Summary
Under adekvat anestesi ble musehjertet eksternalisert gjennom interkostalrommet, og hjerteinfarkt ble vellykket indusert ved å ligere venstre fremre synkende arterie (LAD) ved hjelp av materialer som var lett tilgjengelige i de fleste laboratorier.
Abstract
Hjerteinfarkt (MI) representerer en av de viktigste dødsårsakene. MI-modeller er mye brukt for å undersøke patomekanismene til post-MI remodellering og evaluering av nye terapier. Ulike metoder (f.eks. isoproterenolbehandling, kryoskade, koronararterieligering, etc.) har blitt brukt til å indusere MI. Sammenlignet med isoproterenolbehandling og kryoskade, kan koronar ligering bedre reflektere iskemisk respons og kronisk remodellering etter MI. Imidlertid er tradisjonelle metoder for koronar ligering hos mus teknisk utfordrende. Denne studien beskriver en enkel og effektiv prosess for induksjon av MI hos mus med lett tilgjengelige materialer. Musens brysthud ble kuttet åpen under stabil anestesi. Hjertet ble umiddelbart eksternalisert gjennom interkostalrommet etter stump separasjon av pectoralis major og pectoralis minor. Den venstre fremre synkende grenen (LAD) ble ligert med en 6-0 sutur 3 mm fra opprinnelsen. Etter LAD ligering indikerte farging med 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) vellykket induksjon av MI og temporale endringer av arrstørrelse etter MI. I mellomtiden viste overlevelsesanalyseresultater åpenbar dødelighet innen 7 dager etter MI, hovedsakelig på grunn av hjerteruptur. Videre viste post-MI ekkokardiografisk vurdering vellykket induksjon av kontraktil dysfunksjon og ventrikulær remodellering. Når du mestrer, kan en MI-modell etableres hos mus innen 2-3 minutter med lett tilgjengelige materialer.
Introduction
Hjerteinfarkt (MI) representerer en av de viktigste årsakene til død og uførhet over hele verden 1,2,3,4,5. Til tross for rettidig reperfusjon er det for tiden mangel på effektive terapier for å behandle post-MI hjerteremodellering. Tilsvarende er det gjort en betydelig innsats for mekanistisk utforskning og terapiutnyttelse for MI 6,7,8. Merk at etablering av MI-modeller er en forutsetning for å møte disse målene.
Flere metoder (f.eks. isoproterenolbehandling, kryoskade, koronararterieligering, etc.) har blitt foreslått for å indusere MI-modeller hos små dyr. Isoproterenolbehandling er en enkel metode for MI-induksjon, men den kan ikke indusere infarkt i målområdet9. Kryoskade fører til myokardnekrose via generering av iskrystaller og forstyrrelse av cellemembranen i stedet for direkte iskemi10. Derimot tillater koronararterieligering presis kontroll av okklusjonssted og utbredelse av infarktområdet og rekapitulerer trofast remodelleringsrespons etter infarkt11,12. Koronar ligering utføres vanligvis etter intubasjon, mekanisk ventilasjon og torakotomi, noe som er teknisk utfordrende13,14. Flere modifiserte protokoller for koronar ligering (f.eks. ventilasjonsfri) ble rapportert og potenserte induksjon av MI, men detaljerte visuelle demonstrasjoner mangler15,16,17. Disse problemene utgjør en betydelig økonomisk og teknisk barriere for grupper som ønsker å engasjere seg i forskning ved hjelp av MI-modeller. Denne rapporten presenterer en tilnærming for induksjon av MI hos mus. Den nåværende metoden er enkel, tidsbesparende, og bruker kirurgiske verktøy og utstyr som finnes lett i de fleste laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene som involverer dyrearbeid utføres med alle nødvendige godkjenninger fra Laboratory Animal Welfare Ethics Committee of Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine (R52021-0506). Kvinnelige og mannlige C57BL/6J-mus i alderen 8-10 uker ble brukt i studien.
1. Klargjøring av forenklet anestesiutstyr (VALGFRITT)
MERK: Dette er et valgfritt preoperativt oppsett og kan erstattes med titrerbar anestesi som nevnt i avsnitt 2. Institusjonens dyreetiske komité og veterinær(er) bør konsulteres før dette tilpasses i dyreprosedyrer.
- Ta et 15 ml sentrifugerør, og gjør et kutt vinkelrett på rørets lange akse ca 3 cm fra åpningen.
MERK: Sørg for at kuttet er større enn halvparten av den sirkulære omkretsen av rørlumen, slik at ventilen kan settes inn. - Bor hull (diameter, 2 mm) ved sentrifugerørveggen mellom kuttet og røråpningen.
- Klipp et passende stort stykke av ventilen fra en plastplate og sett ventilen inn i kuttet på rørveggen.
MERK: Ventilen kan brukes til å kontrollere frigjøringshastigheten til isofluran ved å endre innføringsdybden. - Inne i en avtrekkshette kutter du bunnen av røret og kobler den til oksygenforsyningen. Plasser en bomullsdott nær den nederste enden av røret, tilsett last 0,5 ml isofluran (som oppnådd, se materialfortegnelse) på bomullsdotten, og lukk ventilen.
- Test anestesieffekten ved å maskere musene med rør tilberedt som beskrevet ovenfor. Overvåk pustefrekvensen og anestesidybden ved tåklemmerespons.
MERK: En pustefrekvens mindre enn 10 ganger / 10 s antyder overdreven anestesi, og innføringsdybden til ventilen bør justeres. For alle prosedyrer som involverer anestesi, må et gassfilter fylt med aktivt kullplater brukes (figur 1A-i), og kirurgi bør utføres i en hette.
2. Operativ forberedelse og anestesi
- Forbered og steriliser alle nødvendige instrumenter på operasjonsdagen, inkludert en tang, en mikromygghemostat, en kirurgisk saks, to par nåleholdere, 4-0 silke kirurgisk sutur, 6-0 silke kirurgisk sutur, et gassfilter og en lyskilde (se materialfortegnelse) (figur 1A).
- Ta på en kirurgisk maske og sterile hansker.
- Påfør hårfjerningskrem på musebrystet og vent i 1 min. Tørk forsiktig av hårfjerningskrem og hår med vått gasbind.
- Hold musen med den dominerende hånden etter hårfjerning. Induserer anestesi via inhalasjon av fordampet isofluran (4 %) med oksygenforsyning (1 l/min) og opprettholdes på 2-3 % isofluran.
- Bekreft tilstrekkelig anestesi ved mangel på tåklemmrespons.
- Påfør steril øyekrem på begge øynene for å forhindre tørrhet i hornhinnen.
- Fest musene på en operasjonsplattform i ryggleie. Påfør povidon-jod vattpinner (se materialfortegnelse) på brystet tre ganger og dekk det desinfiserte brystet med en steril drapering.
3. Induksjon av hjerteinfarkt
- Bytt de forurensede hanskene for å sikre sterilitet.
- Lag en 0,5 cm hud kutt langs linjen som forbinder xiphoid og armhulen etter lokal blokk med lidokain.
- Sløvt skille pectoral major og pectoral mindre muskler ved hjelp av tang og en mikro-mygg hemostat for å avsløre den fjerde intercostal plass.
- Åpne det fjerde interkostalrommet ved hjelp av en mikromygghemostat.
- Eksternaliser hjertet ved å skyve hjertet mot det fjerde interkostalrommet med pekefingeren på venstre hånd.
- Fest hjertet med venstre hånd, og liger venstre fremre synkende gren med en 6-0 sutur 3 mm fra opprinnelsen.
- Plasser hjertet raskt tilbake i brysthulen.
MERK: Det er trygt å eksternalisere hjertet i mindre enn 30 s. - Evakuer luften ut av brysthulen ved et forsiktig trykk på brysthulen manuelt.
- Lukk muskellaget over ribbeina med en 6-0 silkesutur.
- Lukk huden med en 4-0 silke sutur.
- Legg musene på en pute (37 °C) umiddelbart etter operasjonen.
- Injiser buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg) subkutant hver 4.-6. time for å redusere postoperativ smerte i opptil 72 timer.
- Sett de opererte musene tilbake i burene når de er fullstendig gjenopprettet.
MERK: Musene vil bli fullstendig gjenopprettet innen 3-5 minutter etter operasjonen. - Overvåk musene nøye og gi våt mat i opptil 7 dager.
4. Høsting av vevet
- Ofre musene på forskjellige tidspunkter etter MI-etablering ved cervikal dislokasjon.
- Fest de ofrede musene på operasjonsplattformen i ryggleie.
- Lag et ventralt snitt (~3-4 cm) i øvre del av magen. Klipp av ribbeina fra begge sider av brysthulen, og fjern membranen.
- Perfus hjertet med 10 ml kald fosfatbufret saltvann (1x PBS, 4 °C) ved intraventrikulær injeksjon.
- Samle hjertet ved å kutte av aortaroten og oppbevar hjertet umiddelbart ved -80 °C.
MERK: Ifølge forfatternes erfaring er det mulig å utføre TTC-farging innen to uker etter lagring. - Flekk hjertet med 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC).
- Skjær det frosne hjertet i 1 mm tykke seksjoner på is ved hjelp av barberblader.
- Inkuber de preparerte hjerteskivene i 1 % TTC-oppløsning (oppløst i 1x PBS) ved 37 °C i 10-15 minutter.
MERK: Etter 15 min inkubasjon, kast TTC-oppløsningen og senk de fargede hjerteskivene i 1x PBS.
- Fotografer skivene med et digitalkamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle protokollen og noen av de kritiske trinnene er vist i figur 1. Det forenklede anestesiutstyret induserte anestesi. Som vist i figur 2A var den induserte anestesien stabil, noe som gjenspeiles av de vanlige pustefrekvensene (varierte fra 90-107 pust/min hos de testede musene). Etter koronarligering indikerte TTC-fargingsanalyse vellykket induksjon av hjerteinfarkt og temporale forandringer av arrstørrelse etter MI (figur 2B). I mellomtiden viste overlevelsesanalyseresultater åpenbar dødelighet innen 7 dager etter MI hos mannlige og kvinnelige C57BL/6J-mus (figur 2C,D). Ventrikulær ruptur (56 % hos hannmus, 40 % hos hunnmus) var en vanlig årsak til død etter MI. Videre viste ekkokardiografisk vurdering etter MI vellykket induksjon av kontraktil dysfunksjon og ventrikkelremodellering (figur 2E,F).
Figur 1: Materialer og kritiske trinn i modifiserte metoder for MI-induksjon . (A) Kirurgiske instrumenter og materialer som trengs for denne protokollen. (a) 4-0 silke sutur. (b) 6-0 silke sutur. (c) Tang. (d) Saks. (VG Nett) Nål holdere. (g) Mikro-mygg hemostat. (h) Lyskilde. (i) Gassfilter. (B) Representative bilder som viser viktige trinn for å indusere MI hos mus. (a) Musen ble sikret etter anestesi, og povidon-jod ble påført operasjonsstedet. (b) Operasjonsstedet er drapert. (c) Et 0,5 cm kutt på operasjonsstedet etter lokal blokk med lidokain. (d) Eksponerte ribber. Pilen indikerer ribbeina. (e) Dissekert pectoral major og pectoral minor muskler for å eksponere det fjerde interkostalrommet. (f) Eksternalisert hjerte. (VG Nett) Ligert LAD med en 6-0 silke sutur. Pilen indikerer LAD. (i) Hjertet plasseres tilbake i brysthulen. j) Luft ble evakuert fra brysthulen. (k) Muskellaget lukket seg over ribbeina med 6-0 silkessutur og huden lukket seg med 4-0 silkesuturer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Histologiske og funksjonelle forandringer etter koronar ligering. (A) Pustefrekvenser hos mus bedøvet av det forenklede anestesiutstyret (n = 10). (B) TTC-fargeresultater av hjerteskiver (4 skiver fra hvert hjerte) ble samlet på forskjellige tidspunkter etter MI. Det hvite området indikerte et infarktområde, og det røde området viste levedyktig myokard. (C) Kaplan-Meier-kurven viser post-MI dødelighet hos hannmus (n = 20 per gruppe). (D) Kaplan-Meier-kurven viser post-MI dødelighet hos hunnmus (n = 20 per gruppe). (E) Representative bilder av ekkokardiografisk analyse ved forskjellige tidspunkter etter MI (simulering, 3 dager, 7 dager, 21 dager og 28 dager etter MI). (F) Den kvantitative analysen av venstre ventrikkels ejeksjonsfraksjon (LVEF), venstre ventrikkelfraksjonell forkortelse (LVFS), venstre ventrikkels endesystoliske diameter (LVsD) og venstre ventrikkels endediastoliske dimensjonsverdier (LVdD) blant de angitte gruppene (n = 5 per gruppe). **p<0.01 eller ***p<0.001 vs. uekte; ##p<0.01 eller ###p<0.001 vs. 3 dager etter MI. Enveisanalyse av varians med posthoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) test ble utført for statistisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapporten viste en enkel protokoll for MI-induksjon hos mus med lett tilgjengelige materialer, som ble modifisert fra en metode rapportert av Gao16. Murine MI-modeller er uunnværlige for mekanistisk leting og medikamentell screening for post-MI dysfunksjon og remodellering12. Blant de eksisterende teknikkene for MI-induksjon representerer koronararterieligering den mest praktiserte. Koronararterieligering rekapitulerer trofast iskemiens natur av hjerteinfarkt og fører til en arrhelings- og remodelleringsrespons som ligner på det kliniske scenariet18,19. Imidlertid innebærer den konvensjonelle protokollen for koronararterieligering intubasjon, ventilasjon og en bred åpning av brystet, noe som er teknisk utfordrende og tidkrevende. I løpet av de siste årene har forskjellige protokoller for koronar ligering blitt rapportert og potensert etableringen av MI til en viss grad15,16,17. Den nåværende studien presenterte en enkel og effektiv protokoll ved hjelp av kirurgiske verktøy og utstyr som lett finnes i de fleste laboratorier.
Kritiske trinn og feilsøking
For optimal ytelse i å praktisere denne metoden, er flere viktige trinn verdt å merke seg. For å eksternalisere hjertet, bør brysthulen ikke klemmes voldsomt, noe som vil påvirke koronar blodstrømmen negativt og skjule koronararterien, noe som fører til usynlighet av koronararterien og svikt i LAD ligering. Videre kan dette føre til alvorlig lungeskade. I de fleste tilfeller vil et forsiktig trykk mot høyre side av brystveggen med hell eksternalisere hjertet gjennom det åpne interkostalrommet. Av og til kan en følelse av motstand under hjerteeksternalisering indikere en mismatch av hjertets apex og interkostalåpningen. Dette kan løses ved små bevegelser av mikromygghemostaten langs midaxillarlinjen. Et annet kritisk punkt er tilstrekkelig evakuering av restluften i brysthulen før suturering av muskler og hud. Unnlatelse av å gjøre dette vil øke postoperativ dødelighet på grunn av pneumothorax.
Fordeler og begrensninger
Konvensjonelle metoder for koronar ligering krever intubasjon, mekanisk ventilasjon, ribber blir kuttet, og er ikke lett for koronararterieidentifikasjon på grunn av høy hjertefrekvens. Disse problemene forlenger driftstiden dramatisk og øker driftsrelatert dødelighet. Sammenlignet med konvensjonelle metoder gir den modifiserte protokollen følgende fordeler: (1) det er tidsbesparende (dvs. det tar omtrent 3 minutter fra anestesi, LAD ligering til vellykket hudsuturering); (2) De kirurgiske verktøyene og materialene som kreves, er lett tilgjengelige i de fleste laboratorier. En betydelig begrensning av denne unike metoden er imidlertid den begrensede tiden som er tillatt for LAD ligering etter hjerteeksternalisering på grunn av mangel på mekanisk ventilasjonsstøtte. Dermed kan man forvente høy dødelighet forårsaket av pneumothorax for nybegynnere. Basert på forfatternes erfaring, er hjerteeksternalisering i mindre enn 30 s godt tolerert av alle testede mus. Dette tidsvinduet er tilstrekkelig for en erfaren tekniker til å fullføre MI-induksjon med lav perioperativ mortalitet (<5 %).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (201409005200), Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030) og China Postdoctoral Science Foundation (2020M671161, BX20190216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA | T8877-25G | TTC staining |
| 4-0 silk suture | YUANKANG | 4-0 | Surgical instrument |
| Autoclave | HIRAYAMA | HVE-50 | Sterilization for the solid |
| Buprenorphine | Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd. | H10940181 | reduce post-operative pain |
| Centrifugation tube | Biological Hope | 1850-K | 15ML |
| Depilatory cream | ZIKER BIOTECHNOLOGY | ZK-L2701 | Depilation agent for laboratory animals |
| Forcep | RWD | F12028 | Surgical instrument |
| Gas filter | ZHAOXIN | SA-493 | Operator protection |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | Used for anesthesia |
| Light source | Beijing PDV | LG-150B | Operating lamp |
| Micro-mosquito hemostat | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Needle | BINXIONG | 42180104 | Surgical instrument |
| Needle and the 6-0 silk suture | JIAHE | SC086 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32030 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32010 | Surgical instrument |
| Povidone-iodine swabs | SingleLady | GB26368-2010 | Skin disinfection |
| Scissors | CNSTRONG | JYJ1030 | Surgical instrument |
| Sterile eye cream | Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H10940177 | prevent corneal dryness |
| Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals | VisualSonics | Vevo 2100 | Echocardiographic analysis |
References
- Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074 (2018).
- Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
- Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
- Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
- Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
- Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
- Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
- vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
- Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
- Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
- Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
- Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).
