Summary
Bajo la anestesia adecuada, el corazón del ratón se exteriorizó a través del espacio intercostal, y el infarto de miocardio se indujo con éxito mediante la ligadura de la arteria descendente anterior (DA) izquierda utilizando materiales fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios.
Abstract
El infarto de miocardio (IM) representa una de las principales causas de muerte. Los modelos de infarto de miocardio se utilizan ampliamente para investigar los mecanismos patológicos de la remodelación posterior al infarto de miocardio y la evaluación de nuevas terapias. Se han utilizado diferentes métodos (p. ej., tratamiento con isoproterenol, criolesión, ligadura de las arterias coronarias, etc.) para inducir el infarto de miocardio. En comparación con el tratamiento con isoproterenol y la criolesión, la ligadura de las arterias coronarias puede reflejar mejor la respuesta isquémica y la remodelación crónica después del infarto de miocardio. Sin embargo, los métodos tradicionales para la ligadura coronaria en ratones son técnicamente desafiantes. El presente estudio describe un proceso simple y eficiente para la inducción de IM en ratones con materiales fácilmente disponibles. La piel del tórax del ratón se abrió bajo anestesia estable. El corazón se exteriorizó inmediatamente a través del espacio intercostal después de la separación roma del pectoral mayor y el pectoral menor. La rama descendente anterior izquierda (DA) se ligó con una sutura 6-0 a 3 mm de su origen. Después de la ligadura de LAD, la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) indicó una inducción exitosa del infarto de miocardio y cambios temporales del tamaño de la cicatriz posterior al infarto de miocardio. Mientras tanto, los resultados del análisis de supervivencia mostraron una mortalidad manifiesta dentro de los 7 días posteriores al infarto de miocardio, principalmente debido a la rotura cardíaca. Además, la evaluación ecocardiográfica posterior al infarto de miocardio demostró la inducción exitosa de la disfunción contráctil y el remodelado ventricular. Una vez dominado, se puede establecer un modelo de IM en ratones en 2-3 minutos con materiales fácilmente disponibles.
Introduction
El infarto de miocardio (IM) representa una de las principales causas de muerte y discapacidad en todo el mundo 1,2,3,4,5. A pesar de la reperfusión oportuna, actualmente hay una falta de terapias efectivas para tratar el remodelado cardíaco posterior al infarto de miocardio. En consecuencia, se han realizado esfuerzos considerables para la exploración mecanicista y la explotación terapéutica del IM 6,7,8. Cabe destacar que el establecimiento de modelos de IM es un requisito previo para cumplir con estos fines.
Se han propuesto varios métodos (p. ej., tratamiento con isoproterenol, criolesión, ligadura de arterias coronarias, etc.) para inducir modelos de infarto de miocardio en animales pequeños. El tratamiento con isoproterenol es un método sencillo para la inducción del infarto de miocardio, pero no puede inducir el infarto de la zona objetivo9. La criolesión conduce a la necrosis miocárdica a través de la generación de cristales de hielo y la ruptura de la membrana celular en lugar de la isquemia directa10. Por el contrario, la ligadura de las arterias coronarias permite un control preciso del sitio de oclusión y de la extensión del área del infarto y recapitula fielmente la respuesta de remodelación después del infarto11,12. La ligadura de las arterias coronarias generalmente se realiza después de la intubación, la ventilación mecánica y la toracotomía, lo que es técnicamente desafiante13,14. Se reportaron varios protocolos modificados para la ligadura de arterias coronarias (por ejemplo, sin ventilación) que potenciaron la inducción del infarto de miocardio, pero faltan demostraciones visuales detalladas15,16,17. Estos problemas plantean una barrera financiera y técnica significativa para los grupos que desean participar en la investigación utilizando modelos de IM. Este informe presenta un enfoque para la inducción de IM en ratones. El método actual es fácil, ahorra tiempo y utiliza herramientas y equipos quirúrgicos que se encuentran fácilmente en la mayoría de los laboratorios.
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Protocol
Los experimentos que involucran trabajo con animales se realizan con todas las aprobaciones necesarias del Comité de Ética de Bienestar de Animales de Laboratorio del Hospital Renji de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (R52021-0506). En el estudio se utilizaron ratones hembra y macho C57BL/6J de entre 8 y 10 semanas.
1. Preparación del equipo de anestesia simplificado (OPCIONAL)
NOTA: Esta es una configuración preoperatoria opcional y se puede reemplazar con anestesia titulable como se menciona en la sección 2. El comité institucional de ética animal y el veterinario o veterinarios deben ser consultados antes de adaptar esta configuración en los procedimientos con animales.
- Tome un tubo de centrífuga de 15 ml y haga un corte perpendicular al eje largo del tubo a unos 3 cm de la abertura.
NOTA: Asegúrese de que el corte sea mayor que la mitad de la circunferencia circular del lumen del tubo para que la válvula pueda insertarse con éxito. - Taladre orificios (diámetro, 2 mm) en la pared del tubo de centrífuga entre el corte y la abertura del tubo.
- Corte un trozo de válvula de tamaño adecuado de una lámina de plástico e inserte la válvula en el corte de la pared del tubo.
NOTA: La válvula se puede utilizar para controlar la tasa de liberación de isoflurano cambiando la profundidad de la inserción. - Dentro de una campana extractora, corte la parte inferior del tubo y conéctelo al suministro de oxígeno. Coloque una bola de algodón cerca del extremo inferior del tubo, agregue una carga de 0,5 ml de isoflurano (como se obtuvo, consulte la Tabla de materiales) sobre la bola de algodón y cierre la válvula.
- Pruebe la eficacia de la anestesia enmascarando a los ratones con tubos preparados como se describió anteriormente. Controle la frecuencia respiratoria y la profundidad de la anestesia mediante la respuesta de pellizco de los dedos de los pies.
NOTA: Una frecuencia respiratoria inferior a 10 veces/10 s sugiere una anestesia excesiva y se debe ajustar la profundidad de inserción de la válvula. Para todos los procedimientos que involucran anestesia, se debe usar un filtro de gas lleno de láminas de carbón activado (Figura 1A-i) y la cirugía debe realizarse dentro de una campana.
2. Preparación quirúrgica y anestesia
- Prepare y esterilice todos los instrumentos necesarios el día de la cirugía, incluyendo un par de fórceps, un hemostático para micromosquitos, un par de tijeras quirúrgicas, dos pares de portaagujas, sutura quirúrgica de seda 4-0, sutura quirúrgica de seda 6-0, un filtro de gas y una fuente de luz (ver Tabla de materiales) (Figura 1A).
- Colóquese una mascarilla quirúrgica y guantes estériles.
- Aplicar la crema depilatoria en el pecho del ratón y esperar 1 min. Limpie suavemente la crema depilatoria y el cabello con una gasa húmeda.
- Sostenga el mouse con la mano dominante después de la depilación. Inducir la anestesia por inhalación de isoflurano vaporizado (4%) con aporte de oxígeno (1L/min) y mantener al 2-3% el isoflurano.
- Confirme la anestesia adecuada por la falta de respuesta de pellizco del dedo del pie.
- Aplique crema estéril para los ojos en ambos ojos para prevenir la sequedad de la córnea.
- Asegure a los ratones en una plataforma quirúrgica en posición supina. Aplique hisopos de povidona yodada (ver Tabla de materiales) en el tórax tres veces y cubra el tórax desinfectado con un paño estéril.
3. Inducción de infarto de miocardio
- Cambie los guantes contaminados para garantizar la esterilidad.
- Haga un corte de piel de 0,5 cm a lo largo de la línea que conecta el xifoides y la axila después del bloqueo local con lidocaína.
- Separe sin rodeos los músculos pectorales mayores y pectorales menores con fórceps y un micromosquito hemostático para exponer el cuarto espacio intercostal.
- Abra el cuarto espacio intercostal con un micromosquito hemostático.
- Exteriorizar el corazón empujando el corazón hacia el cuarto espacio intercostal con el dedo índice de la mano izquierda.
- Asegurar el corazón con la mano izquierda, y ligar la rama descendente anterior izquierda con una sutura 6-0 a 3 mm de su origen.
- Vuelva a colocar el corazón en la cavidad torácica rápidamente.
NOTA: Es seguro externalizar el corazón durante menos de 30 s. - Evacúe el aire fuera de la cavidad torácica presionando suavemente la cavidad torácica manualmente.
- Cierra la capa muscular sobre las costillas con una sutura de seda 6-0.
- Cerrar la piel con una sutura de seda 4-0.
- Coloque los ratones sobre una almohadilla (37 °C) inmediatamente después de la operación.
- Inyectar buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por vía subcutánea cada 4-6 horas para reducir el dolor postoperatorio durante un máximo de 72 horas.
- Regrese los ratones operados a las jaulas cuando estén completamente recuperados.
NOTA: Los ratones se recuperarán por completo dentro de los 3-5 minutos posteriores a la cirugía. - Vigile cuidadosamente a los ratones y proporciónele comida húmeda durante un máximo de 7 días.
4. Recolección de los tejidos
- Sacrificar a los ratones en diferentes momentos después del establecimiento del infarto de miocardio por luxación cervical.
- Asegure los ratones sacrificados en la plataforma de cirugía en posición supina.
- Haga una incisión ventral (~3-4 cm) en la parte superior del abdomen. Corta las costillas de ambos lados de la cavidad torácica y retira el diafragma.
- Perfundir el corazón con 10 ml de solución salina fría tamponada con fosfato (1x PBS, 4 °C) mediante inyección intraventricular.
- Recoja el corazón cortando la raíz aórtica y guárdelo inmediatamente a -80 °C.
NOTA: De acuerdo con la experiencia de los autores, es factible realizar la tinción TTC dentro de las dos semanas posteriores al almacenamiento. - Tiñe el corazón con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC).
- Corta el corazón congelado en secciones de 1 mm de grosor sobre hielo con cuchillas de afeitar.
- Incubar las rodajas de corazón preparadas en una solución de TTC al 1% (disuelta en 1x PBS) a 37 °C durante 10-15 min.
NOTA: Después de 15 minutos de incubación, deseche la solución de TTC y sumerja las rodajas de corazón teñidas en 1x PBS.
- Fotografía las rebanadas con una cámara digital.
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Representative Results
El protocolo experimental y algunos de los pasos críticos se muestran en la Figura 1. El equipo de anestesia simplificado indujo la anestesia. Como se muestra en la Figura 2A, la anestesia inducida fue estable, como se refleja en la frecuencia respiratoria regular (varió de 90 a 107 respiraciones/min en los ratones analizados). Después de la ligadura de las arterias coronarias, el análisis de tinción TTC indicó una inducción exitosa del infarto de miocardio y cambios temporales del tamaño de la cicatriz posterior al infarto de miocardio (Figura 2B). Mientras tanto, los resultados del análisis de supervivencia mostraron una mortalidad manifiesta dentro de los 7 días posteriores al infarto de miocardio en ratones machos y hembras C57BL/6J (Figura 2C,D). La ruptura ventricular (56% en ratones machos; 40% en ratones hembras) fue una razón común de muerte posterior al infarto de miocardio. Además, la evaluación ecocardiográfica posterior al infarto de miocardio demostró una inducción exitosa de la disfunción contráctil y el remodelado ventricular (Figura 2E,F).
Figura 1: Materiales y pasos críticos en los métodos modificados para la inducción de infarto de miocardio . (A) Instrumentos quirúrgicos y materiales necesarios para este protocolo. a) Sutura de seda 4-0. (b) Sutura de seda 6-0. c) Fórceps. d) Tijeras. (e-f) Portagujas. g) Micromosquito hemostático. h) Fuente de luz. (i) Filtro de gas. (B) Imágenes representativas que muestren los pasos clave para inducir el infarto de miocardio en ratones. (a) El ratón fue asegurado después de la anestesia, y se aplicó povidona yodada en el sitio quirúrgico. (b) El sitio quirúrgico está cubierto. (c) Un corte de 0,5 cm en el sitio quirúrgico después de un bloqueo local con lidocaína. d) Costillas expuestas. La flecha indica las costillas. (e) Diseccionó los músculos pectorales mayores y pectorales menores para exponer el cuarto espacio intercostal. f) Corazón externalizado. (g-h) LAD ligado con sutura de seda 6-0. La flecha indica LAD. (i) El corazón se vuelve a colocar en la cavidad torácica. j) Se evacuó aire de la cavidad torácica. (k) La capa muscular se cerró sobre las costillas con sutura de seda 6-0 y la piel se cerró con suturas de seda 4-0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cambios histológicos y funcionales tras la ligadura de arterias coronarias. (A) Frecuencia respiratoria en ratones anestesiados por el equipo de anestesia simplificada (n=10). (B ) Los resultados de la tinción de TTC de cortes de corazón (4 cortes de cada corazón) se recolectaron en diferentes puntos de tiempo después del infarto de miocardio. El área blanca indicaba un área infartada y el área roja revelaba miocardio viable. (C) La curva de Kaplan-Meier muestra la tasa de mortalidad post-infarto de miocardio en ratones machos (n=20 por grupo). (D) La curva de Kaplan-Meier muestra la tasa de mortalidad post-IM en ratones hembra (n=20 por grupo). (E) Imágenes representativas del análisis ecocardiográfico en diferentes momentos después del infarto de miocardio (simulado, 3 días, 7 días, 21 días y 28 días después del infarto de miocardio). (F) El análisis cuantitativo de los valores de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI), del acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (FEVI), del diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo (DSVI) y de la dimensión diastólica telediastólica del ventrículo izquierdo (DSVI) entre los grupos indicados (n=5 por grupo). **p<0.01 o ***p<0.001 vs. fingir; ##p<0.01 o ###p<0.001 vs. 3 días después del infarto de miocardio. Se realizó un análisis de varianza de una vía con la prueba posthoc de Tukey HSD (Honestly Significant Difference) para el análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El presente informe demostró un protocolo fácil para la inducción de IM en ratones con materiales fácilmente disponibles, que fue modificado a partir de un método reportado por Gao16. Los modelos murinos de IM son indispensables para la exploración mecanicista y el cribado farmacológico de la disfunción y remodelación post-IM12. Entre las técnicas existentes para la inducción del infarto de miocardio, la ligadura de las arterias coronarias es la más practicada. La ligadura de arterias coronarias recapitula fielmente la naturaleza isquémica del infarto de miocardio y conduce a una respuesta de cicatrización y remodelación de la cicatriz similar al escenario clínico18,19. Sin embargo, el protocolo convencional para la ligadura de las arterias coronarias implica intubación, ventilación y una amplia apertura del tórax, lo que es técnicamente difícil y requiere mucho tiempo. En los últimos años, se han descrito diferentes protocolos para la ligadura de arterias coronarias que han potenciado en cierta medida el establecimiento del IM15,16,17. El presente estudio presentó un protocolo simple y eficiente utilizando herramientas y equipos quirúrgicos que se encuentran fácilmente en la mayoría de los laboratorios.
Pasos críticos y solución de problemas
Para un rendimiento óptimo en la práctica de este método, vale la pena señalar varios pasos clave. Para exteriorizar el corazón, la cavidad torácica no debe apretarse ferozmente, lo que afectaría negativamente el flujo sanguíneo coronario y oscurecería la arteria coronaria, lo que llevaría a la invisibilidad de la arteria coronaria y al fracaso de la ligadura de LAD. Además, esto puede provocar una lesión pulmonar grave. En la mayoría de los casos, un empuje suave contra el lado derecho de la pared torácica exteriorizará con éxito el corazón a través del espacio intercostal abierto. En ocasiones, una sensación de resistencia durante la externalización del corazón puede indicar un desajuste entre el ápice cardíaco y la abertura intercostal. Esto puede solucionarse mediante ligeros movimientos del hemostático del micromosquito a lo largo de la línea axilar media. Otro punto crítico es la adecuada evacuación del aire residual en la cavidad torácica antes de suturar los músculos y la piel. De lo contrario, aumentará la mortalidad postoperatoria por neumotórax.
Ventajas y limitaciones
Los métodos convencionales para la ligadura coronaria requieren intubación, ventilación mecánica, corte de costillas y no son fáciles de identificar las arterias coronarias debido a la alta frecuencia cardíaca. Estos problemas prolongan drásticamente el tiempo de operación y aumentan la mortalidad relacionada con la operación. En comparación con los métodos convencionales, el protocolo modificado presenta las siguientes ventajas: (1) ahorra tiempo (es decir, toma aproximadamente 3 minutos desde la anestesia, la ligadura de la DA hasta la sutura exitosa de la piel); (2) Las herramientas y materiales quirúrgicos necesarios están fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios. Sin embargo, una limitación significativa de este método único es el tiempo limitado permitido para la ligadura de la DA después de la externalización del corazón debido a la falta de soporte de ventilación mecánica. Por lo tanto, se puede esperar una alta mortalidad causada por el neumotórax para los principiantes. Según la experiencia de los autores, la externalización del corazón durante menos de 30 s es bien tolerada por todos los ratones probados. Esta ventana de tiempo es adecuada para que un técnico experimentado termine la inducción del infarto de miocardio con una baja mortalidad perioperatoria (<5%).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), el Programa de Líderes Académicos Sobresalientes de Shanghái (18XD1402400), la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghái (201409005200), el Programa de Talento Pujiang de Shanghái (2020PJD030) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2020M671161, BX20190216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA | T8877-25G | TTC staining |
| 4-0 silk suture | YUANKANG | 4-0 | Surgical instrument |
| Autoclave | HIRAYAMA | HVE-50 | Sterilization for the solid |
| Buprenorphine | Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd. | H10940181 | reduce post-operative pain |
| Centrifugation tube | Biological Hope | 1850-K | 15ML |
| Depilatory cream | ZIKER BIOTECHNOLOGY | ZK-L2701 | Depilation agent for laboratory animals |
| Forcep | RWD | F12028 | Surgical instrument |
| Gas filter | ZHAOXIN | SA-493 | Operator protection |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | Used for anesthesia |
| Light source | Beijing PDV | LG-150B | Operating lamp |
| Micro-mosquito hemostat | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Needle | BINXIONG | 42180104 | Surgical instrument |
| Needle and the 6-0 silk suture | JIAHE | SC086 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32030 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32010 | Surgical instrument |
| Povidone-iodine swabs | SingleLady | GB26368-2010 | Skin disinfection |
| Scissors | CNSTRONG | JYJ1030 | Surgical instrument |
| Sterile eye cream | Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H10940177 | prevent corneal dryness |
| Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals | VisualSonics | Vevo 2100 | Echocardiographic analysis |
References
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