Summary
Das aktuelle Protokoll stellt eine schnelle, effiziente und schonende Methode zur Isolierung einzelner Zellen dar, die für die Einzelzell-RNA-seq-Analyse aus einem kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahn, Mausmollaren und menschlichen Zähnen geeignet sind.
Abstract
Maus- und menschliche Zähne stellen herausfordernde Organe für eine schnelle und effiziente Zellisolierung für einzellige transkriptomische oder andere Anwendungen dar. Das zahnärztliche Pulpagewebe, das reich an extrazellulärer Matrix ist, erfordert einen langen und langwierigen Dissoziationsprozess, der typischerweise über die angemessene Zeit für die Einzelzell-Transkriptomik hinausgeht. Um künstliche Veränderungen in der Genexpression zu vermeiden, muss die Zeit von der Einschläferung eines Tieres bis zur Analyse einzelner Zellen minimiert werden. Diese Arbeit stellt ein schnelles Protokoll vor, das es ermöglicht, einzellige Suspensionen aus Maus- und menschlichen Zähnen in einer ausgezeichneten Qualität zu erhalten, die für scRNA-seq (Single-Cell RNA-Sequencing) geeignet ist. Dieses Protokoll basiert auf beschleunigten Gewebeisolationsschritten, enzymatischem Aufschluss und anschließender Herstellung der endgültigen Einzelzellsuspension. Dies ermöglicht eine schnelle und schonende Verarbeitung von Geweben und ermöglicht die Verwendung von mehr tierischen oder menschlichen Proben zur Gewinnung von Zellsuspensionen mit hoher Lebensfähigkeit und minimalen Transkriptionsänderungen. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll Forscher leiten könnte, die daran interessiert sind, das scRNA-seq nicht nur an der Maus oder menschlichen Zähnen durchzuführen, sondern auch an anderen extrazellulären matrixreichen Geweben, einschließlich Knorpel, dichtem Bindegewebe und Dermis.
Introduction
Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Entschlüsselung der In-vivo-Zellpopulationsstruktur, -hierarchie, -interaktionen und -homöostase1,2. Seine Ergebnisse hängen jedoch stark vom ersten Schritt dieser fortschrittlichen Analyse ab - der Herstellung einer Einzelzellsuspension von perfekter Qualität aus dem komplexen, gut organisierten Gewebe. Dies umfasst die Erhaltung der Zellen und die Verhinderung unerwünschter, künstlicher Veränderungen der Genexpressionsprofile der Zellen3,4. Solche Veränderungen könnten zu einer ungenauen Charakterisierung der Populationsstruktur und zu einer Fehlinterpretation der gesammelten Daten führen.
Spezifische Protokolle für die Isolierung aus einer Vielzahl von Geweben wurden entwickelt5,6,7,8. Sie verwenden in der Regel eine mechanische Dissoziation in Kombination mit einer weiteren Inkubation mit verschiedenen proteolytischen Enzymen. Dazu gehören typischerweise Trypsin, Kollagenasen, Dispasen, Papain6,7,8,9 oder kommerziell erhältliche Enzymmischungen wie Accutase, Tryple usw.5. Der kritischste Teil, der die Transkriptomqualität beeinflusst, ist die enzymatische Verdauung. Es konnte gezeigt werden, dass eine längere Inkubation mit Enzymen bei 37 °C die Genexpression beeinflusst und die Hochregulierung vieler stressbedingter Gene bewirkt10,11,12,13. Der andere kritische Parameter des Isolationsprozesses ist seine Gesamtlänge, da gezeigt wurde, dass sich zelltranskriptome nach der Gewebeischämie verändern14. Dieses Protokoll stellt ein effizientes Protokoll für die schonende Isolierung einzelner Zellen aus Maus- und menschlichen Zähnen dar, schneller als andere, zuvor verwendete Protokolle zur Isolierung von Zellen aus komplexen Geweben5,6,9,11,13,15,16.
Dieses Protokoll zeigt, wie man Weichgewebe schnell vom Hartzahn seziert und eine einzellige Suspension herstellt, die für scRNA-seq geeignet ist. Diese Methode verwendet nur einen Zentrifugationsschritt und minimiert den Effekt unerwünschter transkriptioneller Veränderungen, indem sie die Handhabungs- und Verdauungszeit des Gewebes reduziert und das Gewebe und die Zellen die meiste Zeit bei 4 ° C hält. Das Verfahren zeigt als Beispiel die Isolierung von Zellen aus Mausschneidezähnen, Backenzahn und menschlichen Weisheitszähnen, sollte aber hauptsächlich für andere Zähne in verschiedenen Organismen funktionieren. Das vollständige Protokoll ist in Abbildung 1 schematisch visualisiert. Dieses Protokoll wurde kürzlich verwendet, um einen Zahnzelltypatlas zu erstellen, der aus Maus- und menschlichen Zähnen gewonnen wurde1.
Protocol
Alle Tierversuche wurden gemäß den internationalen und lokalen Vorschriften durchgeführt und vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik genehmigt (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Dieses Protokoll wurde sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen Wildtyp-C57BL/6- und CD-1-Mäusen und mit genetisch veränderten Sox10::iCreERT2-Mäusen17 (kombiniert mit verschiedenen Reportersystemen) auf einem C57BL/6-Hintergrund getestet. Experimente mit menschlichen Proben wurden mit Zustimmung der Ethikkommissionen der Medizinischen Fakultät, Masaryk Universität Brünn & St. Anne's Fakultätskrankenhaus in Brünn, Tschechische Republik, durchgeführt.
1. Versuchsaufbau und Lösungsvorbereitung
- Instrumentenaufbau
- Die Zentrifuge auf 4 °C abkühlen.
- Die Inkubationskammer auf 37 °C erhitzen.
- Starten Sie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortiermaschine (FACS) und stellen Sie alle Temperaturen des Sortierers (inklusive Auffangrohrhalter) auf 4 °C ein. Führen Sie die Qualitätskontrolle des Geräts durch und stellen Sie die Drop-Verzögerung ein.
- Legen Sie die vorläufige Gating-Strategie fest, und führen Sie die Testsortierung durch.
HINWEIS: Wenn Sie FACS verwenden, verwenden Sie die 100 μm Düse.
- Bereiten Sie die Lösungen vor (Schritte 1.2.1-1.2.3).
- Waschlösung: Bereiten Sie frische 2% FBS (Fetal Bovine Serum) in HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) zu.
- Verdauungsmischung: Bereiten Sie frische Kollagenase P (3 U/ml) vor, die vollständig in HBSS gelöst ist.
- Optional: Bereiten Sie frisches HBSS + BSA (0,04%) und Kühlmethanol in analytischer Qualität in einem Gefrierschrank von -20 °C zur Lagerung von Einzelzellsuspension bei -80 °C vor.
HINWEIS: Schritt 1 muss vor Beginn des Tests ausgeführt werden. Die Zusammensetzung der verwendeten Lösungen ist in der Ergänzenden Tabelle 1 zusammengefasst.
2. Vorbereitung von Versuchstieren und menschlichen Zähnen
- Bereiten Sie die Versuchstiere (Maus) vor.
- Die Maus gemäß den örtlichen Vorschriften einschläfern; z.B. durch Überdosierung von Betäubungsmitteln wie zuvor beschrieben1.
ACHTUNG: Die Vorschriften für die humane Einschläferung von Versuchstieren variieren lokal. Befolgen Sie immer die geltenden lokalen Vorschriften. - Fahren Sie sofort mit dem Schritt der Gewebedissektion fort (Schritt 3).
HINWEIS: Wenn das Gewebe der Versuchstiere nicht sofort seziert werden kann (z. B. aufgrund des Transfers aus einer Tierhaltungseinrichtung), legen Sie die Versuchstiere auf Eis und führen Sie so schnell wie möglich eine Gewebedissektion durch. Um mehr Zellen aus Molarenpulpen der Maus zu erhalten, verwenden Sie jüngere (6 Wochen und weniger) Tiere. Mit zunehmendem Alter nimmt die Größe der Zahnpulpa ab. Mausschneidezähne behalten ihre Struktur meist mit zunehmendem Alter, so dass Tiere unterschiedlichen Alters zur Gewebedissektion verwendet werden können.
- Die Maus gemäß den örtlichen Vorschriften einschläfern; z.B. durch Überdosierung von Betäubungsmitteln wie zuvor beschrieben1.
- Bereiten Sie den menschlichen Zahn vor
HINWEIS: Menschliche Zähne wurden aus einem klinisch relevanten Grund extrahiert. Jede Diagnose wurde individuell behandelt, und ein erfahrener Zahnarzt führte immer die Zahnextraktion durch.- Den frisch extrahierten Zahn sofort in ein 50 ml Röhrchen mit eiskaltem HBSS geben und das Röhrchen bis zur Weiterverarbeitung auf Eis halten.
HINWEIS: Die Verwendung von erhaltenen Weisheitszähnen von Patienten bis zum Alter von 25-30 Jahren wird für die höchste Zellausbeute empfohlen.
- Den frisch extrahierten Zahn sofort in ein 50 ml Röhrchen mit eiskaltem HBSS geben und das Röhrchen bis zur Weiterverarbeitung auf Eis halten.
3. Gewebedissektion
- Halten Sie das Versuchstier hinter seinen Kopf und schauen Sie auf den ventralen Aspekt seines Kopfes, so dass der Schwanz weg zeigt.
- Entfernen Sie mit einer kleinen, scharfen Schere schnell die Haut vom Unterkiefer, um den Unterkieferbogen, das Weichgewebe zwischen jeder Hälfte der Unterkiefer und die angrenzenden Gesichtsmuskeln freizulegen.
- Machen Sie einen tiefen Schnitt von jeder Seite des Unterkiefers; zuerst durch m. masseter entlang der bukkalen Seite des Unterkiefers bis zum Kiefergelenk und dann entlang des inneren Teils jeder Hälfte des Unterkiefers durch die Basis der Mundhöhle (siehe Ergänzende Abbildung 1).
- Schneiden Sie alle Muskeln und Bänder entlang des Unterkiefers bis zum Kiefergelenk sowohl von außen als auch von innen der Mundhöhle ab.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, Knochen zu schneiden. Dies kann den apikalsten Teil des Schneidezahns beschädigen. - Greifen Sie den Unterkiefer mit einer gebogenen Spitzenpinzette und entfernen Sie ihn. Teilen Sie dann den sezierten Unterkiefer mit einer Schere in zwei Hälften, indem Sie die Unterkiefersymphyse durchschneiden (siehe Ergänzende Abbildung 1).
- Verwenden Sie ein industrielles Tuch mit niedrigem Fusselgehalt, um das verbleibende Weichgewebe von jeder Hälfte des Unterkiefers zu scheuern. Nachdem beide Teile des Unterkiefers gereinigt wurden, legen Sie sie in eine vorbereitete Petrischale mit eiskaltem HBSS.
HINWEIS: Arbeiten Sie ab diesem Zeitpunkt auf Eis. Die weitere Sezierung von Mausschneidezähnen und Molaren erfolgt unter einem Stereomikroskop mit schwarzem Hintergrund. - Maus-Unterkiefer-Schneidezähne
- Entfernen Sie für die Dissektion der Unterkieferschneidezähne den Alveolarkamm mit allen drei Molaren und knacken Sie den Unterkieferbogen transversal an der Stelle, die der Position zwischen dem ersten und zweiten Backenzahn entspricht.
HINWEIS: Für diesen Schritt werden eine scharfe Skalpellklinge Nr. 11 und eine Pinzette verwendet (siehe Materialtabelle). - Ziehen Sie den Schneidezahn vorsichtig aus dem Rest der Zahnhöhle.
HINWEIS: Wenn erfolgreich, enthält der extrahierte Schneidezahn intakte apikale Teile, einschließlich Epithelgewebe mit vollständigen zervikalen Schleifen. - Entfernen Sie bei Bedarf die verbleibenden Knochenfragmente, die noch am Schneidezähnen befestigt sind, mit einer Pinzette und einem Skalpell.
- Legen Sie die sezierten Schneidezähne in frische, eiskalte HBSS und sezieren Sie das interessierende Gewebe: Zervixschlaufe, Zahnpulpa oder andere Teile des Zahnes.
- Legen Sie das sezierte Weichgewebe in einen Tröpfchen frischer, eiskalter HBSS in der Mitte einer 10 cm langen Petrischale. Auf Eis halten.
- Entfernen Sie für die Dissektion der Unterkieferschneidezähne den Alveolarkamm mit allen drei Molaren und knacken Sie den Unterkieferbogen transversal an der Stelle, die der Position zwischen dem ersten und zweiten Backenzahn entspricht.
- Maus-Unterkiefermolaren
- Um die Unterkiefermolaren zu sezieren, entfernen Sie den Alveolarkamm vollständig vom Rest des Unterkiefers mit einer Skalpellklinge.
- Bewegen Sie den sezierten Alveolarkamm in einer Petrischale in frisches, eiskaltes HBSS und entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden Fragmente von Alveolarknochen, die an den Wurzeln befestigt sind.
- Legen Sie die sezierten Backenzähne ohne Alveolarknochen in frisches, eiskaltes HBSS. Um die Pulpa freizulegen, beginnen Sie, Teile des Dentins von der apikalen Seite mit einer feinen, scharfen Spitzenpinzette zu entfernen, bis Sie die Pulpahöhle erreichen.
- Sobald die Pulpahöhle erreicht ist, sezieren Sie die Zahnpulpa vorsichtig mit einer Scharfspitzenpinzette und legen Sie das Weichgewebe der Zahnpulpa in ein Tröpfchen frischer, eiskalter HBSS in der Mitte einer 10 cm langen Petrischale, die auf Eis aufbewahrt wird.
HINWEIS: Da die Molarenpulpen der Maus extrem klein sind, passen Sie die Vergrößerung des Stereomikroskops entsprechend an.
- Menschlicher Zahn
- Waschen Sie den menschlichen Zahn erneut in eiskaltem HBSS, um das verbleibende Blut zu entfernen.
- Legen Sie den Zahn in drei dickwandige sterile Plastiktüten und verwenden Sie einen gusseisernen Ingenieursschraubstock, um den Zahn zu knacken. Verwenden Sie Schraubstockbacken mit einer ebenen Oberfläche, um das Eindringen in die Beutel zu vermeiden.
- Ziehen Sie den Schraubstock langsam fest, bis Sie das Knacken des Zahnes hören; Nehmen Sie es aus den Beuteln und legen Sie es in frische, eiskalte HBSS in eine Petrischale.
- Nehmen Sie mit zwei Pinzetten die Zahnpulpa heraus, reinigen Sie sie von allen Resten harten Gewebes und legen Sie sie in einen Tropfen eiskaltes HBSS in der Mitte einer 10 cm langen Petrischale, die auf Eis aufbewahrt wird.
VORSICHT: Menschliches Gewebe könnte möglicherweise infektiös sein. Wenn Sie mit menschlichem Gewebe arbeiten, verwenden Sie Schutzausrüstung, um direkten Kontakt mit dem Gewebe zu vermeiden.
4. Herstellung einer Einzelzellsuspension
- Bereiten Sie ein 15-ml-Röhrchen mit 2,5 ml Verdauungsmischung vor, das aus Kollagenase P (3 U / ml) besteht, die vollständig in HBSS gelöst ist. Bewahren Sie die Lösung bis zum Gebrauch auf Eis auf.
HINWEIS: Verwenden Sie immer frisch zubereitete Kollagenase P; die Aliquots nicht einfrieren. Die Kollagenase-P-Aktivität variiert von Charge zu Charge. Überprüfen Sie die Aktivität Ihrer Charge vor dem Verdünnen. Kollagenase P wird durch Kalzium aktiviert, dessen Menge im lyophilisierten Pulver bereits ausreichend ist. Daher ist es unnötig, die Enzymmischung mit Kalzium anzureichern. Kollagenase P wird nicht durch FBS inaktiviert, kann aber durch Chelatbildner (z. B. Ethylendiamintetraacetic - EDTA) inaktiviert werden. Das Stoppen des Dissoziationsprozesses wird durch Verdünnung der Collagenase P in Wash-Lösung (2% FBS in HBSS) sichergestellt. Es hat sich gezeigt, dass die Zugabe von FBS die Zelllebensfähigkeit und die endgültige Anzahl der Zellen nach dem Sortieren erhöht18. - Mit einer runden Skalpellklinge Nr. 10 das Gewebe in alle Richtungen in kleinstmögliche Stücke schneiden. Aggregieren Sie die Gewebestücke in der Mitte des Tröpfchens neu und schneiden Sie die Gewebeaggregate wiederholt mit einer runden (Nr. 10) Skalpellklinge ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis das Material ausreichend zerkleinert ist.
- Die zerkleinerten Gewebestücke mit einer 1 ml Pipettenspitze in die vorbereitete Aufschlussmischung geben.
HINWEIS: Bei einer größeren Anzahl von Tieren, die gleichzeitig verarbeitet werden, teilen Sie das Gewebe mit Collagenase P in mehrere Röhrchen auf. Die maximale Menge pro Tube sind Pulpen, die aus etwa 10 Mausschneidezähnen gewonnen werden. Im Falle von Backenzähnen, wo Pulpen viel kleiner sind, kann die Anzahl der verarbeiteten Pulpen ausreichend erhöht werden. Verwenden Sie bei der Verwendung menschlicher Zähne maximal 2-3 Pulpa pro Röhrchen, abhängig von der Pulpagröße. - Legen Sie das Röhrchen mit einem Shaker in einen 37 °C vorgewärmten Inkubator. Kippen Sie das Rohr im Inneren des Shakers auf einen Winkel von 60 ° und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 150-200 U / min ein, um konstante Aufhängungsbewegungen im Rohr zu gewährleisten.
- Die Suspension alle 3-4 Minuten mit einer 1 ml Pipettenspitze kräftig verdrängen, um alle Klumpen aufzulösen.
HINWEIS: Mit der Zeit werden die Klumpen kleiner und weicher, bis sie fast verschwinden. - Insgesamt inkubieren Sie für 15-20 min. Am Ende der Inkubation zum letzten Mal verreibungen und dann langsam eiskalte Waschlösung auf ein Endvolumen von 12 ml geben.
- Entfernen Sie die verbleibenden Klumpen oder Stücke verkalkten Gewebes, indem Sie die Suspension mit einem 50 μm Zellsieb filtrieren.
- Nehmen Sie 10-20 μL der gefilterten Zellsuspension und zählen Sie die Zellen während der Zentrifugation mit einer Zellzählkammer (Hämozytometer). Zentrifuge für 5 min bei 300 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer 10 ml serologischen Pipette.
HINWEIS: Wenn die Anzahl der Zellen begrenzt ist, die nicht in verdünnter Suspension gezählt werden können, überspringen Sie die Zellzählung und verwenden Sie alle Zellen für die weitere Verarbeitung. - Optional: Fahren Sie mit der Fixierung und Lagerung fort21.
- Resuspensieren Sie die Pellets (bis zu 107 Zellen) in 100 μL HBSS + BSA (0,04%).
- 400 μL gekühltes Methanol zugeben und langsam vermischen.
- Inkubieren Sie die Zellsuspension für 15 min auf Eis.
- Bis zur Verarbeitung bei -80 °C lagern (nicht länger als 1 Monat).
- Resuspendieren Sie das Pellet in der Wash-Lösung. Ziel sind 700-1200 Zellen/μL der Wash-Lösung.
- Bewahren Sie das Röhrchen bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis auf.
HINWEIS: Falls erforderlich, führen Sie die Fixierung und Lagerung bei -80 °C durch. Empfohlen wird jedoch eine sofortige Verarbeitung der Zellsuspension für scRNA-seq. Die weiteren Schritte hängen vom Einzelzell-RNA-Seq-Protokoll ab. Wenn das scRNA-seq-Protokoll ein mikrofluidisches System verwendet (einige sc-RNA-seq-Unternehmen tun dies), laden Sie die Zellen basierend auf den Richtlinien des Herstellers entweder direkt oder nach der Zellsortierung auf. - Fahren Sie für FACS mit Schritt 5 fort.
5. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
- Bereiten Sie vor dem Sortieren das Zellsortierinstrument vor.
- Kühlen Sie das gesamte System auf 4 °C ab, führen Sie die Gerätequalitätskontrolle durch, stellen Sie die Tropfenverzögerung und die Spannung der Ablenkplatten ein. Legen Sie auffangröhrchen in den Auffangrohrhalter.
HINWEIS: Um zusätzliche Zentrifugationsschritte zu vermeiden, die zu einem unvermeidlichen Zellverlust führen, sortieren Sie die Zellen in eine Mikroröhre (1,5 ml) mit einer kleinen Menge (25-50 μL) der Wash-Lösung.
- Kühlen Sie das gesamte System auf 4 °C ab, führen Sie die Gerätequalitätskontrolle durch, stellen Sie die Tropfenverzögerung und die Spannung der Ablenkplatten ein. Legen Sie auffangröhrchen in den Auffangrohrhalter.
- Optional: Führen Sie vor FACS eine Lebensfähigkeitsfärbung durch.
- Propidiumiodid vor FACS in die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 0,5 μg/ml geben und 15 min bei 4 °C inkubieren.
- Laden Sie die Probe in den Zellsortierer. Legen Sie eine strenge Gating-Strategie fest, um Zelltrümmer, Dubletten und abgestorbene Zellen zu entfernen. Sortieren Sie die Zellen in ein vorbereitetes Röhrchen oder Multi-Well-Platten. Ein Beispiel für eine Gating-Strategie ist in Abbildung 2 dargestellt.
HINWEIS: Um Manipulationsschritte zu minimieren und das Protokoll zu beschleunigen, wird empfohlen, eine strenge Gating-Strategie anzuwenden (in Abbildung 2 vorgeschlagen), anstatt eine Lebensfähigkeitsfärbung zu verwenden. Um die Immunzellen von der isolierten Population zu trennen, kann eine CD45-Antikörperfärbung durchgeführt werden. Um dies zu tun, resuspend Zellsuspension in 100 μL Färbelösung (PBS + 2% FBS + Anti-CD45-APC konjugierte Antikörper 1/100 Verdünnung). 15 min auf lichtgeschütztem Eis inkubieren und FACS direkt durchführen.
Representative Results
Die exemplarische Isolierung einzelner Zellen wurde von zwei Unterkieferschneidezähnen eines 6 Wochen alten C57BL/6-Mausmännchens durchgeführt. Nach diesem Protokoll wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt und anschließend eine Einzelzellsequenzierung durchgeführt. Die hergestellte Einzelzellsuspension wurde mit FACS analysiert und sortiert (Abbildung 2). Zuerst wurde die FSC-A- (Vorwärtsstreuung, Fläche) und SSC-A-Darstellung (Seitenstreuung, Fläche) angewendet, und eine geeignete Gating-Strategie wurde verwendet, um eine Population mit erwarteter Größe und Granularität auszuwählen, um unsere Zelltrümmer und Zellduletten oder Aggregate zu filtern (Abbildung 2A). Diese ausgewählte Population (P1), die 38% aller Ereignisse zählte, wurde weiter verwendet, und FSC-A- und FSC-H-Parameter (Vorwärtsstreuung, Höhe) wurden angewendet, um die verbleibenden Zelldoppletten zu entfernen (Abbildung 2B). Die Population ohne Zelldoppletten (P2), die 95% von P1 zählt, kann anschließend für scRNA-seq verwendet werden. Alternativ kann zusätzliches Gating verwendet werden, um die interessierende Population auszuwählen (z. B. Expression von fluoreszierenden Proteinen oder lebende/tote Färbung). Um die Anzahl der lebenden/toten Zellen in der endgültigen Suspension zu überprüfen, wurde die PI-Färbung (Propidiumiodid) durchgeführt (Abbildung 2C). Die P3-Population , die PI- (lebende) Zellen enthielt, betrug 98,4% der übergeordneten P2-Population und 35,5% der gesamten Ereignisse. Die Gesamtzahl der herausgefilterten, toten (PI+) Zellen betrug 1887.
Die endgültige Anzahl von Zellen, die ohne Lebensfähigkeitsfärbung erhalten wurden, die für RNA-seq (P2) geeignet waren, zählte 118.199 Zellen aus zwei Maus-Schneidezähnulen. Das bedeutet die Zahl von fast 60.000 lebenden Zellen aus einem Unterkieferschneider.
Um die Anzahl der Immunzellen in der endgültigen Einzelzellsuspension zu klären, wurden zwei Ansätze verwendet. Zunächst wurden die CD45-Antikörperfärbung und die anschließende FACS-Analyse verwendet. Als ergänzende Methode wurde die Gesamtzahl der Immunzellen (CD45+) in scRNA-seq-Daten analysiert. Die FACS-Analyse zeigte 14,44% der CD45+-Zellen (13,20% lebend und 1,24% tot) (Abbildung 3A). Die Analyse von scRNA-seq-Daten zeigte 10,90% der CD45-exprimierenden Zellen (Abbildung 3B). Die Abnahme von CD45+-Zellen in scRNA-seq-Daten kann durch zusätzliche Schwellenwerte während der scRNA-seq-Analyse verursacht werden.
Diese repräsentativen Daten am Beispiel des Mausschneiders zeigen, dass das gegebene Protokoll in Kombination mit einer strengen Gating-Strategie effizient ist, um eine hohe Anzahl von Zellen aus einem einzigen Mauszahn zu gewinnen, ohne dass eine zusätzliche Verwendung der Lebensfähigkeitsfärbung erforderlich ist. Das Verhältnis der Immunzellen (CD45+) war gering (13,2%). Darüber hinaus wurde zuvor gezeigt, dass die Immunzellen für die Aufrechterhaltung der Zahnhomöostase unerlässlich sind, so dass die Entfernung aus der scRNA-seq-Analyse während des FACS in einigen Anwendungen kontraproduktiv wäre.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls. Verschiedene Schritte, einschließlich Der Temperaturbedingungen und der erwarteten Zeit, werden dargestellt, um eine Einzelzellsuspension aus Maus- und menschlichen Zähnen herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiel für die Gating-Strategie. FSC-A- und SSC-A-Gating wurde verwendet, um das P1-Gatter zu erzeugen, das die Zellpopulation mit der erwarteten Größe und Granularität widerspiegelt und die Zell- und extrazellulären Matrixtrümmer und die meisten großen Ereignisse (A) herausfiltert. Anschließend wurde die P1-Population in FSC-H- und FCS-A-Diagrammen dargestellt, die Zelldoppletten (B) herausfilterten. Diese P2-Population wurde dann auf das Vorhandensein toter Zellen durch Propidiumiodid (C) analysiert. Die Anzahl der Ereignisse/Zellen pro Gate ist in (D) dargestellt. (FSC-A - Vorwärtsstreuung, Fläche; SSC-A - Seitenstreuung, Fläche; FSC-H - Vorwärtsstreuung, Höhe; PI - Propidiumiodid). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung der Immunzellen. Die Quantifizierung der Immunzellen erfolgte durch FACS-Analyse von Zellen, die mit Anti-CD45-Antikörpern gefärbt waren, und Lebend-/Totanalyse mittels Propidiumiodid-Färbung (A). Eine weitere Quantifizierung von Immunzellen wurde während der scRNA-seq-Analyse durchgeführt (B). (CD45-APC - Anti-CD45 Allophycocyanin konjugierter Antikörper; PI - Propidiumiodid; t-SNE - t-verteilte stochastische Nachbareinbettung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Überblick über den Unterkieferdissektionsprozess. Gestrichelte Linien veranschaulichen vorgeschlagene Schnitte. TMJ - Kiefergelenk, m. masseter - musculus masseter. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Zusammensetzung der in der Studie verwendeten Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
Die Untersuchung von Zähnen und Knochen auf zellulärer oder molekularer Ebene ist im Allgemeinen eine Herausforderung, da Zellen, die diese Gewebe bilden, von verschiedenen Arten von harten Matrizen umgeben sind19. Eines der Hauptziele für die Durchführung von einzelligem RNA-seq auf Zahngewebe ist die Notwendigkeit, Zellen von Interesse schnell und ohne künstliche Veränderungen in ihren Transkriptomen zu erhalten. Um dies zu erreichen, wurde ein hocheffizientes Protokoll entwickelt, das für die Isolierung von Zellen aus Maus- und menschlichen Zahnpulpa geeignet ist und eine schnelle Generierung von Einzelzellsuspensionen für alle transkriptomischen Anwendungen ermöglicht. Dies wurde durch eine schnelle Gewebeisolierung, die Minimierung der Schritte der Gewebe- und Zellmanipulation und die Rationalisierung der mechanischen und enzymatischen Verdauung sichergestellt.
Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die schnelle Gewebeverarbeitung und die adäquate Vorbereitung der Einzelsuspension8,9. Ein manueller Ansatz wird verwendet, um Zahnpulpa zu erhalten, ohne einen Zahnbohrer oder andere wärmeerzeugende Geräte zu verwenden. Eine Überhitzung kann zu einer künstlichen Expression von Hitzeschockproteinen und anderen Genen führen, was letztendlich dazu führt, dass die analysierten Genexpressionsmuster nicht repräsentativ für das ursprüngliche Gewebe sind20. Die manuelle Gewebeentnahme kann ein herausfordernder Schritt sein, der wahrscheinlich vorher etwas Training erfordert. Das Fruchtfleisch wird dann in kleine Stücke geschnitten und bei 37 °C enzymatisch verdaut. Mit Ausnahme der 15-20 Minuten des enzymatischen Aufschlusses wird das gesamte Protokoll bei 4 °C durchgeführt. Die Gewebeverarbeitung und insbesondere die enzymatische Verdauung wurden auf die kürzest mögliche Zeit minimiert, da eine längere Inkubation bei 37 °C Veränderungen im Genexpressionsmuster verursachen kann10. Die mechanische Entfernung des Dentins wird vor der enzymatischen Verdauung empfohlen. Dentin und das an der Pulpa befestigte Predentin enthalten eine große Menge an Kollagen, und seine übermäßige Anwesenheit kann die Wirksamkeit der Verdauungslösung verringern. Nach der Entfernung aus dem Körper (oder dem Tod von Organismen) wurde gezeigt, dass Zellen beginnen, ihre Genexpressionsmuster schnell zu verändern12. Daher sollte die Zellisolierung und -verarbeitung so schnell wie möglich durchgeführt werden. Das aktuelle Protokoll reduziert die Verarbeitungszeit auf 35-45 min von der Isolierung des Gewebes (einschläferndes Tier) bis zur Herstellung einer Einzelzellsuspension.
Eine alternative Modifikation dieser Technik ist die Zellkonservierung für die spätere Verwendung. Dies wird durch Methanolfixierung erreicht. Methanol-fixierte Zellsuspension kann bis zu 1 Monat bei -80 °C gelagert werden, wie im Protokoll21 beschrieben. Führen Sie jedoch, wann immer möglich, scRNA-seq direkt durch, da gezeigt wurde, dass die Einzelzelldaten aus Methanol-fixierten Einzelzellsuspensionen unter einer erhöhten Expression stressbedingter Gene und einer Kontamination mit Ambient-RNA22 leiden könnten. Dieser Schritt erfordert möglicherweise zusätzliche Änderungen gemäß den Protokollen des Herstellers.
Vor der ersten Anwendung dieses Protokolls werden mehrere Validierungsschritte empfohlen, um die Technik zu testen. Aus unserer Erfahrung empfehlen wir, die oben genannten kritischen Schritte des Protokolls zu testen. Darüber hinaus empfehlen wir, die Wirksamkeit der Kollagenase-P-Lösung zu testen und die Handhabung des Gewebedissoziationsschritts zu testen. Insbesondere um die ersten 5 Minuten nach Beginn der Kollagenase-P-Inkubation sollten die Gewebestücke zusammen aggregieren. Dies ist eine häufige Situation. Aggregate werden alle 3-4 min mit einer 1 ml Pipette zerlegt und sollten mit zunehmender Zeit kleiner werden, bis sie kaum noch sichtbar sind.
Weiterhin wird empfohlen, vor der Zentrifugation und vor und nach der Filterung eine Zellzählung in einer Zellzählkammer durchzuführen, um mögliche Zellverluste durch suboptimale Überstandsentfernung zu erkennen. Wenn die endgültige Einzelzellsuspension gereinigt werden muss, kann FACS verwendet werden. Die Zellsortierung ermöglicht nicht nur die Entfernung von Ablagerungen oder abgestorbenen Zellen, sondern vor allem die Anreicherung der Endsuspension mit fluoreszierend markierten Zellen13,19. Um Scherspannungen oder Verstopfungen des Zellsortierers zu vermeiden, wird eine breite Düse (85 μm oder 100 μm) verwendet. Dies wird die Lebensfähigkeit der sortierten Zellen weiter verbessern.
Diese Technik wurde sowohl an Maus- als auch an menschlichen Zähnen entwickelt und getestet. Der wichtigste limitierende Faktor ist die geringe Anzahl von Zellen in den reduzierten Zahnpulpa der Zähne älterer Mäuse (Molaren) und Menschen. Angenommen, es muss eine größere Anzahl von Zellen gewonnen oder Zellen aus den Zähnen älterer Patienten erworben werden. Eine mögliche Lösung besteht darin, eine höhere Anzahl von Zähnen zu verarbeiten und zu einer einzigen Charge zusammenzuführen, die anschließend als eine Probe verarbeitet wird.
Lebende Zellen der menschlichen Zahnpulpa wurden erstmals vor mehr als zwanzig Jahren mit einem Enzymgemisch aus Kollagenase I und Dispase23 isoliert. Seitdem wurden Isolierungen von Zahnpulpazellen weit verbreitet, und es wurden mehrere Techniken verwendet5,6,7,8. Die entscheidende Bedeutung der hier vorgestellten Methode ist die Anpassung aller Isolationsschritte, um die Isolierung schnell und schonend zu gestalten, um die hohe Qualität der endgültigen Zellsuspension für scRNA-seq sicherzustellen. Eine höhere Zellausbeute kann durch längere Inkubation mit Enzymen erzielt werden. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Lösung, um schnell einzelne Zellen aus Maus- und menschlichen Zähnen von geeigneter Qualität für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zu gewinnen. Es wird erwartet, dass diese Technik für andere Gewebe oder Organismen mit nur geringfügigen technischen Modifikationen weit verbreitet ist.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
J.K. wurde von der Grant Agency der Masaryk University (MUNI/H/1615/2018) und durch Mittel der Medizinischen Fakultät MU für Nachwuchswissenschaftler unterstützt. J.L. wurde von der Grant Agency der Masaryk University (MUNI/IGA/1532/2020) unterstützt und ist ein Brno Ph.D. Talent Scholarship Holder - Finanziert von der Stadtverwaltung Brünn. T.B. wurde vom Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung gefördert (Lise-Meitner-Stipendium: M2688-B28). Wir danken Lydie Izakovicova Holla und Veronika Kovar Matejova für ihre Hilfe bei der Gewinnung menschlicher Zähne. Abschließend danken wir Radek Fedr und Karel Soucek für ihre freundliche Unterstützung bei der FACS-Sortierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 0 (0), (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 - Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
