Summary
Золотым стандартом в кардиологии для клеточных и молекулярно-функциональных экспериментов являются кардиомиоциты. В этой статье описываются адаптации к методу Лангендорфа для выделения кардиомиоцитов мыши.
Abstract
Потребность в воспроизводимых, но технически простых методах, дающих высококачественные кардиомиоциты, имеет важное значение для исследований в области биологии сердца. Клеточные и молекулярно-функциональные эксперименты (например, сокращение, электрофизиология, кальциевый цикл и т. д.) на кардиомиоцитах являются золотым стандартом для установления механизма (механизмов) заболевания. Мышь является предпочтительным видом для функциональных экспериментов, и описанная методика предназначена специально для выделения кардиомиоцитов мыши. Предыдущие методы, требующие аппарата Лангендорфа, требуют высокого уровня подготовки и точности для канюляции аорты, что часто приводит к ишемии. Область смещается в сторону методов выделения без Лангендорфа, которые просты, воспроизводимы и дают жизнеспособные миоциты для сбора физиологических данных и культивирования. Эти методы значительно сокращают время ишемии по сравнению с канюляцией аорты и приводят к надежно полученным кардиомиоцитам. Наша адаптация к методу без Лангендорфа включает в себя начальную перфузию ледяным очищающим раствором, использование стабилизирующей платформы, которая обеспечивает устойчивую иглу во время перфузии, и дополнительные этапы пищеварения для обеспечения надежно полученных кардиомиоцитов для использования в функциональных измерениях и посеве. Этот метод прост и быстр в исполнении и не требует особых технических навыков.
Introduction
На протяжении десятилетий важной идеей в литературе по биологии сердца является молекулярный механизм действия. Механизм действия должен быть установлен, чтобы публиковать надежные исследования. Хорошо зарекомендовавшей себя стратегией определения молекулярного механизма являются изолированные исследования кардиомиоцитов, которые требуют высококачественных кардиомиоцитов для получения достоверных данных. Клеточные и молекулярные эксперименты, проводимые на кардиомиоцитах для определения механизма действия, являются золотым стандартом для исследования сокращения1, электрофизиологии2, цикла кальция (Ca2+)3, чувствительности миофиламентаCa 2+ 4, цитоскелета5, метаболизма6, эффектов гормонов7, сигнальных молекул8, исследований лекарств9 и так далее. Мышь стала предпочтительным видом для большинства экспериментов по биологии сердца из-за простоты генетических манипуляций, ее небольшого размера, относительно короткой продолжительности жизни, низкой стоимости и т. д.10. Тем не менее, надежное выделение высококачественных кардиомиоцитов мыши не является тривиальным с современными методами.
Лаборатории выделяют кардиомиоциты уже почти 70 лет11. Практически все методы выделения кардиомиоцитов основаны на переваривании сердца с помощью различных ферментов (коллагеназа, протеаза, трипсин и т. Д.). В ранние периоды (1950-1960-е годы) использовался метод кусков, который включал удаление сердца, разрезание на гораздо более мелкие кусочки и инкубацию в растворе с коллагеназой / протеазой / трипсином12. В 1970-х годах лаборатории внедрили улучшенный метод «Лангендорфа»13, который изолировал кардиомиоциты с использованием метода изоляции на основе перфузии коронарных артерий (ретроградная перфузия ферментом через аппарат Лангендорфа); Этот метод остается доминирующим методом выделения миоцитов в этой области сегодня, ~ 50 лет спустя14,15,16. Недавняя работа сместилась в сторону канюляции сердца in vivo для ограничения времени гипоксии и ишемического повреждения, что приводит к превосходному выделению кардиомиоцитов (лучшие выходы и более высокое качество)17. В последнее время это превратилось в выполнение in vivo, перфузии сердца без Лангендорфа 18,19,20,21,22. Мы разработали метод выделения кардиомиоцитов без Лангендорфа на основе метода Ackers-Johnson et al.18 и адаптировали различные компоненты из многих предыдущих методов выделения. Эти ключевые приспособления включают инъекцию ледяного очищающего буфера и включение поддерживающей платформы для стабилизации иглы, что позволяет уменьшить манипуляции с сердцем. Также в этом методе подробно описан контроль температуры вводимых буферов (37 ° C), что уменьшило время между инъекцией in vivo и перевариванием из-за меньшей перфузии ЭДТА, как было опубликованоранее 18. Уменьшая манипуляции с сердцем и, следовательно, минимизируя размер места прокола, достигается тщательная и постоянная перфузия коронарных артерий. Мы также усовершенствовали технику с помощью метода вторичного разложения кусков, количества ЭДТА в введенном буфере очистки и изменили pH. Описанная нами методика надежнее, эффективнее и не требует обширной подготовки/практики по сравнению с использованием аппарата Лангендорфа (табл. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, выполненные в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете штата Огайо в соответствии с руководящими принципами NIH.
1. Приготовление раствора
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите таблицу 2 для буферных концентраций.
- Предварительная изоляция (за 2 недели до выделения миоцитов)
- Перфузионное буферное основание: Приготовьте 1 л перфузионного буферного основания (NaCl, KCl,2 PO 4, HEPES, глюкоза и BDM) в 1 л сверхчистого 18,2 МОм · см H2O. Отрегулируйте pH7,4 перед стерильной фильтрацией 0,22 мкм. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции.
- Очищающий буфер: Приготовьте 1 л очищающего буфера (NaCl, KCl, 2 PO 4, HEPES, глюкоза, ЭДТА и BDM) в 1 л сверхчистого 18,2 МОм · см H2O. Отрегулируйте до pH7,4 перед стерильной фильтрацией 0,22 мкм. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции.
- Исходный растворCaCl2 100 мМ: взвесьте 1,11 г CaCl 2 и растворите в 100 мл сверхчистого 18,2 МОм · см H2O. Хранить при комнатной температуре до дня изоляции.
- Аликвоты либерразы: растворите 5 мг пищеварительных ферментов в 5 мл стерильной воды, не содержащей РНКазы. Приготовьте аликвоты объемом 0,8 мл и храните при температуре -20 °C до дня изоляции.
- Ламинируйте посуду: нанесите 100 мкл 40 мкг/мл мышиного ламинина на стерильные чашки Петри со стеклянным дном объемом 30 мл. Оставьте на 30 минут и удалите излишки ламинина. Установите ламинин на чашку Петри с УФ-инкубацией при комнатной температуре на 30 мин. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции (ламинированные чашки Петри можно использовать до 2 недель).
- Среда DMEM: В шкаф биобезопасности добавьте 2,5 мл FBS, 0,5 мл пенициллина-стрептомицина (50 ЕД/мл-50 мкг) и 1 мл 500 мМ BDM к 46 мл DMEM. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции (среду можно использовать до 2 недель).
- Среда M199: Приготовьте 1 л среды M199 (NaHCO3, HEPES, L-глутатион, M199, BDM и BSA) в 1 л сверхчистой среды 18,2 МОм · см H2O. Отрегулируйте до pH 7,4 перед стерильной фильтрацией (фильтр 0,22 мкм). Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции.
- Запас 500 мМ BDM: добавьте 0,5 г BDM к 10 мл сверхчистого 18,2 МОм · см H2O. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции.
- Создание стабилизирующей платформы: Формовка пластилина вокруг основания иглы, ввинченной в запорный кран Луера. Приготовьте форму к чашке Петри, в которой будет находиться сердце, и убедитесь, что игла находится на правильной высоте для инъекции желудочка (~ 5 мм над дном чашки).
- День изоляции
- Перфузионный буфер: В день выделения добавьте 9,5 мг MgCl2к 100 мл перфузионного буферного основания. Дайте полностью перемешаться перед удалением 30 мл готового перфузионного буфера и поместите в чистую стеклянную бутылку объемом 100 мл с широким горлышком и крышкой с завинчивающейся крышкой (буфер для разложения).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти добавки могут быть сделаны в день изоляции без дополнительной корректировки pH, так как их добавление незначительно изменяет pH.- Извлеките 12 мл перфузионного буфера и отложите в сторону (стоп-буфер). Перелейте оставшиеся 58 мл перфузионного буфера в другую чистую стеклянную бутылку объемом 100 мл с широким горлышком и крышкой с завинчивающейся крышкой. Храните оставшийся буфер для перфузии при температуре 37 °C в течение всей изоляции.
- Буфер для разложения: добавьте 7,5 мкл 100 мМ CaClот 2 до 30 мл перфузионного буфера для конечной концентрации 25 мкМ. Непосредственно перед выделением добавьте 770 мкл либеразы в буфер для разложения для конечной концентрации 26 мкг/мл.
- Стоп-буфер: растворите 240 мг BSA в 12 мл перфузионного буфера. Хранить при температуре 37 °C во время изоляции.
- Очищающий буфер: Подготовьте шприц очищающего буфера объемом 3 мл и очистите иглу от пузырьков. Хранить на льду до изоляции.
- Перфузионный буфер: В день выделения добавьте 9,5 мг MgCl2к 100 мл перфузионного буферного основания. Дайте полностью перемешаться перед удалением 30 мл готового перфузионного буфера и поместите в чистую стеклянную бутылку объемом 100 мл с широким горлышком и крышкой с завинчивающейся крышкой (буфер для разложения).
2. Подготовка коллектора
- Очистите коллектор с регулируемой температурой свежеприготовленным буфером для перфузии, следя за тем, чтобы не осталось пузырьков. Используя соединитель замка Luer, вкрутите иглу 27 G и очистите от пузырьков. Очищенный коллектор необходим для успешной изоляции.
3. Подготовка животных
- Вводят мышам внутрибрюшинно 100 мг/кг кетамина и 20 мг/кг ксилазина по массе тела непосредственно перед выделением. В этой процедуре использовался 4-месячный самец мыши C57Bl / 6.
- При необходимости поместите мышь на нагретую хирургическую подушечку, чтобы стимулировать седативный эффект. Наденьте палатку на руки мыши и прикрепите конечности и основание хвоста к синему лабораторному подгузнику. Убедитесь, что животное полностью обезболито, сняв рефлекс защемления пальцев ног. Наложите стерильную простыню на операционную область.
4. Процедура выделения кардиомиоцитов
- Обнажите грудину мыши и латерально к средней линии разрежьте проксимально через ребра и до подмышечной впадины. Аккуратно прорежьте диафрагму полностью, делая неглубокие разрезы, чтобы избежать сердца. Зажмите грудину гемостатом и сложите ребра назад, чтобы обнажить грудную полость.
- Аккуратно извлеките перикард из сердца и полностью прорежьте нижнюю полую вену, непосредственно дистальнее сердца. Используйте шприц объемом 3 мл с иглой 27 г, чтобы быстро ввести 3 мл ледяного очищающего буфера в правый желудочек сердца в течение 1 минуты.
- Аккуратно зажмите сердце пинцетом и оттяните от тела, обнажив как можно большую часть аорты. Используя гемостат, пережмите восходящую аорту, стараясь не пережать предсердия, и иссеките сердце из грудной клетки.
- Быстро перенесите зажатое сердце на крышку полипропиленовой чашки Петри с примерно 10 мл теплого перфузионного буфера. Поместите зажатое сердце в опорную платформу и используйте стабилизированную иглу 27 G, прикрепленную к коллектору, чтобы ввести 10 мл перфузионного буфера с регулируемой температурой 37 °C в левый желудочек в течение 5 минут.
- Перенесите зажатое сердце и опорную платформу в чашку Петри с примерно 5 мл буфера для пищеварения. Замените входные шприцы на шприц объемом 50 мл с буфером для разложения 25 мл.
- Перед инъекцией очистите коллектор от пузырьков и оставшегося буфера для перфузии. Осторожно вставьте иглу в то же положение иглы в верхушке левого желудочка.
- Используйте перфузионный насос для введения буфера для разложения 37 °C с регулируемой температурой в левый желудочек в течение 15 минут с помощью шприца объемом 50 мл. Контролируйте температуру раствора с помощью водяной рубашки, предварительно откалиброванной для выброса раствора при температуре 37 °C на конце иглы.
- Удалите желудочки из предсердий и пересадите в стакан объемом 10 мл. Добавьте 3 мл буфера для пищеварения в стакан и острыми ножницами разрежьте желудочки на большие куски. Накройте стакан алюминиевой фольгой и поставьте на водяную баню, разогретую до 37 °C, на 5 минут.
- Откажитесь от надосадочной жидкости, стараясь не удалять куски ткани. Ресуспендировать кусочки ткани в 3 мл буфера для разложения и растирать в течение примерно 4 мин или до получения однородной смеси.
- Отфильтруйте клетки через нейлоновый сетчатый фильтр для ячеек размером 70 мкм в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл.
- Верните фильтрат в полипропиленовую пробирку с круглым дном объемом 14 мл и центрифугу в течение 1 мин при 100 об/мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 3 мл стоп-буфера.
- Добавьте 54 мкл 100 мМ запаса CaCl2 в ресуспендированные ячейки для получения конечной концентрацииCaCl2 1,8 мМ. Этот шаг также может быть выполнен поэтапно, чтобы увеличить выход клеток.
- Дайте живым клеткам осесть под действием силы тяжести в течение 10 минут, прежде чем удалять надосадочную жидкость, содержащую мертвые клетки. Ресуспендировать гранулы в растворе для хранения (перфузионный раствор с 200 мкМCaCl2). Эти клетки теперь можно использовать для функциональных экспериментов (например, визуализации/сокращения кальция, пластыря и т. д.), культивирования и т. д.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки также могут быть ресуспендированы в лабораторных или экспериментальных растворах.
5. Клеточная культура
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или с помощью полевого просмотра с помощью сетчатого покровного листа. Поскольку миоциты очень большие, подсчет с помощью гемоцитометра не всегда точен. Это используется, чтобы получить представление о том, сколько примерно клеток было получено из выделения.
- Разбавьте клетки до ~ 25 000 клеток / мл с помощью среды DMEM. Добавьте по 1 мл клеточного раствора в каждую лунку.
- Инкубировать при 37 °C, 95% O 2, 5 % CO 2 в течение2 часов.
- Аккуратно аспирируйте среду DMEM из каждой лунки и добавьте 2 мл среды M199.
- Инкубировать при 37 °C, 95% O 2, 5 % CO2 до 24 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Есть несколько элементов, которые следует учитывать при определении успешности изоляции. Во-первых, кардиомиоциты должны иметь палочковидную форму без мембранных пузырьков, таких как клетки, выделенные на рисунке 1. Типичная изоляция дает ~ 80% миоцитов палочковидной формы. Если выделение дает что-то менее 50% палочковидных клеток, то это считается неудачной изоляцией, и кардиомиоциты не используются. Наконец, кардиомиоциты должны находиться в состоянии покоя. Спонтанное сокращение миоцитов демонстрирует непереносимость Ca2+ и дает ненадежные данные. Из всех выделений, выполненных с использованием вышеописанной техники, почти все выделения считаются успешными. Культивируемые кардиомиоциты считаются успешными, если они имеют палочковидную форму без мембранных пузырьков или закругленных краев с высокой выживаемостью (рис. 2).
Таблица 1. Приведена таблица отмеченных различий между нашим методом, методами Лангендорфа и ранее опубликованными методами выделения кардиомиоцитов мышей без Лангендорфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Концентрации буферных сред. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Рисунок 1. (A) 4-месячные кардиомиоциты мыши C57Bl / 6, визуализированные с помощью светлопольной микроскопии. Доходность: ~80%; 20-кратное увеличение. (B) Изображение яркого поля кардиомиоцита мыши C57Bl/6 в возрасте 4 месяцев. Кардиомиоциты находятся в состоянии покоя, имеют палочковидную форму без мембранных пузырьков. Масштабная линейка составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. (A) 4-месячные кардиомиоциты мыши C57Bl/6, культивируемые в течение 24 ч в среде M199. Жизнеспособность: ~80%; 20-кратное увеличение. (B) Миоциты, культивируемые в течение 24 ч. Через 24 часа кардиомиоциты имеют палочковидную форму без мембранных пузырьков. (C) % кривая выживаемости для кардиомиоцитов, культивируемых в течение 24 ч с использованием описанного способа. Масштабная линейка составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основное преимущество нашей методики выделения кардиомиоцитов без Лангендорфа заключается в том, что она ограничивает время гипоксии и ишемии, не требуя канюляции в аппарате Лангендорфа. В отличие от классических методов Лангендорфа, которые занимают несколько минут для удаления, очистки и подвешивания сердца, что часто приводит к ишемическому повреждению миоцита, наш метод включает очистку крови in vivo с помощью ледяного очищающего раствора. Ледяной очищающий буфер содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), необратимо хелатирует двухвалентные катионы для эффективного удаления кальция, что делает его отличным антикоагулянтом, и, следовательно, останавливает сокращение23. Использование ледяных растворов ингибирует сокращение, замедляя ионный обмен и скорость клеточного метаболизма, предотвращая повреждение, вызванное ишемией24. Устраняя необходимость в канюляции аорты, методы, свободные от Лангендорфа, создают надежные миоциты, что приводит к более надежной подготовке для получения достоверных данных, что не всегда имеет место для методов выделения Лангендорфа.
Это разновидность ранее опубликованной методики изоляции без Лангендорфа18 с адаптациями, как показано в таблице 1. Самое главное, что этот метод вводит стабилизирующую платформу, которая ограничивает количество раз, когда игла должна быть удалена и заменена из сердца. Любое ненужное движение, введенное в иглу при введении в желудочек, расширяет место прокола. Более широкое место прокола приводит к обратному оттоку из желудочка от места прокола, снижению давления в сердце и уменьшению притока к коронарным артериям. Эта проблема устранена с помощью стабилизирующей платформы. Ограничивая движение иглы и количество раз, когда игла удаляется и заменяется (один по сравнению с тремя разами, как описаноранее 18), мы поддерживаем постоянный поток к коронарным артериям и последовательно достигаем пищеварения. Еще одной ключевой адаптацией было добавление рубашки с регулируемой температурой для поддержания растворов ферментов при 37 ° C при входе в сердце (температурная ванна была откалибрована для выброса при 37 ° C из иглы). Используемый фермент пищеварения обладает оптимальной реакционной активностью при 37 ° C, а добавление контроля температуры увеличивает активность фермента, тем самым уменьшая время пищеварения. Либераза также имеет минимальную вариабельность от партии к партии и имеет более высокую воспроизводимость по сравнению с другими ферментами. Другой адаптацией предыдущих методов является уменьшение количества впрыскиваемого очищающего раствора. Уменьшение количества очищающего буфера для проникновения в сердце и разрешение на очистку большего количества крови перфузионным буфером уменьшает инактивацию фермента пищеварения ЭДТА. Еще одна причина, по которой наш метод последовательно обеспечивает успешное выделение миоцитов, заключается в использовании BDM. BDM является ингибитором миозина, который предотвращает механизм силового удара саркомера, тем самым препятствуя сокращению и ограничивая повреждение реоксигенацией во время пищеварения. Ограничивая сокращение, мы предотвращаем круговорот кальция и неотъемлемую продукцию активных форм кислорода при сокращении миоцитов в культуре. Поскольку питательная среда содержит кальций, возможно, что миоциты могут сокращаться и уменьшать последующий выход после культивирования. Мы решили культивировать миоциты в BDM, чтобы предотвратить сокращение и увеличить выход25,26. BDM всегда можно вымыть из миоцитов для функциональных измерений после культивирования с большим успехом. В качестве альтернативы, все этапы этой процедуры могут быть выполнены без добавления BDM, но выделения не могут считаться «успешными» на изолированных миоцитах без BDM.
Помимо ишемического времени, есть много других факторов, которые будут определять, будет ли изоляция производить прочные миоциты. Поскольку в отдельных лабораториях существуют различные условия, лицам, выполняющим изоляцию, может потребоваться изменить количество фермента и/или кальция, время перфузии и/или скорость насоса, а также скорость и/или время качания водяной бани. Эти параметры будут зависеть от используемой модели мыши, например, здоровая или больная, стареющая и т. д.
Хотя этот метод не требует хирургических навыков, необходимых для методов, основанных на методах Лангендорфа, все же есть важные шаги, чтобы сделать технику успешной. Наиболее распространенная проблема, которая приводит к плохим миоцитам с помощью этого метода, связана с тем, что пузырьки попадают в систему перфузии и блокируют ткань миокарда от доступа к буферу перфузии. Решением этой проблемы является тщательная практика, чтобы избежать пузырьков (с помощью правильной техники очистки шприца, правильной техники очистки иглы, отрыжки многообразия пузырьков при смене шприцев и т. Д.), А также нескольких точек выхода из системы перфузии в случае, если пузырь застрял в коллекторе. Без пузырьков, по нашему опыту, мы получаем почти 100% успешных выделений миоцитов (определяемых как более 50% палочковидных миоцитов; среднее значение составляет ~ 80%).
В то время как метод был упрощен за счет удаления хирургического навыка, необходимого для метода Лангендорфа, этот адаптированный метод был опробован только на мышах. Еще одно преимущество метода без Лангендорфа заключается в том, что его можно использовать для многих мышиных моделей (т.е. от новорожденного до стареющего), как описано ранее19. К сожалению, более крупные млекопитающие (например, собаки, свиньи и т. д.) не подходят для этой техники из-за размера их сердец. Было бы невозможно перфузировать сердце достаточным количеством раствора, чтобы получить надежные миоциты.
Наша адаптация метода без Лангендорфа является надежным методом для успешного выделения кардиомиоцитов мыши. По сравнению с методом Лангендорфа, этот альтернативный подход требует небольших технических навыков для последовательного получения кардиомиоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) и T32 HL134616 (Sturgill and Salyer).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
- Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
- Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
- Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).
- Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
- Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
- Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
- Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
- Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
- Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).
- Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
- Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
- Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).
- Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).
- Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
- Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).
