Summary
הפרוטוקול הנוכחי מציג שיטה מהירה, יעילה ועדינה לבידוד תאים בודדים המתאימים לניתוח RNA-seq חד-תאי משיניים שיניים חד-תאיות של עכבר, שיניים שיניים לבנות עכבר ושיניים אנושיות הגדלות ללא הרף.
Abstract
עכבר ושיניים אנושיות מייצגים איברים מאתגרים לבידוד תאים מהיר ויעיל עבור יישומים תמלוליים או אחרים של תאים בודדים. רקמת עיסת השיניים, עשירה במטריצה חוץ-תאית, דורשת תהליך דיסוציאציה ארוך ומייגע שהוא בדרך כלל מעבר לזמן הסביר עבור תמלול של תא אחד. כדי להימנע משינויים מלאכותיים בביטוי הגנים, חלף הזמן מהמתת חסד של בעל חיים עד שיש למזער את הניתוח של תאים בודדים. עבודה זו מציגה פרוטוקול מהיר המאפשר להשיג מתלה של תא יחיד משיניים עכבר ואדם באיכות מעולה המתאימה scRNA-seq (רצף RNA של תא יחיד). פרוטוקול זה מבוסס על צעדי בידוד רקמות מואצים, עיכול אנזימטי, והכנה מאוחרת יותר של השעיה סופית של תא יחיד. זה מאפשר עיבוד מהיר ועדין של רקמות ומאפשר שימוש בדגימות יותר של בעלי חיים או בני אדם לקבלת השעיות תאים עם כדאיות גבוהה ושינויי שעתוק מינימליים. זה צפוי כי פרוטוקול זה עשוי להנחות חוקרים המעוניינים לבצע את scRNA-seq לא רק על העכבר או השיניים האנושיות, אלא גם על רקמות אחרות מחוץ למטריקס עשיר, כולל סחוס, רקמת חיבור צפופה, ו dermis.
Introduction
רצף RNA חד-תאי הוא כלי רב עוצמה לפענוח מבנה אוכלוסיית תאי vivo, היררכיה, אינטראקציות והומיוסטזיס1,2. עם זאת, תוצאותיו תלויות מאוד בשלב הראשון של ניתוח מתקדם זה - הכנת השעיה של תא אחד באיכות מושלמת מתוך הרקמה המורכבת והמאורגנת היטב. זה כולל שמירה על תאים בחיים ומניעת שינויים מלאכותיים לא רצויים בפרופילי ביטוי גנים של התאים3,4. שינויים כאלה עלולים להוביל לאפיון לא מדויק של מבנה האוכלוסייה ולפרשנות שגויה של הנתונים שנאספו.
פרוטוקולים ספציפיים לבידוד מתוך מגוון רחב של רקמות פותחו5,6,7,8. הם בדרך כלל משתמשים דיסוציאציה מכנית בשילוב עם דגירה נוספת עם אנזימים פרוטאוליטיים שונים. אלה כוללים בדרך כלל טריפסין, collagenases, dispases, פפאין6,7,8,9, או תערובות אנזימים זמין מסחרית כגון Accutase, טריפל, וכו '5. החלק הקריטי ביותר המשפיע על איכות התמלול הוא עיכול אנזימטי. הוכח כי דגירה ממושכת עם אנזימים ב 37 °C משפיע על ביטוי הגן וגורם upregulation של גנים רבים הקשורים ללחץ10,11,12,13. הפרמטר הקריטי השני של תהליך הבידוד הוא אורכו הכולל, שכן הוכח כי תמלול התא משתנה לאחר איסכמיה הרקמה14. פרוטוקול זה מציג פרוטוקול יעיל לבידוד עדין של תאים בודדים משיניים עכבריות ושיניים אנושיות, מהר יותר מאשר פרוטוקולים אחרים, נוצלו בעבר לבידוד תאים מרקמות מורכבות5,6,9,11,13,15,16.
פרוטוקול זה מציג כיצד לנתח במהירות רקמה רכה מן השן הקשה ולהכין מתלה תא יחיד המתאים scRNA-seq. שיטה זו משתמשת רק צעד צנטריפוגה אחד וממזערת את ההשפעה של שינויים תמלול לא רצויים על ידי הפחתת הטיפול ברקמות וזמן העיכול ושמירה על הרקמה והתאים ב 4 °C (70 °F) רוב הזמן. הנוהל מציג את בידוד התאים משיניים של עכבר, טוחנות ושיני בינה אנושיות כדוגמה, אך בעיקר צריך לעבוד עבור שיניים אחרות באורגניזמים שונים. הפרוטוקול המלא מוצג באופן סכמטי באיור 1. פרוטוקול זה שימש לאחרונה כדי ליצור אטלס סוג תא שיניים המתקבל עכבר ושיניים אנושיות1.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי התקנות הבינלאומיות והמקומיות ואושרו על ידי משרד החינוך, הנוער והספורט, צ'כיה (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). פרוטוקול זה נבדק עם עכברי סוג בר זכר ונקבה C57BL/6 ו- CD-1 ועם עכברי Sox10 מהונדסים גנטית::iCreERT2 עכברים17 (בשילוב עם מערכות כתב שונות) על רקע C57BL/6. ניסויים בדגימות אנושיות בוצעו באישור הוועדות לאתיקה של הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת מסריק ברנו וסנט אן בבית החולים הפקולטי של סנט אן בברנו, צ'כיה.
1. הקמה והכנה ניסיונית של פתרונות
- הגדרת מכשירים
- מצננים את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס.
- מחממים את תא הדגירה ל-37 מעלות צלזיוס.
- הפעל את מכונת מיון התאים המופעלת על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) והגדר את כל הטמפרטורות של הממיין (כולל מחזיק צינור איסוף) ל-4 °C (70 °F). בצע את בקרת האיכות של הכלי, הגדר את השהיית השחרור.
- הגדר את אסטרטגיית הגינג הראשונית ובצע את מיון הבדיקה.
הערה: בעת שימוש ב- FACS, השתמש בזרבובית 100 מיקרומטר.
- הכן את הפתרונות (שלבים 1.2.1-1.2.3).
- פתרון שטיפה: הכן FBS טרי 2% (סרום בקר עוברי) ב- HBSS (פתרון המלח המאוזן של הנקס).
- תערובת עיכול: הכן קולגנאז טרי P (3 U/mL) מומס לחלוטין ב- HBSS.
- אופציונלי: הכן HBSS + BSA טרי (0.04%) ומתנול כיתה אנליטית צוננת במקפיא של -20 °C לאחסון מתלה של תא יחיד ב- -80 °C (80 °F).
הערה: שלב 1 צריך להתבצע לפני תחילת הניסוי. הרכב הפתרונות המנוצלים מסוכם בטבלה משלימה 1.
2. הכנת בעלי חיים/ים ניסיוניים ושן אנושית
- הכן את החיות הניסיוניות (עכבר).
- המתת חסד את העכבר על פי התקנות המקומיות; למשל על ידי מנת יתר של הרדמה כפי שתואר קודם לכן1.
זהירות: תקנות להמתת חסד הומאנית של בעלי חיים ניסיוניים משתנות באופן מקומי. פעל תמיד על פי תקנות מקומיות תקפות. - המשך מיד לשלב ניתוח הרקמה (שלב 3).
הערה: אם לא ניתן לנתח את הרקמה מבעלי החיים הניסיוניים באופן מיידי (למשל, עקב העברה ממתקן דיור לבעלי חיים), הניחו את בעלי החיים הניסיוניים על הקרח ובצעו ניתוח רקמות בהקדם האפשרי. כדי להשיג יותר תאים מפולות הטוחנות של העכבר, השתמש בבעלי חיים צעירים יותר (6 שבועות ופחות). עם הגיל ההולך וגדל, גודל עיסת השיניים פוחתת. חתני עכבר בעיקר לשמור על המבנה שלהם עם הגיל גדל כך בעלי חיים בגילאים שונים יכולים לשמש עבור ניתוח רקמות.
- המתת חסד את העכבר על פי התקנות המקומיות; למשל על ידי מנת יתר של הרדמה כפי שתואר קודם לכן1.
- הכן את השן האנושית
הערה: שיניים אנושיות חולצו מסיבה רלוונטית מבחינה קלינית. כל אבחנה טופלה בנפרד, ומנתח שיניים מנוסה תמיד ביצע את עקירת השן.- שים את השן שחולצה טרי מיד לתוך צינור 50 מ"ל עם HBSS קר כקרח ולשמור את הצינור על קרח עד עיבוד נוסף.
הערה: מומלץ להשתמש בשיני בינה שמורות מחולים עד גיל 25-30 עבור תפוקת התא הגבוהה ביותר.
- שים את השן שחולצה טרי מיד לתוך צינור 50 מ"ל עם HBSS קר כקרח ולשמור את הצינור על קרח עד עיבוד נוסף.
3. ניתוח רקמות
- החזק את החיה הניסיונית מאחורי ראשה, מביט על ההיבט הגחוני של ראשו כך שהזנב יצביע משם.
- בעזרת מספריים קטנים וחדים, הסר במהירות את העור מהלסת התחתונה כדי לחשוף את הקשת הלסת התחתונה, את הרקמה הרכה בין כל מחצית מהלסת התחתונה ואת שרירי הפנים הסמוכים.
- לעשות חתך עמוק מכל צד של הלסתן; ראשית, דרך מעסה מ ' לאורך הצד buccal של הלסת התחתונה עד המפרק temporomandibular, ולאחר מכן לאורך החלק הפנימי של כל מחצית הלסת התחתונה דרך הבסיס של חלל הפה (ראה איור משלים 1).
- חותכים את כל השרירים והרצועות לאורך הלסת התחתונה עד למפרק הטמפורומנדיבולרי הן מבחוץ והן מבפנים של חלל הפה.
הערה: הימנע חיתוך עצמות. זה עלול לפגוע בחלק האפיטי ביותר של השן החותך. - לתפוס את הלסתן באמצעות פינצטה קצוצה כפופה ולהסיר אותו. לאחר מכן, פצל את הלסת התחתונה המנותחת לשני חצאים עם מספריים על ידי חיתוך דרך סימפיזה לסת התחתונה (ראה איור 1 משלים).
- השתמש במחוב מוך נמוך תעשייתי כדי לשפשף את הרקמה הרכה הנותרת מכל חצי מהלסתן. לאחר שני חלקי הלסת התחתונה מנוקים, מניחים אותם לתוך צלחת פטרי מוכנה מראש עם HBSS קר כקרח.
הערה: מנקודה זו ואילך, לעבוד על קרח. ניתוח נוסף של חתכים וטחנות עכברים מתבצע תחת סטריאומיקרוסקופ עם רקע שחור. - חותמות מלסת התחתונה של העכבר
- עבור ניתוח של חתכים הלסת התחתונה, להסיר את הרכס המכתשי עם כל שלוש הטוחנות לפצח לרוחב את הקשת הלסת התחתונה במקום המתאים למיקום בין הטוחנת הראשונה והשנייה.
הערה: להב אזמל חד מס '11 ופינצטה משמשים לביצוע שלב זה (ראה טבלת חומרים). - בזהירות למשוך את השן החותך מתוך שאר שקע השיניים.
הערה: אם מוצלח, השן החותכת שחולצה תכיל חלקים אפיים שלמים, כולל רקמת אפיתל עם לולאות צוואר הרחם מלאות. - במידת הצורך, להסיר את שברי העצם הנותרים עדיין מחוברים החותכת עם פינצטה ואזמל.
- מניחים את החותכות נותחות לתוך HBSS טרי וקר כקרח ונותחים את רקמת העניין: לולאת צוואר הרחם, עיסת השיניים או חלקים אחרים של השן.
- מניחים את הרקמה הרכה המנותחת בטיפת HBSS טרייה וקרה כקרח באמצע צלחת פטרי באורך 10 ס"מ. שמור על קרח.
- עבור ניתוח של חתכים הלסת התחתונה, להסיר את הרכס המכתשי עם כל שלוש הטוחנות לפצח לרוחב את הקשת הלסת התחתונה במקום המתאים למיקום בין הטוחנת הראשונה והשנייה.
- טחנות מותן עכבר
- לניתוח טחנות הלסת התחתונה, הסר לחלוטין את הרכס המכתשי משאר הלסת התחתונה באמצעות להב אזמל.
- מעבירים את פסגת המכתשי המנותח ל-HBSS טרי וקר כקרח בצלחת פטרי ומסירים בזהירות את כל שברי העצמות המכתשיות הנותרות המחוברות לשורשים.
- מניחים את הטוחנות הנותחות ללא עצם כפתת שמש לתוך HBSS טרי וקר כקרח. כדי לחשוף את עיסת, להתחיל להסיר חלקים של dentin מהצד apical באמצעות פינצטה עדינה, חד קצה עד שתגיע חלל עיסת.
- לאחר הגעת חלל העיסה, ניתחו בזהירות עיסת שיניים באמצעות זוג פינצטה חדה ומניחים את הרקמה הרכה של עיסת השיניים לתוך טיפה של HBSS טרי וקר כקרח באמצע צלחת פטרי 10 ס"מ שנשמרה על קרח.
הערה: מכיוון שפולסות טוחנות עכבר קטנות מאוד, התאימו את ההגדלה בסטריומיקרוסקופ בהתאם.
- שן אנושית
- לשטוף שן אנושית שוב ב HBSS קר כקרח כדי להסיר את הדם הנותר.
- מניחים את השן לשלוש שקיות פלסטיק סטריליות עבות ומשתמשים במגמתו של מהנדס ספסל ברזל יצוק כדי לפצח את השן. השתמש במלתעות vise עם משטח שטוח כדי למנוע חדירה לשקיות.
- לאט להדק את המאזני עד שאתה שומע את השן פיצוח; מוציאים אותו מהשקיות ומניחים אותו לתוך HBSS טרי וקר כקרח בצלחת פטרי.
- באמצעות שני פינצטה, להוציא את עיסת השיניים, לנקות אותו מכל שרידי רקמה קשה ומניחים אותו לתוך טיפה אחת של HBSS קר כקרח באמצע צלחת פטרי 10 ס"מ נשמר על קרח.
זהירות: רקמה אנושית עלולה להיות מדבקת. בעת עבודה עם רקמה אנושית, להשתמש בציוד מגן כדי למנוע מגע ישיר עם הרקמה.
4. הכנת השעיה חד-תאית
- הכן צינור 15 מ"ל עם 2.5 מ"ל של תערובת עיכול המורכבת קולגנאז P (3 U/mL) מומס לחלוטין HBSS. שמור את הפתרון על קרח עד השימוש.
הערה: השתמש תמיד קולגנאז P מוכן טרי; אין להקפיא את ה-aliquots. פעילות Collagenase P משתנה מאצווה לאצווה. בדוק את פעילות האצווה שלך לפני דילול. Collagenase P מופעל על ידי סידן, שכמותו כבר מספיקה באבקה lyophilized. לכן, אין צורך להעשיר את תערובת האנזים בסידן. Collagenase P אינו מומת על ידי FBS אבל יכול להיות מומת על ידי סוכני כלאט (למשל, אתילנדימינשטראקטי - EDTA). עצירת תהליך הניתוק מובטחת על ידי דילול תמיסת Collagenase P ב-Wash (2% FBS ב-HBSS). הוכח כי הוספת FBS מגדילה את הכדאיות של התא ואת המספר הסופי של תאים לאחר מיון18. - בעזרת להב אזמל בצורת עגול מס ' 10, חותכים את הרקמה לכל הכיוונים לחתיכות הקטנות ביותר האפשריות. Reaggregate חתיכות הרקמה באמצע טיפה לחתוך שוב ושוב את אגרגטים הרקמות באמצעות להב אזמל בצורת עגול (מס '10). חזור על תהליך זה מספר פעמים עד שהחומר טחון מספיק.
- מעבירים את חתיכות הרקמה הגרוסה בעזרת טיפ פיפטה של 1 מ"ל לתערובת העיכול המוכנה.
הערה: במקרה של מספר גדול יותר של בעלי חיים מעובדים בבת אחת, לפצל את הרקמה למספר צינורות עם Collagenase P. הסכום המרבי לכל צינור הם פעימות המתקבלות מכ -10 חותמות עכבר. במקרה של טחנות, שבו פולסים הם הרבה יותר קטנים, מספר pulps מעובד ניתן להגדיל כראוי. בעת שימוש בשיניים אנושיות, להשתמש מקסימום של 2-3 פעימות לכל צינור, בהתאם לגודל עיסת. - מניחים את הצינור לתוך אינקובטור 37 °C (37 °F) מחומם מראש עם שייקר. הטה את הצינור בתוך השייקר לזווית של 60° והגדר את המהירות ל-150-200 סל"ד כדי להבטיח תנועות מתלים קבועות בתוך הצינור.
- טריטורציה נמרצת את המתלה כל 3 - 4 דקות עם קצה פיפטה 1 מ"ל כדי לפורר את כל הגושים.
הערה: עם הזמן, הגושים יהפכו לקטנים ורכים יותר עד שהם כמעט ייעלמו. - בסך הכל, דגירה במשך 15-20 דקות. בסוף הדגירה, triturate בפעם האחרונה, ולאחר מכן לאט להוסיף קר קרח לשטוף פתרון לנפח הסופי של 12 מ"ל.
- הסר את הגושים הנותרים או חתיכות של רקמה מסוידת על ידי סינון ההשעיה באמצעות מסננת תא 50 מיקרומטר.
- קח 10-20 μL של השעיית התא המסונן ולספור את התאים במהלך צנטריפוגה באמצעות תא ספירת תאים (Hemocytometer). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.
הערה: אם מספר התאים מוגבל שלא ניתן לספור בהשעיה מדוללת, דלג על ספירת התאים והשתמש בכל התאים לעיבוד נוסף. - אופציונלי: המשך עבור קיבוע ואחסון21.
- להשעות מחדש את הכדורים (עד 107 תאים) ב 100 uL של HBSS + BSA (0.04%).
- מוסיפים 400 μL של מתנול צונן ומערבבים לאט.
- לדגור על השעיית התא למשך 15 דקות על קרח.
- יש לאחסן ב- -80 °C (70 °F) עד לעיבוד (לא יותר מחודש אחד).
- יש להזרים את הכדור בתמיסת הכביסה. לשאוף 700-1200 תאים / μL של פתרון לשטוף.
- שמור את הצינור על קרח עד לעיבוד נוסף.
הערה: במידת הצורך, בצע את הקיבעון והאחסון ב - 80 °C (70 °F). עם זאת, מומלץ לעבד באופן מיידי את השעיית התא עבור scRNA-seq. שלבים נוספים יהיו תלויים בפרוטוקול seq RNA של תא יחיד. כאשר פרוטוקול scRNA-seq משתמש במערכת מיקרופלואידית (חברות sc-RNA-seq מסוימות עושות זאת), טען את התאים בהתבסס על הנחיות היצרן ישירות או לאחר מיון תאים. - עבור FACS, המשך לשלב 5.
5. מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS)
- לפני המיון, הכן את כלי מיון התאים.
- לקרר את המערכת כולה ל 4 °C (5 °F), לבצע את בקרת איכות המכשיר, להגדיר את השהיית טיפה ואת המתח של לוחות הסטה. שים צינורות איסוף במחזיק צינור האיסוף.
הערה: כדי למנוע שלבי צנטריפוגה נוספים וכתוצאה מכך אובדן תאים בלתי נמנע, מיין תאים למיקרו-tube (1.5 מ"ל) עם כמות קטנה (25-50 μL) של פתרון הכביסה.
- לקרר את המערכת כולה ל 4 °C (5 °F), לבצע את בקרת איכות המכשיר, להגדיר את השהיית טיפה ואת המתח של לוחות הסטה. שים צינורות איסוף במחזיק צינור האיסוף.
- אופציונלי: בצע כתמי קיימא לפני FACS.
- הוסף יוד Propidium לתוך השעיית התא לפני FACS לריכוז הסופי 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ודגרה במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
- טען את הדוגמה לתוך ממיין התאים. הגדר אסטרטגיית גטינג קפדנית להסרת פסולת תאים, מכפילים ותאים מתים. מיין את התאים לתוך צינור מוכן או לוחות מרובי בארות. דוגמה לאסטרטגיית גטינג מוצגת באיור 2.
הערה: כדי למזער את שלבי המניפולציה ולהאיץ את הפרוטוקול, מומלץ ליישם אסטרטגיית גטינג קפדנית (מוצע באיור 2) במקום להשתמש בהכתמת כדאיות. כדי להפריד את תאי החיסון מהאוכלוסייה המבודדת, ניתן לבצע כתמי נוגדנים CD45. כדי לבצע זאת, השעיית תא resuspend ב 100 μL של פתרון כתמים (PBS + 2% FBS + נוגדן מצומד נגד CD45-APC 1/100 דילול). דגירה במשך 15 דקות על קרח מוגן מפני אור ולבצע FACS ישירות.
Representative Results
בידוד מופתי של תאים בודדים בוצע משני חתכים חד-תאיים מזכר עכבר C57BL/6 בן 6 שבועות. בעקבות פרוטוקול זה, הוכן השעיה של תא יחיד ולאחר מכן בוצע רצף של תא בודד. ההשעיה המוכנה של תא בודד נותחה ומוינתה באמצעות FACS (איור 2). ראשית, הוחל על התוויית ה- FSC-A (פיזור קדימה, שטח) ו- SSC-A (פיזור צד, אזור), ואסטרטגיית גטינג מתאימה שימשה לבחירת אוכלוסייה עם גודל וצפיפות צפויים כדי לסנן את פסולת התא שלנו ואת מכפילי התאים או האגרגטים (איור 2A). אוכלוסייה נבחרת זו (P1), שסופרת 38% מכלל האירועים, שימשה עוד יותר, והוחלו פרמטרים של FSC-A ו- FSC-H (פיזור קדימה, גובה) כדי להסיר את מכפילי התא הנותרים (איור 2B). האוכלוסייה ללא מכפילים תאים (P2) לספור 95% של P1 יכול לשמש לאחר מכן עבור scRNA-seq. לחלופין, ניתן להשתמש בגטינג נוסף כדי לבחור את אוכלוסיית העניין (למשל, ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים או כתמים חיים / מתים). כדי לבדוק את מספר התאים החיים/מתים בהשעיה הסופית, בוצעה הכתמת PI (פרופיליום יודיד) (איור 2C). אוכלוסיית P3 שהכילה תאי PI ( חיים) הייתה 98.4% מתוך אוכלוסיית ההורה P2 ו-35.5% מכלל האירועים. המספר הכולל של תאים מסוננים, מתים (PI+) היה 1887.
המספר הסופי של תאים שהושגו ללא מכתם בכדאיות המתאים ל- RNA-seq (P2) ספר 118,199 תאים משני פעימות חותם עכבר. משמעות הדבר היא מספר של כמעט 60,000 תאים חיים מבן ן יתד אחד.
כדי להבהיר את מספר תאי החיסון בהשעיה הסופית של תא בודד, נעשה שימוש בשתי גישות. ראשית, כתמי נוגדנים CD45 וניתוח FACS לאחר מכן שימשו. כשיטה משלימה, המספר הכולל של תאי מערכת החיסון (CD45+) בנתוני scRNA-seq נותח. ניתוח FACS הראה כי 14.44% מתאי CD45+ (13.20% חיים ו-1.24% מתים) (איור 3A). ניתוח נתוני scRNA-seq הראה כי 10.90% מהתאים מבטאי CD45 (איור 3B). הירידה של תאי CD45+ בנתוני scRNA-seq יכולה להיגרם על-ידי סף נוסף במהלך ניתוח scRNA-seq.
נתונים מייצגים אלה על הדוגמה של שן החותכת של העכבר מראים כי הפרוטוקול הנתון בשילוב עם אסטרטגיית gating קפדנית יעיל בהשגת מספר גבוה של תאים מתוך שן עכבר אחת ללא צורך בשימוש נוסף של מכתים קיימא. היחס בין תאי מערכת החיסון (CD45+) היה מינורי (13.2%). יתר על כן, הוכח בעבר כי תאי החיסון חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס שיניים, ולכן הסרתם מניתוח scRNA-seq במהלך FACS יהיה מועיל ביישומים מסוימים.
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. צעדים שונים, כולל תנאי טמפרטורה וזמן צפוי, מיוצגים כדי להכין השעיה חד-תאית משיניים עכבר ואדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה לאסטרטגיית הג'יטינג. FSC-A ו- SSC-A gating שימש לייצור שער P1, המשקף את אוכלוסיית התאים עם גודל ופרטיות צפויים וסינון פסולת התא והמטריקס החוץ תאי ורוב האירועים הגדולים (A). לאחר מכן, אוכלוסיית P1 שורטלה בחלקת FSC-H ו- FCS-A, אשר סיננה מכפילים לתאים (B). אוכלוסיית P2 זו נותחה לאחר מכן לנוכחות של תאים מתים על ידי פרופידיום יודיד (C). מספר האירועים/התאים לשער מיוצגים ב- (D). (FSC-A - פיזור קדימה, אזור; SSC-A - פיזור צד, שטח; FSC-H - פיזור קדימה, גובה; PI - פרופידיום יודיד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות תאי החיסון. כימות תאי החיסון בוצע על ידי ניתוח FACS של תאים מוכתמים בנוגדן אנטי-CD45 וניתוח חי/מת באמצעות כתמי יודיד פרופידיום (A). כימות נוסף של תאי מערכת החיסון בוצע במהלך ניתוח scRNA-seq (B). (CD45-APC - נוגדן מצומד נגד CD45 אלופיקוסיאנין; PI - פרופידיום יודיד; t-SNE - הטמעת שכנים סטוכאסטיים מבוזרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: סקירה כללית של תהליך הניתוח הלסת-חת. קווים מקווקווים ממחישים את החתכים המוצעים. TMJ - מפרק טמפומורומנדיבולרי, מ' מעסה - מעסה שרירים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: הרכבי הפתרונות המשמשים במחקר. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Discussion
לימוד שיניים ועצמות ברמה התאית או המולקולרית הוא בדרך כלל מאתגר שכן תאים היוצרים רקמות אלה מוקפים סוגים שונים של מטריצות קשות19. אחת המטרות העיקריות לביצוע RNA-seq חד-תאי על רקמת השיניים היא הצורך להשיג תאים מעניינים במהירות וללא שינויים מלאכותיים בתעתיקים שלהם. לשם כך, פותח פרוטוקול יעיל ביותר המתאים לבידוד תאים מפעמי עכברים ושיניים אנושיות, המאפשר ייצור מהיר של מתלים חד-תאיים לכל היישומים התמלוליים. זה הובטח על ידי בידוד רקמות מהיר, מזעור השלבים של מניפולציות רקמה ותא, וייעול העיכול מכני אנזימטי.
השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם עיבוד רקמות מהיר והכנה נאותה של השעיה חד-תאית8,9. גישה ידנית משמשת להשגת פעימות שיניים מבלי להשתמש במקדחה דנטלית או במכשירים אחרים המייצרים חום. התחממות יתר עלולה לגרום לביטוי מלאכותי של חלבוני הלם חום וגנים אחרים, ובסופו של דבר להוביל לכך שדפוסי ביטוי הגנים המנותחים אינם מייצגים את הרקמה המקורית20. קציר רקמות ידני עשוי להיות צעד מאתגר שסביר להניח שיזדקק להכשרה מראש. עיסת הוא חתוך לאחר מכן לחתיכות קטנות מתעכל אנזימטית ב 37 °C (50 °F). למעט 15-20 דקות של עיכול אנזימטי, הפרוטוקול כולו מבוצע ב 4 °C (70 °F). עיבוד הרקמה ובמיוחד העיכול אנזימטי צומצמו לזמן הקצר ביותר האפשרי מאז דגירה ממושכת יותר ב 37 °C (50 °F) יכול לגרום לשינויים בדפוסי ביטוי גנים10. הסרה מכנית של דנטין מומלץ לפני עיכול אנזימטי. דנטין ופרדנטין המחובר לעיסה מכילים כמות גדולה של קולגן, ונוכחותו המוגזמת עשויה להפחית את האפקטיביות של פתרון העיכל. לאחר שהוסרו מהגוף (או מוות של אורגניזמים), הוכח כי תאים מתחילים לשנות את דפוסי ביטוי הגנים שלהם במהירות12. לכן, בידוד ועיבוד תאים צריך להתבצע מהר ככל האפשר. הפרוטוקול הנוכחי מקטין את זמן העיבוד ל-35-45 דקות מבידוד הרקמה (המתת חסד) ועד להכנת השעיה של תא בודד.
שינוי חלופי אחד של טכניקה זו הוא שימור תאים לשימוש מאוחר יותר. זה מושג על ידי קיבעון מתנול. מתלה תא קבוע מתנול ניתן לאחסן עד חודש אחד ב -80 °C (70 °F), כמתואר בפרוטוקול21. עם זאת, במידת האפשר, לבצע scRNA-seq ישירות, שכן הוכח כי הנתונים של תא יחיד מן מתנול קבוע השעיות תא בודד עשויים לסבול ביטוי מוגבר של גנים הקשורים ללחץ וזיהום עם RNA הסביבה 22. ייתכן שצעד זה יצריך שינוי נוסף בהתאם לפרוטוקולי היצרן.
לפני היישום הראשון של פרוטוקול זה, מומלץ לבצע מספר שלבי אימות כדי לבדוק את הטכניקה. מניסיוננו, אנו מציעים לבחון את השלבים הקריטיים הנ"ל של הפרוטוקול. בנוסף, אנו מציעים לבדוק את האפקטיביות של פתרון collagenase P ולבדוק את הטיפול בשלב פירוק הרקמה. באופן ספציפי, סביב 5 הדקות הראשונות לאחר החניכה של דגירה P collagenase, חתיכות הרקמה צריך להצטבר יחד. זהו מצב נפוץ. אגרגטים מתפוררים כל 3-4 דקות באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, ועם הזמן הגובר, הם צריכים להיות קטנים יותר עד שבקושי נראים לעין.
יתר על כן, מומלץ לבצע ספירת תאים בתא ספירת תאים לפני צנטריפוגה ולפני ואחרי סינון כדי לזהות אובדן תאים אפשרי עקב הסרת supernatant תת-אופטימלי. אם יש לטהר את ההשעיה הסופית של תא בודד, ניתן להשתמש ב- FACS. מיון תאים מאפשר לא רק להסיר פסולת או תאים מתים, אלא חשוב מאפשר להעשיר את ההשעיה הסופית עם תאים בעלי תווית פלואורסצנטית13,19. כדי למנוע מתח גזוז או סתימה של סדרן התא, זרבובית רחבה (85 מיקרומטר או 100 מיקרומטר) משמש. זה ישפר עוד יותר את הכדאיות של התאים ממוינים.
טכניקה זו תוכננה ונבדקה הן על עכבר והן על שיניים אנושיות. הגורם המגביל העיקרי הוא מספר קטן של תאים בפעימות השיניים המופחתות של השיניים של עכברים מבוגרים (שיניים שיניים) ובני אדם. נניח שיש להשיג מספר גדול יותר של תאים או לרכוש תאים משיניהם של חולים מבוגרים יותר. פתרון אפשרי אחד הוא לעבד מספר גבוה יותר של שיניים ולמזג אותם לתוך אצווה אחת, לאחר מכן מעובד כדגימה אחת.
תאים חיים של עיסת שיניים אנושית בודדו לראשונה לפני יותר מעשרים שנה באמצעות תערובת אנזימים של קולגנאז I ו dispase23. מאז, בידודים של תאי עיסת שיניים הפכו מנוצלים נרחב, וכמה טכניקות שימשו 5,6,7,8. המשמעות הקריטית של השיטה המוצגת כאן היא הסתגלות של כל צעדי הבידוד כדי להפוך את הבידוד למהיר ועדין כדי להבטיח את האיכות הגבוהה של השעיית התא הסופי עבור scRNA-seq. תפוקת תאים גבוהה יותר ניתן להשיג על ידי דגירה ממושכת יותר עם אנזימים. פרוטוקול זה מספק פתרון יעיל להשגה מהירה של תאים בודדים מעכבר ושיניים אנושיות באיכות מתאימה לרצף RNA חד-תאי. טכניקה זו צפויה להיות בשימוש נרחב עבור רקמות אחרות או אורגניזמים עם שינויים טכניים קלים בלבד.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על ניגודי עניינים.
Acknowledgments
J.K. נתמך על ידי סוכנות המענקים של אוניברסיטת מסריק (MUNI/H/1615/2018) ובמימון מהפקולטה לרפואה MU לחוקר זוטר. J.L. נתמך על ידי סוכנות המענקים של אוניברסיטת מסריק (MUNI/ IGA/1532/2020) והוא בעל מלגת כישרונות של ברנו - במימון עיריית ברנו סיטי. T.B נתמך על ידי קרן המדע האוסטרית (מענק ליס מייטנר: M2688-B28). אנו מודים ללידה איזקוביץובה הולה ולרוניקה קובאר מאטג'ובה על עזרתם בהשגת שיניים אנושיות. לבסוף, אנו מודים לראדק פדר וקרל סוסק על עזרתם האדיבת במיון FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 0 (0), (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 - Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
