Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

Résumé

L’étalon-or en cardiologie pour les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires sont les cardiomyocytes. Cet article décrit les adaptations à la technique non-Langendorff pour isoler les cardiomyocytes de souris.

Résumé

Le besoin de méthodes reproductibles mais techniquement simples produisant des cardiomyocytes de haute qualité est essentiel pour la recherche en biologie cardiaque. Les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires (p. ex. contraction, électrophysiologie, cycle du calcium, etc.) sur les cardiomyocytes sont l’étalon-or pour établir le(s) mécanisme(s) de la maladie. La souris est l’espèce de choix pour les expériences fonctionnelles et la technique décrite est spécifiquement pour l’isolement des cardiomyocytes de souris. Les méthodes antérieures nécessitant un appareil de Langendorff nécessitent des niveaux élevés d’entraînement et de précision pour la canulation aortique, entraînant souvent une ischémie. Le domaine évolue vers des méthodes d’isolement sans Langendorff qui sont simples, reproductibles et produisent des myocytes viables pour l’acquisition de données physiologiques et la culture. Ces méthodes diminuent considérablement le temps d’ischémie par rapport à la canulation aortique et permettent d’obtenir des cardiomyocytes obtenus de manière fiable. Notre adaptation à la méthode sans Langendorff comprend une perfusion initiale avec une solution de nettoyage glacé, l’utilisation d’une plate-forme stabilisatrice qui assure une aiguille stable pendant la perfusion et des étapes de digestion supplémentaires pour garantir un obtention fiable de cardiomyocytes pour une utilisation dans les mesures fonctionnelles et la culture. Cette méthode est simple et rapide à réaliser et nécessite peu de compétences techniques.

Introduction

Pendant des décennies, une idée essentielle dans la littérature en biologie cardiaque est le mécanisme moléculaire de l’action. Le mécanisme d’action doit être établi afin de publier des études fiables. Une stratégie bien établie pour déterminer le mécanisme moléculaire consiste en des études de cardiomyocytes isolés, qui nécessitent des cardiomyocytes de haute qualité pour obtenir des données fiables. Les expériences cellulaires et moléculaires effectuées sur les cardiomyocytes pour déterminer le mécanisme d’action sont l’étalon-or pour étudier la contraction¹, l’électrophysiologie², le cycle du calcium (Ca 2+)

Protocole

Toutes les procédures effectuées dans cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Ohio State University conformément aux directives des NIH.

1. Préparation de la solution

NOTA : Veuillez consulter le tableau 2 pour connaître les concentrations de tampons.

1. Pré-isolement (jusqu’à 2 semaines avant l’isolement des myocytes
   1. Base tampon de perfusion : Préparer 1 L de base tampon de perfusion (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose et BDM) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H₂O ultrapur. Ajuster à pH

Résultats

Il y a quelques éléments à examiner pour déterminer le succès d’un isolement. Tout d’abord, les cardiomyocytes doivent être en forme de bâtonnets sans blebs membranaires, tels que les cellules isolées à la figure 1. Un isolement typique donnera ~80% des myocytes étant en forme de bâtonnet. Si l’isolement produit moins de 50% de cellules en forme de bâtonnet, il est considéré comme un isolement infructueux et les cardiomyocytes ne sont pas utilisés. Enfin, les cardiomyocytes doivent être au r.......

Discussion

Le principal avantage de notre technique d’isolation des cardiomyocytes sans Langendorff est qu’elle limite l’hypoxie et le temps ischémique en ne nécessitant pas de canulation à un appareil de Langendorff. Alternative aux techniques classiques de Langendorff qui prennent plusieurs minutes pour enlever, nettoyer et suspendre le cœur, entraînant souvent des dommages ischémiques au myocyte, notre méthode comprend une élimination in vivo du sang via une solution de nettoyage glacée. Le tampon de nettoyage .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 cc Bd Luer-Lok Seringue	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL bouchon en polypropylène Bouteille de stockage en verre	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Tubes à essai en polypropylène à fond rond avec bouchon	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Seringue	Fisher Sci	14-823-435
Plats à fond en verre 35 mm	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Seringue sans aiguille	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Tubes à centrifuger coniques	Cole-Palmer	EW-22999-84
95 % O2 5 % CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 g x 1/2" Aiguilles hypodermiques	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Fraction de choc thermique, poudre lyophilisée, essentiellement sans acides gras, >98 %
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma	C7902	>99 %
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Convient pour la culture cellulaire, >99,5 %
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC Plat de culture cellulaire	Corning	353003
FBS	R& D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Circulateurs à immersion chauffés	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Pince hémostatique	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber	Set Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5 %
Ruban d’étiquetage	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Pousse-seringue	kdScientific	788100
L-glutathion	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	Concentration élevée de thermolysine
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Chlorure	de magnésiumInvitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Chlorure de potassium	Sigma	P5405	>99 %
Precision Digital Bain d’eau alternatif	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Bicarbonate de sodium	Sigma	S5761	Convient pour la cellule culture
Chlorure	de sodium Sigma	S5886	>99 %
Phosphate de sodium monobasique	Sigma	S5011	>99 %
Passoire à cellules stériles 70 µ ; m	Fisher Sci	22-363-548
Ciseaux fins d’étudiant	Outils scientifiques fins	91460-11
Sous-couches absorbantes VWR	Fisher Sci NC9481815