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Biochemistry

Méthodes spectrophotométriques pour l’étude du métabolisme du glycogène eucaryote

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

Des techniques pour mesurer l’activité des enzymes clés du métabolisme du glycogène sont présentées, à l’aide d’un spectrophotomètre simple fonctionnant dans la plage visible.

Abstract

Le glycogène est synthétisé comme une forme de stockage du glucose par un large éventail d’organismes, allant des bactéries aux animaux. La molécule comprend des chaînes linéaires de résidus de glucose liés α1,4 avec des branches introduites par l’ajout de liaisons α1,6. Comprendre comment la synthèse et la dégradation du glycogène sont régulées et comment le glycogène atteint sa structure ramifiée caractéristique nécessite l’étude des enzymes de stockage du glycogène. Cependant, les méthodes les plus couramment utilisées pour étudier ces activités enzymatiques utilisent généralement des réactifs ou des techniques qui ne sont pas disponibles pour tous les chercheurs. Ici, nous discutons d’une batterie de procédures techniquement simples, rentables et pourtant capables de fournir des informations précieuses sur le contrôle du stockage du glycogène. Les techniques nécessitent l’accès à un spectrophotomètre, fonctionnant dans la plage de 330 à 800 nm, et sont décrites en supposant que les utilisateurs utiliseront des cuvettes en plastique jetables. Cependant, les procédures sont facilement évolutives et peuvent être modifiées pour une utilisation dans un lecteur de microplaques, permettant une analyse hautement parallèle.

Introduction

Le glycogène est largement distribué dans la nature, le composé se trouvant dans les bactéries, de nombreux protistes, champignons et animaux. Dans les micro-organismes, le glycogène est important pour la survie des cellules lorsque les nutriments sont limitatifs et, chez les organismes supérieurs tels que les mammifères, la synthèse et la dégradation du glycogène servent à tamponner les niveaux de glucose sanguin 1,2,3. L’étude du métabolisme du glycogène est donc importante pour des domaines aussi divers que la microbiologie et la physiologie des mammifères. Comprendre le métabolisme du glycogène nécessite d’étudier les enzymes clés de la synthèse du glycogène (glycogène synthase et enzyme ramifiée) et de la dégradation du glycogène (glycogène phosphorylase et enzyme débranchante). Les dosages de référence des activités enzymatiques de glycogène synthase, de phosphorylase, de ramification et de débranchement utilisent des isotopes radioactifs. Par exemple, la glycogène synthase est généralement mesurée dans un essai radiochimique arrêté en suivant l’incorporation du glucose de l’UDP-[14 C]glucose (dans le cas des enzymes animales et fongiques) ou de l’ADP-[14C]glucose (dans le cas des enzymes bactériennes) dans le glycogène 4,5. De même, la glycogène phosphorylase est mesurée dans le sens de la synthèse du glycogène, suite à l’incorporation du glucose de [14C]glucose-1-phosphate dans le glycogène6. L’enzyme ramifiée est dosée en mesurant la capacité de cette enzyme à stimuler l’incorporation du [14 C]glucose du glucose-1-phosphate dans les chaînes liées α1,4 par la glycogène phosphorylase7, et l’activité enzymatique débranchante est déterminée en suivant la capacité de l’enzyme à incorporer [14C]glucose dans le glycogène8 . Bien que très sensibles, permettant leur utilisation dans des extraits cellulaires bruts à faible activité enzymatique, les substrats radioactifs sont coûteux et soumis aux exigences réglementaires liées à l’utilisation de radio-isotopes. Ces obstacles placent l’utilisation de certains tests hors de portée de nombreux travailleurs. Cependant, au cours de nombreuses années, une variété impressionnante d’approches spectrophotométriques pour la mesure de ces enzymes ont été décrites. En général, ces approches reposent en fin de compte sur la mesure de la production ou de la consommation de NADH / NADPH, ou la génération de complexes colorés entre le glycogène et l’iode. Ainsi, ils sont simples et peuvent être réalisés à l’aide de spectrophotomètres simples équipés uniquement de lampes flash au tungstène ou au xénon.

Les dosages spectrophotométriques de la glycogène synthase reposent sur la mesure du diphosphate nucléosidique libéré par le donneur de nucléotides de sucre lorsque le glucose est ajouté à la chaîne de glycogène 9,10 en croissance. La procédure de mesure de l’activité de la glycogène synthase décrite à la section 1 du protocole, ci-dessous, est une modification de celle décrite par Wayllace et coll.11, et le schéma de couplage est illustré ci-dessous :

(Glucose) n + UPD-glucose → (Glucose)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + phosphoénolpyruvate → pyruvate + ATP

Pyruvate + NADH + H+ → Lactate + NAD+

La glycogène synthase ajoute du glucose de l’UDP-glucose au glycogène. L’UDP généré dans ce processus est converti en UTP par nucléoside diphosphate kinase (NDP kinase), dans une réaction qui génère de l’ADP. L’ADP, à son tour, sert ensuite de substrat pour la pyruvate kinase, qui phosphoryle l’ADP en utilisant le phosphoénolpyruvate comme donneur de phosphate. Le pyruvate résultant est converti en lactate par l’enzyme lactate déshydrogénase dans une réaction qui consomme du NADH. Le test peut donc être effectué de manière continue, en surveillant la diminution de l’absorbance à 340 nm lorsque le NADH est consommé. Il est facilement adapté pour une utilisation avec des enzymes qui nécessitent du glucose ADP comme donneur de glucose. Ici, les étapes de couplage sont plus simples puisque l’ADP libéré par l’action de la glycogène synthase est directement agité par la pyruvate kinase.

Il existe une variété de tests spectrophotométriques disponibles pour la détermination de l’activité de la glycogène phosphorylase. Dans la version classique, l’enzyme est poussée vers l’arrière, dans le sens de la synthèse du glycogène, comme indiqué ci-dessous:

(Glucose) n + Glucose-1-phosphate → (Glucose)n+1 + Pi

A intervalles temporels, les aliquotes du mélange réactionnel sont éliminées et la quantité de phosphate libérée est quantifiée12,13. Dans nos mains, ce test a été d’une utilité limitée en raison de la présence de phosphate libre facilement mesurable dans de nombreuses préparations commerciales de glucose-1-phosphate, combinée aux concentrations élevées de glucose-1-phosphate nécessaires à l’action de la phosphorylase. Au lieu de cela, nous avons régulièrement utilisé un test alternatif qui mesure le glucose-1-phosphate libéré lorsque le glycogène est dégradé par la phosphorylase13. Un schéma de réaction couplée, illustré ci-dessous, est utilisé.

(Glucose) n + Pi → (Glucose)n-1 + Glucose-1-phosphate

Glucose-1-phosphate → Glucose-6-phosphate

Glucose-6-phosphate + NADP+ → 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Le glucose-1-phosphate est converti en glucose-6-phosphate par la phosphoglucomutase, et le glucose-6-phosphate est ensuite oxydé en 6-phosphogluconolactone, avec la réduction concomitante du NADP+ en NADPH. La procédure détaillée à la section 2 du protocole, ci-dessous, est dérivée des méthodes décrites par Mendicino et al.14 et Schreiber & Bowling15. Le test peut être facilement effectué de manière continue, avec l’augmentation de l’absorbance à 340 nm au fil du temps, permettant la détermination de la vitesse de réaction.

La détermination spectrophotométrique de l’activité enzymatique débranchante repose sur la mesure du glucose libéré par l’action de l’enzyme sur la phosphorylase limite la dextrine16. Ce composé est fabriqué en traitant le glycogène de manière exhaustive avec de la glycogène phosphorylase. Étant donné que l’action de la glycogène phosphorylase arrête 4 résidus de glucose d’un point de branche α1,6, la dextrine limite contient du glycogène, dont les chaînes externes ont été raccourcies à ~4 résidus de glucose. La préparation de la dextrine limite de phosphorylase est décrite ici, en utilisant une procédure dérivée de celles développées par Taylor et al.17 et Makino & Omichi 18.

Le débranchement est un processus en deux étapes. L’activité de la 4-α-glucanotransférase de l’enzyme débranchante bifonctionnelle transfère d’abord trois résidus de glucose du point de branche à l’extrémité non réductrice d’une chaîne de glucose proche liée α1,4. Le seul résidu de glucose lié à l’α1,6 restant au point de branche est ensuite hydrolysé par l’activité α1,6-glucosidase19. Le test est généralement effectué de manière arrêtée, le glucose libéré après un temps donné (ou une série de fois) étant mesuré dans un dosage enzymatique couplé comme indiqué ci-dessous:

(Glucose) n → (glucose)n-1 + glucose

Glucose + ATP → Glucose-6-phosphate + ADP

Glucose-6-phosphate + NADP+ → 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

La détermination du NADPH produit donne une mesure de la production de glucose. La procédure décrite à la section 3 du protocole, ci-dessous, est basée sur celle décrite par Nelson et al.16. Comme les autres méthodes qui reposent sur la consommation ou la génération de NADH / NADPH, le test est assez sensible. Cependant, la présence d’amylases ou d’autres glucosidases, qui peuvent également libérer le glucose libre de la phosphorylase limite la dextrine, provoquera des interférences importantes (voir Discussion).

La détermination colorimétrique de l’activité enzymatique ramifiée repose sur le fait que les chaînes de glucose liées à l’α1,4 adoptent des structures hélicoïdales qui se lient à l’iode, formant des complexes colorés20. La couleur du complexe formé dépend de la longueur des chaînes liées α1,4. Ainsi, l’amylose, qui consiste en de longues chaînes largement non ramifiées de glucose lié à α1,4, forme un complexe bleu profond avec de l’iode. En revanche, les glycogènes, dont les chaînes externes sont généralement de l’ordre de 6 à 8 résidus de glucose de long, forment des complexes rouge-orangé. Si une solution d’amylose est incubée avec une enzyme ramifiée, l’introduction de branches dans l’amylose entraîne la génération de chaînes de glucose plus courtes liées à α1,4. Ainsi, le maximum d’absorption des complexes amylose/iode se déplace vers des longueurs d’onde plus courtes. La procédure discutée ici est dérivée de celle détaillée par Boyer & Preiss21 et l’activité enzymatique ramifiée est quantifiée comme une réduction de l’absorption du complexe amylose / iode à 660 nm au fil du temps.

Comme il ressort clairement de la discussion ci-dessus, le fait que les couleurs des complexes formés entre les chaînes iodée et α1,4-glucose varient avec la longueur de la chaîne signifie que les spectres d’absorbance des complexes glycogène/iode devraient varier avec le degré de ramification du glycogène. C’est en effet le cas, et les glycogènes moins ramifiés / glycogènes avec des chaînes externes plus longues absorbent la lumière à une longueur d’onde plus longue que les glycogènes qui sont plus ramifiés / ont des chaînes externes plus courtes. La réaction de coloration à l’iode peut donc être utilisée pour obtenir des données qualitatives rapides sur le degré de ramification du glycogène22. La couleur brun orangé se forme lorsque les complexes de glycogène avec de l’iode ne sont pas particulièrement intenses. Cependant, le développement de la couleur peut être amélioré par l’inclusion d’une solution saturée de chlorure de calcium22. Cela multiplie par 10 la sensibilité de la méthode et permet une analyse facile des quantités de microgrammes de glycogène. Le dosage pour la détermination de la ramification décrit à la section 4 du protocole, ci-dessous, est adapté d’une procédure développée par Krisman22. Elle est réalisée simplement en combinant l’échantillon de glycogène avec une solution d’iode et de chlorure de calcium dans une cuvette et en collectant le spectre d’absorption de 330 nm à 800 nm. L’absorbance maximale se déplace vers des longueurs d’onde plus longues à mesure que le degré de ramification diminue.

Collectivement, les méthodes décrites ici fournissent des moyens simples et fiables d’évaluer les activités des enzymes clés du métabolisme du glycogène et d’obtenir des données qualitatives sur l’étendue de la ramification du glycogène.

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Protocol

1. Détermination de l’activité de la glycogène synthase

  1. Préparer les solutions mères des réactifs requis comme indiqué dans le tableau 1 (avant le jour expérimental).
Composant Itinéraire
50 mM Tris pH 8,0 Dissoudre 0,61 g de Tris base dans ~ 80 mL d’eau.  Refroidir à 4 °C.   Ajustez le pH à 8,0 avec HCl et faites le volume jusqu’à 100 mL avec de l’eau.
Tampon HEPES 20 mM Dissoudre 0,477 g de HEPES dans ~ 80 mL d’eau.  Ajustez le pH à 7,0 avec NaOH et portez le volume à 100 mL avec de l’eau.
Tampon 132 mM Tris/32 mM KCl pH 7,8 Dissoudre 1,94 g de Tris base et 0,239 g de KCl dans ~90 mL d’eau.  Ajuster le pH à 7,8 avec HCl et compléter le volume à 100 mL avec de l’eau.
0,8 % p/v de glycogène d’huître Peser 80 mg de glycogène d’huître et ajouter à l’eau.  Faire porter le volume final jusqu’à 10 ml avec de l’eau et réchauffer doucement/mélanger pour dissoudre complètement le glycogène.
100 mM UDP-glucose Dissoudre 0,31 g d’UDP-glucose dans de l’eau et porter le volume final à 1 mL.  Conserver dans des aliquotes, congelées à -20 °C.   Stable pendant plusieurs mois.
50 mM ATP Dissoudre 0,414 g d’ATP dans ~ 13 mL d’eau.  Ajuster le pH à 7,5 avec NaOH et porter le volume à 15 mL avec de l’eau.  Conserver dans des aliquotes congelées à -20 °C.   Stable pendant plusieurs mois.
100 mM glucose-6-phosphate pH 7,8 Dissoudre 0,282 g de glucose-6-phosphate dans ~ 7 à 8 mL d’eau.  Ajustez le pH à 7,8 avec NaOH.  Porter le volume jusqu’à 10 mL avec de l’eau.  Conserver congelé dans des aliquotes à -20 °C.   Stable depuis au moins six mois.
40 mM phosphoénolpyruvate Dissoudre 4 mg de phosphoénolpyruvate dans 0,5 mL de tampon HEPES 20 mM pH 7,0.  Conserver à -20 °C.   Stable pendant au moins 1 semaine.
0,5 M MnCl2 Dissoudre 9,90 g de MnCl2dans un volume final de 100 mL d’eau.
Kinase du NPD Reconstituer la poudre lyophilisée avec suffisamment d’eau pour donner 1 solution U/μl.  Préparer les aliquotes, les congeler dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.   Stable depuis au moins 1 an.

Tableau 1 : Solutions mères requises pour le dosage de l’activité de la glycogène synthase.

  1. Le jour du dosage, préparer une nouvelle solution de travail de 4 mM de NADH en dissolvant 4,5 mg de NADH dans 1,5 mL de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Conserver sur de la glace, à l’abri de la lumière.
  2. Décongeler des solutions mères d’UDP-glucose, d’ATP, de phosphoénolpyruvate et de NDP kinase sur de la glace.
  3. Préchauffer un bain-marie à 30 °C.
  4. Mettre en place chaque test de glycogène synthase dans un tube de 1,5 mL en ajoutant les réactifs de mélange réactionnel énumérés dans le tableau 2.
Composant Volume (μl)
Tampon 160 mM Tris/32 mM KCl pH 7,8 250
Eau 179
100 mM glucose-6-phosphate, pH 7,8 58
0,8 % p/v de glycogène d’huître 67
50 mM ATP 80
4 mM de NADH 80
100 mM UDP-glucose 28
40 mM phosphoénolpyruvate 20
0,5 M MnCl2 8
Volume final 770

Tableau 2 : Composition du mélange réactionnel pour le dosage de l’activité de la glycogène synthase.

NOTE: Pour faciliter la mise en place, un mélange maître peut être fait contenant suffisamment de chacun des réactifs énumérés ci-dessus pour compléter le nombre de dosages prévus.

  1. Préparer une réaction à blanc, où le NADH dans le mélange ci-dessus est remplacé par de l’eau. Transférer dans une cuvette de méthacrylate jetable et l’utiliser pour régler le zéro sur le spectrophotomètre à 340 nm.
  2. Prélever une quantité de 770 μL de la partie aliquote du mélange réactionnel dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 2 μL de NDP kinase et 2 μL de mélange pyruvate kinase/lactate déshydrogénase, mélanger doucement et incuber à 30 °C pendant 3 min pour préchauffer le mélange réactionnel.
  3. Ajouter 30 μL de l’échantillon contenant la glycogène synthase dans un tampon Tris de 20 mM, pH 7,8; mélanger et transférer le mélange réactionnel dans une cuvette de méthacrylate jetable.
  4. Placez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance à 340 nm à intervalles chronométrés pendant 10 à 20 min. Tracer les absorbances obtenues en fonction du temps.
    NOTE: Une réaction dans laquelle l’échantillon de glycogène synthase est remplacé par un tampon Tris de 20 mM doit être effectuée pour contrôler l’oxydation non enzymatique du NADH. Selon la pureté de l’échantillon, d’autres réactions de contrôle peuvent être nécessaires. Voir Discussion pour plus de détails.
  5. Déterminez la vitesse de réaction (voir Résultats pour plus de détails).

2. Détermination de l’activité de la glycogène phosphorylase

  1. Préparer les solutions mères comme indiqué dans le tableau 3 (avant le jour de l’expérimentation).
Composant Itinéraire
125 mM TUYAUX pH 6,8 Dissoudre 3,78 g de PIPES dans l’eau.  Ajuster le pH à 6,8 avec NaOH et porter le volume à 100 mL avec de l’eau.
8 % p/v de glycogène d’huître Peser 0,8 g de glycogène d’huître et ajouter à l’eau.  Faire porter le volume final jusqu’à 10 mL avec de l’eau et réchauffer doucement/mélanger pour dissoudre le glycogène.  Conserver congelé à -20 °C.
200 mM Na phosphate pH 6,8 Dissoudre 2,63 g de Na2HPO4.7H2Oet 1,41 g deNaH2PO4. H2Odans l’eau.  Porter le volume à 100 ml avec de l’eau.
1 mM de glucose-1,6-bisphosphate Dissoudre 2 mg de glucose-1,6-bisphosphate dans 4 mL d’eau.  Aliquote et conserver congelé à -20 °C.   Stable depuis au moins plusieurs mois.
10 mM NADP Dissoudre 23 mg de NADP dans 3 mL d’eau.  Aliquote et conserver congelé à -20 °C.   Stable depuis au moins plusieurs mois.

Tableau 3 : Solutions mères requises pour le dosage de l’activité de la glycogène phosphorylase.

  1. Préchauffer un bain-marie à 30 °C
  2. Mettre en place chaque essai de glycogène phosphorylase dans un tube de 1,5 mL en ajoutant les réactifs de mélange réactionnel énumérés ci-dessous (tableau 4).
Composant Volume (μl)
Tampon PIPES 125 mM pH 6,8 160
Eau 70
8 % p/v de glycogène d’huître 100
200 mM Na phosphate 6,8 400
1 mM de glucose-1,6-bisphosphate 20
10 mM NADP 20
Volume final 770

Tableau 4 : Composition du mélange réactionnel pour le dosage de l’activité de la glycogène phosphorylase.

NOTE: Pour faciliter la mise en place, un mélange maître peut être fait contenant suffisamment de chacun des réactifs énumérés ci-dessus pour compléter le nombre de dosages prévus.

  1. Préparer une réaction à blanc contenant les composants énumérés dans le tableau 4 , mais ajouter 30 μL supplémentaires de tampon PIPES 25 mM, pH 6,8 (préparé en diluant 125 mM de tampon PIPES 1/5 avec de l’eau). Transférer dans une cuvette de méthacrylate jetable et utiliser pour régler le zéro sur le spectrophotomètre à 340 nm.
  2. Prélever une partie aliquote de 770 μL de mélange réactionnel dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 1 μL de glucose-6-phosphate déshydrogénase et 1 μL de phosphoglucomutase, mélanger doucement et incuber à 30 °C pendant 3 min pour préchauffer le mélange réactionnel.
  3. Ajouter 30 μL de l’échantillon contenant la glycogène phosphorylase dans un tampon PIPES 25 mM, pH 6,8. Mélanger et transférer le mélange réactionnel dans une cuvette de méthacrylate jetable.
  4. Placez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance à 340 nm à intervalles chronométrés pendant 10 à 20 min. Tracer les absorbances obtenues en fonction du temps.
    REMARQUE : Une réaction dans laquelle la glycogène phosphorylase est remplacée par un tampon PIPES de 25 mM doit être incluse. Selon la pureté de l’échantillon de glycogène phosphorylase, d’autres contrôles peuvent également être nécessaires (voir la discussion pour plus de détails).
  5. Déterminer la vitesse de réaction (voir Résultats représentatifs pour plus de détails).

3. Détermination de l’activité enzymatique débranchante du glycogène

  1. Préparer les solutions mères comme indiqué dans le tableau 5 (avant le jour expérimental).
Composant Itinéraire
Tampon maléate de 100 mM Dissoudre 1,61 g d’acide maléique dans ~ 80 mL d’eau.  Ajustez le pH à 6,6 avec NaOH et faites le volume final jusqu’à 100 mL avec de l’eau.
300 mM de chlorhydrate de triéthanolamine/ 3 mM de MgSO4 pH 7,5 Dissoudre 27,85 g de chlorhydrate de triéthanolamine et 0,370 g deMgSO4. 7H2O dans ~ 400 mL d’eau.  Ajuster le pH à 7,5 avec NaOH et compléter jusqu’à un volume final de 500 mL avec de l’eau.
150 mM ATP/12 mM NADP Dissoudre 1,24 g d’ATP dans ~ 10 mL d’eau.  Surveillez le pH et ajoutez du NaOH pour maintenir un pH de ~ 7,5 lorsque l’ATP se dissout.  Ajouter 0,138 g de PNDA.  Ajuster le pH à ~ 7,5 avec NaOH et compléter à un volume final de 15 mL avec de l’eau. Conserver dans des aliquotes à – 20 °C. Stable pendant plusieurs mois.
Tampon phosphate Na 50 mM pH 6,8 Dissoudre 32,81 g deNa2HPO4,7H2Oet 17,61 g de NaH2PO4. H2Odans l’eau.  Porter le volume à un volume final de 5 L avec de l’eau.

Tableau 5 : Solutions mères requises pour l’essai de l’activité enzymatique débranchante du glycogène.

  1. Préparer la phosphorylase limite la dextrine
    1. Dissoudre 0,3 g de glycogène d’huître dans 10 mL de tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 6,8.
    2. Dissoudre suffisamment de poudre de phosphorylase A lyophilisée pour donner 60 U d’activité dans un tampon phosphate de 50 mM, pH 6,8.
      NOTE: Selon le lot de phosphorylase A acheté, la masse nécessaire variera mais se situe généralement entre 5 et 10 mg de poudre.
  2. Ajouter 60 U de phosphorylase A à la solution de glycogène et transférer dans une poche de dialyse. Dialyser à température ambiante contre 1 L de tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 6,8 pendant 8 h. Passez au tampon de dialyse frais et poursuivez l’incubation pendant la nuit.
  3. Ajouter encore 10 U de phosphorylase A et passer à un tampon de dialyse frais. Après 8 h, passez à nouveau au tampon de dialyse frais et continuez l’incubation pendant la nuit.
  4. Transférer le contenu de la poche de dialyse dans un tube centrifuge et faire bouillir pendant 10 min. Refroidir sur la glace, puis centrifuger à 10 000 x g pendant 15 min.
  5. Transvaser le surnageant dans une poche de dialyse et dialyser pendant 8 h contre trois changements de 2 L d’eau distillée.
  6. Transférer le contenu de la poche de dialyse dans un tube à centrifuger de 50 mL. Mesurer le volume et ajouter deux volumes d’éthanol absolu glacé pour précipiter la limite de dextrine. Laissez le tube reposer sur la glace pendant 30 minutes.
    NOTE: Un précipité blanc devrait commencer à se former immédiatement après l’ajout d’éthanol, mais, si ce n’est pas le cas, ajouter une goutte de 3 M NaCl.
  7. Centrifuger à 15 000 x g pendant 15 min et jeter le surnageant. Rincer deux fois la pastille blanche de dextrine limite avec de l’éthanol à 66 % v/v, en utilisant ~30 mL pour chaque rinçage.
  8. Transférer la limite de dextrine dans un mortier et laisser sécher complètement à l’air. Lorsque la limite de dextrine est sèche, broyer en poudre à l’aide d’un pilon et transférer dans un récipient approprié pour le stockage; sec à 4 °C.
  9. Pour une utilisation comme substrat enzymatique débranchant, préparer une solution à 1% p/v dans de l’eau.
  10. Préchauffer un bain-marie à 30 °C.
  11. Préchauffez un bloc chauffant ou un bain-marie à 95 °C.
  12. Préparer quatre tubes de 1,5 mL contenant chacun 100 μL de tampon maléate, 80 μL de phosphorylase limite la dextrine et 10 μL d’eau. Ces tubes seront utilisés pour effectuer le dosage enzymatique de débranchement. Étiqueter deux des tubes Réaction et les deux autres tubes Contrôle.
  13. À intervalles réguliers, ajouter 10 μL de l’échantillon d’enzyme débranchante dans les tubes de réaction et 10 μL de tampon qui a été utilisé pour préparer l’échantillon d’enzyme ramifiée dans les tubes témoins. Incuber à 30 °C.
  14. À des moments définis (p. ex. incubation de 5, 10 et 20 minutes), prélever 50 μL de chaque tube de réaction et de contrôle et placer immédiatement dans le bloc chauffant ou le bain-marie à 95 °C. Chauffer pendant 3 min.
  15. Centrifuger à 15 000 x g pendant 2 min afin d’éliminer les protéines précipitées.
    Remarque : À ce stade, la procédure peut être arrêtée si nécessaire. Les échantillons chauffés peuvent être conservés congelés à -20 °C jusqu’à la mesure du glucose libéré (étape 17, ci-dessous).
  16. Mesure du glucose libéré
    1. Transfèrent 40 μL du surnageant des échantillons chauffés dans des cuvettes de méthacrylate jetables et ajoutez 833 μL de tampon chlorhydrate de triéthanolamine/sulfate de magnésium, 67 μL de mélange NADP/ATP et 60 μL d’eau. Mélanger en pipitant doucement de haut en bas, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air.
      NOTE: Pour faciliter la mise en place, un mélange maître peut être fait contenant suffisamment de chacun des réactifs énumérés ci-dessus pour compléter le nombre de dosages prévus.
    2. Préparer une réaction à blanc en combinant 100 μL de tampon maléate, 80 μL de phosphorylase limite la dextrine et 20 μL d’eau. Bien mélanger et transférer 40 μL dans une cuvette de méthacrylate jetable. Ajouter 833 μL de chlorhydrate de triéthanolamine/sulfate de magnésium, etc., comme décrit à l’étape 3.17.1.
    3. Réglez le zéro sur le spectrophotomètre à 340 nm en utilisant la réaction de blanc.
    4. Ajouter 0,5 μL de glucose-6-phosphate déshydrogénase à chaque cuvette. Mélanger doucement en pipitant lentement de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 10 min, puis enregistrer l’absorbance à 340 nm.
      NOTE: Les valeurs d’absorption doivent être faibles, ce qui signifie peu de contamination des échantillons par le glucose-6-phosphate.
    5. Ajouter 0,5 μL d’hexokinase à chaque cuvette. Mélanger doucement en pipitant lentement de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 15 min, puis enregistrer l’absorbance à 340 nm.
    6. Poursuivre l’incubation à température ambiante pendant 5 minutes supplémentaires. Enregistrez à nouveau l’absorbance à 340 nm. Si l’absorption a augmenté par rapport à celle enregistrée à 15 min, poursuivre l’incubation pendant encore 5 minutes et vérifier à nouveau l’absorption. Enregistrer l’absorption finale à 340 nm obtenue.
    7. Pour chaque échantillon, soustraire l’absorbance à 340 nm enregistrée après addition de glucose-6-phosphate déshydrogénase de l’absorbance finale obtenue après addition d’hexokinase. Tracer les valeurs obtenues en fonction de la durée pendant laquelle l’échantillon correspondant a été incubé avec l’enzyme débranchante.

4. Détermination de l’activité de l’enzyme ramifiée du glycogène

  1. Avant la journée expérimentale, préparer la solution d’iode/KI en dissolvant d’abord 2,6 g de KI dans 10 mL d’eau. Dans une hotte, peser 0,26 g d’iode et ajouter à la solution de KI.
    ATTENTION : L’iode est nocif au contact de la peau ou en cas d’inhalation. Mélanger pour dissoudre l’iode et conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière. Préparez également un tampon PIPES de 125 mM, pH 6,8 (voir tableau 3).
  2. Lorsque vous commencez les expériences, constituez un stock de travail de réactif d’iode acidifié.
    1. Prélever 45,7 mL d’eau dans un tube de 50 mL et ajouter 150 μL de solution d’iode/KI suivi de 150 μL de HCl 1 M
    2. Bien mélanger et conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière. La solution est stable pendant au moins 3 jours dans ces conditions.
  3. Le jour de l’expérience, préparez une solution fraîche d’amylose à 10 mg/mL.
    1. Peser 50 mg d’amylose et transférer dans un tube de 15 mL.
    2. Ajouter 200 μL d’éthanol absolu et agiter doucement.
    3. Ajouter 500 μL de 2 M KOH et agiter doucement.
      ATTENTION : KOH provoque de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié.
    4. Ajouter 0,5 mL d’eau en secouant doucement. Si l’amylose ne se dissout pas complètement, ajoutez 0,5 mL d’eau supplémentaire.
    5. Ajuster le pH à ~6,5 à 7,0 avec 1 M HCl.
      ATTENTION : HCl peut provoquer une irritation des yeux, de la peau et des voies respiratoires. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié.
    6. Ajouter de l’eau pour atteindre un volume final de 5 mL.
    7. Stériliser par passage à travers un filtre d’extrémité de seringue de 0,2 μm et conserver à température ambiante. Ne pas refroidir et congeler.
  4. Préchauffer un bain-marie à 30 °C.
  5. Préparer douze tubes de 1,5 mL, chacun contenant 1 mL de réactif d’iode acidifié. Réserver sur le banc. Ceux-ci seront utilisés pour arrêter la réaction enzymatique ramifiée.
  6. Préparer quatre tubes de 1,5 mL contenant chacun 150 μL d’amylose, 150 μL de tampon PIPES et 45 μL d’eau. Ces tubes seront utilisés pour effectuer le dosage enzymatique ramifié. Étiqueter deux des tubes Réaction et les deux autres tubes Contrôle.
  7. À intervalles réguliers, ajouter 5 μL d’échantillon d’enzyme ramifiée dans les tubes de réaction et 5 μL de tampon qui a été utilisé pour préparer l’échantillon d’enzyme ramifiée dans les tubes témoins. Incuber à 30 °C.
  8. À des moments définis (p. ex. 5, 10 et 15 minutes d’incubation), prélever 10 μL de chaque tube de réaction et de contrôle et ajouter aux tubes de 1,5 mL qui contiennent 1 mL de réactif d’iode acidifié. Ajouter 140 μL d’eau supplémentaires et bien mélanger. Transférer dans des cuvettes jetables.
    NOTE: Les échantillons doivent être de couleur bleue et la solution doit être exempte de précipité. La couleur formée est stable pendant au moins 2 h à température ambiante.
  9. Préparer un échantillon contenant 1 mL de réactif d’iode acidifié et 150 μL d’eau. Bien mélanger et transférer dans une cuvette. Utilisez cette cuvette pour régler le zéro du spectrophotomètre à 660 nm.
  10. Lire l’absorbance de chacun des douze échantillons à 660 nm. Déterminer la vitesse de la réaction enzymatique ramifiée en soustrayant l’absorbance obtenue en présence d’enzyme ramifiée (réaction) de l’absorbance lorsqu’aucune enzyme ramifiée n’est présente (témoin) à chaque point temporel. Voir Résultats représentatifs pour plus de détails.

5. Évaluation qualitative de la ramification du glycogène

  1. Préparer la solution saturée de chlorure de calcium en ajoutant 74,5 g de chlorure de calcium anhydre à ~40 mL d’eau et en agitant. Ajouter un peu plus d’eau et continuer à remuer. Porter le volume à 100 mL avec de l’eau et continuer à agiter jusqu’à ce que le CaCl2 soit complètement dissous.
  2. Préparer un stock de travail de réactif colorant iode/CaCl 2 en mélangeant 50 μL de solution mère de KI/iode (voir étape 4.1 ci-dessus) avec 13 mL de solution saturée de CaCl2 dans un tube de 15 mL. Bien mélanger et conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière. La solution est stable pendant au moins 1 semaine dans ces conditions.
  3. Détermination de la ramification
    1. Dans un tube de 1,5 mL, mélanger 650 μL de bouillon de réactif coloré iode/CaCl2 avec 100 μL d’eau et bien mélanger. Transférer la solution dans une cuvette de méthacrylate jetable.
      REMARQUE: La solution dans la cuvette doit être claire et de couleur jaune pâle.
    2. Placer dans le spectrophotomètre et, en mode de balayage de longueur d’onde, collecter un spectre de fond de 330 nm à 800 nm.
    3. Dans un tube de 1,5 mL, combiner 650 μL de réactif colorimétrique iode/CaCl2 avec 50 μg de glycogène d’huître. Porter le volume final à 750 μL avec de l’eau et bien mélanger. Transférer la solution dans une cuvette de méthacrylate jetable.
      REMARQUE: La solution dans la cuvette doit être claire et d’une couleur orange / brun foncé.
    4. Placer dans le spectrophotomètre et recueillir un spectre d’absorption de 330 nm à 800 nm.
    5. Répétez les étapes 4.4.3 à 4.4.4 avec 50 μg d’amylopectine et 30 μg d’amylose.
      NOTE: L’échantillon d’amylopectine doit être jaune/vert et l’échantillon d’amylose doit être vert/bleu. Les deux échantillons doivent être clairs. Les complexes colorés formés sont stables, sans changement de spectre d’absorption, pendant au moins 1 h à température ambiante.
    6. Pour obtenir une indication de la structure ramifiée d’un échantillon de glycogène non caractérisé, combiner 25 μg à 50 μg de glycogène avec 650 μL de réactif colorimétrique iode/CaCl2 . Procéder comme ci-dessus, en portant le volume à 750 μL avec de l’eau, en mélangeant bien et en transférant dans une cuvette de méthacrylate.
      NOTE: L’échantillon de glycogène doit donner une couleur jaune/orange à orange/brun en fonction du degré de ramification (longueur des chaînes externes) du glycogène présent. Encore une fois, l’échantillon doit être clair. Voir Résultats représentatifs pour plus de détails.
    7. Recueillir le spectre d’absorption.

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Representative Results

Détermination de l’activité de la glycogène synthase
La figure 1 montre des résultats représentatifs d’essais de glycogène synthase utilisant des enzymes purifiées. Dans le panneau A, après un léger décalage, on a observé une diminution linéaire de l’absorption à 340 nm au fil du temps pendant une période d’environ 12 min. Le taux de variation de l’absorption sur la figure 1A était de ~0,12 unité d’absorbance/min. Un taux de variation de l’absorbance entre ~0,010 et ~0,20 unités d’absorbance/min est optimal et la quantité de glycogène synthase ajoutée doit être ajustée pour obtenir des taux d’élasticité dans cette plage. Dans le panel B, le résultat de l’ajout d’une trop grande quantité de glycogène synthase au test est montré. Ici, la réaction était complète dans les 2 premières minutes. La réaction de contrôle, qui dans ces cas ne contenait pas de glycogène synthase, n’a montré aucune diminution mesurable de l’absorbance au fil du temps. Comme expliqué dans la discussion, l’utilisation d’homogénats tissulaires dans ce test est parfaitement réalisable, bien que des réactions de contrôle supplémentaires soient nécessaires.

Le protocole décrit ici utilise le glycogène des huîtres comme substrat, ce qui fonctionne bien avec les glycogènes synthases de nombreuses espèces différentes. Cependant, il convient de noter que les glycogènes synthases peuvent présenter une activité très variable selon le type de glycogène employé. Par conséquent, il est conseillé d’étudier une variété de formes de glycogène avant de commencer toute étude détaillée.

Le protocole donné inclut le glucose-6-phoposphate dans le mélange réactionnel, puisque de nombreuses glycogènes synthases sont activées allostériquement par ce composé 9,23,24,25,26. La réalisation de dosages en présence et en absence de glucose-6-phosphate (constituant le volume de réaction avec de l’eau) permet de calculer le rapport d’activité -/+ glucose-6-phosphate, ce qui est une indication utile de l’état de phosphorylation des glycogènes synthases 1,27 chez les mammifères et les fongiques.

La détermination de l’activité de la glycogène synthase à partir du changement d’absorbance est assez simple. Le coefficient d’extinction du NADH est de 6220 M-1 cm-1, ce qui permet de calculer le taux de variation de la concentration de NADH à partir du taux de variation de l’absorbance comme suit:

Un taux de variation de l’absorption de 0,12 unité/min correspond à 0,12/6220 = 1,93 x 10-5 mol/L/min de variation de la concentration de NADH. Le volume dans la cuvette était de 0,8 mL, ce qui signifie que la variation de la quantité de NADH était: 1,93 x 10-5 x 0,8 x 10-3 = 3,46 x 10-8 mol/min. Le volume d’enzyme ajouté était de 60 μL, 3,46 x 10-8 x (1000 / 60) = 5,76 x 10-7 mol de NADH consommé/min/mL d’enzyme.

Comme il existe une relation univoque entre le NADH consommé et le glucose incorporé dans le glycogène, le taux de réaction peut être exprimé comme 5,76 x 10-7 mol glucose incorporé/min/mL.

Lorsque la teneur en protéines de l’échantillon d’enzymes est connue, l’activité enzymatique spécifique peut être exprimée en protéines μmol glucose incorporé/min/mg ou en protéines nmol glucose incorporées/min/mg, selon le cas.

Comme mentionné dans l’introduction, le protocole est facilement adapté pour mesurer l’activité des glycogènes synthases qui utilisent l’ADP-glucose comme donneur de glucose. Ceci est réalisé par la simple substitution de l’UDP-glucose par l’ADP-glucose dans le mélange réactionnel. De plus, la NDP kinase et l’ATP sont omises du mélange réactionnel, car l’ADP libéré pendant l’action de la glycogène synthase est un substrat direct de la pyruvate kinase.

Figure 1
Figure 1 : Résultats représentatifs des essais de l’activité de la glycogène synthase. Le spectrophotomètre devait effectuer une lecture par minute pour une durée totale de 20 minutes. Le panneau A montre la courte phase de décalage attendue suivie d’une diminution linéaire de l’absorbance avec le temps (expérimentale). Aucune diminution de l’absorption n’a été observée dans la réaction de contrôle. La vitesse de réaction est calculée à partir de la pente du changement d’absorbance dans la phase linéaire (de 5 à 16 min). Le panneau B montre le résultat de l’ajout d’une trop grande quantité d’enzyme. Ici, le NADH est épuisé en 2 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Détermination de l’activité de la glycogène phosphorylase
La figure 2 montre des données représentatives d’un essai de glycogène phosphorylase utilisant une enzyme purifiée. Avec la préparation utilisée ici, le dosage a été linéaire pendant environ 3 minutes. L’encart montre une droite de régression tracée à travers les points du temps 0 à 2,5 min. La pente de cette droite montre que le taux de variation de l’absorbance est de 0,022 unité d’absorbance/min. Une augmentation du taux d’absorbance d’environ 0,01 à 0,04 est optimale, car le test s’écartera assez rapidement de la linéarité si trop d’enzyme est présente. Le taux de formation de NADPH est calculé à partir du coefficient d’extinction qui, comme celui du NADH, est de 6220 M-1 cm-1. Pour chaque 1 mol de NADPH formé, une mol de glucose-1-phosphate avait été produite par l’action de la glycogène phosphorylase. L’activité enzymatique peut donc être exprimée comme la quantité de glucose-1-phosphate libérée par le glycogène par unité de temps, suivant un calcul similaire à celui décrit ci-dessus.

Les conditions de réaction sont facilement adaptables aux phosphorylases sensibles à la modulation allostérique. Les effecteurs requis sont simplement inclus dans le mélange maître de réaction, remplaçant une partie de l’eau. Une mise en garde importante est qu’il doit être démontré que l’effecteur lui-même n’influence pas l’activité des enzymes de couplage, de la phosphoglucomutase et de la glucose-6-phosphate déshydrogénase.

Enfin, comme pour la glycogène synthase décrite ci-dessus, le type de glycogène utilisé comme substrat peut avoir un impact sur la vitesse de la réaction. Bien que le glycogène des huîtres fonctionne bien avec les phosphorylases de nombreuses espèces, ce n’est pas toujours le choix optimal.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs des essais de l’activité de la glycogène phosphorylase. Le spectrophotomètre devait effectuer une lecture toutes les 30 s pour une durée totale de 10 minutes. Une augmentation constante de l’absorbance a été enregistrée en présence de glycogène phosphorylase (expérimentale), tandis que la réaction sans phosphorylase ajoutée est restée à l’inclusion (témoin). L’encart montre un élargissement de la période de réaction initiale, démontrant la linéarité de la formation du produit par rapport au temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Détermination de l’activité enzymatique débranchante du glycogène
Les données présentées à la figure 3 sont représentatives d’un dosage de l’enzyme débranchante du glycogène utilisant une enzyme débranchante purifiée. À chaque point temporel, le changement d’absorption qui s’est produit en l’absence d’enzyme ramifiée ajoutée (témoin) a été soustrait du changement d’absorption qui s’est produit en présence d’une enzyme ramifiée (réaction). Les valeurs d’absorbance résultantes ont ensuite été tracées. Comme ci-dessus, un taux de variation de la concentration de NADPH est calculé à partir de la pente initiale de la courbe par analyse de régression. Dans cet exemple, l’augmentation du NADPH par unité de temps a été linéaire pendant 10 min, avec une pente de 0,0079 unité d’absorbance/min. Bien que ces données soient parfaitement utilisables, l’ajout d’un peu moins d’enzymes aurait donné une pente moins profonde et permis une phase linéaire plus longue. Alternativement, des lectures supplémentaires pourraient être prises en retirant les aliquotes pour la mesure à 2 min et 7 min d’incubation. La détermination de l’activité enzymatique débranchante est très simple, car 1 mol de NADPH est formé pour chaque 1 mole de glucose libéré par l’activité α1,6-glucosidase de l’enzyme débranchante. Ainsi, la vitesse de réaction peut être exprimée en quantité de glucose libérée par la phosphorylase limite la dextrine par unité de temps, en suivant le même type de calcul que celui utilisé pour les tests de glycogène synthase et de phosphorylase, ci-dessus.

Figure 3
Figure 3 : Résultats représentatifs des essais de l’activité enzymatique débranchante du glycogène. Des échantillons de dextrine limite de phosphorylase ont été traités avec une enzyme débranchante pendant 5, 10, 20 ou 40 minutes. L’augmentation de l’absorbance à 340 nm, produite lorsque le NADP a été réduit en NADPH dans un dosage enzymatique couplé, a été mesurée dans des échantillons prélevés à chacun de ces points temporels. La réaction a montré une phase linéaire, persistant pendant au moins 10 minutes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Détermination de l’activité enzymatique ramifiée du glycogène
La figure 4 montre les données des dosages d’enzymes ramifiées du glycogène. À chacun des points temporels indiqués, l’absorbance des échantillons de contrôle et de réaction a été mesurée. L’absorbance de l’échantillon de réaction à 660 nm a été soustraite de celle de l’échantillon témoin correspondant, et la différence d’absorbance a été tracée en fonction du temps. Une droite de régression a ensuite été tracée à travers les points (panneau A). La vitesse de réaction peut être exprimée simplement comme le changement d’absorbance à 660 nm par unité de temps. Le changement maximal d’absorbance qui peut se produire dans ce test n’est que de ~0,4 unité d’absorbance, représentant la ramification maximale de l’amylose ajoutée par l’enzyme ramifiée (panel B). De plus, lorsque l’absorbance des tubes de réaction chute de plus de ~0,2 unités d’absorbance en dessous de celle du groupe témoin, le test n’est plus dans la plage linéaire et aucune estimation de la vitesse de réaction ne peut être faite (panneau B).

L’amylose utilisée comme substrat dans cette procédure commencera à quitter la solution assez facilement si elle est refroidie ou congelée, puis décongelée. Par conséquent, il est important de rendre la solution de substrat d’amylose fraîche et de s’assurer qu’aucun précipité ne s’est formé avant utilisation.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs des essais de l’activité enzymatique ramifiée du glycogène. Des échantillons d’amylose ont été traités avec une enzyme ramifiée. Les aliquotes ont été éliminées aux points temporels indiqués et ajoutées à un réactif d’iode acidifié. L’absorbance du complexe amylose/iode formé a ensuite été mesurée à 660 nm. Les données présentées représentent la différence d’absorbance entre les incubations témoins dépourvues d’enzyme ramifiée et les réactions contenant une enzyme ramifiée. Le panneau A montre une diminution de l’absorbance à 660 nm en raison de l’activité enzymatique débranchante, qui était linéaire pendant ~20 min. Le panneau B illustre la plage dynamique étroite de l’essai, où le changement maximal de l’absorbance pouvant être produit est de ~0,4 unité d’absorbance et la linéarité est perdue lorsque le changement d’absorption est de ~0,2 unité d’absorbance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Évaluation qualitative de l’étendue de la ramification du glycogène
L’amylose, l’amylopectine, la phosphorylase limite la dextrine, le glycogène isolé de la levure ont été combinés avec une solution d’iode/chlorure de calcium saturé et les spectres d’absorption des complexes résultants ont été recueillis (Figure 5). En utilisant les masses de glycogène, d’amylopectine et d’amylose données dans le protocole décrit ci-dessus, la lecture d’absorbance maximale obtenue devrait être d’environ 0,7 à 0,8, comme indiqué ici (panels A et B). Les maxima d’absorbance pour l’amylose et l’amylopectine sont d’environ 660 nm et 500 nm, et 385 nm respectivement. La dextrine limite de phosphorylase a été incluse ici, car la collecte du spectre d’absorbance des complexes limite phosphorylase dextrine/iode permet de vérifier rapidement l’étendue de la digestion de la phosphorylase obtenue lors de la préparation de ce substrat enzymatique débranchant. Le glycogène provenant de la plupart des sources produit deux pics, l’un à environ 400 nm et l’autre à 460 nm (figure 5B). Les décalages vers la gauche dans les spectres d’absorbance du glycogène indiquent une augmentation de la ramification / diminution de la longueur de la chaîne externe. Inversement, les déplacements vers la droite indiquent une diminution de la ramification ou une augmentation de la longueur de la chaîne externe.

La solution saturée de chlorure de calcium est dense et les échantillons de glycogène ajoutés formeront une couche sur le dessus lorsqu’ils seront ajoutés. Par conséquent, un mélange soigneux est nécessaire pour obtenir une solution homogène. De plus, si les échantillons de glucides utilisés ne sont pas complètement dissous avant d’être mélangés à la solution de chlorure de calcium, des agrégats de coloration foncée se formeront dans la cuvette. Ces agrégats entraveront évidemment la collecte d’un spectre d’absorption et il est important de s’assurer que la solution dans la cuvette est claire avant de procéder à toute mesure.

Figure 5
Figure 5 : Résultats représentatifs de l’évaluation qualitative de la ramification du glycogène. Des échantillons de dextrine, d’amylopectine, d’amylopectine (panneau A) ou de glycogène (panneau B) purifiés ont été combinés avec une solution d’iode/chlorure de calcium saturé et les spectres d’absorption des complexes obtenus ont été mesurés de 330 nm à 800 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

En général, les principaux avantages de toutes les méthodes présentées sont leur faible coût, leur facilité, leur rapidité et leur manque de dépendance à l’égard d’équipements spécialisés. Le principal inconvénient qu’ils partagent tous est la sensibilité par rapport aux autres méthodes disponibles. La sensibilité des procédures impliquant la production ou la consommation de NADH/NADPH est facile à estimer. Étant donné que le coefficient d’extinction du NADH/NADPH est de 6,22 M-1 cm-1, une simple arithmétique indique que des changements de concentration de ~10-20 μM peuvent être facilement détectés. Avec les volumes de dosage décrits dans le présent article, cela correspond à la capacité de mesurer des quantités comprises entre ~10 et 20 nmol. On peut soutenir que c’est assez délicat. Cependant, il est possible d’ajuster l’activité spécifique des substrats radiomarqués de manière à ce que la sensibilité puisse être augmentée assez facilement au-delà de la limite des essais spectrophotométriques. Bien que le dosage de l’enzyme ramifiée et l’évaluation qualitative de la ramification du glycogène reposent tous deux sur la formation de complexes entre l’iode et les polymères de glucose liés à l’α1,4, le résultat de chaque essai est différent et leurs sensibilités sont également différentes. Les considérations spécifiques pour chacun des tests décrits sont discutées ci-dessous.

Détermination de l’activité de la glycogène synthase
Le dosage enzymatique couplé décrit ici permet un dosage continu de l’activité de la glycogène synthase, ce qui est utile dans la détermination des paramètres cinétiques. Il est également facilement évolutif et une procédure très similaire a été décrite pour une utilisation dans les plaques de microtitrage, permettant d’effectuer des mesures très parallèles de l’activité enzymatique28. Nous utilisons régulièrement ce test avec des glycogènes synthases29 recombinantes purifiées. Cependant, les procédures décrites ont été développées à l’origine pour être utilisées dans les homogénats tissulaires (par exemple, voir Danforth10 et Leloir et coll.9). Une mise en garde ici est que l’homogénat tissulaire doit être dilué de manière appropriée avant utilisation. La dilution est nécessaire pour réduire la turbidité de l’homogénat et l’interférence des enzymes/substrats concurrents dans l’homogénat. De plus, pour tenir compte de la consommation de NADH qui ne dépend pas de l’activité de la glycogène synthase, les réactions à blanc contenant tous les composants de la réaction à l’exception de l’UDP-glucose doivent être incluses. L’activité glycogène synthase est ensuite déterminée en soustrayant le taux de variation de l’absorbance du NADH en l’absence d’UDP-glucose de celui obtenu en présence de ce composé.

Détermination de l’activité de la glycogène phosphorylase
Comme le test de glycogène synthase, la mesure spectrophotométrique de l’activité de la phosphorylase peut être effectuée de manière continue, tandis que les autres tests de phosphorylases sont arrêtés les essais13. Il est également facilement adaptable pour une utilisation dans des plaques de microtitrage ou d’autres applications à haut débit15. Encore une fois, son utilisation avec des homogénats tissulaires nécessite une dilution appropriée pour réduire la turbidité et les réactions interférentes. Par exemple, le glucose-6-phosphate est un métabolite assez abondant et sa présence dans un homogénat tissulaire entraînera la production de NADPH via l’enzyme de couplage glucose-6-phosphate déshydrogénase indépendante de l’activité de la phosphorylase. Lorsque l’on travaille avec des homogénats tissulaires, les réactions de contrôle qui contiennent un homogénat tissulaire dilué de manière appropriée et tous les autres composants de l’essai, à l’exception du phosphate et du glycogène, doivent être incluses. L’activité de la phosphorylase est ensuite calculée en soustrayant la production de NADPH en l’absence de glycogène/phosphate de celle qui se produit en présence de ces composés. Des recommandations spécifiques relatives au degré approprié de dilution de divers types d’extraits de tissus de mammifères se trouvent dans Mezl et al.13.

Détermination de l’activité enzymatique débranchante du glycogène
Bien que décrite ici comme un essai arrêté, cette procédure peut être facilement adaptée et réalisée de manière continue16. Étant donné que le test repose sur la production de glucose, son utilisation dans des extraits bruts de tissus doit tenir compte de la libération de glucose à partir de la phosphorylase limite la dextrine par des enzymes autres que l’enzyme débranchante, et de la génération de glucose par l’action de ces enzymes sur le glycogène endogène présent dans l’extrait tissu. La question du glycogène endogène est facilement abordée par une réaction de contrôle à laquelle on n’ajoute pas de limite de phosphorylase de dextrine. La présence d’autres activités de la α-glucosidase peut être estimée dans des réactions parallèles où la maltose, plutôt que la limite phosphorylase de la dextrine, est présente sous forme de substrat.

Détermination de l’activité enzymatique ramifiée du glycogène
Parmi les différents dosages quantitatifs discutés, le dosage de l’enzyme de ramification colorimétrique est de loin le moins sensible. En effet, il a été estimé que la sensibilité est environ 50 à 100 fois inférieure à celle obtenue avec la méthode radiochimique, où la stimulation de la réaction de la phosphorylase glycogène par l’ajout d’une enzyme ramifiée est mesurée21. Semblable au test de l’enzyme de débranchement, le dosage de l’enzyme ramifiée est également sensible à la présence d’activités contaminantes de la glucosidase, car la digestion de l’amylose aura un impact sur la liaison à l’iode. Certaines solutions de contournement ont été proposées pour permettre l’utilisation de dosages similaires à ceux décrits ici en présence d’activités contaminantes de la glucosidase30. Cependant, à notre avis, ce test est le mieux adapté à l’étude des enzymes de ramification du glycogène purifiées ou partiellement purifiées, lorsque ces activités interférentes sont minimes ou absentes.

Évaluation qualitative de l’étendue de la ramification du glycogène
L’analyse détaillée de la ramification du glycogène est plutôt laborieuse, impliquant généralement une combinaison de digestion enzymatique, de modification chimique et une variété de techniques de séparation pour analyser les produits générés31. Bien que le test colorimétrique décrit ici ne puisse manifestement pas fournir d’informations comparables sur la structure fine du glycogène, il fournit une mesure simple et rapide de plus ou moins de ramification. De plus, les spectres obtenus contiennent des informations supplémentaires. Par exemple, comme indiqué dans la section Résultats représentatifs, des échantillons de glycogène sont généralement présents avec des pics d’absorbance à ~400 nm et ~460 nm. Le pic à ~400 nm représente apparemment de courtes chaînes externes dans les particules de glycogène, puisqu’il est amélioré dans le glycogène isolé à partir de mutants de levure dépourvus d’enzyme ramifiée par rapport à la levure de type sauvage32.

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Disclosures

Il n’y a pas de conflits d’intérêts connus associés à ce travail et il n’y a eu aucun soutien financier pour ce travail qui aurait pu influencer son résultat.

Acknowledgments

L’auteur tient à remercier Karoline Dittmer et Andrew Brittingham pour leurs idées et leurs nombreuses discussions utiles. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l’Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 et 03-20-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

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References

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Biochimie numéro 174
Méthodes spectrophotométriques pour l’étude du métabolisme du glycogène eucaryote
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Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

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