Summary
Le protocole actuel présente une méthode rapide, efficace et douce pour isoler des cellules individuelles adaptées à l’analyse de l’ARN unicellulaire à partir d’une incisive de souris, d’une molaire de souris et de dents humaines en croissance continue.
Abstract
Les dents de souris et d’homme représentent des organes difficiles pour une isolation cellulaire rapide et efficace pour des applications transcriptomiques unicellulaires ou autres. Le tissu pulpaire dentaire, riche en matrice extracellulaire, nécessite un processus de dissociation long et fastidieux qui dépasse généralement le délai raisonnable pour la transcriptomique unicellulaire. Pour éviter les changements artificiels dans l’expression des gènes, le temps écoulé entre l’euthanasie d’un animal et l’analyse de cellules individuelles doit être minimisé. Ce travail présente un protocole rapide permettant d’obtenir une suspension unicellulaire à partir de dents de souris et d’humains dans une excellente qualité adaptée au scRNA-seq (séquençage de l’ARN unicellulaire). Ce protocole est basé sur des étapes d’isolement tissulaire accéléré, la digestion enzymatique et la préparation ultérieure de la suspension monocellulaire finale. Cela permet un traitement rapide et doux des tissus et permet d’utiliser plus d’échantillons animaux ou humains pour obtenir des suspensions cellulaires avec une viabilité élevée et des changements transcriptionnels minimes. On s’attend à ce que ce protocole guide les chercheurs intéressés à effectuer le scRNA-seq non seulement sur les dents de souris ou d’hommes, mais aussi sur d’autres tissus riches en matrice extracellulaire, y compris le cartilage, le tissu conjonctif dense et le derme.
Introduction
Le séquençage de l’ARN unicellulaire est un outil puissant pour déchiffrer in vivo la structure, la hiérarchie, les interactions et l’homéostasie de la population cellulaire1,2. Cependant, ses résultats dépendent fortement de la première étape de cette analyse avancée - la préparation d’une suspension unicellulaire de qualité parfaite à partir du tissu complexe et bien organisé. Il s’agit notamment de maintenir les cellules en vie et de prévenir les changements artificiels indésirables dans les profils d’expression génique des cellules3,4. De tels changements pourraient conduire à une caractérisation inexacte de la structure de la population et à une mauvaise interprétation des données recueillies.
Des protocoles spécifiques pour l’isolement d’un large éventail de tissus ont été développés5,6,7,8. Ils utilisent généralement la dissociation mécanique en combinaison avec une incubation ultérieure avec diverses enzymes protéolytiques. Ceux-ci comprennent généralement la trypsine, les collagénases, les dispases, la papaïne6,7,8,9 ou des mélanges d’enzymes disponibles dans le commerce tels que Accutase, Tryple, etc.5. La partie la plus critique affectant la qualité du transcriptome est la digestion enzymatique. Il a été démontré qu’une incubation prolongée avec des enzymes à 37 °C influence l’expression des gènes et provoque la régulation à la hausse de nombreux gènes liés au stress10,11,12,13. L’autre paramètre critique du processus d’isolement est sa longueur totale, car il a été démontré que les transcriptomes cellulaires changent après l’ischémie tissulaire14. Ce protocole présente un protocole efficace pour isoler en douceur les cellules individuelles des dents de souris et humaines, plus rapidement que d’autres protocoles précédemment utilisés pour isoler les cellules des tissus complexes5,6,9,11,13,15,16.
Ce protocole montre comment disséquer rapidement les tissus mous de la dent dure et préparer une suspension unicellulaire adaptée à scRNA-seq. Cette méthode n’utilise qu’une seule étape de centrifugation et minimise l’effet des changements transcriptionnels indésirables en réduisant le temps de manipulation et de digestion des tissus et en maintenant les tissus et les cellules à 4 ° C la plupart du temps. La procédure présente l’isolement des cellules des incisives de souris, des molaires et des dents de sagesse humaines à titre d’exemple, mais devrait principalement fonctionner pour d’autres dents dans divers organismes. Le protocole complet est schématiquement visualisé à la figure 1. Ce protocole a récemment été utilisé pour générer un atlas de type cellulaire dentaire obtenu à partir de dents de souris et d’humains1.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux réglementations internationales et locales et approuvées par le ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République tchèque (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Ce protocole a été testé avec des souris mâles et femelles de type sauvage C57BL/6 et CD-1 et avec des souris Sox10::iCreERT2 génétiquement modifiées17 (combinées à divers systèmes de rapporteur) sur un fond C57BL/6. Des expériences avec des échantillons humains ont été réalisées avec l’approbation des comités d’éthique de la faculté de médecine de l’Université Masaryk de Brno et de l’hôpital de la faculté Sainte-Anne de Brno, en République tchèque.
1. Mise en place expérimentale et préparation de solutions
- Configuration des instruments
- Refroidir la centrifugeuse à 4 °C.
- Chauffer la chambre d’incubation à 37 °C.
- Démarrez la machine de tri de cellules activées par fluorescence (FACS) et réglez toutes les températures du trieur (y compris le support du tube de collecte) à 4 °C. Effectuez le contrôle de la qualité de l’instrument, réglez le délai de chute.
- Définissez la stratégie de contrôle préliminaire et effectuez le tri de test.
REMARQUE: Lorsque vous utilisez FACS, utilisez la buse de 100 μm.
- Préparez les solutions (étapes 1.2.1-1.2.3).
- Solution de lavage: Préparez du FBS (sérum fœtal bovin) frais à 2% dans hbSS (solution saline équilibrée de Hanks).
- Mélange de digestion: Préparer la collagénase P fraîche (3 U / mL) complètement dissoute dans HBSS.
- Facultatif : Préparer du HBSS frais + BSA (0,04 %) et refroidir le méthanol de qualité analytique dans un congélateur à -20 °C pour conserver la suspension monocellulaire à -80 °C.
REMARQUE: L’étape 1 doit être effectuée avant le début de l’expérience. La composition des solutions utilisées est résumée dans le tableau supplémentaire 1.
2. Préparation d’un ou de plusieurs animaux expérimentaux et de dents humaines
- Préparer les animaux de laboratoire (souris).
- Euthanasier la souris selon les réglementations locales; par exemple par surdosage anesthésique tel que décrit précédemment1.
ATTENTION : La réglementation relative à l’euthanasie sans cruauté des animaux de laboratoire varie localement. Suivez toujours les réglementations locales en vigueur. - Passez immédiatement à l’étape de dissection tissulaire (étape 3).
REMARQUE : Si le tissu des animaux de laboratoire ne peut pas être disséqué immédiatement (p. ex., en raison d’un transfert d’un refuge pour animaux), placez les animaux d’expérimentation sur de la glace et effectuez une dissection tissulaire dès que possible. Pour obtenir plus de cellules à partir de pulpes molaires de souris, utilisez des animaux plus jeunes (6 semaines et moins). Avec l’âge, la taille de la pulpe dentaire diminue. Les incisives de souris gardent principalement leur structure avec l’âge, de sorte que les animaux de différents âges peuvent être utilisés pour la dissection des tissus.
- Euthanasier la souris selon les réglementations locales; par exemple par surdosage anesthésique tel que décrit précédemment1.
- Préparer la dent humaine
REMARQUE: Les dents humaines ont été extraites pour une raison cliniquement pertinente. Chaque diagnostic a été traité individuellement et un chirurgien-dentiste expérimenté a toujours effectué l’extraction dentaire.- Mettez immédiatement la dent fraîchement extraite dans un tube de 50 mL avec hbSS glacé et gardez le tube sur la glace jusqu’à ce que le traitement soit ultérieur.
REMARQUE: L’utilisation de dents de sagesse conservées des patients jusqu’à l’âge de 25 à 30 ans est recommandée pour le rendement cellulaire le plus élevé.
- Mettez immédiatement la dent fraîchement extraite dans un tube de 50 mL avec hbSS glacé et gardez le tube sur la glace jusqu’à ce que le traitement soit ultérieur.
3. Dissection tissulaire
- Tenez l’animal expérimental derrière sa tête, en regardant l’aspect ventral de sa tête afin que la queue pointe vers l’extérieur.
- À l’aide de petits ciseaux tranchants, retirez rapidement la peau de la mandibule pour exposer l’arc mandibulaire, les tissus mous entre chaque moitié des mandibules et les muscles faciaux adjacents.
- Faites une coupe profonde de chaque côté de la mandibule; tout d’abord, à travers m. masseter le long de la face buccale de la mandibule jusqu’à l’articulation temporo-mandibulaire, puis le long de la partie interne de chaque moitié de la mandibule à travers la base de la cavité buccale (voir la figure supplémentaire 1).
- Coupez tous les muscles et ligaments le long de la mandibule jusqu’à l’articulation temporo-mandibulaire de l’extérieur et de l’intérieur de la cavité buccale.
REMARQUE: Évitez de couper les os. Cela pourrait endommager la partie la plus apicale de l’incisive. - Saisissez la mandibule à l’aide d’une pince à épiler à pointe pliée et retirez-la. Ensuite, divisez la mandibule disséquée en deux moitiés avec des ciseaux en coupant à travers la symphyse mandibulaire (voir la figure supplémentaire 1).
- Utilisez une lingette industrielle à faible peluche pour froisser les tissus mous restants de chaque moitié de la mandibule. Une fois les deux parties de la mandibule nettoyées, placez-les dans une boîte de Petri préparée à l’avance avec du HBSS glacé.
REMARQUE: À partir de ce moment, travaillez sur la glace. Une dissection supplémentaire des incisives et des molaires de souris est effectuée sous un stéréomicroscope sur fond noir. - Incisives mandibulaires de souris
- Pour la dissection des incisives mandibulaires, retirer la crête alvéolaire avec les trois molaires et fissurer transversalement l’arc mandibulaire à l’endroit correspondant à la position entre la première et la deuxième molaire.
REMARQUE: Une lame de scalpel tranchante n ° 11 et une pince à épiler sont utilisées pour effectuer cette étape (voir tableau des matériaux). - Retirez soigneusement l’incisive du reste de l’alvéole dentaire.
REMARQUE: En cas de succès, l’incisive extraite contiendra des parties apicales intactes, y compris du tissu épithélial avec des boucles cervicales complètes. - Si nécessaire, retirez les fragments d’os restants encore attachés à l’incisive avec une pince à épiler et un scalpel.
- Placez les incisives disséquées dans du HBSS frais et glacé et disséquez le tissu d’intérêt : l’anse cervicale, la pulpe dentaire ou d’autres parties de la dent.
- Placez les tissus mous disséqués dans une gouttelette de HBSS frais et glacé au milieu d’une boîte de Petri de 10 cm. Restez sur la glace.
- Pour la dissection des incisives mandibulaires, retirer la crête alvéolaire avec les trois molaires et fissurer transversalement l’arc mandibulaire à l’endroit correspondant à la position entre la première et la deuxième molaire.
- Molaires mandibulaires de souris
- Pour disséquer les molaires mandibulaires, retirez complètement la crête alvéolaire du reste de la mandibule à l’aide d’une lame de scalpel.
- Déplacez la crête alvéolaire disséquée dans du HBSS frais et glacé dans une boîte de Pétri et retirez soigneusement tous les fragments restants d’os alvéolaires attachés aux racines.
- Placez les molaires disséquées sans os alvéolaire dans du HBSS frais et glacé. Pour exposer la pulpe, commencez à enlever des parties de la dentine du côté apical à l’aide d’une pince à épiler fine et pointue jusqu’à ce que vous atteigniez la cavité pulpaire.
- Une fois la cavité pulpaire atteinte, disséquez soigneusement la pulpe dentaire à l’aide d’une pince à épiler à pointe pointue et placez les tissus mous de la pulpe dentaire dans une gouttelette de HBSS frais et glacé au milieu d’une boîte de Petri de 10 cm conservée sur de la glace.
REMARQUE: Étant donné que les pulpes molaires de souris sont extrêmement petites, adaptez le grossissement du stéréomicroscope en conséquence.
- Dent humaine
- Lavez à nouveau les dents humaines dans le HBSS glacé pour éliminer le sang restant.
- Placez la dent dans trois sacs en plastique stériles à paroi épaisse et utilisez l’étau d’un ingénieur de paillasse en fonte pour fissurer la dent. Utilisez des mâchoires à vis avec une surface plane pour éviter de pénétrer dans les sacs.
- Serrez lentement l’étau jusqu’à ce que vous entendiez la dent se fissurer; retirez-le des sacs et placez-le dans du HBSS frais et glacé dans une boîte de Pétri.
- À l’aide de deux pincettes, retirez la pulpe dentaire, nettoyez-la de tous les restes de tissu dur et placez-la dans une gouttelette de HBSS glacée au milieu d’une boîte de Petri de 10 cm conservée sur de la glace.
ATTENTION : Les tissus humains peuvent potentiellement être infectieux. Lorsque vous travaillez avec des tissus humains, utilisez un équipement de protection pour éviter tout contact direct avec les tissus.
4. Préparation de la suspension monocellulaire
- Préparer un tube de 15 mL avec 2,5 mL de mélange de digestion composé de collagénase P (3 U/mL) complètement dissous dans HBSS. Conserver la solution sur la glace jusqu’à utilisation.
REMARQUE: Toujours utiliser Collagenase P fraîchement préparé; ne pas congeler les aliquotes. L’activité de la collagénase P varie d’un lot à l’autre. Vérifiez l’activité de votre lot avant de le diluer. La collagénase P est activée par le calcium, dont la quantité est déjà suffisante dans la poudre lyophilisée. Par conséquent, il n’est pas nécessaire d’enrichir le mélange d’enzymes avec du calcium. La collagénase P n’est pas inactivée par FBS mais peut être inactivée par des agents chélatants (par exemple, l’éthylènediaminetétraacétique - EDTA). L’arrêt du processus de dissociation est assuré par la dilution de la collagénase P dans une solution de lavage (2% FBS dans HBSS). Il a été démontré que l’ajout de FBS augmente la viabilité des cellules et le nombre final de cellules après le tri18. - À l’aide d’une lame de scalpel de forme ronde n° 10, coupez le tissu dans toutes les directions en morceaux les plus petits possibles. Réagrégez les morceaux de tissu au milieu de la gouttelette et coupez à plusieurs reprises les agrégats de tissu à l’aide d’une lame de scalpel de forme ronde (n ° 10). Répétez ce processus plusieurs fois jusqu’à ce que le matériau soit suffisamment haché.
- Transférer les morceaux de tissu déchiquetés à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL dans le mélange de digestion préparé.
REMARQUE: Dans le cas d’un plus grand nombre d’animaux traités à la fois, divisez le tissu en plusieurs tubes avec collagenase P. La quantité maximale par tube sont des pulpes obtenues à partir d’environ 10 incisives de souris. Dans le cas des molaires, où les pulpes sont beaucoup plus petites, le nombre de pâtes transformées peut être augmenté de manière adéquate. Lorsque vous utilisez des dents humaines, utilisez un maximum de 2-3 pulpes par tube, selon la taille de la pulpe. - Placez le tube dans un incubateur préchauffé à 37 °C avec un agitateur. Inclinez le tube à l’intérieur du shaker à un angle de 60° et réglez la vitesse à 150-200 tr/min pour assurer des mouvements de suspension constants à l’intérieur du tube.
- Triturez vigoureusement la suspension toutes les 3-4 minutes avec une pointe de pipette de 1 mL pour désintégrer toutes les touffes.
REMARQUE: Avec le temps, les touffes deviendront plus petites et plus douces jusqu’à ce qu’elles disparaissent presque. - Au total, incuber pendant 15-20 min. À la fin de l’incubation, triturez pour la dernière fois, puis ajoutez lentement la solution de lavage glacée à un volume final de 12 ml.
- Enlevez les touffes ou les morceaux de tissu calcifié restants en filtrant la suspension à l’aide d’une passoire cellulaire de 50 μm.
- Prélever 10 à 20 μL de la suspension cellulaire filtrée et compter les cellules pendant la centrifugation à l’aide d’une chambre de comptage cellulaire (hémocytomètre). Centrifuger pendant 5 min à 300 x g à 4 °C. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
REMARQUE: Si le nombre de cellules qui ne peut pas être compté dans une suspension diluée est limité, sautez le comptage des cellules et utilisez toutes les cellules pour un traitement ultérieur. - Facultatif : Procédez à la fixation et au stockage21.
- Re-suspendre les granulés (jusqu’à 107 cellules) dans 100 uL de HBSS + BSA (0,04%).
- Ajouter 400 μL de méthanol réfrigéré et mélanger lentement.
- Incuber la suspension cellulaire pendant 15 min sur de la glace.
- Conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit traité (pas plus de 1 mois).
- Remettez en suspension le granulé dans la solution wash. Visez 700-1200 cellules/μL de la solution Wash.
- Gardez le tube sur la glace jusqu’à ce que le traitement soit ultérieur.
REMARQUE: Si nécessaire, effectuez la fixation et le stockage à -80 ° C. Cependant, le traitement immédiat de la suspension cellulaire pour scRNA-seq est recommandé. Les étapes suivantes dépendront du protocole seq d’ARN unicellulaire. Lorsque le protocole scRNA-seq utilise un système microfluidique (certaines sociétés sc-RNA-seq le font), chargez les cellules en fonction des directives du fabricant, soit directement, soit après le tri cellulaire. - Pour FACS, passez à l’étape 5.
5. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
- Avant de trier, préparez l’instrument de tri des cellules.
- Refroidissez l’ensemble du système à 4 °C, effectuez le contrôle de la qualité de l’instrument, réglez le délai de chute et la tension des plaques de déviation. Placez les tubes de collecte dans le porte-tube de collecte.
REMARQUE: Pour éviter des étapes de centrifugation supplémentaires entraînant une perte cellulaire inévitable, triez les cellules dans un microtube (1,5 mL) avec une petite quantité (25-50 μL) de la solution wash.
- Refroidissez l’ensemble du système à 4 °C, effectuez le contrôle de la qualité de l’instrument, réglez le délai de chute et la tension des plaques de déviation. Placez les tubes de collecte dans le porte-tube de collecte.
- Facultatif: effectuer une coloration de viabilité avant FACS.
- Ajouter l’iodure de propidium dans la suspension cellulaire avant FACS à une concentration finale de 0,5 μg/mL et incuber pendant 15 min à 4 °C.
- Chargez l’échantillon dans le trieur de cellules. Établissez une stratégie de contrôle stricte pour éliminer les débris cellulaires, les doublets et les cellules mortes. Triez les cellules dans un tube préparé ou des plaques multi-puits. Un exemple de stratégie de contrôle est illustré à la figure 2.
REMARQUE: Pour minimiser les étapes de manipulation et accélérer le protocole, il est recommandé d’appliquer une stratégie de contrôle stricte (suggérée à la figure 2) plutôt que d’utiliser une coloration de viabilité. Pour séparer les cellules immunitaires de la population isolée, une coloration par anticorps CD45 peut être effectuée. Pour ce faire, remettez en suspension cellulaire dans 100 μL de solution de coloration (PBS + 2% FBS + anticorps conjugué anti-CD45-APC 1/100 dilution). Incuber pendant 15 min sur de la glace à l’abri de la lumière et effectuer FACS directement.
Representative Results
Un isolement exemplaire de cellules individuelles a été réalisé à partir de deux incisives mandibulaires d’un mâle souris C57BL/6 âgé de 6 semaines. Conformément à ce protocole, une suspension unicellulaire a été préparée et, par la suite, un séquençage unicellulaire a été effectué. La suspension monocellulaire préparée a été analysée et triée à l’aide de FACS (Figure 2). Tout d’abord, le tracé FSC-A (diffusion vers l’avant, zone) et SSC-A (dispersion latérale, zone) a été appliqué, et une stratégie de contrôle appropriée a été utilisée pour sélectionner une population dont la taille et la granularité attendues devraient filtrer nos débris cellulaires et nos doublets ou agrégats cellulaires (figure 2A). Cette population sélectionnée (P1), comptant 38 % de tous les événements, a ensuite été utilisée, et les paramètres FSC-A et FSC-H (diffusion vers l’avant, hauteur) ont été appliqués pour éliminer les doublets cellulaires restants (figure 2B). La population sans doublets cellulaires (P2) comptant 95% de P1 peut ensuite être utilisée pour scRNA-seq. Alternativement, un contrôle supplémentaire peut être utilisé pour sélectionner la population d’intérêt (par exemple, expression de protéines fluorescentes ou coloration vivante / morte). Pour vérifier le nombre de cellules vivantes/mortes dans la suspension finale, la coloration PI (iodure de propidium) a été effectuée (Figure 2C). La population P3 contenant des cellules PI( vivantes) était de 98,4 % de la population mère P2 et de 35,5 % du total des événements. Le nombre total de cellules mortes filtrées (PI+) était de 1887.
Le nombre final de cellules obtenues sans coloration de viabilité adaptées à l’ARN-seq (P2) a compté 118 199 cellules de deux pulpes d’incisives de souris. Cela signifie le nombre de près de 60 000 cellules vivantes d’une incisive mandibulaire.
Pour clarifier le nombre de cellules immunitaires dans la suspension unicellulaire finale, deux approches ont été utilisées. Tout d’abord, la coloration des anticorps CD45 et l’analyse FACS ultérieure ont été utilisées. En tant que méthode complémentaire, le nombre total de cellules immunitaires (CD45+) dans les données scRNA-seq a été analysé. L’analyse FACS a montré que 14,44 % des cellules CD45+ (13,20 % étaient vivantes et 1,24 % mortes) (figure 3A). L’analyse des données scRNA-seq a montré 10,90 % des cellules exprimant CD45 (Figure 3B). La diminution des cellules CD45+ dans les données scRNA-seq peut être causée par un seuil supplémentaire lors de l’analyse scRNA-seq.
Ces données représentatives sur l’exemple de l’incisive de souris montrent que le protocole donné en combinaison avec une stratégie de contrôle stricte est efficace pour obtenir un grand nombre de cellules d’une seule dent de souris sans avoir besoin d’une utilisation supplémentaire de la coloration de viabilité. Le ratio de cellules immunitaires (CD45+) était mineur (13,2 %). De plus, il a déjà été démontré que les cellules immunitaires sont essentielles au maintien de l’homéostasie dentaire, de sorte que les retirer de l’analyse scRNA-seq pendant le FACS serait contre-productif dans certaines applications.
Figure 1 : Représentation schématique du protocole. Différentes étapes, y compris les conditions de température et le temps prévu, sont représentées pour préparer une suspension unicellulaire à partir de dents de souris et d’humains. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemple de stratégie de contrôle. Le contrôle FSC-A et SSC-A a été utilisé pour produire la porte P1, reflétant la population cellulaire avec la taille et la granularité attendues et filtrant les débris de la matrice cellulaire et extracellulaire et la plupart des grands événements (A). Par la suite, la population P1 a été tracée dans les diagrammes FSC-H et FCS-A, qui ont filtré les doublets cellulaires (B). Cette population P2 a ensuite été analysée pour la présence de cellules mortes par iodure de propidium (C). Le nombre d’événements/cellules par porte est représenté en (D). (FSC-A - dispersion vers l’avant, zone; SSC-A - dispersion latérale, zone; FSC-H - dispersion vers l’avant, hauteur; PI - iodure de propidium). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification des cellules immunitaires. La quantification des cellules immunitaires a été réalisée par analyse FACS des cellules colorées avec des anticorps anti-CD45 et analyse live/mort à l’aide de la coloration à l’iodure de propidium (A). Une quantification plus poussée des cellules immunitaires a été effectuée au cours de l’analyse scRNA-seq (B). (CD45-APC - anticorps conjugués anti-CD45 allophycocyanine; PI - iodure de propidium; t-SNE - intégration stochastique du voisin distribuée par t). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Vue d’ensemble du processus de dissection de la mandibule. Des lignes pointillées illustrent les coupes suggérées. ATM - articulation temporo-mandibulaire, m. masseter - musculus masseter. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Compositions des solutions utilisées dans l’étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Discussion
L’étude des dents et des os au niveau cellulaire ou moléculaire est généralement difficile car les cellules formant ces tissus sont entourées de différents types de matrices dures19. L’un des principaux objectifs de la réalisation d’un séquençage d’ARN unicellulaire sur le tissu dentaire est la nécessité d’obtenir des cellules d’intérêt rapidement et sans aucun changement artificiel dans leurs transcriptomes. Pour ce faire, un protocole très efficace adapté à l’isolement des cellules des pulpes dentaires de souris et d’humains a été développé, ce qui permet la génération rapide de suspensions unicellulaires pour toutes les applications transcriptomiques. Ceci a été assuré par un isolement rapide des tissus, minimisant les étapes des manipulations tissulaires et cellulaires et rationalisant la digestion mécanique et enzymatique.
Les étapes les plus critiques de ce protocole sont le traitement rapide des tissus et la préparation adéquate de la suspension unicellulaire8,9. Une approche manuelle est utilisée pour obtenir des pâtes dentaires sans utiliser de perceuse dentaire ou d’autres dispositifs générateurs de chaleur. La surchauffe peut provoquer une expression artificielle des protéines de choc thermique et d’autres gènes, ce qui conduit finalement à ce que les modèles d’expression des gènes analysés ne soient pas représentatifs du tissu d’origine20. La récolte manuelle des tissus peut être une étape difficile qui nécessitera probablement une formation préalable. La pulpe est ensuite coupée en petits morceaux et digérée enzymatiquement à 37 °C. À l’exception des 15-20 minutes de digestion enzymatique, l’ensemble du protocole est effectué à 4 °C. Le traitement des tissus et en particulier la digestion enzymatique ont été minimisés dans les plus brefs délais, car une incubation plus prolongée à 37 °C peut entraîner des changements dans les schémas d’expression des gènes10. L’élimination mécanique de la dentine est recommandée avant la digestion enzymatique. La dentine et la prédentine attachée à la pulpe contiennent une grande quantité de collagène, et sa présence excessive pourrait diminuer l’efficacité de la solution de digestion. Après avoir été retirées du corps (ou la mort des organismes), il a été démontré que les cellules commencent à modifier rapidement leurs schémas d’expression génique12. Par conséquent, l’isolement et le traitement des cellules doivent être effectués le plus rapidement possible. Le protocole actuel réduit le temps de traitement à 35-45 min de l’isolement du tissu (euthanasie de l’animal) à la préparation de la suspension unicellulaire.
Une autre modification de cette technique est la préservation cellulaire pour une utilisation ultérieure. Ceci est réalisé par la fixation du méthanol. La suspension à cellules fixes au méthanol peut être conservée jusqu’à 1 mois à -80 °C, comme décrit dans le protocole21. Cependant, dans la mesure du possible, effectuer directement scRNA-seq, car il a été démontré que les données unicellulaires des suspensions unicellulaires fixées au méthanol pourraient souffrir d’une expression accrue des gènes liés au stress et d’une contamination par l’ARN ambiant22. Cette étape peut nécessiter des modifications supplémentaires selon les protocoles du fabricant.
Avant la première application de ce protocole, il est recommandé d’effectuer plusieurs étapes de validation pour tester la technique. D’après notre expérience, nous suggérons de tester les étapes critiques susmentionnées du protocole. De plus, nous suggérons de tester l’efficacité de la solution de collagénase P et de tester la manipulation de l’étape de dissociation tissulaire. Plus précisément, vers les 5 premières minutes après le début de l’incubation de la collagénase P, les morceaux de tissu doivent s’agréger ensemble. C’est une situation courante. Les agrégats sont désintégrés toutes les 3-4 minutes à l’aide d’une pipette de 1 mL et, avec le temps, ils devraient devenir plus petits jusqu’à ce qu’ils soient à peine visibles.
En outre, il est recommandé d’effectuer le comptage cellulaire dans une chambre de comptage cellulaire avant la centrifugation et avant et après le filtrage pour détecter les pertes cellulaires possibles dues à l’élimination sous-optimale du surnageant. Si la suspension monocellulaire finale doit être purifiée, FACS peut être utilisé. Le tri cellulaire permet non seulement d’éliminer les débris ou les cellules mortes, mais surtout d’enrichir la suspension finale avec des cellules marquées par fluorescence13,19. Pour éviter les contraintes de cisaillement ou le colmatage du trieur de cellules, une buse large (85 μm ou 100 μm) est utilisée. Cela améliorera encore la viabilité des cellules triées.
Cette technique a été conçue et testée sur des dents de souris et d’humains. Le principal facteur limitant est le petit nombre de cellules dans les pulpes dentaires réduites des dents des souris plus âgées (molaires) et des humains. Supposons qu’un plus grand nombre de cellules doivent être obtenues ou que des cellules provenant des dents de patients plus âgés doivent être acquises. Une solution possible consiste à traiter un plus grand nombre de dents et à les fusionner en un seul lot, puis à les traiter en un seul échantillon.
Les cellules vivantes de la pulpe dentaire humaine ont été isolées pour la première fois il y a plus de vingt ans à l’aide d’un mélange enzymatique de collagénase I et de dispase23. Depuis lors, les isolements de cellules de la pulpe dentaire sont devenus largement utilisés et plusieurs techniques ont été utilisées5,6,7,8. L’importance critique de la méthode présentée ici est l’adaptation de toutes les étapes d’isolement pour rendre l’isolement rapide et doux afin d’assurer la haute qualité de la suspension cellulaire finale pour scRNA-seq. Un rendement cellulaire plus élevé peut être obtenu par une incubation plus prolongée avec des enzymes. Ce protocole fournit une solution efficace pour obtenir rapidement des cellules uniques de souris et de dents humaines de qualité appropriée pour le séquençage de l’ARN unicellulaire. Cette technique devrait être largement utilisée pour d’autres tissus ou organismes avec seulement de légères modifications techniques.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
J.K. a été soutenu par l’agence de subvention de l’Université Masaryk (MUNI / H / 1615 / 2018) et par des fonds de la Faculté de médecine MU à un chercheur junior. J.L. a été soutenu par l’agence de subvention de l’Université Masaryk (MUNI / IGA / 1532 / 2020) et est titulaire d’une bourse de doctorat de Brno - financée par la municipalité de la ville de Brno. T.B. a été soutenu par le Fonds autrichien pour la science (bourse Lise Meitner: M2688-B28). Nous remercions Lydie Izakovicova Holla et Veronika Kovar Matejova pour leur aide dans l’obtention de dents humaines. Enfin, nous remercions Radek Fedr et Karel Soucek pour leur aimable aide au tri FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
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