Summary
Under adekvat anestesi externaliserades mushjärtat genom det interkostala utrymmet, och hjärtinfarkt inducerades framgångsrikt genom ligering av den vänstra främre nedåtgående artären (LAD) med hjälp av material som är lättillgängliga i de flesta laboratorier.
Abstract
Hjärtinfarkt är en av de vanligaste dödsorsakerna. MI-modeller används i stor utsträckning för att undersöka patomekanismerna för post-MI-remodellering och utvärdering av nya terapier. Olika metoder (t.ex. isoproterenobehandling, kryoskada, kranskärlsligering, etc.) har använts för att inducera hjärtinfarkt. Jämfört med isoproterenobehandling och kryoskada kan kranskärlsligering bättre återspegla det ischemiska svaret och kronisk remodellering efter hjärtinfarkt. Traditionella metoder för kranskärlsligering på möss är dock tekniskt utmanande. Den aktuella studien beskriver en enkel och effektiv process för induktion av hjärtinfarkt hos möss med lättillgängliga material. Huden på musbröstet skars upp under stallbedövning. Hjärtat externaliserades omedelbart genom det interkostala utrymmet efter trubbig separation av pectoralis major och pectoralis minor. Den vänstra främre nedåtgående grenen (LAD) ligerades med en 6-0 sutur 3 mm från sitt ursprung. Efter LAD-ligering indikerade färgning med 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) framgångsrik induktion av hjärtinfarkt och temporala förändringar av ärrstorlek efter hjärtinfarkt. Samtidigt visade överlevnadsanalysresultaten uppenbar dödlighet inom 7 dagar efter hjärtinfarkt, främst på grund av hjärtruptur. Dessutom visade ekokardiografisk bedömning efter hjärtinfarkt framgångsrik induktion av kontraktil dysfunktion och ventrikulär remodellering. När den väl behärskas kan en MI-modell etableras i möss inom 2-3 minuter med lättillgängligt material.
Introduction
Hjärtinfarkt är en av de vanligaste orsakerna till dödsfall och funktionsnedsättningi världen 1,2,3,4,5. Trots snabb reperfusion finns det för närvarande en brist på effektiva terapier för att behandla hjärtremodellering efter hjärtinfarkt. På motsvarande sätt har betydande ansträngningar gjorts för mekanistisk utforskning och terapiutnyttjande för MI 6,7,8. Det bör noteras att upprättandet av MI-modeller är en förutsättning för att uppfylla dessa mål.
Flera metoder (t.ex. isoproterenobehandling, kryoskada, kranskärlsligering, etc.) har föreslagits för att inducera MI-modeller hos små djur. Isoproterenolbehandling är en enkel metod för induktion av hjärtinfarkt, men den kan inte inducera infarkt i målområdet9. Kryoskada leder till myokardnekros via generering av iskristaller och störning av cellmembranet snarare än direkt ischemi10. Däremot möjliggör kranskärlsligering exakt kontroll av ocklusionsplatsen och omfattningen av infarktområdet och rekapitulerar troget remodelleringsresponsen efter infarkt11,12. Kranskärlsligering utförs vanligtvis efter intubation, mekanisk ventilation och torakotomi, vilket är tekniskt utmanande13,14. Flera modifierade protokoll för kranskärlsligering (t.ex. ventilationsfri) rapporterades och potentierade induktionen av hjärtinfarkt, men detaljerade visuella demonstrationer saknas15,16,17. Dessa frågor utgör ett betydande ekonomiskt och tekniskt hinder för grupper som vill bedriva forskning med hjälp av MI-modeller. Denna rapport presenterar ett tillvägagångssätt för induktion av hjärtinfarkt hos möss. Den nuvarande metoden är enkel, tidsbesparande och använder kirurgiska verktyg och utrustning som lätt finns i de flesta laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försöken med djurarbete utförs med alla nödvändiga godkännanden från Laboratory Animal Welfare Ethics Committee vid Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine (R52021-0506). Hon- och hanmöss av typen C57BL/6J i åldern 8-10 veckor användes i studien.
1. Förberedelse av den förenklade anestesiutrustningen (FRIVILLIG UPPGIFT)
OBS: Detta är en valfri preoperativ inställning och kan ersättas med titrerbar anestesi som nämns i avsnitt 2. Samråd bör ske med den institutionella djurförsöksetiska kommittén och veterinär(er) innan denna uppsättning av djurförsök anpassas.
- Ta ett 15 ml centrifugrör och gör ett snitt vinkelrätt mot rörets långa axel ca 3 cm från öppningen.
OBS: Se till att snittet är större än hälften av rörets cirkulära omkrets så att ventilen kan sättas in. - Borra hål (diameter, 2 mm) vid centrifugrörets vägg mellan snittet och röröppningen.
- Skär en lagom stor del av ventilen från en plastskiva och sätt in ventilen i snittet på rörväggen.
OBS: Ventilen kan användas för att kontrollera frisättningshastigheten för isofluran genom att ändra djupet på insättningen. - Skär upp botten av röret inuti ett dragskåp och anslut det till syretillförseln. Placera en bomullstuss nära den nedre änden av röret, tillsätt 0.5 ml isofluran (som erhålls, se materialförteckning) på bomullstussen och stäng ventilen.
- Testa anestesieffekten genom att maskera mössen med rör preparerade enligt beskrivningen ovan. Övervaka andningsfrekvensen och anestesidjupet genom att nypa ihop tårna.
OBS: En andningsfrekvens mindre än 10 gånger/10 s tyder på överdriven anestesi, och ventilens införingsdjup bör justeras. För alla ingrepp som involverar anestesi måste ett gasfilter fyllt med aktivt kol användas (Figur 1A-i), och kirurgi bör utföras i en huva.
2. Operativ förberedelse och anestesi
- Förbered och sterilisera alla nödvändiga instrument på operationsdagen, inklusive en pincett, en mikromygghemostat, en kirurgisk sax, två par nålhållare, 4-0 silkeskirurgisk sutur, 6-0 silkeskirurgisk sutur, ett gasfilter och en ljuskälla (se materialförteckning) (Figur 1A).
- Ta på dig ett kirurgiskt munskydd och sterila handskar.
- Applicera hårborttagningskrämen på musbröstet och vänta i 1 minut. Torka försiktigt bort hårborttagningskrämen och håret med våt gasbinda.
- Håll musen med den dominanta handen efter depilering. Inducera anestesi via inhalation av förångad isofluran (4%) med syretillförsel (1L/min) och bibehåll 2-3% isofluran.
- Bekräfta adekvat anestesi genom bristen på tåklämningssvar.
- Applicera steril ögonkräm på båda ögonen för att förhindra torrhet i hornhinnan.
- Fäst mössen på en operationsplattform i ryggläge. Applicera povidon-jod-svabbar (se materialtabell) på bröstet tre gånger och täck det desinficerade bröstet med ett sterilt draperi.
3. Induktion av hjärtinfarkt
- Byt ut de kontaminerade handskarna för att säkerställa sterilitet.
- Gör ett 0,5 cm långt hudsnitt längs linjen som förbinder xiphoid och armhåla efter lokal blockering med lidokain.
- Separera trubbigt pectoral major och pectoral minor muskler med hjälp av pincett och en mikromygga hemostat för att exponera det fjärde interkostala utrymmet.
- Öppna det fjärde interkostala utrymmet med hjälp av en mikromygghemostat.
- Externalisera hjärtat genom att trycka hjärtat mot det fjärde interkostala utrymmet med pekfingret på vänster hand.
- Fäst hjärtat med vänster hand och ligera den vänstra främre nedåtgående grenen med en 6-0 sutur 3 mm från dess ursprung.
- Sätt snabbt tillbaka hjärtat i brösthålan.
OBS: Det är säkert att externalisera hjärtat i mindre än 30 s. - Evakuera luften ur brösthålan genom ett lätt tryck på brösthålan manuellt.
- Stäng muskellagret över revbenen med en 6-0 silkessutur.
- Stäng huden med en 4-0 silkessutur.
- Placera mössen på en dyna (37 °C) omedelbart efter operationen.
- Injicera buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg) subkutant var 4-6:e timme för att minska postoperativ smärta i upp till 72 timmar.
- Sätt tillbaka de opererade mössen i burar när de är helt återställda.
OBS: Mössen kommer att vara helt återställda inom 3-5 minuter efter operationen. - Övervaka mössen noggrant och ge våtfoder i upp till 7 dagar.
4. Skörda vävnaderna
- Offra mössen vid olika tidpunkter efter att hjärtinfarkt etablerats genom cervikal luxation.
- Fäst de avlivade mössen på operationsplattformen i ryggläge.
- Gör ett ventralt snitt (~3-4 cm) i övre delen av buken. Skär av revbenen från båda sidor av brösthålan och ta bort membranet.
- Genomsyra hjärtat med 10 ml kallfosfatbuffrad koksaltlösning (1x PBS, 4 °C) genom intraventrikulär injektion.
- Samla in hjärtat genom att skära av aortaroten och förvara omedelbart hjärtat vid -80 °C.
OBS: Enligt författarnas erfarenhet är det möjligt att utföra TTC-färgning inom två veckor efter lagring. - Färga hjärtat med 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC).
- Skär det frysta hjärtat i 1 mm tjocka isbitar med rakblad.
- Inkubera de beredda hjärtskivorna i 1 % TTC-lösning (upplöst i 1 x PBS) vid 37 °C i 10-15 minuter.
OBS: Efter 15 minuters inkubation, kassera TTC-lösningen och sänk ner de färgade hjärtskivorna i 1x PBS.
- Fotografera skivorna med en digitalkamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det experimentella protokollet och några av de kritiska stegen visas i figur 1. Den förenklade anestesiutrustningen inducerade anestesi. Som visas i figur 2A var den inducerade anestesin stabil, vilket återspeglas i de regelbundna andningsfrekvenserna (varierade från 90-107 andetag/min hos de testade mössen). Efter kranskärlsligering indikerade TTC-färgningsanalys framgångsrik induktion av hjärtinfarkt och temporala förändringar av ärrstorlek efter hjärtinfarkt (Figur 2B). Samtidigt visade överlevnadsanalysresultaten uppenbar mortalitet inom 7 dagar efter hjärtinfarkt hos han- och honmöss av typen C57BL/6J (Figur 2C,D). Ventrikulär ruptur (56 % hos hanmöss; 40 % hos honmöss) var en vanlig orsak till död efter hjärtinfarkt. Dessutom visade ekokardiografisk bedömning efter hjärtinfarkt framgångsrik induktion av kontraktil dysfunktion och ventrikulär remodellering (Figur 2E,F).
Figur 1: Material och kritiska steg i de modifierade metoderna för induktion av hjärtinfarkt . A) Kirurgiska instrument och material som behövs för detta protokoll. (a) 4-0 silkessutur. (b) 6-0 silkessutur. (c) Tång. d) Saxar. (e-f) Nålhållare. g) Hemostat för mikromyggor. h) Ljuskälla. i) Gasfilter. (B) Representativa bilder som visar viktiga steg för att inducera hjärtinfarkt hos möss. a) Musen säkrades efter anestesi och povidonjod applicerades på operationsområdet. b) Operationsområdet är draperat. c) Ett snitt på 0,5 cm vid operationsstället efter lokal blockad med lidokain. d) Exponerade revben. Pilen visar revbenen. (e) Dissekerade bröst- och bröstmusklerna för att exponera det fjärde interkostala rummet. (f) Externaliserat hjärta. (g-h) Ligated LAD med en 6-0 silkessutur. Pilen visar LAD. (i) Hjärtat placeras tillbaka i brösthålan. j) Luft evakuerades från brösthålan. (k) Muskellagret stängt över revbenen med 6-0 silkessutur och huden stängd med 4-0 silkessuturer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Histologiska och funktionella förändringar efter kranskärlsligering. (A) Andningsfrekvens hos möss som bedövats med den förenklade anestesiutrustningen (n=10). (B) TTC-färgningsresultat av hjärtskivor (4 skivor från varje hjärta) samlades in vid olika tidpunkter efter hjärtinfarkt. Det vita området indikerade ett infarktområde, och det röda området avslöjade livsdugligt myokardium. (C) Kaplan-Meier-kurvan visar dödligheten efter hjärtinfarkt hos hanmöss (n=20 per grupp). (D) Kaplan-Meier-kurvan visar dödligheten efter hjärtinfarkt hos honmöss (n=20 per grupp). (E) Representativa bilder av ekokardiografisk analys vid olika tidpunkter efter hjärtinfarkt (sham, 3 dagar, 7 dagar, 21 dagar och 28 dagar efter hjärtinfarkt). (F) Kvantitativ analys av vänsterkammarejektionsfraktionen (LVEF), vänsterkammarfraktionerad förkortning (LVFS), vänsterkammarslutsystolisk diameter (LVsD) och vänsterkammarslutdiastolisk dimension (LVdD) bland de indikerade grupperna (n=5 per grupp). **p<0,01 eller ***p<0,001 jämfört med Bluff; ##p<0.01 eller ###p<0.001 vs. 3 dagar efter hjärtinfarkt utfördes envägsanalys av varians med posthoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) test för statistisk analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den aktuella rapporten demonstrerade ett enkelt protokoll för MI-induktion i möss med lättillgängligt material, vilket modifierades från en metod som rapporterats av Gao16. Murina MI-modeller är oumbärliga för mekanistisk utforskning och läkemedelsscreening för post-MI-dysfunktion och ombyggnad12. Bland de befintliga teknikerna för induktion av hjärtinfarkt är kranskärlsligering den vanligaste. Kranskärlsligering rekapitulerar troget ischemikaraktären hos hjärtinfarkt och leder till ett ärrläknings- och ombyggnadssvar som liknar det kliniska scenariot18,19. Det konventionella protokollet för kranskärlsligering innebär dock intubation, ventilation och en bred öppning av bröstkorgen, vilket är tekniskt utmanande och tidskrävande. Under de senaste åren har olika protokoll för kranskärlsligering rapporterats och potentierat etableringen av hjärtinfarkt till viss del15,16,17. Den aktuella studien presenterade ett enkelt och effektivt protokoll med hjälp av kirurgiska verktyg och utrustning som är lätt att hitta i de flesta laboratorier.
Kritiska steg och felsökning
För optimal prestanda när du utövar denna metod är flera viktiga steg värda att notera. För att externalisera hjärtat bör brösthålan inte klämmas hårt, vilket skulle påverka kranskärlsblodflödet negativt och skymma kranskärlet, vilket leder till att kranskärlet blir osynligt och att LAD-ligeringen misslyckas. Dessutom kan detta leda till allvarliga lungskador. I de flesta fall kommer ett lätt tryck mot den högra sidan av bröstväggen framgångsrikt att externalisera hjärtat genom det öppnade interkostala utrymmet. Ibland kan en känsla av motstånd under hjärtats externalisering tyda på en obalans mellan hjärtats apex och den interkostala öppningen. Detta kan åtgärdas genom små rörelser av mikromyggans hemostat längs midaxillärlinjen. En annan kritisk punkt är tillräcklig evakuering av kvarvarande luft i brösthålan innan musklerna och huden sutureras. Om man inte gör det ökar den postoperativa dödligheten på grund av pneumothorax.
Fördelar och begränsningar
Konventionella metoder för kranskärlsligering kräver intubation, mekanisk ventilation, revben som skärs av och är inte lätta för kranskärlsidentifiering på grund av hög hjärtfrekvens. Dessa problem förlänger operationstiden dramatiskt och ökar den operationsrelaterade dödligheten. Jämfört med konventionella metoder ger det modifierade protokollet följande fördelar: (1) det är tidsbesparande (dvs. det tar cirka 3 minuter från anestesi, LAD-ligering till framgångsrik hudsuturering); (2) De kirurgiska verktyg och material som krävs är lätt tillgängliga i de flesta laboratorier. En betydande begränsning av denna unika metod är dock den begränsade tid som tillåts för LAD-ligering efter hjärtexternalisering på grund av bristen på mekaniskt ventilationsstöd. Således kan hög dödlighet orsakad av pneumothorax förväntas för nybörjare. Baserat på författarnas erfarenhet tolereras hjärtexternalisering under mindre än 30 sekunder väl av alla testade möss. Detta tidsfönster är tillräckligt för att en erfaren tekniker ska kunna avsluta MI-induktion med låg perioperativ mortalitet (<5 %).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (201409005200), Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030) och China Postdoctoral Science Foundation (2020M671161, BX20190216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA | T8877-25G | TTC staining |
| 4-0 silk suture | YUANKANG | 4-0 | Surgical instrument |
| Autoclave | HIRAYAMA | HVE-50 | Sterilization for the solid |
| Buprenorphine | Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd. | H10940181 | reduce post-operative pain |
| Centrifugation tube | Biological Hope | 1850-K | 15ML |
| Depilatory cream | ZIKER BIOTECHNOLOGY | ZK-L2701 | Depilation agent for laboratory animals |
| Forcep | RWD | F12028 | Surgical instrument |
| Gas filter | ZHAOXIN | SA-493 | Operator protection |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | Used for anesthesia |
| Light source | Beijing PDV | LG-150B | Operating lamp |
| Micro-mosquito hemostat | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Needle | BINXIONG | 42180104 | Surgical instrument |
| Needle and the 6-0 silk suture | JIAHE | SC086 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32030 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32010 | Surgical instrument |
| Povidone-iodine swabs | SingleLady | GB26368-2010 | Skin disinfection |
| Scissors | CNSTRONG | JYJ1030 | Surgical instrument |
| Sterile eye cream | Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H10940177 | prevent corneal dryness |
| Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals | VisualSonics | Vevo 2100 | Echocardiographic analysis |
References
- Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074 (2018).
- Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
- Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
- Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
- Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
- Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
- Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
- vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
- Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
- Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
- Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
- Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).
