Summary
L’étalon-or en cardiologie pour les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires sont les cardiomyocytes. Cet article décrit les adaptations à la technique non-Langendorff pour isoler les cardiomyocytes de souris.
Abstract
Le besoin de méthodes reproductibles mais techniquement simples produisant des cardiomyocytes de haute qualité est essentiel pour la recherche en biologie cardiaque. Les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires (p. ex. contraction, électrophysiologie, cycle du calcium, etc.) sur les cardiomyocytes sont l’étalon-or pour établir le(s) mécanisme(s) de la maladie. La souris est l’espèce de choix pour les expériences fonctionnelles et la technique décrite est spécifiquement pour l’isolement des cardiomyocytes de souris. Les méthodes antérieures nécessitant un appareil de Langendorff nécessitent des niveaux élevés d’entraînement et de précision pour la canulation aortique, entraînant souvent une ischémie. Le domaine évolue vers des méthodes d’isolement sans Langendorff qui sont simples, reproductibles et produisent des myocytes viables pour l’acquisition de données physiologiques et la culture. Ces méthodes diminuent considérablement le temps d’ischémie par rapport à la canulation aortique et permettent d’obtenir des cardiomyocytes obtenus de manière fiable. Notre adaptation à la méthode sans Langendorff comprend une perfusion initiale avec une solution de nettoyage glacé, l’utilisation d’une plate-forme stabilisatrice qui assure une aiguille stable pendant la perfusion et des étapes de digestion supplémentaires pour garantir un obtention fiable de cardiomyocytes pour une utilisation dans les mesures fonctionnelles et la culture. Cette méthode est simple et rapide à réaliser et nécessite peu de compétences techniques.
Introduction
Pendant des décennies, une idée essentielle dans la littérature en biologie cardiaque est le mécanisme moléculaire de l’action. Le mécanisme d’action doit être établi afin de publier des études fiables. Une stratégie bien établie pour déterminer le mécanisme moléculaire consiste en des études de cardiomyocytes isolés, qui nécessitent des cardiomyocytes de haute qualité pour obtenir des données fiables. Les expériences cellulaires et moléculaires effectuées sur les cardiomyocytes pour déterminer le mécanisme d’action sont l’étalon-or pour étudier la contraction1, l’électrophysiologie2, le cycle du calcium (Ca 2+)3, la sensibilité du myofilament Ca2+ 4, le cytosquelette5, le métabolisme6, les effets des hormones7, les molécules de signalisation8, les études sur les médicaments9 etc. La souris est devenue l’espèce de choix pour la plupart des expériences de biologie cardiaque en raison de la facilité de manipulation génétique, de sa petite taille, de sa durée de vie relativement courte, de son faible coût, etc.10. Cependant, l’isolement fiable des cardiomyocytes de souris de haute qualité n’est pas trivial avec les techniques actuelles.
Les laboratoires isolent les cardiomyocytes depuis près de 70 ans11. Pratiquement toutes les techniques d’isolement des cardiomyocytes reposent sur la digestion du cœur via diverses enzymes (collagénase, protéase, trypsine, etc.). Dans les premières périodes (années 1950-1960), la méthode des morceaux a été utilisée, qui consistait à retirer le cœur, à couper en morceaux beaucoup plus petits et à incuber en solution avec collagénase / protéase / trypsine12. Dans les années 1970, les laboratoires ont mis en œuvre la méthode améliorée « Langendorff »13, qui isolait les cardiomyocytes à l’aide d’une technique d’isolement basée sur la perfusion des artères coronaires (perfusion rétrograde avec enzyme via l’appareil de Langendorff); Cette technique reste la méthode dominante d’isolement des myocytes dans le domaine aujourd’hui, ~50 ans plus tard14,15,16. Des travaux récents se sont tournés vers la canulation du cœur in vivo pour limiter le temps d’hypoxie et les dommages ischémiques, ce qui a entraîné des isolements de cardiomyocytes supérieurs (meilleurs rendements et meilleure qualité)17. Récemment, cela a évolué pour effectuer in vivo, des perfusions cardiaques sans Langendorff 18,19,20,21,22. Nous avons fait évoluer la technique d’isolation des cardiomyocytes sans Langendorff basée sur la technique d’Ackers-Johnson et al.18 et adapté divers composants des nombreuses techniques d’isolement précédentes. Ces adaptations clés comprennent l’injection d’un tampon de nettoyage glacé et l’incorporation d’une plate-forme de soutien pour stabiliser l’aiguille, ce qui permet de réduire la manipulation du cœur. Cette technique détaille également le contrôle de la température des tampons injectés (37 °C), qui réduit le temps entre l’injection in vivo et la digestion en raison d’une perfusion réduite d’EDTA, comme publié précédemment18. En diminuant la manipulation du cœur et donc en minimisant la taille du site de ponction, on obtient une perfusion complète et constante des artères coronaires. Nous avons également affiné la technique avec une méthode de digestion secondaire en morceaux, la quantité d’EDTA dans le tampon de compensation injecté et modifié le pH. Notre technique décrite est plus fiable, plus efficace et ne nécessite pas la formation / pratique approfondie par rapport à l’utilisation de l’appareil Langendorff (tableau 1).
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Protocol
Toutes les procédures effectuées dans cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Ohio State University conformément aux directives des NIH.
1. Préparation de la solution
NOTA : Veuillez consulter le tableau 2 pour connaître les concentrations de tampons.
- Pré-isolement (jusqu’à 2 semaines avant l’isolement des myocytes
- Base tampon de perfusion : Préparer 1 L de base tampon de perfusion (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose et BDM) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H2O ultrapur. Ajuster à pH7,4 avant la filtration stérile de 0,22 μm. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.
- Tampon de nettoyage: Préparer 1 L de tampon de nettoyage (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose, EDTA et BDM) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H2O ultrapur. Ajuster à pH7,4 avant une filtration stérile de 0,22 μm. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.
- Solution mère de CaCl 2 de 100 mM : Peser 1,11 g de CaCl 2 et dissoudre dans 100 mL de 18,2 MΩ·cm H2 O ultrapure. Conserver à température ambiantejusqu’au jour de l’isolement.
- Aliquotes liberase : Dissoudre 5 mg d’enzymes digestives dans 5 mL d’eau stérile sans RNase. Préparer 0,8 mL d’aliquotes et conserver à -20 °C jusqu’au jour de l’isolement.
- Laminer les plats : Appliquer 100 μL de laminine de souris à 40 μg/mL sur des boîtes de Petri stériles de 30 ml à fond de verre. Laisser reposer pendant 30 minutes et enlever l’excès de laminine. Réglez la laminine sur une boîte de Petri avec incubation UV à température ambiante pendant 30 min. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement (les boîtes de Petri laminées peuvent être utilisées jusqu’à 2 semaines).
- Milieu DMEM : Dans une enceinte de biosécurité, ajouter 2,5 mL de FBS, 0,5 mL de Pénicilline-Streptomycine (50 U/mL-50 μg) et 1 mL de 500 mM de BDM à 46 mL de DMEM. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement (le milieu peut être utilisé jusqu’à 2 semaines).
- Milieu M199 : Préparer 1 L de milieu M199 (NaHCO3, HEPES, L-glutathion, M199, BDM et BSA) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H2O ultrapur. Ajuster à pH 7,4 avant la filtration stérile (filtre de 0,22 μm). Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.
- Stock de BDM 500 mM : Ajouter 0,5 g de BDM à 10 mL de 18,2 MΩ·cm H2O ultrapur. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.
- Création de plate-forme stabilisatrice: pâte à modeler autour de la base de l’aiguille vissée dans le robinet d’arrêt Luer. Mouler dans la boîte de Petri qui contiendra le cœur et s’assurer que l’aiguille est à la bonne hauteur pour l’injection du ventricule (~5 mm au-dessus du fond de la boîte).
- Le jour de l’isolement
- Tampon de perfusion : Le jour de l’isolement, ajouter 9,5 mg de MgCl2 à 100 mL de base tampon de perfusion. Laisser mélanger complètement avant de retirer 30 ml de tampon de perfusion terminé et placer dans une bouteille de verre propre et à large ouverture de 100 ml munie d’un couvercle à vis (tampon de digestion).
REMARQUE : Ces ajouts peuvent être effectués le jour de l’isolement sans ajustement supplémentaire du pH, car leur ajout modifie de façon négligeable le pH.- Retirer 12 ml de tampon de perfusion et placer sur le côté (tampon d’arrêt). Versez les 58 ml restants de tampon de perfusion dans une autre bouteille en verre propre et à large ouverture de 100 ml munie d’un couvercle à vis. Entreposer le tampon de perfusion restant à 37 °C pendant toute la durée de l’isolement.
- Tampon de digestion : Ajouter 7,5 μL de CaCl100 mM 2 à 30 mL de tampon de perfusion pour une concentration finale de 25 μM. Immédiatement avant l’isolement, ajouter 770 μL de Liberase au tampon de digestion pour une concentration finale de 26 μg/mL.
- Tampon d’arrêt : Dissoudre 240 mg de BSA dans 12 mL de tampon de perfusion. Conserver à 37 °C pendant toute la durée de l’isolement.
- Tampon d’élimination : Préparez une seringue de 3 ml de tampon de nettoyage et débarrassez-vous de l’aiguille des bulles. Conserver sur de la glace jusqu’à l’isolement.
- Tampon de perfusion : Le jour de l’isolement, ajouter 9,5 mg de MgCl2 à 100 mL de base tampon de perfusion. Laisser mélanger complètement avant de retirer 30 ml de tampon de perfusion terminé et placer dans une bouteille de verre propre et à large ouverture de 100 ml munie d’un couvercle à vis (tampon de digestion).
2. Préparation du collecteur
- Dégagez le collecteur à température contrôlée avec un tampon de perfusion fraîchement préparé, en veillant à ne pas laisser de bulles. À l’aide d’un connecteur Luer lock, vissez une aiguille de 27 G et débarrassez-vous des bulles. Un collecteur dégagé est essentiel pour un isolement réussi.
3. Préparation des animaux
- Injecter à la souris par voie intrapéritonéale 100 mg/kg de kétamine et 20 mg/kg de xylazine en poids corporel immédiatement avant l’isolement. Cette procédure a utilisé une souris C57Bl/6 mâle âgée de 4 mois.
- Si nécessaire, placez la souris sur un coussin chirurgical chauffé pour encourager la sédation. Tendez les bras de la souris et collez les membres et la base de la queue à une couche de laboratoire bleue. S’assurer que l’animal est complètement anesthésié par le retrait du réflexe de pincement des orteils. Appliquez un champ stérile autour de la zone chirurgicale.
4. Procédure d’isolement des cardiomyocytes
- Exposez le sternum de la souris et, latéralement à la ligne médiane, coupez proximale à travers les côtes et à l’aisselle. Couper doucement complètement à travers le diaphragme, en assurant des coupures peu profondes pour éviter le cœur. Serrez le sternum avec un hémostatique et pliez les côtes vers l’arrière pour exposer la cavité thoracique.
- Retirez doucement le péricarde du cœur et coupez complètement la veine cave inférieure, immédiatement distale au cœur. Utilisez une seringue de 3 mL avec une aiguille de 27 G pour injecter rapidement 3 mL de tampon de nettoyage glacé dans le ventricule droit du cœur pendant 1 min.
- Tenez doucement le cœur à l’aide d’une pince à épiler et éloignez-vous du corps, en exposant autant que possible l’aorte. À l’aide d’un hémostatique, serrez l’aorte ascendante, en prenant soin de ne pas serrer les oreillettes, et excisez le cœur de la poitrine.
- Transférer rapidement le cœur serré sur le couvercle d’une boîte de Petri en polypropylène avec environ 10 ml de tampon de perfusion chaude. Placez le cœur serré dans la plate-forme de support et utilisez une aiguille stabilisée de 27 G fixée au collecteur pour injecter 10 ml de tampon de perfusion à température contrôlée à 37 °C dans le ventricule gauche pendant 5 minutes.
- Transférer le cœur serré et la plate-forme de soutien dans une boîte de Petri avec environ 5 ml de tampon de digestion. Échangez les seringues d’entrée contre une seringue de 50 mL avec 25 mL de tampon de digestion.
- Débarrassez le collecteur de toute bulle et du tampon de perfusion restant avant l’injection. Replacez délicatement l’aiguille dans la même position d’aiguille dans l’apex ventriculaire gauche.
- Utilisez une pompe de perfusion pour injecter un tampon de digestion à température contrôlée à 37 °C dans le ventricule gauche pendant 15 minutes à l’aide d’une seringue de 50 mL. Contrôler la température de la solution à l’aide d’une chemise d’eau préalablement calibrée pour éjecter une solution à 37 °C à l’extrémité de l’aiguille.
- Retirez les ventricules des oreillettes et transférez-les dans un bécher de 10 mL. Ajouter 3 mL de tampon de digestion dans le bécher et, à l’aide de ciseaux tranchants, couper les ventricules en gros morceaux. Couvrir le bécher de papier d’aluminium et placer dans un bain-marie en agitation préchauffé à 37 °C pendant 5 min.
- Jetez le surnageant, en prenant soin d’éviter d’enlever des morceaux de tissu. Remettez en suspension les morceaux de tissu dans 3 mL de tampon de digestion et triturez pendant environ 4 minutes ou jusqu’à ce qu’un mélange homogène soit obtenu.
- Filtrer les cellules à travers une crépine à cellules en nylon de 70 μm dans un tube en polypropylène de 50 mL.
- Remettre le filtrat dans un tube en polypropylène à fond rond de 14 ml et centrifuger pendant 1 min à 100 tr/min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 3 mL de tampon stop.
- Ajouter 54 μL de 100 mM de CaCl2 aux cellules remises en suspension pourune concentration finale de CaCl2 de 1,8 mM. Cette étape peut également être effectuée étape à pas pour augmenter le rendement cellulaire.
- Laisser les cellules vivantes se déposer par gravité pendant 10 minutes avant de retirer le surnageant contenant les cellules mortes. Remettre en suspension la pastille dans une solution de stockage (solution de perfusion avec 200 μM de CaCl2). Ces cellules peuvent maintenant être utilisées pour des expériences fonctionnelles (c.-à-d. imagerie / contraction du calcium, pince de patch, etc.), la culture, etc.
REMARQUE: Les cellules peuvent également être remises en suspension dans des solutions dépendantes du laboratoire ou de l’expérience.
5. Culture cellulaire
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou par un comptage de vue de champ à l’aide d’un bordereau de couverture quadrillé. Comme les myocytes sont très gros, le comptage à l’aide d’un hémocytomètre n’est pas toujours précis. Ceci est utilisé pour avoir une idée approximative du nombre de cellules obtenues à partir de l’isolement.
- Diluer les cellules à ~25 000 cellules/ml avec un milieu DMEM. Ajouter 1 mL de solution cellulaire à chaque puits.
- Incuber à 37 °C, 95%O2, 5% CO 2 pendant2 h.
- Aspirer doucement le média DMEM de chaque puits et ajouter 2 ml de média M199.
- Incuber à 37 °C, 95% O 2, 5% CO2 jusqu’à 24 h.
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Representative Results
Il y a quelques éléments à examiner pour déterminer le succès d’un isolement. Tout d’abord, les cardiomyocytes doivent être en forme de bâtonnets sans blebs membranaires, tels que les cellules isolées à la figure 1. Un isolement typique donnera ~80% des myocytes étant en forme de bâtonnet. Si l’isolement produit moins de 50% de cellules en forme de bâtonnet, il est considéré comme un isolement infructueux et les cardiomyocytes ne sont pas utilisés. Enfin, les cardiomyocytes doivent être au repos. Les myocytes de contraction spontanée démontrent une intolérance au Ca2+ et produiront des données peu fiables. De toutes les isolations effectuées à l’aide de la technique ci-dessus, presque toutes les isolations sont considérées comme réussies. Les cardiomyocytes en culture sont considérés comme efficaces s’ils sont en forme de bâtonnet, sans blebs membranaires ou bords arrondis avec des taux de survie élevés (Figure 2).
Tableau 1. Un tableau des différences notées entre notre méthode, les méthodes Langendorff et les méthodes sans Langendorff précédemment publiées pour isoler les cardiomyocytes de souris. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Concentrations dans les milieux tampons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Graphique 1. (A) Cardiomyocytes de souris C57Bl/6 âgés de 4 mois imagés par microscopie à fond clair. Rendement: ~80%; Grossissement 20x. (B) Image en champ clair d’un cardiomyocyte de souris C57Bl/6 âgé de 4 mois. Les cardiomyocytes sont quiescents, présentant une forme de bâtonnet sans blebs membranaires. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. (A) Les cardiomyocytes de souris C57Bl/6 âgés de 4 mois cultivés pendant 24 h dans un milieu M199. Viabilité : ~80 %; Grossissement 20x. (B) Myocytes cultivés pendant 24 h. À 24 h, les cardiomyocytes présentent une forme de bâtonnet sans blebs membranaires. (C) courbe de survie en % pour les cardiomyocytes cultivés pendant 24 h selon la méthode décrite. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le principal avantage de notre technique d’isolation des cardiomyocytes sans Langendorff est qu’elle limite l’hypoxie et le temps ischémique en ne nécessitant pas de canulation à un appareil de Langendorff. Alternative aux techniques classiques de Langendorff qui prennent plusieurs minutes pour enlever, nettoyer et suspendre le cœur, entraînant souvent des dommages ischémiques au myocyte, notre méthode comprend une élimination in vivo du sang via une solution de nettoyage glacée. Le tampon de nettoyage glacé contient de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), chélate irréversiblement les cations divalents pour éliminer efficacement le calcium, ce qui en fait un excellent anticoagulant, et arrête donc la contraction23. L’utilisation de solutions glacées inhibe la contraction en ralentissant l’échange d’ions et le taux métabolique cellulaire, prévenant ainsi les dommages causés par l’ischémie24. En supprimant le besoin de canulation aortique, les techniques sans Langendorff produisent des myocytes robustes, ce qui permet une préparation plus fiable pour produire des données fiables, ce qui n’est pas toujours le cas pour les méthodes d’isolement de Langendorff.
Il s’agit d’une variante d’une technique d’isolement sans Langendorffpubliée précédemment 18 avec des adaptations comme indiqué dans le tableau 1. Plus important encore, cette technique introduit une plate-forme stabilisatrice qui limite le nombre de fois que l’aiguille doit être retirée et remplacée du cœur. Tout mouvement inutile introduit dans l’aiguille lors de l’insertion dans le ventricule élargit le site de ponction. Un site de ponction plus large entraîne un reflux hors du ventricule du site de ponction, une diminution de la pression dans le cœur et une diminution du flux vers les coronaires. Ce problème est résolu à l’aide de la plate-forme de stabilisation. En limitant le mouvement de l’aiguille et le nombre de fois que l’aiguille est retirée et remplacée (une par rapport à trois fois comme décrit précédemment18), nous maintenons un flux constant vers les coronaires et réalisons une digestion constante. Une autre adaptation clé a été l’ajout d’une enveloppe à température contrôlée pour maintenir les solutions enzymatiques à 37 °C à l’entrée du cœur (le bain de température a été calibré pour être éjecté à 37 °C de l’aiguille). L’enzyme de digestion utilisée a une activité de réaction optimale à 37 °C, et l’ajout d’un contrôle de température augmente l’activité enzymatique, diminuant ainsi le temps de digestion. La liberase a également une variabilité minimale d’un lot à l’autre et une reproductibilité plus élevée par rapport aux autres enzymes. Une autre adaptation des techniques précédentes est une diminution de la quantité de solution de compensation injectée. Diminuer la quantité de tampon d’élimination pour entrer dans le cœur et permettre à plus de sang d’être éliminé par le tampon de perfusion diminue l’inactivation de l’enzyme de digestion par l’EDTA. Une autre raison pour laquelle notre méthode permet systématiquement d’obtenir des isolements de myocytes réussis est l’utilisation de BDM. Le BDM est un inhibiteur de la myosine qui empêche le mécanisme de course de puissance du sarcomère, inhibant ainsi la contraction et limitant les lésions de réoxygénation pendant la digestion. En limitant la contraction, nous empêchons le cycle du calcium et la production d’espèces réactives inhérentes à l’oxygène dans les myocytes contractants en culture. Étant donné que le milieu de culture contient du calcium, il est possible que les myocytes se contractent et diminuent le rendement ultérieur après la culture. Nous choisissons de cultiver les myocytes dans le BDM pour prévenir la contraction et augmenter le rendement25,26. Le BDM peut toujours être éliminé des myocytes pour des mesures fonctionnelles après culture avec beaucoup de succès. Alternativement, toutes les étapes de cette procédure peuvent être effectuées sans l’ajout de BDM, mais les isolements peuvent ne pas être considérés comme « réussis » sur les myocytes isolés sans BDM.
Outre le temps ischémique, il existe de nombreux autres facteurs qui détermineront si un isolement produira des myocytes robustes. Étant donné qu’il existe différentes conditions dans les laboratoires individuels, les personnes effectuant l’isolement peuvent avoir besoin de modifier la quantité d’enzyme et / ou de calcium, le temps de perfusion et / ou la vitesse de la pompe, et la vitesse et / ou le temps de bain d’eau à bascule. Ces paramètres dépendront du modèle murin utilisé, tel que sain ou malade, vieillissement, etc.
Bien que cette technique ne nécessite pas les compétences chirurgicales nécessaires pour les techniques basées sur Langendorff, il reste encore des étapes critiques pour que la technique réussisse. Le problème le plus courant qui produit des myocytes pauvres avec cette technique est dû au fait que des bulles pénètrent dans le système de perfusion et bloquent l’accès du tissu myocardique au tampon de perfusion. La solution à ce problème est une pratique prudente pour éviter les bulles (via une technique de dégagement de seringue appropriée, une technique de dégagement d’aiguille appropriée, rot du collecteur de bulles lors du changement de seringues, etc.), ainsi que plusieurs points de sortie du système de perfusion au cas où une bulle se logerait dans le collecteur. Sans bulles, d’après notre expérience, nous obtenons près de 100% d’isolements de myocytes réussis (définis comme supérieurs à 50% de myocytes en forme de bâtonnet; la moyenne est de ~80%).
Bien que la méthode ait été simplifiée par la suppression de la compétence chirurgicale requise pour la méthode Langendorff, cette méthode adaptée n’a été essayée que chez la souris. Un autre avantage de la méthode sans Langendorff est qu’elle peut être utilisée pour de nombreux modèles murins (c’est-à-dire du nouveau-né à la sénescence), comme décrit précédemment19. Malheureusement, les grands mammifères (par exemple, les chiens, les porcs, etc.) ne conviendront pas à cette technique en raison de la taille de leur cœur. Il serait impossible de percer le cœur avec suffisamment de solution pour acquérir des myocytes fiables.
Notre adaptation de la méthode sans Langendorff est une méthode fiable pour l’isolement réussi des cardiomyocytes de souris. Par rapport à la méthode de Langendorff, cette approche alternative nécessite peu de compétences techniques pour obtenir systématiquement des cardiomyocytes.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions R01 HL114940 (Biesiadecki) des National Institutes of Health, R01 AG060542 (Ziolo) et T32 HL134616 (Sturgill et Salyer).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
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