Summary
細胞および分子機能実験の心臓病学のゴールドスタンダードは心筋細胞です。この記事では、マウス心筋細胞を単離するための非ランゲンドルフ法への適応について説明します。
Abstract
高品質の心筋細胞を生成する再現性がありながら技術的に単純な方法の必要性は、心臓生物学の研究に不可欠です。心筋細胞に関する細胞および分子機能実験(収縮、電気生理学、カルシウムサイクリングなど)は、疾患のメカニズムを確立するためのゴールドスタンダードです。マウスは機能実験に最適な種であり、記載された技術は特にマウス心筋細胞の単離のためのものです。ランゲンドルフ装置を必要とする以前の方法では、大動脈カニュレーションのために高レベルのトレーニングと精度が必要であり、しばしば虚血を引き起こします。この分野は、シンプルで再現性があり、生理学的データの取得と培養のために生存可能な筋細胞を生成するランゲンドルフフリーの分離方法に移行しています。これらの方法は、大動脈カニュレーションと比較して虚血時間を大幅に短縮し、確実に心筋細胞を得る。ランゲンドルフフリー法への適応には、氷冷透明化溶液による初期灌流、灌流中に安定した針を保証する安定化プラットフォームの使用、および機能測定および培養に使用する心筋細胞を確実に取得するための追加の消化ステップが含まれます。この方法は簡単かつ迅速に実行でき、技術的なスキルはほとんど必要ありません。
Introduction
何十年もの間、心臓生物学の文献に不可欠なアイデアは、分子作用機序です。信頼できる研究を発表するためには、作用機序を確立する必要があります。分子メカニズムを決定するための確立された戦略は、信頼できるデータを得るために高品質の心筋細胞を必要とする単離心筋細胞研究です。作用機序を決定するために心筋細胞に対して行われる細胞および分子実験は、収縮1、電気生理学2、カルシウム(Ca2+)サイクリング3、筋フィラメントCa2+感受性4、細胞骨格5、代謝6、ホルモンの影響7、シグナル伝達分子8、薬物研究9等。マウスは、遺伝子操作の容易さ、サイズが小さく、寿命が比較的短く、低コストなどにより、ほとんどの心臓生物学実験に最適な種になっています10。しかし、高品質のマウス心筋細胞の信頼性の高い単離は、現在の技術では自明ではありません。
ラボは、ほぼ70年間心筋細胞を分離してきました11。心筋細胞を単離する事実上すべての技術は、さまざまな酵素(コラゲナーゼ、プロテアーゼ、トリプシンなど)を介した心臓の消化に依存しています。初期(1950年代から1960年代)には、心臓を取り除き、はるかに小さな断片に切断し、コラゲナーゼ/プロテアーゼ/トリプシン12を含む溶液中でインキュベートするチャンク法が採用されました。1970年代の研究室では、冠状動脈灌流ベースの分離技術(ランゲンドルフ装置を介した酵素による逆行性灌流)を使用して心筋細胞を単離する改善された「ランゲンドルフ」法13を実施しました。この技術は、今日でもこの分野で筋細胞単離の支配的な方法であり、~50年後の14,15,16。最近の研究では、低酸素時間と虚血性損傷を制限するためにin vivoで心臓をカニューレ挿入することに移行し、優れた心筋細胞分離(より良い収量とより高い品質)をもたらします17。最近、これはin vivoで行う、ランゲンドルフフリー心臓灌流18、19、20、21、22に進化した。私たちは、Ackers-Johnsonら18技術に基づいてランゲンドルフフリー心筋細胞分離技術を進化させ、以前の多くの分離技術からさまざまなコンポーネントを採用しました。これらの重要な適応には、氷冷透明化バッファーの注入と、針を安定させるための支持プラットフォームの組み込みが含まれ、心臓の操作を減らします。また、この技術で詳細には、注入されたバッファーの温度制御(37°C)があり、以前に発表されたEDTA灌流が少ないため、in vivo注入から消化までの時間が短縮されました18。心臓の操作を減少させ、したがって穿刺部位のサイズを最小化することによって、冠状動脈の徹底的かつ一定の灌流が得られる。また、二次チャンク法による消化、注入した透明化バッファー中のEDTAの量、およびpHの変更により、この技術を改良しました。ここで説明した技術は、ランゲンドルフ装置を使用する場合と比較して、信頼性が高く、効率的であり、広範なトレーニング/練習を必要としません(表1)。
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Protocol
この研究で実施されたすべての手順は、NIHガイドラインに従って、オハイオ州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. 溶液調製
注:バッファー濃度については 、表2 を参照してください。
- 分離前(筋細胞分離の2週間前まで)
- 灌流バッファーベース:1 Lの超高純度18.2 MΩ·cm H 2 Oに1Lの灌流バッファーベース(NaCl、KCl、NaH2PO 4、HEPES、グルコース、およびBDM)を調製し、0.22 μmの滅菌ろ過の前にpH7.4に調整します。隔離当日まで4°Cで保存してください。
- 透明化バッファー:1 Lの超高純度18.2 MΩ·cm H 2 O中に1Lの透明バッファー(NaCl、KCl、NaH2PO 4、HEPES、グルコース、EDTA、およびBDM)を調製し、0.22 μmの滅菌ろ過の前にpH7.4に調整します。隔離当日まで4°Cで保存してください。
- 100 mM CaCl 2ストック溶液:1.11 gのCaCl 2を秤量し、100 mLの超高純度18.2 MΩ・cm H2 Oに溶解し、分離日まで室温で保存します。
- リベラーゼアリコート:5 mgの消化酵素を5 mLの滅菌RNaseフリー水に溶解します。0.8 mLアリコートを調製し、分離日まで-20°Cで保存します。
- ディッシュをラミネートする:100 μLの40 μg/mLマウスラミニンを滅菌済みのガラス底30 mLペトリ皿に塗布します。30分間放置し、余分なラミニンを取り除きます。ラミニンをUVインキュベーションしたペトリ皿に室温で30分間セットします。隔離当日まで4°Cで保存してください(ラミネートシャーレは最大2週間使用できます)。
- DMEM培地:バイオセーフティキャビネットに、2.5 mLのFBS、0.5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン(50 U/mL-50 μg)、および1 mLの500 mM BDMを46 mLのDMEMに追加します。分離日まで4°Cで保存してください(培地は最大2週間使用できます)。
- M199培地:1 Lの超高純度18.2 MΩ·cm H2Oに1 LのM199培地(NaHCO3、HEPES、L-グルタチオン、M199、BDM、およびBSA)を調製し、滅菌ろ過(0.22 μmフィルター)の前にpH 7.4に調整します。隔離当日まで4°Cで保存してください。
- 500 mM BDMストック:10 mLの超高純度18.2 MΩ·cm H2Oに0.5 gのBDMを加え、分離日まで4°Cで保存します。
- プラットフォーム作成の安定化:ルアー活栓にねじ込まれた針の付け根の周りにプレイドウを成形します。心臓を含むペトリ皿に成形し、針が心室注射に適した高さ(皿の底から~5 mm上)にあることを確認します。
- 隔離の日
- 灌流バッファー:単離当日に、9.5 mgのMgCl2 を100 mLの灌流バッファーベースに追加します。完全に混合してから、30 mLの完成した灌流バッファーを除去し、スクリューキャップ蓋付きの清潔で広口の100 mLガラス瓶に入れます(消化バッファー)。
注:これらの添加は、pHをほとんど変化させないため、追加のpH調整なしで分離当日に行うことができます。- 12 mLの灌流バッファーを取り除き、横に置きます(ストップバッファー)。残りの58 mLの灌流バッファーを、スクリューキャップ蓋付きの別の清潔で広口の100 mLガラス瓶に注ぎます。残りの灌流バッファーは、単離全体を通して37°Cで保存します。
- 消化バッファー:7.5 μLの100 mM CaCl2 を30 mLの灌流バッファーに加え、最終濃度25 μMにします。 単離の直前に、770 μLのリベラーゼを消化バッファーに追加し、最終濃度を26 μg/mLにします。
- ストップバッファー:240 mgのBSAを12 mLの灌流バッファーに溶解します。隔離中は37°Cで保存してください。
- 透明化バッファー:透明化バッファーの3 mLシリンジを準備し、針から気泡を取り除きます。隔離されるまで氷上に保管してください。
- 灌流バッファー:単離当日に、9.5 mgのMgCl2 を100 mLの灌流バッファーベースに追加します。完全に混合してから、30 mLの完成した灌流バッファーを除去し、スクリューキャップ蓋付きの清潔で広口の100 mLガラス瓶に入れます(消化バッファー)。
2. マニホールドの準備
- 温度制御されたマニホールドを新たに調製した灌流バッファーで取り除き、気泡が残らないように注意します。ルアーロックコネクタを使用して、27 Gの針をねじ込み、気泡を取り除きます。クリアされたマニホールドは、アイソレーションを成功させるために不可欠です。
3.動物の準備
- 単離の直前に、マウスに体重で100 mg / kgのケタミンと20 mg / kgのキシラジンを腹腔内注射します。.この手順では、生後4か月の雄のC57Bl/6マウスを使用しました。
- 必要に応じて、鎮静を促すために加熱された外科用パッドの上にマウスを置きます。マウスの腕にテントを張り、手足と尾の付け根を青いラボ用おむつにテープで留めます。つま先のつまみ反射の撤退によって動物が完全に麻酔されていることを確認してください。手術部位の周りに滅菌ドレープを適用します。
4.心筋細胞分離手順
- マウスの胸骨を露出させ、正中線の横方向に、肋骨と腋窩を近位に切断します。横隔膜を静かに完全に切断し、心臓を避けるために浅い切断を確実にします。胸骨を止血剤で固定し、肋骨を後方に折りたたんで胸腔を露出させます。
- 心臓から心膜を静かに取り除き、心臓のすぐ遠位にある下大静脈を完全に切断します。27 G針付きの3 mLシリンジを使用して、3 mLの氷冷透明化バッファーを心臓の右心室に1分間すばやく注入します。
- ピンセットを使用して心臓をそっと保持し、体から引き離して、できるだけ多くの大動脈を露出させます。止血剤を使用して、心房を固定しないように注意しながら上行大動脈を固定し、胸部から心臓を切除します。
- クランプされた心臓を、約10 mLの温かい灌流バッファーを含むポリプロピレンペトリ皿の蓋にすばやく移します。クランプされた心臓を支持プラットフォームに置き、マニホールドに取り付けられた安定化された27 G針を使用して、温度制御された37°C灌流バッファー10 mLを左心室に5分間注入します。
- クランプされた心臓と支持プラットフォームを、約5 mLの消化バッファーを含むペトリ皿に移します。インプットシリンジを25 mLの消化バッファーを含む50 mLシリンジに交換します。
- 注入前に、マニホールドから気泡と残りの灌流バッファーを取り除きます。針を左心室頂点の同じ針位置に慎重に交換します。
- 灌流ポンプを使用して、温度制御された37°Cの消化バッファーを50 mLシリンジを使用して左心室に15分間注入します。針の端で37°Cの溶液を排出するように事前に校正されたウォータージャケットで溶液の温度を制御します。
- 心房から心室を取り除き、10mLビーカーに移します。3 mLの消化バッファーをビーカーに加え、鋭利なハサミを使用して心室を大きな塊に切ります。ビーカーをアルミホイルで覆い、37°Cに予熱した振とう水浴に5分間入れます。
- 組織の塊を取り除かないように注意しながら、上清を廃棄します。組織チャンクを3 mLの消化バッファーに再懸濁し、約4分間、または均一な混合物が得られるまで粉砕します。
- 70 μmのナイロンセルストレーナーを通して細胞をろ過し、50 mLのポリプロピレンチューブに入れます。
- ろ液を14 mLの丸底ポリプロピレンチューブに戻し、100 rpmで1分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを3 mLのストップバッファーに再懸濁します。
- 54 μLの100 mM CaCl 2ストックを再懸濁セルに加え、最終CaCl2濃度を1.8 mMにします。この工程は、細胞収率を増加させるために段階的に実施することもできる。
- 生細胞を重力で10分間沈降させてから、死細胞を含む上清を除去します。ペレットを保存溶液(200μMCaCl2を含む灌流溶液)に再懸濁する。これらの細胞は、機能実験(カルシウムイメージング/収縮、パッチクランプなど)、培養などに使用できます。
注:細胞は、ラボまたは実験に依存する溶液に再懸濁することもできます。
5. 細胞培養
- 血球計算盤を使用して、またはグリッドカバースリップを使用してフィールドビューカウントによって細胞をカウントします。筋細胞は非常に大きいため、血球計算盤を使用したカウントは必ずしも正確ではありません。これは、分離から得られたおおよその細胞数のアイデアを得るために使用されます。
- 細胞をDMEM培地で~25,000細胞/mLに希釈します。各ウェルに1 mLの細胞溶液を加えます。
- 37°C、95%O 2、5%CO2で2時間インキュベートします。
- 各ウェルからDMEM培地を穏やかに吸引し、2 mLのM199培地を加えます。
- 37°C、95%O 2、5%CO2で最大24時間インキュベートします。
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Representative Results
分離の成功を判断する際に調べる要素がいくつかあります。まず、心筋細胞は、 図1で単離された細胞のように、膜のブレブのない棒状でなければなりません。典型的な単離では、筋細胞の~80%が棒状になります。単離によって50%未満の棒状細胞が得られる場合、それは失敗した単離と見なされ、心筋細胞は使用されません。最後に、心筋細胞は静止している必要があります。自発的に収縮する筋細胞はCa2+不耐性を示し、信頼性の低いデータを生成します。上記の手法を使用して実行されたすべての分離のうち、ほぼすべての分離が成功したと見なされます。培養心筋細胞は、膜のブレブのない棒状または高い生存率で丸みを帯びたエッジである場合に成功と見なされます(図2)。
表 1.私たちの方法、ランゲンドルフ法、および以前に発表されたランゲンドルフフリーのマウス心筋細胞単離法との顕著な違いの表。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:緩衝液濃度。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 1.(A)明視野顕微鏡を用いて画像化した生後4ヶ月のC57Bl/6マウス心筋細胞。収率: ~80%;倍率20倍。(B)生後4ヶ月のC57Bl/6マウス心筋細胞の明視野画像。心筋細胞は静止しており、膜ブレブのない棒状を呈する。スケールバーは100μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.(A)生後4ヶ月のC57Bl/6マウス心筋細胞をM199培地で24時間培養した。生存率: ~80%;倍率20倍。(B)筋細胞を24時間培養する。24時間後、心筋細胞は膜ブレブのない棒状を示す。(c)記載の方法を用いて24時間培養した心筋細胞についての%生存曲線。スケールバーは100μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
当社のランゲンドルフフリー心筋細胞分離技術の主な利点は、ランゲンドルフ装置へのカニューレ挿入を必要としないため、低酸素症と虚血時間を制限することです。心臓の除去、洗浄、吊り下げに数分かかり、筋細胞に虚血性損傷をもたらすことが多い古典的なランゲンドルフ技術の代わりに、私たちの方法には、氷冷透明化溶液を介したin vivo血液透明化が含まれます。氷冷透明化バッファーはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含み、二価カチオンを不可逆的にキレート化してカルシウムを効率的に除去し、優れた抗凝固剤にし、したがって収縮を停止します23。氷冷溶液の使用は、イオン交換および細胞代謝速度を遅くすることによって収縮を阻害し、虚血によって引き起こされる損傷を防止する24。大動脈カニュレーションの必要性を排除することにより、ランゲンドルフフリー技術は堅牢な筋細胞を生成し、信頼性の高いデータを生成するためのより信頼性の高い調製をもたらしますが、ランゲンドルフの分離法では必ずしもそうではありません。
これは、以前に発表されたランゲンドルフフリー分離技術18のバリエーションであり、表1で強調表示されているような適応があります。最も重要なことは、この技術は、針を取り外して心臓から交換しなければならない回数を制限する安定化プラットフォームを導入することです。心室に挿入されている間に針に不必要な動きが導入されると、穿刺部位が広がります。穿刺部位が広いと、穿刺部位から心室から逆流し、心臓の圧力が低下し、冠状動脈への流れが減少します。この問題は、安定化プラットフォームを使用することで修正されます。針の動きと針の取り外しと交換の回数を制限することにより(前述の18の3回と比較して1回)、冠状動脈への一貫した流れを維持し、一貫して消化を達成します。もう一つの重要な適応は、心臓に入るときに酵素溶液を37°Cに維持するための温度制御ジャケットの追加でした(温度浴は針から37°Cで排出されるように較正されました)。使用する消化酵素は37°Cで最適な反応活性を持ち、温度制御を加えると酵素活性が高まり、消化時間が短縮されます。リベラーゼはまた、ロット間の変動が最小限であり、他の酵素と比較して高い再現性を有する。以前の技術の別の適応は、注入された透明化溶液の量の減少である。心臓に入る透明化バッファーの量を減らし、灌流バッファーによってより多くの血液を透明化できるようにすると、EDTAによる消化酵素の不活性化が減少します。また、筋細胞単離を一貫して成功させているもう一つの理由は、BDMの使用によるものです。BDMは、サルコメアのパワーストロークメカニズムを予防し、それによって収縮を抑制し、消化中の再酸素化傷害を制限するミオシン阻害剤です。収縮を制限することにより、培養中の収縮筋細胞におけるカルシウムサイクルと固有の活性酸素種の産生を防ぎます。培地にはカルシウムが含まれているため、筋細胞が収縮し、培養後にその後の収量が低下する可能性があります。私たちは、収縮を防ぎ、収量を増やすために、BDMで筋細胞を培養することを選択しました25,26。BDMは、培養後の機能測定のために筋細胞からいつでも洗い流すことができ、大成功を収めています。あるいは、この手順のすべてのステップは、BDMを添加することなく実行することができるが、単離は、BDMフリーの単離された筋細胞上で「成功」とは見なされない可能性がある。
虚血時間に加えて、単離が堅牢な筋細胞を生成するかどうかを決定する他の多くの要因があります。個々のラボには異なる条件があるため、分離を行う人は、酵素および/またはカルシウムの量、灌流時間および/またはポンプ速度、および揺動水浴速度および/または時間を変更する必要がある場合があります。これらのパラメータは、健康または疾患、老化など、使用されるマウスモデルに依存する。
この技術は、ランゲンドルフベースの技術に必要な外科的スキルを必要としませんが、テクニックを成功させるための重要なステップがまだあります。この技術で貧弱な筋細胞を生成する最も一般的な問題は、気泡が灌流系に入り、心筋組織が灌流バッファーにアクセスするのを妨げるためです。この問題の解決策は、気泡を回避するための慎重な実践(適切な シリンジクリアランス技術、適切な針クリアランス技術、シリンジ交換時の気泡のマニホールドのげっぷなど)、および気泡がマニホールドに留まった場合の灌流システムからの複数の出口点です。気泡がなければ、私たちの経験では、ほぼ100%成功した筋細胞分離が得られます(50%以上の棒状筋細胞と定義され、平均は~80%です)。
この方法は、ランゲンドルフ法に必要な外科的スキルを取り除くことによって単純化されましたが、この適応された方法はマウスでのみ試みられました。ランゲンドルフフリー法の別の利点は、前述のように、多くのマウスモデル(すなわち、新生児から老化まで)に使用できることです19。残念ながら、大型哺乳類(犬、ブタなど)は、心臓の大きさのためにこの技術には適していません。信頼できる筋細胞を獲得するのに十分な溶液を心臓に灌流することは不可能であろう。
ランゲンドルフフリー法の適応は、マウス心筋細胞の単離を成功させるための信頼できる方法です。ランゲンドルフ法と比較して、この代替アプローチは、心筋細胞を一貫して得るための技術的スキルをほとんど必要としません。
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Disclosures
開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所助成金R01 HL114940(Biesiadecki)、R01 AG060542(Ziolo)、およびT32 HL134616(SturgillとSalyer)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
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