Summary
L'attuale protocollo presenta un metodo veloce, efficiente e delicato per isolare singole cellule adatte per l'analisi RNA-seq a singola cellula da un incisivo di topo in continua crescita, molare di topo e denti umani.
Abstract
I denti di topo e umani rappresentano organi impegnativi per un isolamento cellulare rapido ed efficiente per applicazioni trascrittomiche o di altro tipo. Il tessuto della polpa dentale, ricco di matrice extracellulare, richiede un lungo e noioso processo di dissociazione che è tipicamente oltre il tempo ragionevole per la trascrittomica a singola cellula. Per evitare cambiamenti artificiali nell'espressione genica, il tempo trascorso dall'eutanasia di un animale fino all'analisi delle singole cellule deve essere ridotto al minimo. Questo lavoro presenta un protocollo veloce che consente di ottenere sospensioni monocellulari da denti di topo e umani in una qualità eccellente adatta per scRNA-seq (single-cell RNA-sequencing). Questo protocollo si basa su fasi di isolamento tissutale accelerato, digestione enzimatica e successiva preparazione della sospensione unicellulare finale. Ciò consente un'elaborazione rapida e delicata dei tessuti e consente di utilizzare più campioni animali o umani per ottenere sospensioni cellulari con elevata vitalità e cambiamenti trascrizionali minimi. Si prevede che questo protocollo potrebbe guidare i ricercatori interessati a eseguire lo scRNA-seq non solo sui denti del topo o umani, ma anche su altri tessuti ricchi di matrice extracellulare, tra cui cartilagine, tessuto connettivo denso e derma.
Introduction
Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è un potente strumento per decifrare in vivo la struttura della popolazione cellulare, la gerarchia, le interazioni e l'omeostasi1,2. Tuttavia, i suoi risultati dipendono fortemente dal primo passo di questa analisi avanzata: la preparazione di una sospensione unicellulare di perfetta qualità dal tessuto complesso e ben organizzato. Ciò comprende il mantenimento in vita delle cellule e la prevenzione di cambiamenti artificiali indesiderati nei profili di espressione genica delle cellule3,4. Tali cambiamenti potrebbero portare alla caratterizzazione imprecisa della struttura della popolazione e all'errata interpretazione dei dati raccolti.
Sono stati sviluppati protocolli specifici per l'isolamento da un'ampia gamma di tessuti5,6,7,8. Di solito impiegano la dissociazione meccanica in combinazione con un'ulteriore incubazione con vari enzimi proteolitici. Questi includono tipicamente tripsina, collagenasi, dispasi, papaina6,7,8,9 o miscele enzimatiche disponibili in commercio come Accutase, Tryple, ecc. 5. La parte più critica che influenza la qualità del trascrittoma è la digestione enzimatica. È stato dimostrato che l'incubazione prolungata con enzimi a 37 °C influenza l'espressione genica e provoca la sovraregolazione di molti geni legati allo stress10,11,12,13. L'altro parametro critico del processo di isolamento è la sua lunghezza complessiva, in quanto è stato dimostrato che i trascrittomi cellulari cambiano dopo l'ischemia tissutale14. Questo protocollo presenta un protocollo efficiente per l'isolamento delicato di singole cellule da denti di topo e umani, più veloce di altri protocolli precedentemente utilizzati per l'isolamento di cellule da tessuti complessi5,6,9,11,13,15,16.
Questo protocollo presenta come sezionare rapidamente i tessuti molli dal dente duro e preparare una sospensione unicellulare adatta per scRNA-seq. Questo metodo impiega una sola fase di centrifugazione e minimizza l'effetto di cambiamenti trascrizionali indesiderati riducendo il tempo di manipolazione e digestione dei tessuti e mantenendo il tessuto e le cellule a 4 ° C per la maggior parte del tempo. La procedura mostra l'isolamento delle cellule da incisivi di topo, molari e denti del giudizio umani come esempio, ma principalmente dovrebbe funzionare per altri denti in vari organismi. Il protocollo completo è visualizzato schematicamente nella Figura 1. Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per generare un atlante di tipo cellulare dentale ottenuto da denti di topo e umani1.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le normative internazionali e locali e approvati dal Ministero dell'Istruzione, della gioventù e dello sport, Repubblica Ceca (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Questo protocollo è stato testato con topi wildtype C57BL/6 e CD-1 maschi e femmine e con topi Sox10::iCreERT2 geneticamente modificati17 (combinati con vari sistemi reporter) su uno sfondo C57BL/6. Gli esperimenti con campioni umani sono stati eseguiti con l'approvazione dei Comitati per l'Etica della Facoltà di Medicina, Dell'Università Masaryk di Brno e dell'Ospedale della Facoltà di Sant'Anna a Brno, Repubblica Ceca.
1. Impostazione sperimentale e preparazione delle soluzioni
- Configurazione dello strumento
- Raffreddare la centrifuga a 4 °C.
- Riscaldare la camera di incubazione a 37 °C.
- Avviare la macchina FACS (Fluorescence-activated cell sorting) e impostare tutte le temperature della selezionatrice (incluso il supporto del tubo di raccolta) a 4 °C. Eseguire il controllo di qualità dello strumento, impostare il ritardo di caduta.
- Impostare la strategia di gating preliminare ed eseguire l'ordinamento dei test.
NOTA: quando si utilizza FACS, utilizzare l'ugello da 100 μm.
- Preparare le soluzioni (passaggi 1.2.1-1.2.3).
- Soluzione di lavaggio: Preparare fresco 2% FBS (Fetal Bovine Serum) in HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution).
- Miscela di digestione: Preparare la collagenasi P fresca (3 U/mL) completamente disciolta in HBSS.
- Opzionale: Preparare HBSS + BSA fresco (0,04%) e raffreddare metanolo di grado analitico in un congelatore a -20 °C per conservare la sospensione monocellulare a -80 °C.
NOTA: il passaggio 1 deve essere eseguito prima dell'inizio dell'esperimento. La composizione delle soluzioni utilizzate è riassunta nella Tabella supplementare 1.
2. Preparazione di animali da esperimento e denti umani
- Preparare gli animali da esperimento (topo).
- Eutanasia del mouse secondo le normative locali; ad esempio per sovradosaggio di anestetici come descritto in precedenza1.
ATTENZIONE: Le normative per l'eutanasia umana degli animali da esperimento variano localmente. Segui sempre le normative locali valide. - Procedere immediatamente alla fase di dissezione del tessuto (passaggio 3).
NOTA: se il tessuto degli animali da esperimento non può essere sezionato immediatamente (ad esempio, a causa del trasferimento dalla struttura di stabulazione degli animali), posizionare gli animali da esperimento sul ghiaccio ed eseguire la dissezione dei tessuti il prima possibile. Per ottenere più cellule dalle polpe molari del topo, utilizzare animali più giovani (6 settimane e meno). Con l'aumentare dell'età, la dimensione della polpa dentale diminuisce. Gli incisivi di topo mantengono per lo più la loro struttura con l'aumentare dell'età, quindi gli animali di varie età possono essere utilizzati per la dissezione dei tessuti.
- Eutanasia del mouse secondo le normative locali; ad esempio per sovradosaggio di anestetici come descritto in precedenza1.
- Preparare il dente umano
NOTA: I denti umani sono stati estratti per un motivo clinicamente rilevante. Ogni diagnosi è stata trattata individualmente e un chirurgo dentale esperto ha sempre eseguito l'estrazione del dente.- Mettere immediatamente il dente appena estratto in un tubo da 50 ml con HBSS ghiacciato e mantenere il tubo su ghiaccio fino a un'ulteriore lavorazione.
NOTA: L'uso di denti del giudizio trattenuti dai pazienti fino all'età di 25-30 anni è raccomandato per la massima resa cellulare.
- Mettere immediatamente il dente appena estratto in un tubo da 50 ml con HBSS ghiacciato e mantenere il tubo su ghiaccio fino a un'ulteriore lavorazione.
3. Dissezione dei tessuti
- Tieni l'animale sperimentale dietro la testa, guardando l'aspetto ventrale della sua testa in modo che la coda punti via.
- Usando forbici piccole e affilate, rimuovere rapidamente la pelle dalla mandibola per esporre l'arco mandibolare, il tessuto molle tra ogni metà delle mandibole e i muscoli facciali adiacenti.
- Fai un taglio profondo da ciascun lato della mandibola; in primo luogo, attraverso m. masseter lungo il lato buccale della mandibola fino all'articolazione temporo-mandibolare, e poi lungo la parte interna di ciascuna metà della mandibola attraverso la base della cavità orale (vedi Figura supplementare 1).
- Tagliare tutti i muscoli e i legamenti lungo la mandibola fino all'articolazione temporo-mandibolare sia dall'esterno che dall'interno del cavo orale.
NOTA: Evitare di tagliare le ossa. Ciò potrebbe danneggiare la parte più apicale dell'incisivo. - Afferrare la mandibola usando una pinzetta a punta piegata e rimuoverla. Quindi, dividere la mandibola sezionata in due metà con le forbici tagliando la sinfisi mandibolare (vedere Figura supplementare 1).
- Utilizzare una salvietta industriale a bassa lanugine per sfregare il tessuto molle rimanente da ciascuna metà della mandibola. Dopo aver pulito entrambe le parti della mandibola, metterle in una capsula di Petri pre-preparata con HBSS ghiacciato.
NOTA: Da questo punto in poi, lavora sul ghiaccio. Un'ulteriore dissezione di incisivi e molari di topo viene eseguita sotto uno stereomicroscopio con uno sfondo nero. - Incisivi mandibolari di topo
- Per la dissezione degli incisivi mandibolari, rimuovere la cresta alveolare con tutti e tre i molari e rompere trasversalmente l'arco mandibolare nel punto corrispondente alla posizione tra il primo e il secondo molare.
NOTA: Per eseguire questo passaggio vengono utilizzati una lama affilata per bisturi n. 11 e una pinzetta (vedere Tabella dei materiali). - Estrarre con attenzione l'incisivo dal resto della presa dentale.
NOTA: In caso di successo, l'incisivo estratto conterrà parti apicali intatte, incluso il tessuto epiteliale con anse cervicali complete. - Se necessario, rimuovere i restanti frammenti di osso ancora attaccati all'incisivo con una pinzetta e un bisturi.
- Posizionare gli incisivi sezionati in HBSS fresco e ghiacciato e sezionare il tessuto di interesse: ansa cervicale, polpa dentale o altre parti del dente.
- Posizionare il tessuto molle sezionato in una goccia di HBSS fresco e ghiacciato nel mezzo di una capsula di Petri di 10 cm. Continua sul ghiaccio.
- Per la dissezione degli incisivi mandibolari, rimuovere la cresta alveolare con tutti e tre i molari e rompere trasversalmente l'arco mandibolare nel punto corrispondente alla posizione tra il primo e il secondo molare.
- Molari mandibolari di topo
- Per sezionare i molari mandibolari, rimuovere completamente la cresta alveolare dal resto della mandibola usando una lama di bisturi.
- Spostare la cresta alveolare sezionata in HBSS fresco e ghiacciato in una capsula di Petri e rimuovere con cura tutti i frammenti rimanenti di ossa alveolari attaccate alle radici.
- Posizionare i molari sezionati senza osso alveolare in HBSS fresco e ghiacciato. Per esporre la polpa, iniziare a rimuovere parti della dentina dal lato apicale usando pinzette a punta fine e affilata fino a raggiungere la cavità della polpa.
- Una volta raggiunta la cavità della polpa, sezionare attentamente la polpa dentale usando un paio di pinzette a punta affilata e posizionare il tessuto molle della polpa dentale in una goccia di HBSS fresco e ghiacciato nel mezzo di una capsula di Petri di 10 cm tenuta sul ghiaccio.
NOTA: Poiché le polpe molari del topo sono estremamente piccole, adattare l'ingrandimento sullo stereomicroscopio di conseguenza.
- Dente umano
- Lavare il dente umano ancora una volta in HBSS ghiacciato per rimuovere il sangue rimanente.
- Posizionare il dente in tre sacchetti di plastica sterili a pareti spesse e utilizzare una morsa da banco in ghisa per rompere il dente. Utilizzare ganasce a morsa con una superficie piana per evitare di penetrare nei sacchetti.
- Stringere lentamente la morsa fino a quando non si sente il dente screpolarsi; rimuoverlo dai sacchetti e metterlo in HBSS fresco e ghiacciato in una capsula di Petri.
- Usando due pinzette, estrarre la polpa dentale, pulirla da tutti i resti di tessuto duro e metterla in una goccia di HBSS ghiacciata nel mezzo di una capsula di Petri di 10 cm tenuta sul ghiaccio.
ATTENZIONE: il tessuto umano potrebbe potenzialmente essere infettivo. Quando si lavora con tessuto umano, utilizzare dispositivi di protezione per evitare il contatto diretto con il tessuto.
4. Preparazione della sospensione monocellulare
- Preparare un tubo da 15 mL con 2,5 mL di miscela di digestione composta da Collagenasi P (3 U/mL) completamente disciolta in HBSS. Tenere la soluzione sul ghiaccio fino all'uso.
NOTA: Utilizzare sempre collagenasi P preparata al momento; non congelare le aliquote. L'attività della collagenasi P varia da lotto a lotto. Controllare l'attività del lotto prima di diluire. La collagenasi P è attivata dal calcio, la cui quantità è già sufficiente nella polvere liofilizzata. Pertanto, non è necessario arricchire la miscela enzimatica con il calcio. La collagenasi P non è inattivata da FBS ma può essere inattivata da agenti chelanti (ad esempio, Etilendiamminotetraacetico - EDTA). L'arresto del processo di dissociazione è assicurato diluendo la collagenasi P in soluzione di lavaggio (2% FBS in HBSS). È stato dimostrato che l'aggiunta di FBS aumenta la vitalità cellulare e il numero finale di cellule dopo lo smistamento18. - Usando una lama di bisturi di forma rotonda n. 10, tagliare il tessuto in tutte le direzioni nei pezzi più piccoli possibili. Riaggregare i pezzi di tessuto nel mezzo della goccia e tagliare ripetutamente gli aggregati di tessuto usando una lama di bisturi di forma rotonda (n. 10). Ripetere questo processo più volte fino a quando il materiale non è sufficientemente tritato.
- Trasferire i pezzi di tessuto triturato utilizzando una punta di pipetta da 1 mL nella miscela di digestione preparata.
NOTA: Nel caso di un numero maggiore di animali in lavorazione contemporaneamente, dividere il tessuto in più tubi con collagenasi P. La quantità massima per tubo sono polpe ottenute da circa 10 incisivi di topo. Nel caso dei molari, dove le polpe sono molto più piccole, il numero di polpe lavorate può essere aumentato adeguatamente. Quando si usano denti umani, utilizzare un massimo di 2-3 polpe per tubo, a seconda delle dimensioni della polpa. - Posizionare il tubo in un incubatore preriscaldato a 37 °C con uno shaker. Inclinare il tubo all'interno dello shaker ad un angolo di 60° e impostare la velocità a 150-200 giri/min per garantire movimenti di sospensione costanti all'interno del tubo.
- Triturare vigorosamente la sospensione ogni 3-4 minuti con una punta di pipetta da 1 mL per disintegrare tutti i grumi.
NOTA: Con il tempo, i ciuffi diventeranno più piccoli e più morbidi fino a quasi scomparire. - In totale, incubare per 15-20 min. Alla fine dell'incubazione, triturare per l'ultima volta, quindi aggiungere lentamente la soluzione di lavaggio ghiacciata a un volume finale di 12 ml.
- Rimuovere i rimanenti grumi o pezzi di tessuto calcificato filtrando la sospensione utilizzando un filtro cellulare da 50 μm.
- Prendere 10-20 μL della sospensione cellulare filtrata e contare le cellule durante la centrifugazione utilizzando una camera di conteggio delle cellule (emocitometro). Centrifugare per 5 min a 300 x g a 4 °C. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml.
NOTA: se il numero di celle è limitato che non può essere contato in sospensione diluita, ignorare il conteggio delle celle e utilizzare tutte le celle per un'ulteriore elaborazione. - Facoltativo: procedere per la fissazione e l'archiviazione21.
- Sospendere nuovamente il pellet (fino a 107 celle) in 100 uL di HBSS + BSA (0,04%).
- Aggiungere 400 μL di metanolo refrigerato e mescolare lentamente.
- Incubare la sospensione cellulare per 15 minuti sul ghiaccio.
- Conservare a -80 °C fino a quando non viene lavorato (non più di 1 mese).
- Sospendere nuovamente il pellet nella soluzione di lavaggio. Puntare a 700-1200 celle/μL della soluzione di lavaggio.
- Tenere il tubo sul ghiaccio fino a un'ulteriore lavorazione.
NOTA: Se necessario, eseguire la fissazione e lo stoccaggio a -80 °C. Tuttavia, si raccomanda l'elaborazione immediata della sospensione cellulare per scRNA-seq. Ulteriori passaggi dipenderanno in base al protocollo seq dell'RNA a singola cellula. Quando il protocollo scRNA-seq utilizza un sistema microfluidico (alcune aziende sc-RNA-seq lo fanno), caricare le celle in base alle linee guida del produttore direttamente o dopo la selezione delle cellule. - Per FACS, procedere al passaggio 5.
5. Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)
- Prima di ordinare, preparare lo strumento di selezione delle cellule.
- Raffreddare l'intero sistema a 4 °C, eseguire il controllo qualità dello strumento, impostare il ritardo di caduta e la tensione delle piastre di deflessione. Inserire i tubi di raccolta nel supporto del tubo di raccolta.
NOTA: per evitare ulteriori fasi di centrifugazione con conseguente inevitabile perdita di cellule, ordinare le cellule in un microtubo (1,5 ml) con una piccola quantità (25-50 μL) della soluzione di lavaggio.
- Raffreddare l'intero sistema a 4 °C, eseguire il controllo qualità dello strumento, impostare il ritardo di caduta e la tensione delle piastre di deflessione. Inserire i tubi di raccolta nel supporto del tubo di raccolta.
- Opzionale: eseguire la colorazione di viabilità prima del FACS.
- Aggiungere lo ioduro di propidio in sospensione cellulare prima del FACS a una concentrazione finale di 0,5 μg/mL e incubare per 15 minuti a 4 °C.
- Caricare il campione nel selezionatore di celle. Imposta una rigorosa strategia di gating per rimuovere detriti cellulari, doppietti e cellule morte. Ordinare le celle in un tubo preparato o piastre multi-pozzo. Un esempio di strategia di gating è mostrato nella Figura 2.
NOTA: per ridurre al minimo i passaggi di manipolazione e accelerare il protocollo, si consiglia di applicare una rigorosa strategia di gating (suggerita nella Figura 2) anziché utilizzare una colorazione di fattibilità. Per separare le cellule immunitarie dalla popolazione isolata, è possibile eseguire la colorazione degli anticorpi CD45. Per eseguire ciò, sospendere la sospensione cellulare in 100 μL di soluzione colorante (PBS + 2% FBS + anticorpo coniugato anti-CD45-APC diluizione 1/100). Incubare per 15 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce ed eseguire direttamente FACS.
Representative Results
L'isolamento esemplare di singole cellule è stato eseguito da due incisivi mandibolari di un maschio di topo C57BL/6 di 6 settimane. Seguendo questo protocollo, è stata preparata una sospensione a singola cellula e, successivamente, è stato eseguito il sequenziamento a singola cellula. La sospensione monocellulare preparata è stata analizzata e ordinata utilizzando FACS (Figura 2). In primo luogo, è stato applicato il tracciato FSC-A (forward scatter, area) e SSC-A (side scatter, area) ed è stata utilizzata una strategia di gating appropriata per selezionare una popolazione con dimensioni e granularità previste per filtrare i detriti cellulari e i doppietti o aggregati cellulari (Figura 2A). Questa popolazione selezionata (P1), che conta il 38% di tutti gli eventi, è stata ulteriormente utilizzata e sono stati applicati i parametri FSC-A e FSC-H (forward scatter, height) per rimuovere i doppini cellulari rimanenti (Figura 2B). La popolazione senza doppietti cellulari (P2) che conta il 95% di P1 può essere successivamente utilizzata per scRNA-seq. In alternativa, è possibile utilizzare ulteriori gating per selezionare la popolazione di interesse (ad esempio, espressione di proteine fluorescenti o colorazione viva / morta). Per verificare il numero di cellule vive/morte nella sospensione finale, è stata eseguita la colorazione PI (ioduro di propidio) (Figura 2C). La popolazione P3 contenente cellule PI- (viventi) era il 98,4% della popolazione P2 madre e il 35,5% degli eventi totali. Il numero totale di cellule filtrate e morte (PI+) era 1887.
Il numero finale di cellule ottenute senza colorazione di vitalità adatta per RNA-seq (P2) contava 118.199 cellule da due polpe incisive di topo. Ciò significa il numero di quasi 60.000 cellule viventi da un incisivo mandibolare.
Per chiarire il numero di cellule immunitarie nella sospensione finale a singola cellula, sono stati utilizzati due approcci. In primo luogo, sono state utilizzate la colorazione degli anticorpi CD45 e la successiva analisi FACS. Come metodo complementare, è stato analizzato il numero totale di cellule immunitarie (CD45+) nei dati scRNA-seq. L'analisi FACS ha mostrato il 14,44% delle cellule CD45+ (13,20% vive e 1,24% morte) (Figura 3A). L'analisi dei dati scRNA-seq ha mostrato il 10,90% delle cellule che esprimono CD45 (Figura 3B). La diminuzione delle cellule CD45+ nei dati scRNA-seq può essere causata da una soglia aggiuntiva durante l'analisi scRNA-seq.
Questi dati rappresentativi sull'esempio dell'incisivo di topo mostrano che il protocollo dato in combinazione con una rigorosa strategia di gating è efficiente nell'ottenere un numero elevato di cellule da un singolo dente di topo senza la necessità di un ulteriore uso della colorazione di vitalità. Il rapporto tra le cellule immunitarie (CD45+) è stato minore (13,2%). Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che le cellule immunitarie sono essenziali per mantenere l'omeostasi dentale, quindi rimuoverle dall'analisi scRNA-seq durante il FACS sarebbe controproducente in alcune applicazioni.
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo. Diversi passaggi, comprese le condizioni di temperatura e il tempo previsto, sono rappresentati per preparare la sospensione monocellulare da denti di topo e umani. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempio della strategia di gating. Il gating FSC-A e SSC-A è stato utilizzato per produrre il gate P1, riflettendo la popolazione cellulare con dimensioni e granularità previste e filtrando i detriti della matrice cellulare ed extracellulare e la maggior parte degli eventi di grandi dimensioni (A). Successivamente, la popolazione P1 è stata tracciata in FSC-H e FCS-A plot, che ha filtrato i doppietti cellulari (B). Questa popolazione P2 è stata poi analizzata per la presenza di cellule morte da ioduro di propidio (C). Il numero di eventi/celle per gate è rappresentato in (D). (FSC-A - dispersione in avanti, area; SSC-A - dispersione laterale, area; FSC-H - dispersione in avanti, altezza; PI - ioduro di propidio). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione delle cellule immunitarie. La quantificazione delle cellule immunitarie è stata eseguita mediante analisi FACS di cellule colorate con anticorpo anti-CD45 e analisi Live/Dead utilizzando la colorazione dello ioduro di propidio (A). Un'ulteriore quantificazione delle cellule immunitarie è stata eseguita durante l'analisi scRNA-seq (B). (CD45-APC - anticorpo coniugato allococianina anti-CD45; PI - ioduro di propidio; t-SNE - t-distributed stochastic neighbor embedding). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Panoramica del processo di dissezione della mandibola. Le linee tratteggiate illustrano i tagli suggeriti. ATM - articolazione temporo-mandibolare, m. masseter - massetere muscoloso. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: Le composizioni delle soluzioni utilizzate nello studio. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Discussion
Studiare denti e ossa a livello cellulare o molecolare è generalmente impegnativo poiché le cellule che formano questi tessuti sono circondate da diversi tipi di matrici dure19. Uno degli obiettivi principali per l'esecuzione di RNA-seq unicellulare sul tessuto dentale è la necessità di ottenere cellule di interesse velocemente e senza cambiamenti artificiali nei loro trascrittomi. Per raggiungere questo obiettivo, è stato sviluppato un protocollo altamente efficiente adatto per isolare le cellule dalle polpe dei denti di topo e umani, che consente una rapida generazione di sospensioni monocellulari per tutte le applicazioni trascrittomiche. Ciò è stato garantito da un rapido isolamento dei tessuti, riducendo al minimo le fasi delle manipolazioni tissutali e cellulari e semplificando la digestione meccanica ed enzimatica.
Le fasi più critiche di questo protocollo sono la rapida elaborazione dei tessuti e un'adeguata preparazione della sospensione unicellulare8,9. Un approccio manuale viene utilizzato per ottenere polpe dentali senza utilizzare un trapano dentale o altri dispositivi che generano calore. Il surriscaldamento può causare un'espressione artificiale di proteine da shock termico e altri geni, portando in ultima analisi i modelli di espressione genica analizzati a non essere rappresentativi del tessuto originale20. La raccolta manuale dei tessuti può essere un passo impegnativo che probabilmente richiederà un po 'di allenamento in anticipo. La polpa viene quindi tagliata a pezzetti e digerita enzimaticamente a 37 °C. Ad eccezione dei 15-20 minuti di digestione enzimatica, l'intero protocollo viene eseguito a 4 °C. L'elaborazione tissutale e in particolare la digestione enzimatica sono state ridotte al minimo possibile poiché un'incubazione più prolungata a 37 °C può causare cambiamenti nei modelli di espressione genica10. La rimozione meccanica della dentina è raccomandata prima della digestione enzimatica. La dentina e la predentina attaccata alla polpa contengono una grande quantità di collagene e la sua eccessiva presenza potrebbe ridurre l'efficacia della soluzione digestiva. Dopo essere state rimosse dal corpo (o la morte degli organismi), è stato dimostrato che le cellule iniziano a modificare rapidamente i loro modelli di espressione genica12. Pertanto, l'isolamento e l'elaborazione delle cellule dovrebbero essere eseguiti il più velocemente possibile. L'attuale protocollo riduce il tempo di lavorazione a 35-45 minuti dall'isolamento del tessuto (animale eutanasizzante) alla preparazione della sospensione unicellulare.
Una modifica alternativa di questa tecnica è la conservazione cellulare per un uso successivo. Ciò si ottiene mediante fissazione del metanolo. La sospensione a celle fisse a metanolo può essere conservata fino a 1 mese a -80 °C, come descritto nel protocollo21. Tuttavia, quando possibile, eseguire scRNA-seq direttamente, poiché è stato dimostrato che i dati a singola cellula provenienti da sospensioni monocellulari fissate a metanolo potrebbero soffrire di una maggiore espressione di geni legati allo stress e contaminazione con RNA ambiente22. Questo passaggio potrebbe richiedere ulteriori modifiche in base ai protocolli del produttore.
Prima della prima applicazione di questo protocollo, si consiglia di eseguire diversi passaggi di convalida per testare la tecnica. Dalla nostra esperienza, suggeriamo di testare i suddetti passaggi critici del protocollo. Inoltre, suggeriamo di testare l'efficacia della soluzione di collagenasi P e di testare la gestione della fase di dissociazione dei tessuti. In particolare, intorno ai primi 5 minuti dopo l'inizio dell'incubazione della collagenasi P, i pezzi di tessuto dovrebbero aggregarsi insieme. Questa è una situazione comune. Gli aggregati vengono disintegrati ogni 3-4 minuti usando una pipetta da 1 mL e, con l'aumentare del tempo, dovrebbero diventare più piccoli fino a quando non sono appena visibili.
Inoltre, si raccomanda di eseguire il conteggio cellulare in una camera di conteggio cellulare prima della centrifugazione e prima e dopo il filtraggio per rilevare possibili perdite cellulari dovute alla rimozione di surnatante non ottimale. Se la sospensione monocellulare finale deve essere purificata, è possibile utilizzare FACS. Lo smistamento cellulare consente non solo di rimuovere detriti o cellule morte, ma soprattutto di arricchire la sospensione finale con celle marcate fluorescente13,19. Per evitare lo stress da taglio o l'intasamento della selezionatrice cellulare, viene utilizzato un ampio ugello (85 μm o 100 μm). Ciò migliorerà ulteriormente la vitalità delle cellule selezionate.
Questa tecnica è stata progettata e testata sia su denti di topo che umani. Il principale fattore limitante è il piccolo numero di cellule nelle polpe dentali ridotte dei denti dei topi più anziani (molari) e degli esseri umani. Supponiamo che sia necessario ottenere un numero maggiore di cellule o che le cellule dei denti dei pazienti più anziani debbano essere acquisite. Una possibile soluzione è quella di elaborare un numero maggiore di denti e unirli in un unico lotto, successivamente elaborato come un unico campione.
Le cellule viventi della polpa dentale umana sono state isolate per la prima volta più di vent'anni fa utilizzando una miscela enzimatica di collagenasi I e dispase23. Da allora, gli isolamenti delle cellule della polpa dentale sono diventati ampiamente utilizzati e sono state utilizzate diverse tecniche5,6,7,8. Il significato critico del metodo qui presentato è l'adattamento di tutte le fasi di isolamento per rendere l'isolamento veloce e delicato per garantire l'alta qualità della sospensione cellulare finale per scRNA-seq. Una maggiore resa cellulare può essere ottenuta mediante un'incubazione più prolungata con enzimi. Questo protocollo fornisce una soluzione efficiente per ottenere rapidamente singole cellule da denti di topo e umani di qualità adeguata per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Questa tecnica dovrebbe essere ampiamente utilizzata per altri tessuti o organismi con solo lievi modifiche tecniche.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
J.K. è stato sostenuto dalla Grant Agency della Masaryk University (MUNI/H/1615/2018) e dai fondi della Facoltà di Medicina MU al ricercatore junior. J.L. è stato supportato dalla Grant Agency della Masaryk University, (MUNI/IGA/1532/2020) ed è un Brno Ph.D. Talent Scholarship Holder - Finanziato dal Comune di Brno. T.B. è stato sostenuto dall'Austrian Science Fund (sovvenzione Lise Meitner: M2688-B28). Ringraziamo Lydie Izakovicova Holla e Veronika Kovar Matejova per il loro aiuto nell'ottenimento di denti umani. Infine, ringraziamo Radek Fedr e Karel Soucek per la loro gentile assistenza con lo smistamento FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 0 (0), (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 - Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
