Summary
Sob anestesia adequada, o coração de camundongo foi exteriorizado através do espaço intercostal, e o infarto do miocárdio foi induzido com sucesso pela ligadura da artéria descendente anterior (DA) usando materiais prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios.
Abstract
O infarto do miocárdio (IAM) representa uma das principais causas de morte. Os modelos de IM são amplamente utilizados para investigar os patomecanismos do remodelamento pós-IM e avaliação de novas terapêuticas. Diferentes métodos (por exemplo, tratamento com isoproterenol, criolesão, ligadura da artéria coronária, etc.) têm sido usados para induzir o infarto agudo do miocárdio. No entanto, os métodos tradicionais de ligadura coronária em camundongos são tecnicamente desafiadores. O presente estudo descreve um processo simples e eficiente para indução de IM em camundongos com materiais prontamente disponíveis. A pele do tórax de camundongos foi aberta sob anestesia estável. O coração foi imediatamente exteriorizado através do espaço intercostal após separação romba do peitoral maior e peitoral menor. O ramo descendente anterior (DA) esquerdo foi ligado com sutura 6-0 a 3 mm de sua origem. Após a ligadura da DAD, a coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) indicou indução bem-sucedida de IM e mudanças temporais do tamanho da cicatriz pós-IM. Enquanto isso, os resultados da análise de sobrevida mostraram mortalidade evidente dentro de 7 dias após o IAM, principalmente devido à ruptura cardíaca. Além disso, a avaliação ecocardiográfica pós-IM demonstrou indução bem-sucedida de disfunção contrátil e remodelamento ventricular. Uma vez dominado, um modelo MI pode ser estabelecido em camundongos dentro de 2-3 min com materiais prontamente disponíveis.
Introduction
O infarto do miocárdio (IAM) representa uma das principais causas de morte e incapacidade no mundo1,2,3,4,5. Apesar da reperfusão oportuna, atualmente há uma falta de terapias eficazes para tratar o remodelamento cardíaco pós-IM. Correspondentemente, esforços consideráveis têm sido feitos para a exploração mecanicista e terapêutica para a IM 6,7,8. Vale ressaltar que o estabelecimento de modelos de MI é um pré-requisito para atender a esses fins.
Vários métodos (por exemplo, tratamento com isoproterenol, criolesão, ligadura da artéria coronária, etc.) têm sido propostos para induzir modelos de IM em pequenos animais. O tratamento com isoproterenol é um método simples para indução de IM, mas não pode induzir infarto da área-alvo9. A criolesão leva à necrose miocárdica através da geração de cristais de gelo e ruptura da membrana celular, em vez de isquemia direta10. Por outro lado, a ligadura da artéria coronária permite o controle preciso do local de oclusão e da extensão da área de infarto e recapitula fielmente a resposta de remodelamento após o infarto11,12. A ligadura da artéria coronária é tipicamente realizada após intubação, ventilação mecânica e toracotomia, o que é tecnicamente desafiador13,14. Vários protocolos modificados para ligadura arterial coronariana (por exemplo, ventilação livre) foram relatados e potencializaram a indução de IM, mas faltam demonstrações visuais detalhadas15,16,17. Essas questões representam uma barreira financeira e técnica significativa para grupos que desejam se envolver em pesquisas usando modelos de MI. Este relato apresenta uma abordagem para indução de IM em camundongos. O método atual é fácil, rápido e utiliza ferramentas e equipamentos cirúrgicos encontrados prontamente na maioria dos laboratórios.
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Protocol
Os experimentos envolvendo trabalho com animais são realizados com todas as aprovações necessárias do Comitê de Ética de Bem-Estar Animal de Laboratório do Hospital Renji, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine (R52021-0506). Camundongos C57BL/6J fêmeas e machos com idade entre 8-10 semanas foram usados no estudo.
1. Preparo do aparelho de anestesia simplificado (OPCIONAL)
NOTA: Esta é uma configuração pré-operatória opcional e pode ser substituída por anestesia titulável, conforme mencionado na seção 2. O comité institucional de ética em matéria de animais e o(s) veterinário(s) devem ser consultados antes de adaptarem esta disposição estabelecida nos procedimentos relativos aos animais.
- Pegue um tubo centrífugo de 15 mL e faça um corte perpendicular ao eixo longo do tubo a cerca de 3 cm da abertura.
NOTA: Certifique-se de que o corte é maior que a metade da circunferência circular do lúmen do tubo para que a válvula possa ser inserida com sucesso. - Faça furos (diâmetro, 2 mm) na parede do tubo da centrífuga entre o corte e a abertura do tubo.
- Corte um pedaço da válvula de tamanho adequado de uma folha de plástico e insira a válvula no corte na parede do tubo.
NOTA: A válvula pode ser usada para controlar a taxa de liberação de isoflurano alterando a profundidade da inserção. - Dentro de um exaustor, abra o fundo do tubo e conecte-o à fonte de oxigênio. Coloque uma bola de algodão perto da extremidade inferior do tubo, adicione a carga de 0,5 mL de isoflurano (conforme obtido, consulte Tabela de Materiais) na esfera de algodão e feche a válvula.
- Teste a eficácia da anestesia mascarando os camundongos com tubos preparados conforme descrito acima. Monitore a frequência respiratória e a profundidade da anestesia pela resposta da pinça dos dedos.
NOTA: Uma frequência respiratória inferior a 10 vezes/10 s sugere anestesia excessiva, e a profundidade de inserção da válvula deve ser ajustada. Para todos os procedimentos que envolvem anestesia, deve-se utilizar filtro de gás preenchido com folhas de carvão ativado (Figura 1A-i) e a cirurgia dentro de uma coifa.
2. Preparo operatório e anestesia
- Preparar e esterilizar todos os instrumentos necessários no dia da cirurgia, incluindo um par de pinças, um hemostático de micromosquito, uma tesoura cirúrgica, dois pares de porta-agulhas, sutura cirúrgica de seda 4-0, sutura cirúrgica de seda 6-0, filtro de gás e fonte de luz (ver Tabela de Materiais) (Figura 1A).
- Coloque uma máscara cirúrgica e luvas estéreis.
- Aplique o creme depilatório no peito do rato e aguarde 1 min. Limpe suavemente o creme depilatório e os cabelos com gaze molhada.
- Segure o mouse com a mão dominante após a depilação. Induzir anestesia por inalação de isoflurano vaporizado (4%) com aporte de oxigênio (1L/min) e manter isoflurano a 2-3%.
- Confirme a anestesia adequada pela falta de resposta de pinça dos dedos.
- Aplique creme estéril para os olhos em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea.
- Fixe os ratos em uma plataforma de cirurgia na posição supina. Aplique cotonetes de iodopovidona (ver Tabela de Materiais) no peito três vezes e cubra o tórax desinfetado com um campo estéril.
3. Indução de infarto do miocárdio
- Troque as luvas contaminadas para garantir a esterilidade.
- Fazer um corte cutâneo de 0,5 cm ao longo da linha que liga o xifoide e a axila após o bloqueio local com lidocaína.
- Separe os músculos peitoral maior e peitoral menor usando pinça e um micro-mosquito hemostático para expor o quarto espaço intercostal.
- Abra o quarto espaço intercostal usando um hemostático de micromosquito.
- Exteriorizar o coração empurrando o coração em direção ao quarto espaço intercostal com o dedo indicador da mão esquerda.
- Fixar o coração com a mão esquerda e ligar o ramo descendente anterior esquerdo com sutura 6-0 a 3 mm de sua origem.
- Coloque o coração de volta na cavidade torácica rapidamente.
NOTA: É seguro exteriorizar o coração por menos de 30 s. - Evacue o ar para fora da cavidade torácica pressionando suavemente a cavidade torácica manualmente.
- Feche a camada muscular sobre as costelas com uma sutura de seda 6-0.
- Feche a pele com uma sutura de seda 4-0.
- Coloque os ratinhos numa almofada (37 °C) imediatamente após a operação.
- Injetar buprenorfina (0,05-0,1mg/kg) por via subcutânea a cada 4-6 horas para reduzir a dor pós-operatória por até 72 horas.
- Retorne os camundongos operados para gaiolas quando totalmente recuperados.
NOTA: Os ratos serão totalmente recuperados dentro de 3-5 minutos após a cirurgia. - Monitore cuidadosamente os ratos e forneça comida úmida por até 7 dias.
4. Colheita dos tecidos
- Sacrificar os camundongos em diferentes momentos após o estabelecimento do IM por deslocamento cervical.
- Fixar os camundongos sacrificados na plataforma cirúrgica na posição supina.
- Faça uma incisão ventral (~3-4 cm) no abdome superior. Corte as costelas de ambos os lados da cavidade torácica e remova o diafragma.
- Perfundir o coração com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (1x PBS, 4 °C) por injeção intraventricular.
- Recolher o coração cortando a raiz da aorta e armazenar imediatamente o coração a -80 °C.
OBS: De acordo com a nossa experiência, é factível realizar a coloração TTC em até duas semanas após o armazenamento. - Corar o coração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC).
- Corte o coração congelado em seções de 1 mm de espessura no gelo usando lâminas de barbear.
- Incubar as fatias de coração preparadas em solução TTC a 1% (dissolvida em 1x PBS) a 37 °C durante 10-15 minutos.
NOTA: Após 15 min de incubação, descarte a solução de TTC e mergulhe as fatias de coração coradas em 1x PBS.
- Fotografe as fatias usando uma câmera digital.
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Representative Results
O protocolo experimental e algumas das etapas críticas são mostrados na Figura 1. O aparelho de anestesia simplificado induziu a anestesia. Como mostrado na Figura 2A, a anestesia induzida foi estável, refletida pelas frequências respiratórias regulares (variando de 90-107 ciclos/min nos camundongos testados). Após a ligadura da artéria coronária, a análise da coloração TTC indicou indução bem-sucedida de infarto do miocárdio e mudanças temporais do tamanho da cicatriz pós-IM (Figura 2B). Enquanto isso, os resultados da análise de sobrevivência mostraram mortalidade evidente dentro de 7 dias após o IM em camundongos C57BL/6J machos e fêmeas (Figura 2C,D). A ruptura ventricular (56% em camundongos machos; 40% em camundongos fêmeas) foi uma razão comum para morte pós-IAM. Além disso, a avaliação ecocardiográfica pós-IM demonstrou indução bem-sucedida de disfunção contrátil e remodelamento ventricular (Figura 2E,F).
Figura 1: Materiais e etapas críticas dos métodos modificados para indução de IM . (A) Instrumental cirúrgico e materiais necessários para este protocolo. (a) Sutura de seda 4-0. (b) sutura de seda 6-0. c) Pinças. d) Tesoura. e-f) Porta-agulhas. g) Micro-mosquito hemostático. h) Fonte luminosa. i) Filtro de gás. (B) Imagens representativas mostrando os principais passos para a indução de IM em camundongos. (a) O camundongo foi fixado após a anestesia e iodopovidona foi aplicado no sítio cirúrgico. (b) O sítio cirúrgico é coberto. (c) Corte de 0,5 cm no sítio cirúrgico após anestesia local com lidocaína. d) Costelas expostas. A seta indica as costelas. (e) Dissecação dos músculos peitoral maior e peitoral menor para exposição do quarto espaço intercostal. (f) Coração exteriorizado. (g-h) LAD ligada com fio de seda 6-0. A seta indica LAD. (i) O coração é colocado de volta na cavidade torácica. j) O ar foi evacuado da cavidade torácica. (k) A camada muscular fechada sobre as costelas com fio de seda 6-0 e a pele fechada com fio de seda 4-0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alterações histológicas e funcionais após ligadura da artéria coronária. (A) Frequência respiratória em camundongos anestesiados pelo aparelho de anestesia simplificado (n=10). (B ) Os resultados da coloração TTC dos cortes cardíacos (4 cortes de cada coração) foram coletados em diferentes momentos pós-IM. A área branca indicava área infartada e a vermelha revelava miocárdio viável. (C) A curva de Kaplan-Meier mostra a taxa de mortalidade pós-IAM em camundongos machos (n=20 por grupo). (D) A curva de Kaplan-Meier mostra a taxa de mortalidade pós-IAM em camundongos fêmeas (n=20 por grupo). (E) Imagens representativas da análise ecocardiográfica em diferentes momentos após o IM (sham, 3 dias, 7 dias, 21 dias e 28 dias pós-IM). (F) Análise quantitativa dos valores da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), fração de encurtamento do ventrículo esquerdo (FEVE), diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo (VEsD) e dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (DMd) entre os grupos indicados (n=5 por grupo). **p<0,01 ou ***p<0,001 vs. Farsa; ##p<0.01 ou ###p<0.001 vs. 3 dias após o IM. Análise de variância one-way com teste post-hoc de Tukey HSD (Honestly Significant Difference) foi realizada para análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente relato demonstrou um protocolo fácil para indução de IM em camundongos com materiais prontamente disponíveis, que foi modificado a partir de um método relatado por Gao16. Modelos murinos de IM são indispensáveis para exploração mecanística e triagem de fármacos para disfunção e remodelamento pós-IAM12. Dentre as técnicas existentes para indução de IM, a ligadura da artéria coronária representa a mais praticada. A ligadura da artéria coronária recapitula fielmente a natureza isquêmica do infarto do miocárdio e leva a uma resposta cicatricial de cicatrização e remodelamento semelhante ao cenário clínico18,19. No entanto, o protocolo convencional para ligadura da artéria coronária envolve intubação, ventilação e uma ampla abertura do tórax, o que é tecnicamente desafiador e demorado. Nos últimos anos, diferentes protocolos para ligadura arterial coronariana têm sido relatados e potencializado o estabelecimento do IM em alguma medida15,16,17. O presente estudo apresentou um protocolo simples e eficaz, utilizando ferramentas e equipamentos cirúrgicos facilmente encontrados na maioria dos laboratórios.
Etapas críticas e solução de problemas
Para um desempenho ideal na prática deste método, vários passos importantes são dignos de nota. Para exteriorizar o coração, a cavidade torácica não deve ser espremida ferozmente, o que afetaria negativamente o fluxo sanguíneo coronariano e obscureceria a artéria coronária, levando à invisibilidade da artéria coronária e falha na ligadura da ADA. Além disso, isso pode resultar em lesão pulmonar grave. Para a maioria dos casos, um empurrão suave contra o lado direito da parede torácica irá exteriorizar com sucesso o coração através do espaço intercostal aberto. Ocasionalmente, uma sensação de resistência durante a exteriorização do coração pode indicar uma incompatibilidade entre o ápice do coração e a abertura intercostal. Isso pode ser resolvido por pequenos movimentos do hemostático do micromosquito ao longo da linha axilar média. Outro ponto crítico é a evacuação adequada do ar residual na cavidade torácica antes da sutura dos músculos e da pele. Não fazê-lo aumentará a mortalidade pós-operatória devido ao pneumotórax.
Vantagens e limitações
Os métodos convencionais de ligadura coronária requerem intubação, ventilação mecânica, corte de costelas e não são fáceis de identificar a artéria coronária devido à frequência cardíaca elevada. Esses problemas prolongam drasticamente o tempo de operação e aumentam a mortalidade relacionada à operação. Comparado aos métodos convencionais, o protocolo modificado apresenta as seguintes vantagens: (1) economia de tempo (isto é, leva aproximadamente 3 min desde a anestesia, ligadura da DA até a sutura da pele com sucesso); (2) As ferramentas cirúrgicas e os materiais necessários estão prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios. No entanto, uma limitação significativa desse método único é o tempo limitado permitido para a ligadura da DA após a externalização do coração, devido à falta de suporte ventilatório mecânico. Assim, a alta mortalidade causada pelo pneumotórax pode ser esperada para iniciantes. Com base na experiência dos autores, a externalização cardíaca por menos de 30 s é bem tolerada por todos os camundongos testados. Essa janela de tempo é adequada para que um técnico experiente termine a indução de IM com baixa mortalidade perioperatória (<5%).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), do Programa de Líderes Acadêmicos Excepcionais de Xangai (18XD1402400), da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (201409005200), do Programa de Talentos de Xangai Pujiang (2020PJD030) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2020M671161, BX20190216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA | T8877-25G | TTC staining |
| 4-0 silk suture | YUANKANG | 4-0 | Surgical instrument |
| Autoclave | HIRAYAMA | HVE-50 | Sterilization for the solid |
| Buprenorphine | Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd. | H10940181 | reduce post-operative pain |
| Centrifugation tube | Biological Hope | 1850-K | 15ML |
| Depilatory cream | ZIKER BIOTECHNOLOGY | ZK-L2701 | Depilation agent for laboratory animals |
| Forcep | RWD | F12028 | Surgical instrument |
| Gas filter | ZHAOXIN | SA-493 | Operator protection |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | Used for anesthesia |
| Light source | Beijing PDV | LG-150B | Operating lamp |
| Micro-mosquito hemostat | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Needle | BINXIONG | 42180104 | Surgical instrument |
| Needle and the 6-0 silk suture | JIAHE | SC086 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32030 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32010 | Surgical instrument |
| Povidone-iodine swabs | SingleLady | GB26368-2010 | Skin disinfection |
| Scissors | CNSTRONG | JYJ1030 | Surgical instrument |
| Sterile eye cream | Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H10940177 | prevent corneal dryness |
| Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals | VisualSonics | Vevo 2100 | Echocardiographic analysis |
References
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