Summary
현재 프로토콜은 지속적으로 성장하는 마우스 절개, 마우스 어금니 및 인간 치아로부터 단세포 RNA-seq 분석에 적합한 단일 세포를 격리하는 빠르고 효율적이며 부드러운 방법을 제시합니다.
Abstract
마우스와 인간의 치아는 단세포 전사 또는 기타 응용 분야를 위한 빠르고 효율적인 세포 격리를 위한 도전적인 기관을 나타냅니다. 세포 외 매트릭스가 풍부한 치과 펄프 조직은 일반적으로 단일 세포 전사학에 대한 합리적인 시간을 초과하는 길고 지루한 해리 과정이 필요합니다. 유전자 발현의 인공적 변화를 피하기 위해, 단일 세포의 분석을 최소화 할 때까지 동물을 안락사에서 경과 시간. 이 작품은 scRNA-seq (단세포 RNA-시퀀싱)에 적합한 우수한 품질로 마우스와 인간의 치아에서 단세포 서스펜션을 얻을 수있는 빠른 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 가속 조직 격리 단계, 효소 소화 및 최종 단일 세포 현탁액의 후속 준비를 기반으로합니다. 이를 통해 조직의 빠르고 부드러운 처리를 가능하게 하며, 생존 가능성이 높고 전사적 변화가 최소화된 세포 현탁액을 얻기 위해 더 많은 동물 또는 인간 샘플을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 또는 인간의 치아뿐만 아니라 연골, 조밀 한 결합 조직 및 진피를 포함한 다른 세포 외 매트릭스가 풍부한 조직에뿐만 아니라 scRNA-seq를 수행하는 데 관심이있는 연구원을 안내 할 수 있습니다.
Introduction
단세포 RNA 시퀀싱은 생체 내 세포 집단 구조, 계층 구조, 상호 작용 및 항상성1,2에서 해독하기 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그 결과는 강하게 이 진보된 분석의 첫번째 단계에 달려 있습니다 - 복잡하고 잘 조직된 조직에서 완벽한 품질의 단세포 현탁액의 준비. 이것은 세포를 살아 있게 하고 세포의 유전자 발현 단면도에 있는 원치 않는, 인공적인 변경을 방지하는 것을 포함합니다3,4. 이러한 변경은 인구 구조의 부정확한 특성화와 수집된 데이터의 오해로 이어질 수 있습니다.
광범위한 조직에서 격리하기 위한 특정 프로토콜이 개발되었습니다5,6,7,8. 그(것)들은 일반적으로 각종 보철 효소와 추가 잠복과 조합하여 기계적인 해리를 채택합니다. 이들은 전형적으로 트립신, 콜라게나아제, 디스파, papain6,7,8,9, 또는 Accutase, Tryple 등과 같은 상업적으로 이용 가능한 효소 혼합물을 포함합니다. 전사 품질에 영향을 미치는 가장 중요한 부분은 효소 소화입니다. 37°C에서 효소를 통한 장기간 배양이 유전자 발현에 영향을 미치고 많은 스트레스 관련 유전자10,11,12,13의 업레귤레이션을 유발하는 것으로 나타났다. 격리 과정의 다른 중요한 매개 변수는 조직 허혈 114 후에 세포 전사가 변화한다는 것을 보여주었기 때문에 전체 길이입니다. 이 프로토콜은 복잡한 조직에서 세포의 격리를 위한 이전에 이용된 프로토콜인 마우스와 인간 치아에서 단일 세포의 부드러운 절연을 위한 효율적인 프로토콜을 제시합니다5,6,9,11,13,15,16.
이 프로토콜은 단단한 치아에서 연조직을 신속하게 해부하고 scRNA-seq에 적합한 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 하나의 원심 분리 단계를 채택하고 조직 처리 및 소화 시간을 줄이고 조직과 세포를 대부분의 시간 4 °C로 유지함으로써 원치 않는 전사 변화의 효과를 최소화합니다. 절차는 예를 들어 마우스 절개, 어금니 및 인간의 사랑 니에서 세포의 분리를 보여 주지만, 주로 다양한 유기체에서 다른 치아를 위해 작동해야합니다. 전체 프로토콜은 그림 1에서 괄호적으로 시각화됩니다. 이 프로토콜은 최근에 마우스와 인간 치아로부터 얻은 치과 세포 유형 아틀라스를 생성하는 데 사용되어 왔다1.
Protocol
모든 동물 실험은 국제 및 지역 규정에 따라 수행되었으며 교육부, 청소년 및 스포츠, 체코 (MSMT-8360/2019-2)의 승인을 받았습니다. MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). 이 프로토콜은 C57BL/6 배경에서 남성과 여성 야생형 C57BL/6 및 CD-1 마우스와 유전자 변형 Sox10:iCreERT2 mice17(다양한 리포터 시스템과 결합)으로 테스트되었습니다. 인간 샘플을 가진 실험은 의학 학부의 윤리위원회의 승인으로 수행되었다, Masaryk 대학 브르노 & 세인트 앤의 교수 병원 브르노, 체코 공화국.
1. 솔루션의 실험 적인 설정 및 준비
- 계측기 설정
- 원심분리기를 4°C로 식힙니다.
- 인큐베이션 챔버를 37°C로 가열합니다.
- 형광 활성화 셀 정렬(FACS) 기계를 시작하고 선별기(수집 튜브 홀더 포함)의 모든 온도를 4°C로 설정합니다. 계측기 품질 관리를 수행하고 낙하 지연을 설정합니다.
- 예비 게이팅 전략을 설정하고 테스트 정렬을 수행합니다.
참고: FACS를 사용하는 경우 100 μm 노즐을 사용합니다.
- 솔루션 준비(1.2.1-1.2.3 단계).
- 세척 용액: HBSS(행크스의 균형 잡힌 소금 용액)에서 신선한 2% FBS(태아 소 세럼)를 준비하세요.
- 소화 혼합물: HBSS에 완전히 용존되는 신선한 콜라게나아제 P(U/mL 3개)를 준비합니다.
- 선택 사항: -80°C에서 단일 셀 서스펜션을 저장하기 위해 -20°C 냉동고에 신선한 HBSS + BSA(0.04%) 및 냉각 분석 등급 메탄올을 준비합니다.
참고: 1단계는 실험이 시작되기 전에 수행해야 합니다. 활용된 솔루션의 구성은 보충표 1에 요약되어 있다.
2. 실험동물/s 및 인간 치아 준비
- 실험 동물 (마우스)을 준비합니다.
- 현지 규정에 따라 마우스를 안락사; 예를 들어, 이전에 설명된 바와 같이 마취과 에 의해 1.
주의: 실험 동물의 인도적인 안락사에 대한 규정은 현지에서 다릅니다. 항상 유효한 현지 규정을 따릅니다. - 즉시 조직 해부 단계 (단계 3)로 진행합니다.
참고: 실험 동물의 조직이 즉시 해부될 수 없는 경우(예: 동물 하우징 시설에서 옮겨짐 에 의한) 실험동물을 얼음 위에 놓고 가능한 한 빨리 조직 해부를 수행한다. 마우스 어금니 펄프에서 더 많은 세포를 얻으려면 더 젊은 (6 주 이하) 동물을 사용하십시오. 나이가 증가함에 따라 치과 펄프의 크기가 감소합니다. 마우스 절개는 주로 나이가 증가함에 따라 구조를 유지하므로 다양한 연령대의 동물을 조직 해부에 사용할 수 있습니다.
- 현지 규정에 따라 마우스를 안락사; 예를 들어, 이전에 설명된 바와 같이 마취과 에 의해 1.
- 인간의 치아 준비
참고: 인간의 치아는 임상적으로 관련된 이유로 추출되었습니다. 모든 진단은 개별적으로 처리되었고, 숙련 된 치과 의사는 항상 치아 추출을 수행했습니다.- 갓 추출한 치아를 얼음으로 차가운 HBSS로 50mL 튜브에 즉시 넣고 추가 처리가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 25-30세까지 환자로부터 유지된 사랑니를 사용하는 것이 가장 높은 세포 수율을 위해 권장됩니다.
- 갓 추출한 치아를 얼음으로 차가운 HBSS로 50mL 튜브에 즉시 넣고 추가 처리가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
3. 조직 해부
- 실험적인 동물을 머리 뒤에 안고 꼬리가 가리키게 되도록 머리의 복부 측면을 바라보세요.
- 작고 날카로운 가위를 사용하여 하악아치, 하악의 각 절반 사이의 연조직 및 인접한 얼굴 근육을 노출시키기 위해 하악에서 피부를 신속하게 제거합니다.
- 하악의 각 면에서 깊은 상처를 만드십시오. 첫째, 하악의 부칼 면을 따라 m. 매스를 통해 구술의 기저부를 통해 하악의 각 절반의 안쪽 부분을 따라 ( 보충 도 1 참조).
- 구강 의 외부와 내부에서 모든 근육과 인대를 구두 의 외부와 내부에서 템포로 만드세요 관절까지 하악을 따라 절단.
참고: 뼈를 자르지 마십시오. 이것은 절개의 가장 중요한 부분을 손상시킬 수 있습니다. - 구부러진 팁 핀셋을 사용하여 하악을 잡고 제거하십시오. 그런 다음 해부된 하악을 하악 심피를 절단하여 가위를 두 부분으로 분할합니다( 보충 도 1 참조).
- 산업용 낮은 보풀 닦기를 사용하여 하악의 각 절반에서 나머지 연조직을 차게하십시오. 하악의 두 부분을 모두 청소한 후, 미리 준비된 페트리 요리에 얼음이 차가운 HBSS를 넣습니다.
참고 : 이 시점에서 앞으로, 얼음에 작업. 마우스 절개와 어금니의 추가 해부는 검은 색 배경이있는 스테레오 현미경으로 수행됩니다. - 마우스 하악 절개
- 하악 절개의 해부를 위해, 세 개의 어금니가 있는 폐포 능선을 제거하고 제1 과 제 2 어어 사이의 위치에 해당하는 장소에서 하악 아치를 횡단하게 균열.
참고: 날카로운 메스 블레이드 11번과 핀셋이 이 단계를 수행하는 데 사용됩니다( 재료표 참조). - 조심스럽게 치과 소켓의 나머지 부분에서 절개를 당겨.
참고: 성공하면 추출된 절개에는 완전한 자궁 경부 루프가 있는 상피 조직을 포함하여 그대로 정골 부분이 포함됩니다. - 필요한 경우 핀셋과 메스로 절개에 부착된 뼈의 나머지 조각을 제거합니다.
- 해부 된 절개를 신선한 얼음 차가운 HBSS에 넣고 관심있는 조직을 해부하십시오 : 자궁 경부 루프, 치과 펄프 또는 치아의 다른 부분.
- 해부된 연조직을 10cm 페트리 접시 중간에 신선한 얼음으로 차가운 HBSS 한방울에 넣습니다. 얼음을 유지합니다.
- 하악 절개의 해부를 위해, 세 개의 어금니가 있는 폐포 능선을 제거하고 제1 과 제 2 어어 사이의 위치에 해당하는 장소에서 하악 아치를 횡단하게 균열.
- 마우스 하악 거어
- 하악 어금니를 해부하기 위해 메스 블레이드를 사용하여 하악의 나머지 부분에서 폐포 능선을 완전히 제거하십시오.
- 해부된 폐포 문장을 페트리 접시에 넣고 신선한 얼음처럼 차가운 HBSS로 옮기고 뿌리에 부착된 폐포 뼈의 나머지 조각을 조심스럽게 제거합니다.
- 폐포 뼈없이 해부 된 어금니를 신선하고 얼음차가운 HBSS에 넣습니다. 펄프를 노출하려면 펄프 캐비티에 도달할 때까지 미세하고 날카로운 팁 핀셋을 사용하여 정성 측에서 덴틴의 일부를 제거하기 시작합니다.
- 펄프 캐비티에 도달하면 날카로운 팁 핀셋을 사용하여 치과 펄프를 조심스럽게 해부하고 치과 펄프의 연조직을 얼음 위에 보관한 10cm 페트리 접시 중간에 신선하고 차가운 HBSS 의 한방울에 넣습니다.
참고: 마우스 어금니 펄프는 매우 작기 때문에, 그에 따라 스테레오 현미경에 배율을 적응.
- 인간의 치아
- 남은 혈액을 제거하기 위해 얼음 차가운 HBSS에서 다시 한 번 인간의 치아를 씻으십시오.
- 치아를 두꺼운 벽으로 된 멸균 비닐 봉지 세 개에 넣고 주철 벤치탑 엔지니어의 바이스를 사용하여 치아를 깨시세요. 평평한 표면의 비스 턱을 사용하여 가방을 관통하지 마십시오.
- 치아가 갈라지는 소리가 들 때까지 비스를 천천히 조입니다. 가방에서 꺼내 페트리 접시에 신선한 얼음 차가운 HBSS에 넣습니다.
- 두 개의 핀셋을 사용하여 치과 펄프를 꺼내 하드 티슈의 모든 잔재에서 청소하고 얼음위에 보관된 10cm 페트리 접시 한가운데에 얼음이 차가운 HBSS 한 방울에 넣습니다.
주의: 인간 조직은 잠재적으로 전염성이 있을 수 있습니다. 인간 조직과 함께 작업 할 때, 조직과의 직접적인 접촉을 피하기 위해 보호 장비를 사용합니다.
4. 단세포 서스펜션 준비
- HBSS에 완전히 용존되는 콜라게나아제 P(3 U/mL)로 구성된 소화 혼합물 2.5mL로 15mL 튜브를 준비한다. 사용 전까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 항상 갓 준비된 콜라게나아제 P를 사용하십시오. 알리쿼트(aliquots)를 동결하지 마십시오. 콜라게나아제 P 활동은 배치마다 다릅니다. 희석하기 전에 일괄 처리의 활동을 확인합니다. 콜라게나아제 P는 칼슘에 의해 활성화되며, 그 양은 이미 lyophilized 분말에 충분합니다. 따라서 효소 믹스를 칼슘과 농축할 필요가 없습니다. 콜라게나아제 P는 FBS에 의해 비활성화되지 않지만 킬라팅 에이전트에 의해 비활성화 될 수 있습니다 (예를 들어, 에틸렌디아민테트라세틱 - EDTA). 해리 공정을 중지하면 콜라게나아제 P 인 워시 용액(HBSS의 2%FBS)을 희석하여 보장됩니다. FBS를 추가하면 셀 생존가능성과 정렬 후 최종 셀 수가 증가하는 것으로 나타났습니다18. - 둥근 모양의 메스 블레이드 10번을 사용하여 조직을 가능한 가장 작은 조각으로 자른다. 물방울 의 중간에 있는 조직 조각을 재집계하고 둥근 모양 (10 번) 메스 블레이드를 사용하여 조직 응고를 반복적으로 잘라냅니다. 재료가 충분히 다진 때까지 이 과정을 여러 번 반복합니다.
- 1mL 파이펫 팁을 사용하여 분쇄된 조직 조각을 준비된 소화 혼합물로 옮킨다.
참고: 한 번에 처리되는 동물의 더 많은 수의 경우, 콜라게나아제 P와 여러 튜브로 조직을 분할. 튜브 당 최대 금액은 약 10 마우스 절개에서 얻은 펄프입니다. 펄프가 훨씬 작은 어금니의 경우 가공 펄프의 수를 적절하게 늘릴 수 있습니다. 인간의 치아를 사용하는 경우 펄프 크기에 따라 튜브 당 최대 2-3 펄프를 사용하십시오. - 튜브를 셰이커로 예열된 인큐베이터에 넣습니다. 셰이커 내부의 튜브를 60°각도로 기울이고 속도를 150-200 rpm으로 설정하여 튜브 내부의 일정한 서스펜션 움직임을 보장합니다.
- 모든 덩어리를 분해하기 위해 3-4 분마다 서스펜션을 1 mL 파이펫 팁으로 적극적으로 세리세울 수 있습니다.
참고: 시간이 지남에 따라 덩어리가 거의 사라질 때까지 더 작고 부드러워집니다. - 총 15-20 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션이 끝나면 마지막으로 세트리튜트한 다음 12mL의 최종 부피에 얼음 냉간 세척 용액을 천천히 추가합니다.
- 50 μm 세포 스트레이너를 사용하여 현탁액을 필터링하여 석회화 된 조직의 나머지 덩어리 또는 조각을 제거하십시오.
- 여과 된 세포 현탁액의 10-20 μL을 취하고 세포 계수 챔버 (혈류계)를 사용하여 원심 분리 중에 세포를 계산하십시오. 4 °C에서 300 x g 에서 5 분 동안 원심 분리기. 10mL 세로지피펫을 사용하여 상체를 제거합니다.
참고: 희석된 현탁액으로 계산할 수 없는 셀 수가 제한된 경우 셀 계수를 건너뛰고 모든 셀을 사용하여 추가 처리를 합니다. - 선택 사항: 고정 및 저장소21을 진행합니다.
- HBSS + BSA (0.04%)의 100 uL에서 펠릿 (최대 107 세포)을 다시 중단합니다.
- 차가운 메탄올 400 μL을 넣고 천천히 섞습니다.
- 얼음에 15 분 동안 셀 서스펜션을 인큐베이션.
- 처리 될 때까지 -80 °C (더 이상 1 개월 이상)에 보관하십시오.
- 세척 용액에서 펠릿을 다시 놓습니다. 워시 용액의 700-1200 셀/μL을 목표로 합니다.
- 추가 처리될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 필요한 경우 -80°C에서 고정 및 보관을 수행합니다. 그러나 scRNA-seq용 세포 현탁액의 즉각적인 처리가 권장됩니다. 추가 단계는 단세포 RNA seq 프로토콜에 따라 달라집니다. scRNA-seq 프로토콜이 미세 유체 시스템(일부 sc-RNA-seq 회사)을 사용하는 경우, 제조업체의 지침에 따라 세포를 직접 또는 세포 정렬 후 로드합니다. - FACS의 경우 5단계로 진행하십시오.
5. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)
- 정렬하기 전에 셀 정렬 기기를 준비합니다.
- 전체 시스템을 4°C로 냉각시키고, 계측기 품질 관리를 수행하고, 낙하 지연 및 편향 플레이트의 전압을 설정합니다. 수집 튜브 홀더에 수집 튜브를 넣습니다.
참고: 불가피한 세포 손실로 인한 추가 원심 분리 단계를 피하기 위해 세척 용액의 소량(25-50 μL)을 사용하여 셀을 마이크로튜브(1.5mL)로 정렬합니다.
- 전체 시스템을 4°C로 냉각시키고, 계측기 품질 관리를 수행하고, 낙하 지연 및 편향 플레이트의 전압을 설정합니다. 수집 튜브 홀더에 수집 튜브를 넣습니다.
- 선택 사항: FACS 전에 생존 가능성 염색을 수행합니다.
- FACS 전에 세포 현탁액에 프로피듐 요오드를 최종 농도 0.5 μg/mL에 넣고 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 샘플을 셀 선별기에 로드합니다. 세포 파편, 이중 및 죽은 세포를 제거하기 위해 엄격한 게이팅 전략을 설정합니다. 세포를 준비된 튜브 또는 다중 웰 플레이트로 정렬합니다. 게이팅 전략의 예는 그림 2에 표시됩니다.
참고: 조작 단계를 최소화하고 프로토콜을 가속화하려면 생존 가능성 염색을 사용하는 대신 엄격한 게이팅 전략을 적용하는 것이 좋습니다( 그림 2에서 제안). 면역 세포를 분리하는 것은 분리된 집단으로부터, CD45 항체 염색을 수행할 수 있다. 이를 수행하기 위해, 염색 용액의 100 μL에서 세포 현탁액을 다시 중단 (PBS + 2 % FBS + 안티 CD45-APC 공액 항체 1/100 희석). 빛으로부터 보호된 얼음에 15분 동안 배양하고 FACS를 직접 수행합니다.
Representative Results
단일 세포의 모범적 격리는 6주 된 C57BL/6 마우스 남성으로부터 두 개의 하악 절개로부터 수행되었다. 이 프로토콜에 따라 단일 셀 서스펜션이 준비되었고, 그 후 단일 셀 시퀀싱이 수행되었다. 제조된 단세포 현탁액은 FACS(그림 2)를 사용하여 분석 및 분류하였다. 첫째, FSC-A(전방 산란, 면적) 및 SSC-A(측면 산란, 영역) 플롯이 적용되었고, 적절한 게이팅 전략이 우리의 세포 파편 및 세포 이중 또는 골재를 필터링하기 위해 예상되는 크기와 세분성을 가진 인구를 선택하는 데 사용되었다(그림 2A). 이러한 선택된 인구(P1)는 모든 이벤트의 38%를 계산하고, 추가로 사용되었고, FSC-A 및 FSC-H(전방 산란, 높이) 파라미터가 나머지 셀 더블릿(그림 2B)을 제거하기 위해 적용되었다. P1의 95%를 계산하는 세포 이중(P2)이 없는 인구는 이후에 scRNA-seq에 사용될 수 있다. 대안적으로, 추가 게이팅은 관심의 인구를 선택하는 데 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 형광 단백질 또는 살아있는 / 죽은 염색의 발현). 최종 현탁액에서 라이브/데드 셀의 수를 확인하기 위해 PI(프로피듐 요오드) 염색이 수행되었다(도 2C). PI- (생활) 세포를 포함하는 P3 인구는 부모 P2 인구 중 98.4%, 전체 이벤트 중 35.5%였다. 필터링된 총 수의 죽은(PI+) 셀은 1887개였다.
RNA-seq(P2)에 적합한 생존력 스테인링 없이 얻은 세포의 최종 수는 두 개의 마우스 절개 펄프로부터 118,199개의 세포를 계산하였다. 이것은 한 하악 절개에서 거의 60,000개의 살아있는 세포의 수를 의미합니다.
최종 단세포 현탁액에서 면역 세포의 수를 명확히하기 위해 두 가지 접근법이 사용되었습니다. 먼저, CD45 항체 염색 및 후속 FACS 분석이 사용되었다. 보완적인 방법으로서, scRNA-seq 데이터에서 면역 세포의 총 수(CD45+)를 분석하였다. FACS 분석은 CD45+ 세포의 14.44%(살아있는 13.20% 및 1.24% 죽은) (그림 3A)를 보여주었습니다. scRNA-seq 데이터의 분석은 CD45 표현 세포의 10.90%를 보였다(도 3B). scRNA-seq 데이터에서 CD45+ 세포의 감소는 scRNA-seq 분석 도중 추가 임계값에 기인할 수 있습니다.
마우스 절개 예에 대한 이러한 대표적인 데이터는 주어진 프로토콜이 엄격한 게이팅 전략과 함께 생존 가능성 염색의 추가 사용없이 단일 마우스 치아에서 많은 수의 세포를 얻는 데 효율적이라는 것을 보여줍니다. 면역(CD45+) 세포의 비율은 미미(13.2%)였다. 더욱이, 면역 세포는 치아 항상성을 유지하는 데 필수적이라는 것을 이전에 보여주었기 때문에 FACS 동안 scRNA-seq 분석에서 제거하는 것은 일부 응용 분야에서 비생산적일 것입니다.
그림 1: 프로토콜의 회로도 표현입니다. 온도 조건 및 예상 시간을 포함하여 다른 단계는 마우스와 인간 치아에서 단세포 서스펜션을 준비하기 위하여 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 게이팅 전략의 예입니다. FSC-A 및 SSC-A 게이팅은 P1 게이트를 생성하기 위해 사용되었으며, 예상되는 크기와 세분성을 가진 세포 집단을 반영하고 세포 및 세포 외 매트릭스 파편 및 대부분의 큰 이벤트(A)를 필터링하였다. 그 후, P1 인구는 FSC-H 및 FCS-A 플롯에서 플롯되었으며, 이는 셀 더블트(B)를 필터링했습니다. 이 P2 인구는 공판요오드(C)에 의해 죽은 세포의 존재를 분석하였다. 게이트당 이벤트/셀 수가 D로 표시됩니다. (FSC-A - 전방 산란, 영역; SSC-A - 측면 산란, 영역; FSC-H - 전방 산란, 높이; PI - 프로피듐 요오드). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 면역 세포의 정량화. 면역 세포의 정량화는 항 CD45 항체로 염색된 세포의 FACS 분석및 항오드 염색(A)을 사용하여 라이브/데드 분석을 수행하였다. 면역 세포의 추가 정량화는 scRNA-seq 분석 (B) 도중 수행되었다. (CD45-APC - 항 CD45 알로피코시아닌 컨쥬게이드 항체; PI - 프로피듐 요오드; t-SNE - t 분산 스토샤스 이웃 포함). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 하악 해부 프로세스의 개요. 대시 라인은 제안 된 컷을 보여줍니다. TMJ - 템포로만디컬 조인트, m. 매스터 - 근육질 매스터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 연구에 사용되는 솔루션의 조성. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
세포 또는 분자 수준에 치아와 뼈를 공부하는 것은 일반적으로 도전이 조직을 형성하는 세포는 하드 matrices19의 다른 종류에 의해 포위되기 때문에 도전적이다. 치과 조직에 단세포 RNA-seq를 수행하기위한 주요 목표 중 하나는 자신의 전사에 인공 적 변화없이 빠르게 관심의 세포를 얻을 필요가있다. 이를 위해 마우스와 인간 치아 펄프에서 세포를 분리하는 데 적합한 매우 효율적인 프로토콜이 개발되어 모든 전사 응용 분야에 대한 빠른 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있습니다. 이것은 빠른 조직 격리에 의해 보장되었다, 조직 과 세포 조작의 단계를 최소화, 기계적 및 효소 소화를 간소화.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 빠른 조직 처리 및 적당한 단세포 현탁액 준비8,9입니다. 수동 접근 방식은 치과 드릴 이나 다른 열 발생 장치를 활용 하지 않고 치과 펄프를 얻기 위해 사용 됩니다. 과열은 열 충격 단백질 및 기타 유전자의 인공 발현을 일으킬 수 있으며, 궁극적으로 분석된 유전자 발현 패턴이 원래 조직을 대표하지 않게 한다20. 수동 조직 수확 가능성이 사전에 몇 가지 훈련이 필요할 것 이다 도전적인 단계 일 수 있습니다. 펄프는 작은 조각으로 잘라 37 °C에서 효소로 소화된다. 효소 소화의 15-20 분 제외, 전체 프로토콜은 4 °C에서 수행된다. 조직 처리 및 특히 효소 소화는 37°C에서 더 장기간 배양되기 때문에 가능한 한 짧은 시간으로 최소화되어 유전자 발현 패턴10의 변화를 일으킬 수 있다. 효소 소화 전에 덴틴을 기계적으로 제거하는 것이 좋습니다. 덴틴과 펄프 부착 된 predentin은 다량의 콜라겐을 함유하고 있으며 과도한 존재는 소화 용액의 효과를 감소시킬 수 있습니다. 신체에서 제거 된 후 (또는 유기체의 죽음), 세포가 유전자 발현 패턴을 신속하게 수정하기 시작하는 것으로 나타났다12. 따라서 셀 격리 및 처리는 가능한 한 빨리 수행되어야 합니다. 현재 프로토콜은 조직을 분리하는 것에서 35-45 분으로 처리 시간을 감소시킵니다 (동물 안락사) 단세포 현탁액을 준비하는.
이 기술의 한 가지 대체 수정은 나중에 사용하기 위한 세포 보존입니다. 이것은 메탄올 고정에 의해 달성된다. 메탄올 고정 셀 현탁액은 프로토콜21에 기재된 바와 같이 -80°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있다. 그러나, 가능하면, 메탄올 고정 단세포 현탁액으로부터의 단일 세포 데이터가 스트레스 관련 유전자의 증가발현과 주변 RNA22의 오염으로 고통받을 수 있음을 보여주었기 때문에, 가능한 한 직접 scRNA-seq를 수행한다. 이 단계에서는 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 수정이 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜의 첫 번째 응용 프로그램 전에 기술을 테스트하려면 여러 유효성 검사 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에서, 우리는 프로토콜의 전술 한 중요한 단계를 테스트하는 것이 좋습니다. 또한 콜라게나아제 P 용액의 효과를 테스트하고 조직 해리 단계의 처리를 테스트하는 것이 좋습니다. 특히, 콜라게나아제 P 배큐베이션이 개시된 후 처음 5분 정도, 조직의 조각이 함께 집계되어야 한다. 이것은 일반적인 상황입니다. 골재는 1mL 파이펫을 사용하여 3-4분마다 분해되며 시간이 증가하면 거의 보이지 않을 때까지 작아져야 합니다.
더욱이, 원심분리 전 및 필터링 전후의 세포 카운팅 챔버에서 세포 계수를 수행하여 최적이 아닌 초중제 제거로 인한 가능한 세포 손실을 검출하는 것이 좋습니다. 최종 단일 셀 서스펜션을 정화해야 하는 경우 FACS를 사용할 수 있습니다. 세포 선별은 파편이나 죽은 세포를 제거할 뿐만 아니라 형광으로 표지된 셀13,19로 최종 현탁액을 풍부하게 할 수 있게 합니다. 전단 응력이나 셀 선별기의 막힘을 피하기 위해 넓은 노즐(85 μm 또는 100 μm)이 사용됩니다. 이것은 정렬 된 세포의 생존가능성을 더욱 향상시킬 것입니다.
이 기술은 마우스와 인간의 치아 모두에서 설계 및 테스트되었습니다. 주요 제한 인자는 오래된 마우스 (어금니) 및 인간의 치아의 감소 된 치과 펄프에서 세포의 작은 수입니다. 더 많은 수의 세포를 얻을 필요가 있거나 더 오래된 환자의 치아로부터 세포를 획득해야한다고 가정합니다. 한 가지 가능한 해결책은 더 많은 수의 치아를 처리하고 단일 배치로 병합한 후 하나의 샘플로 처리되는 것입니다.
인간 치과 펄프의 살아있는 세포는 콜라게나아제 I와 dispase23의 효소 혼합물을 사용하여 20 년 이상 전에 처음으로 격리되었습니다. 그 이후로 치과 펄프 세포의 격리가 널리 활용되었고, 몇몇 기술은 사용되었습니다5,6,7,8. 여기에 제시된 방법의 중요한 중요성은 scRNA-seq에 대한 최종 세포 현탁액의 높은 품질을 보장하기 위해 격리를 빠르고 부드럽게 만드는 모든 격리 단계의 적응입니다. 더 높은 세포 수율은 효소를 가진 더 긴 배양에 의해 얻어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 단세포 RNA-염기서열에 적합한 품질의 마우스와 인간 치아에서 단일 세포를 신속하게 획득하기 위한 효율적인 솔루션을 제공합니다. 이 기술은 단지 약간의 기술적 수정과 다른 조직이나 유기체에 널리 사용될 것으로 예상된다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
J.K.는 마사리크 대학의 보조금 기관 (MUNI / H / 1615/2018)에 의해 지원되었으며, 의학 MU 학부에서 주니어 연구원에 이르기까지 자금을 지원받았습니다. J.L.은 마사릭 대학교 보조금 청(MUNI/IGA/1532/2020)의 지원을 받았으며, 브르노 박사 인재 장학금 소지자입니다- 브르노 시 지방자치단체의 자금 지원. T.B. 오스트리아 과학 기금 (리스 마이트너 보조금: M2688-B28)에 의해 지원되었다. 우리는 라이디 이자코비치바 홀라와 베로니카 코바르 마테호바에게 인간의 치아 획득에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 FACS 정렬에 대한 친절한 지원에 대한 라덱 페더와 카렐 수크에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
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