedadgående gren (LAD) blev ligeret med en 6-0 sutur 3 mm fra dens oprindelse. Efter LAD ligering indikerede farvning med 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) vellykket induktion af MI og tidsmæssige ændringer af arstørrelsen efter MI. I mellemtiden viste overlevelsesanalyseresultater åbenlys dødelighed inden for 7 dage efter MI, hovedsageligt på grund af hjertebrud. Desuden viste post-MI ekkokardiografisk vurdering vellykket induktion af kontraktil dysfunktion og ventrikulær remodellering. Når den er mestret, kan en MI-model etableres i mus inden for 2-3 minutter med let tilgængelige materialer.
Introduction
Myokardieinfarkt (MI) repræsenterer en af de væsentlige årsager til død og handicap på verdensplan 1,2,3,4,5. På trods af rettidig reperfusion er der i øjeblikket mangel på effektive terapier til behandling af post-MI hjerteombygning. Tilsvarende er der gjort en betydelig indsats for mekanistisk udforskning og terapiudnyttelse for MI 6,7,8. Det skal bemærkes, at etableringen af MI-modeller er en forudsætning for at opfylde disse mål.
Flere metoder (f.eks. isoproterenolbehandling, kryoskade, koronararterieligering osv.) er blevet foreslået til at inducere MI-modeller hos små dyr. Isoproterenolbehandling er en simpel metode til MI-induktion, men det kan ikke fremkalde infarkt i målområdet9. Kryoskade fører til myokardienekrose via dannelsen af iskrystaller og forstyrrelse af cellemembranen snarere end direkte iskæmi10. I modsætning hertil tillader koronararterieligering præcis kontrol af okklusionsstedet og omfanget af infarktområdet og rekapitulerer trofast remodelleringsrespons efter infarkt11,12. Koronararterieligering udføres typisk efter intubation, mekanisk ventilation og thoracotomi, hvilket er teknisk udfordrende13,14. Flere modificerede protokoller for koronararterieligering (f.eks. ventilationsfri) blev rapporteret og forstærket induktionen af MI, men detaljerede visuelle demonstrationer mangler15,16,17. Disse spørgsmål udgør en betydelig økonomisk og teknisk barriere for grupper, der ønsker at engagere sig i forskning ved hjælp af MI-modeller. Denne rapport præsenterer en tilgang til induktion af MI i mus. Den nuværende metode er let, tidsbesparende og bruger kirurgiske værktøjer og udstyr, der let findes i de fleste laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene, der involverer dyrearbejde, udføres med alle nødvendige godkendelser fra laboratoriedyrets velfærdsetikkomité på Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine (R52021-0506). Hun- og hanmus i alderen 87-10 uger blev anvendt i undersøgelsen.
1. Forberedelse af det forenklede anæstesiudstyr (VALGFRIT)
BEMÆRK: Dette er en valgfri præoperativ opsætning og kan erstattes med titrerbar anæstesi som nævnt i afsnit 2. Den institutionelle dyreetiske komité og dyrlæge(r) bør høres, inden denne struktur for dyreforsøg tilpasses.
- Tag et 15 ml centrifugerør, og lav et snit vinkelret på rørets lange akse ca. 3 cm fra åbningen.
BEMÆRK: Sørg for, at snittet er større end halvdelen af rørets cirkulære omkreds, så ventilen kan indsættes med succes. - Bor huller (diameter, 2 mm) ved centrifugerørets væg mellem snittet og røråbningen.
- Skær et stykke af ventilen i passende størrelse af en plastplade, og indsæt ventilen i snittet på rørvæggen.
BEMÆRK: Ventilen kan bruges til at kontrollere frigivelseshastigheden af isofluran ved at ændre dybden af indføringen. - Inde i en røghætte skal du skære bunden af røret op og tilslutte det til iltforsyningen. Placer en vatrondel nær den nederste ende af røret, tilsæt 0,5 ml isofluran (som opnået, se materialetabellen) på vatkuglen, og luk ventilen.
- Test anæstesieffektiviteten ved at maskere musene med rør fremstillet som beskrevet ovenfor. Overvåg vejrtrækningshastigheden og anæstesidybden ved hjælp af tåklemmeresponsen.
BEMÆRK: En vejrtrækning mindre end 10 gange / 10 s tyder på overdreven anæstesi, og ventilens indføringsdybde skal justeres. For alle procedurer, der involverer anæstesi, skal der anvendes et gasfilter fyldt med aktiverede kulplader (figur 1A-i), og kirurgi skal udføres i en hætte.
2. Operativ forberedelse og anæstesi
- Forbered og steriliser alle de nødvendige instrumenter på operationsdagen, herunder et par tang, en mikromyghæmostat, en par kirurgiske saks, to par nåleholdere, 4-0 silkekirurgisk sutur, 6-0 silkekirurgisk sutur, et gasfilter og en lyskilde (se materialetabel) (figur 1A).
- Tag en kirurgisk maske og sterile handsker på.
- Påfør hårfjerningscremen på musebrystet og vent i 1 min. Tør forsigtigt hårfjerningscremen og håret af med vådt gasbind.
- Hold musen med den dominerende hånd efter depilering. Inducer anæstesi via indånding af fordampet isofluran (4%) med iltforsyning (1L / min) og hold ved 2-3% isofluran.
- Bekræft tilstrækkelig anæstesi ved manglen på tåklemmerespons.
- Påfør steril øjencreme på begge øjne for at forhindre tørhed i hornhinden.
- Fastgør musene på en operationsplatform i liggende stilling. Påfør povidon-jodvatpinde (se materialetabel) på brystet tre gange og dæk det desinficerede bryst med en steril gardin.
3. Induktion af myokardieinfarkt
- Skift de forurenede handsker for at sikre sterilitet.
- Lav en 0,5 cm hudskæring langs linjen, der forbinder xiphoid og armhule efter lokal blok med lidokain.
- Adskil bryst større og bryst mindre muskler ved hjælp af tang og en mikro-myg hemostat for at udsætte det fjerde interkostale rum.
- Åbn det fjerde interkostale rum ved hjælp af en mikro-myg hæmostat.
- Eksternalisere hjertet ved at skubbe hjertet mod det fjerde interkostale rum med pegefingeren på venstre hånd.
- Fastgør hjertet med venstre hånd, og liger den venstre forreste nedadgående gren med en 6-0 sutur 3 mm fra dens oprindelse.
- Placer hjertet hurtigt tilbage i brysthulen.
BEMÆRK: Det er sikkert at eksternalisere hjertet i mindre end 30 s. - Evakuer luften ud af brysthulen ved et let tryk på brysthulen manuelt.
- Luk muskellaget over ribbenene med en 6-0 silkesutur.
- Luk huden med en 4-0 silkesutur.
- Placer musene på en pude (37 °C) umiddelbart efter operationen.
- Injicer buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) subkutant hver 4-6 timer for at reducere postoperative smerter i op til 72 timer.
- Sæt de opererede mus tilbage i burene, når de er kommet sig helt.
BEMÆRK: Musene vil være fuldt restitueret inden for 3-5 minutter efter operationen. - Overvåg omhyggeligt musene og sørg for våd mad i op til 7 dage.
4. Høstning af vævene
- Ofre musene på forskellige tidspunkter efter MI-etablering ved cervikal dislokation.
- Fastgør de ofrede mus på operationsplatformen i liggende stilling.
- Lav et ventralt snit (~ 3-4 cm) i overlivet. Skær ribbenene af fra begge sider af brysthulen, og fjern membranen.
- Perfus hjertet med 10 ml koldt fosfatbufret saltvand (1x PBS, 4 °C) gennem intraventrikulær injektion.
- Hjertet opsamles ved at afskære aortroden og straks opbevare hjertet ved -80 °C.
BEMÆRK: Ifølge forfatternes erfaring er det muligt at udføre TTC-farvning inden for to uger efter opbevaring. - Plet hjertet med 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC).
- Skær det frosne hjerte i 1 mm tykke sektioner på is ved hjælp af barberblade.
- De tilberedte hjerteskiver inkuberes i 1% TTC-opløsning (opløst i 1x PBS) ved 37 °C i 10-15 min.
BEMÆRK: Efter 15 minutters inkubation kasseres TTC-opløsningen, og de farvede hjerteskiver nedsænkes i 1x PBS.
- Fotografer udsnittene ved hjælp af et digitalt kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle protokol og nogle af de kritiske trin er vist i figur 1. Det forenklede anæstesiudstyr inducerede anæstesi. Som vist i figur 2A var den inducerede anæstesi stabil, hvilket afspejles af de regelmæssige vejrtrækningshastigheder (varierede fra 90-107 vejrtrækninger / min hos de testede mus). Efter koronararterieligering indikerede TTC-farvningsanalyse vellykket induktion af myokardieinfarkt og tidsmæssige ændringer af arstørrelse efter MI (figur 2B). I mellemtiden viste overlevelsesanalyseresultater åbenlys dødelighed inden for 7 dage efter MI hos mandlige og kvindelige C57BL/6J-mus (figur 2C, D). Ventrikelruptur (56% hos hanmus; 40% hos hunmus) var en almindelig årsag til post-MI død. Desuden viste post-MI ekkokardiografisk vurdering vellykket induktion af kontraktil dysfunktion og ventrikulær remodellering (figur 2E, F).
Figur 1: Materialer og kritiske trin i de modificerede metoder til MI-induktion . (A) Kirurgiske instrumenter og materialer, der er nødvendige for denne protokol. (a) 4-0 silkesutur. b) 6-0 silkesutur. c) Tang. d) Saks. (e-f) Kanyleholdere. g) Mikromyg hæmostat. h) Lyskilde. i) Gasfilter. (B) Repræsentative billeder, der viser vigtige trin til inducering af MI i mus. (a) Musen blev sikret efter anæstesi, og povidon-jod blev påført det kirurgiske sted. b) Det kirurgiske sted er draperet. (c) Et 0,5 cm snit på det kirurgiske sted efter lokal blok med lidokain. d) Blottede ribben. Pilen angiver ribbenene. (e) Dissekerede bryst større og pectoral mindre muskler for at afsløre det fjerde interkostale rum. (f) Eksternaliseret hjerte. (g-h) Ligeret LAD med en 6-0 silkesutur. Pilen angiver LAD. (i) Hjertet placeres tilbage i brysthulen. (j) Luft blev evakueret fra brysthulen. (k) Muskellaget lukkede sig over ribbenene med 6-0 silkesutur og huden lukkede med 4-0 silkesuturer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Histologiske og funktionelle ændringer efter koronararterieligering. (A) Vejrtrækningshastigheder hos mus bedøvet af det forenklede anæstesiudstyr (n = 10). (B ) TTC-farvningsresultater af hjerteskiver (4 skiver fra hvert hjerte) blev indsamlet på forskellige tidspunkter efter MI. Det hvide område angav et infarkt område, og det røde område afslørede levedygtigt myokardium. (C) Kaplan-Meier-kurven viser dødeligheden efter MI hos hanmus (n = 20 pr. Gruppe). (D) Kaplan-Meier-kurven viser post-MI-dødeligheden hos hunmus (n = 20 pr. Gruppe). (E) Repræsentative billeder af ekkokardiografisk analyse på forskellige tidspunkter efter MI (humbug, 3 dage, 7 dage, 21 dage og 28 dage efter MI). (F) Den kvantitative analyse af værdierne for venstre ventrikels uddrivningsfraktion (LVEF), venstre ventrikels fraktionelle forkortelse (LVFS), venstre ventrikels endesystoliske diameter (LVsD) og venstre ventrikels endediastoliske dimension (LVdD) blandt de angivne grupper (n = 5 pr. Gruppe). **p<0,01 eller ***p<0,001 vs. Sham; ##p<0.01 eller ###p<0.001 vs. 3 dage efter MI. Envejsanalyse af varians med posthoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) test blev udført til statistisk analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapport demonstrerede en nem protokol for MI-induktion i mus med let tilgængelige materialer, som blev modificeret fra en metode rapporteret af Gao16. Murine MI-modeller er uundværlige for mekanistisk udforskning og lægemiddelscreening for post-MI-dysfunktion og ombygning12. Blandt de eksisterende teknikker til MI-induktion repræsenterer koronararterieligering den mest almindeligt praktiserede. Koronararterieligering rekapitulerer trofast den iskæmiske karakter af myokardieinfarkt og fører til et arhelings- og ombygningsrespons svarende til det kliniske scenarie18,19. Den konventionelle protokol for koronararterieligering involverer imidlertid intubation, ventilation og en bred åbning af brystet, hvilket er teknisk udfordrende og tidskrævende. I løbet af de seneste år er forskellige protokoller for koronararterieligering blevet rapporteret og forstærket etableringen af MI til en vis grad15,16,17. Den aktuelle undersøgelse præsenterede en enkel og effektiv protokol ved hjælp af kirurgiske værktøjer og udstyr, der let findes i de fleste laboratorier.
Kritiske trin og fejlfinding
For optimal ydeevne ved at praktisere denne metode er flere vigtige trin værd at bemærke. For at eksternalisere hjertet bør brysthulen ikke presses voldsomt, hvilket ville påvirke koronar blodgennemstrømningen negativt og skjule koronararterien, hvilket fører til usynligheden af koronararterien og svigt i LAD-ligering. Desuden kan dette resultere i alvorlig lungeskade. I de fleste tilfælde vil et blidt skub mod højre side af brystvæggen med succes eksternalisere hjertet gennem det åbne interkostale rum. Lejlighedsvis kan en følelse af modstand under hjerteeksternalisering indikere en uoverensstemmelse mellem hjertespidsen og den interkostale åbning. Dette kan løses ved små bevægelser af mikromyggen hemostat langs den midaxillære linje. Et andet kritisk punkt er tilstrækkelig evakuering af den resterende luft i brysthulen, før musklerne og huden sutureres. Hvis du ikke gør det, vil det øge postoperativ dødelighed på grund af pneumothorax.
Fordele og begrænsninger
Konventionelle metoder til koronar ligering kræver intubation, mekanisk ventilation, ribben skæres og er ikke lette til koronararterieidentifikation på grund af høj puls. Disse problemer forlænger operationstiden dramatisk og øger operationsrelateret dødelighed. Sammenlignet med konventionelle metoder giver den modificerede protokol følgende fordele: (1) det er tidsbesparende (dvs. det tager ca. 3 minutter fra anæstesi, LAD-ligering til vellykket hudsuturering); (2) De kirurgiske værktøjer og materialer, der kræves, er let tilgængelige i de fleste laboratorier. En væsentlig begrænsning af denne unikke metode er imidlertid den begrænsede tid, der er tilladt for LAD-ligering efter hjerteeksternalisering på grund af manglen på mekanisk ventilationsstøtte. Således kan høj dødelighed forårsaget af pneumothorax forventes for begyndere. Baseret på forfatternes erfaring tolereres hjerteeksternalisering i mindre end 30 s godt af alle de testede mus. Dette tidsvindue er tilstrækkeligt for en erfaren tekniker til at afslutte MI-induktion med lav perioperativ dødelighed (<5%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (201409005200), Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030) og China Postdoctoral Science Foundation (2020M671161, BX20190216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA | T8877-25G | TTC staining |
| 4-0 silk suture | YUANKANG | 4-0 | Surgical instrument |
| Autoclave | HIRAYAMA | HVE-50 | Sterilization for the solid |
| Buprenorphine | Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd. | H10940181 | reduce post-operative pain |
| Centrifugation tube | Biological Hope | 1850-K | 15ML |
| Depilatory cream | ZIKER BIOTECHNOLOGY | ZK-L2701 | Depilation agent for laboratory animals |
| Forcep | RWD | F12028 | Surgical instrument |
| Gas filter | ZHAOXIN | SA-493 | Operator protection |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | Used for anesthesia |
| Light source | Beijing PDV | LG-150B | Operating lamp |
| Micro-mosquito hemostat | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Needle | BINXIONG | 42180104 | Surgical instrument |
| Needle and the 6-0 silk suture | JIAHE | SC086 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32030 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32010 | Surgical instrument |
| Povidone-iodine swabs | SingleLady | GB26368-2010 | Skin disinfection |
| Scissors | CNSTRONG | JYJ1030 | Surgical instrument |
| Sterile eye cream | Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H10940177 | prevent corneal dryness |
| Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals | VisualSonics | Vevo 2100 | Echocardiographic analysis |
References
- Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074 (2018).
- Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
- Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
- Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
- Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
- Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
- Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
- vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
- Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
- Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
- Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
- Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).
