Summary
En detaljeret protokol præsenteres her for at beskrive en in vitro-organoidmodel fra humane nasale epitelceller. Protokollen har muligheder for målinger, der kræver standard laboratorieudstyr, med yderligere muligheder for specialudstyr og software.
Abstract
Individualiseret terapi til cystisk fibrose (CF) patienter kan opnås med en in vitro sygdomsmodel for at forstå baseline Cystisk Fibrose Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) aktivitet og restaurering fra små molekyleforbindelser. Vores gruppe fokuserede for nylig på at etablere en veldifferentieret organoidmodel direkte afledt af primære humane nasale epitelceller (HNE). Histologi af sektionerede organoider, helmonteret immunofluorescerende farvning og billeddannelse (ved hjælp af konfokal mikroskopi, immunofluorescerende mikroskopi og lyst felt) er afgørende for at karakterisere organoider og bekræfte epiteldifferentiering som forberedelse til funktionelle assays. Desuden producerer HNE-organoider lumen af varierende størrelse, der korrelerer med CFTR-aktivitet, idet der skelnes mellem CF- og ikke-CF-organoider. I dette manuskript beskrives metoden til dyrkning af HNE-organoider detaljeret med fokus på vurdering af differentiering ved hjælp af billeddannelsesmetoderne, herunder måling af baseline lumenområde (en metode til CFTR-aktivitetsmåling i organoider, som ethvert laboratorium med et mikroskop kan anvende) samt den udviklede automatiserede tilgang til et funktionelt assay (som kræver mere specialiseret udstyr).
Introduction
Introduktion til teknikken
Ex vivo kulturbaserede assays er et stadig mere anvendt værktøj til præcisionsmedicin og studiet af sygdomspatofysiologi. Primær human nasal epitel (HNE) cellekultur er blevet anvendt i adskillige undersøgelser af cystisk fibrose 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , en autosomal recessiv sygdom, der påvirker epitelcellefunktionen i flere organer. HNE-kultur giver en vedvarende kilde til luftvejsepitel, der kan opnås fremadrettet og rekapitulerer elektrofysiologiske og biokemiske kvaliteter for at teste cystisk fibrose transmembrane konduktansregulator (CFTR) aktivitet. HNE-celler kan prøveudtages med minimale bivirkninger14, svarende til almindelige virale respiratoriske vatpinde. Forskningsarbejde, der beskriver en model for cystisk fibrose undersøgelse afledt af HNE børstebiopsier er for nylig blevet offentliggjort11,13. I lighed med andre modeller, der anvender primær HNE 2,3 og tarmvæv 15,16,17,18,19, beskrives detaljeret karakterisering af differentieringen og billeddannelsen af denne model her til brug i CF-forskning og til støtte i undersøgelser af andre luftvejssygdomme 13 . Organoidmodellen er ikke ubegrænset som udødeliggjorte cellelinjer, men kan udvides ved betinget omprogrammering (ved hjælp af bestrålede og inaktiverede feederfibroblaster og Rho-kinasehæmmere) til en mere stamcellelignende tilstand 20,21,22,23. Behandlingen af HNE-børstebiopsier ved hjælp af denne metode giver et stort antal epitelceller til brug i flere applikationer ved højere gennemstrømning, samtidig med at evnen til at differentiere fuldt ud bevares. Mens denne protokol blev udviklet ved hjælp af feederceller, kan andre metoder anvendes af efterforskere, der ønsker at undgå feedercelleteknologi14,24.
Betydningen af teknikken for lungebiologi
En betydelig undersøgelse er blevet afsat til at forstå, hvordan fraværet af regelmæssig, fungerende CFTR i cellemembranen i epitelceller resulterer i dysfunktion i lungerne, bugspytkirtlen, leveren, tarmen eller andre væv. Dysfunktionel epiteliontransport, især for chlorid og bicarbonat, resulterer i et nedsat volumen af epitelforingsvæskerne og ændringer i slimhindesekretioner, hvilket fører til slimhindestasis og obstruktion. I andre luftvejssygdomme, såsom primær ciliær dyskinesi, forringer ændret ciliær bevægelse mucociliær clearance og fører til slimhindestasis og obstruktion25. Derfor er den nuværende HNE-organoidmodel udviklet til forskellige anvendelser afhængigt af investigatorens eksperimentelle design og ressourcer. Dette omfatter levende cellebilleddannelse ved hjælp af levende cellepletter; fiksering og sektionering for at karakterisere morfologien; immunofluorescensfarvning med antistoffer og helmonteret konfokal billeddannelse for at undgå at forstyrre intraluminale strukturer; og lysfeltsbilleddannelse og mikrooptisk kohærenstomografi til kvantitative målinger af ciliary beat-frekvens og mucociliær transport13. For at lette udvidelsen til andre efterforskere blev kommercielt tilgængelige reagenser og forsyninger brugt til dyrkning. Der blev udviklet et funktionelt assay, der brugte almindelige mikroskopteknikker og mere specialiseret udstyr. Samlet set, mens den nuværende model blev designet til at vurdere CFTR-aktivitet ved baseline eller som reaktion på terapi, kan de teknikker, der er beskrevet i denne protokol, anvendes på andre sygdomme, der involverer epitelcellefunktion, især epitelcellevæsketransport.
Sammenligning med andre metoder
For nylig blev nytten af denne organoidmodel udviklet ved at korrelere in vitro CFTR-modulatorresponser fra patienters organoider med deres kliniske respons11. Det er navnlig også påvist, at den nuværende model parallelt med kortslutningsstrømresponser, den nuværende guldstandard for vurdering af CFTR-funktion, hos de samme patienter. Kortslutningsstrøm adskiller sig fra hævelsesassayet, fordi førstnævnte måler CFTR-funktion via iontransport26. I modsætning hertil måler dette assay en mere nedstrøms effekt med væsketransport, hvilket giver yderligere oplysninger om den samlede funktion af CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortslutningsstrømmålinger har fortsat været en almindelig og pålidelig metode til bestemmelse af CFTR-chloridkanalaktivitet 1,33. Disse elektrofysiologiske assays kræver specialiseret, dyrt udstyr, kræver mange gange flere celler til hver eksperimentel replikat end organoidassayet, kan ikke let automatiseres og er ikke modtagelige for opskalering til applikationer med højere gennemstrømning. En anden organoidmodel afledt af tarmepitel har yderligere fordele 15,16,17,18, såsom mere fremragende replikativ kapacitet, men er hverken afledt af et luftvejsvæv eller er universelt tilgængeligt. HNE børstninger opnås med billige cytologibørster uden behov for sedation og med minimal risiko. At få børstningen kræver ikke en kliniker og kan udføres af uddannede forskningskoordinatorer og andet forskningspersonale14. HNE-organoidmodellen kan dyrkes af ethvert laboratorium med primærcellekulturkapacitet, og nogle af applikationerne kan udføres med standardmikroskopiteknikker. Alt i alt giver disse fordele yderligere adgang til teknologi til vurdering af luftvejsepitelfunktion, som ellers ville være utilgængelig for nogle laboratorier. Desuden kan HNE-organoider bruges til at studere andre sygdomstilstande, der påvirker luftvejene, såsom primær ciliær dyskinesi25 eller virusinfektion, som tarmorganoider ikke kan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HNE prøver blev indsamlet på Children's of Alabama hospitalet. Alle procedurer og metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af IRB University of Alabama i Birmingham (UAB IRB #151030001). For at lette udvidelsen og forbedre funktionen af humane nasale epitelceller (HNE'er) er de nuværende dyrkningsmetoder tilpasset fra den velkendte luft-væske-grænseflade (ALI) dyrkningsmetode28,34. HVE'er blev oprindeligt indsamlet ved børstebiopsi som tidligere beskrevet12,14, hvor den eneste forskel var brugen af en cytologibørste. Alle prøvebehandlingstrin og cellekultur blev udført i biosikkerhedsskabet.
1. Cellekultur og udvidelse af nasale epitelceller
- Efter børstning opbevares næsebiopsiprøven i 8 ml RPMI-medier i et 15 ml konisk rør på is og overføres til laboratoriet inden for 4 timer (højst 24 timer).
- Dissocier næsebørstebiopsien i 8 ml RPMI-medier i et 15 ml konisk rør ved at føre cytologibørsten gennem en 1 ml stor borepipettespids (afskåret spidsen) flere gange, indtil børsten er fri for væv.
- Centrifugering af cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, fjern supernatanten, og suspender derefter cellepillen igen i 3 ml celleløsningsopløsning (se materialetabel) og inkuber ved stuetemperatur i 16 minutter for at fordøje.
- Brug 5 ml ekspansionsmedier (tabel 1) til at vaske cellerne to gange. Derefter tilsættes celler til en T75-kolbe, der er forfrøet med bestrålede og inaktiverede 3T3 fibroblaster22 (50%-60% sammenløb) for at samkulturere cellerne og ekspandere i ekspansionsmediet i 7-14 dage (se figur 1 for den relevante koloni). Før brug skal du teste de bestrålede 3T3 fibroblaster for at sikre, at de ikke kan sprede sig, hvilket vil påvirke epitelcelleudvidelsen negativt.
BEMÆRK: Kassér cellerne, hvis næseepitelcellesammenløbet ikke når 70% inden for 14 dage. - For de celler, der stammer fra patienter med CF, indføres fire antibiotika (100 μg/ml tobramycin, 2,5 μg/ml amphotericin B, 100 μg/ml ceftazidim, 100 μg/ml vancomycin, se materialetabel) i ekspansionsmediet til desinfektion af cellerne i de første 3 dyrkningsdage og erstatter derefter mediet med antibiotikafrie ekspansionsmedier, der ændrer mediet hver anden dag.
BEMÆRK: Denne begrænsede anvendelse af antibiotika er beregnet til at reducere kulturtab på grund af bakteriel kolonisering og samtidig tilskynde til spredning, efter at de ekstra antibiotika er fjernet. Disse antibiotika kan skræddersys til patientens specifikke mikrobiologiske resultater, med følsomheder, hvis det er nødvendigt. - Høst HVE'er fra samkultur ved hjælp af den dobbelte trypsiniseringsmetode22 , når cellerne når ca. 80% sammenløb. Denne metode sikrer, at de bestrålede og inaktiverede 3T3 fibroblaster fjernes fra kolben, og de forurener ikke efterfølgende organoidsåning.
- Vask cellerne med 1x DPBS, og tilsæt derefter 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA i T75-kolben i 4 minutter ved 37 °C for at fjerne den bestrålede og inaktiverede 3T3 fibroblast fra dyrkning.
- Skyl T75-kolben med 1x DPBS to gange for grundigt at vaske eventuelle resterende 3T3 fibroblaster væk; Der tilsættes 1,5 ml 0,05 % trypsin-EDTA i T75-kolben i 10 minutter ved 37 °C for at løsne HNE'er.
- Neutraliser trypsin med sojabønne trypsinhæmmer (se tabel over materialer) i forholdet 1:1. Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 min, og fjern derefter supernatanten. Efter vask af cellerne med 5 ml ekspansionsmedier en gang, er cellerne klar til såning for at dyrke organoider.
BEMÆRK: HNE'er med et passagenummer på tre anbefales at blive brugt til yderligere eksperimenter.
2. Vækst og differentiering af organoider i dias og kulturindsatser
- Optø den organoide kultur ekstracellulær matrix (ECM) natten over ved 4 °C. Cool pipettespidser til 4 °C og 15-brønds angiogenese glider (se tabel over materialer) natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: ECM skal sættes ved 4 °C natten før cellehøsten skal udføres. - Belæg diasene med 5 μL kold 100% ECM på is (pipette 5 μL kold 100% ECM med en kold pipettespids i hver brønd i 15-brønds diaset), og anbring dem derefter i en cellekulturinkubator ved 37 ° C i mindst 30 minutter til konsolidering.
- Tæl HNE'er høstet fra samkultur ved hjælp af et hæmocytometer, og fortynd cellerne til 500 celler/μL i samlet antal med 20 % ECM fortyndet med differentieringsmedier (tabel 2) på is. Derefter frø 5 μL af koldcelle/ECM-blandingen i hver brønd i diasene belagt med ECM.
- Overfør straks diasene til en dyrkningsinkubator ved 37 °C i 1 time for at konsolidere celle/ECM-blandingen.
- Foder cellerne i hver brønd af de 15-brønds angiogenese dias med 50 μL differentieringsmedier. Skift medier hver anden dag, indtil organoiderne er klar til yderligere eksperimenter.
BEMÆRK: Organoider kan normalt visualiseres efter 1-2 dage. Der er 20-90 organoider, der almindeligvis dannes i hver brønd af diasene. Organoiderne kan typisk overleve i 40-60 dage i ECM med fodring hver anden dag, når de opbevares i en befugtet inkubator ved 37 ° C. - Dyrkning af organoiderne i kulturindsatserne (se materialetabel) for større mængde til specifikke anvendelser (såsom sektionering for histologi eller immunofluorescens) i henhold til nedenstående trin.
- For at dyrke organoider i kulturindsatserne skal du forberede organoidkulturen ECM, pipettespidser og indsatser som nævnt i trin 2.1-2.2. Belæg indsatserne med 100 μL kold 100% ECM.
- Frø 60 μL celle/ECM-blanding (500 celler/μL med 20 % ECM i differentieringsmedier) oven på ECM-belægningen i indsatsen.
BEMÆRK: Alle de andre trin til fremstilling af organoider i indsatserne er de samme som dem, der udføres i diasene, trin 2.4-2.5. - Tilsæt 600 μL af differentieringsmediet i den nederste del af indsatsen. Skift medier hver anden dag, indtil organoiderne bruges til eksperimenter, typisk 2-3 uger.
3. Forberedelse og isolering af organoider til helmonteret immunofluorescens
- Isolering og fiksering af organoider
- Forbehandle 8-brønds glasbundskammerrutsjebaner med celleklæbemiddel (se materialetabel) i 30 minutter efter reference35. Efter kassering af opløsningen lufttørres brøndene i 30 minutter.
- For at høste organoiderne skal du fjerne mediet fra toppen af ECM og derefter tilføje 50 μL koldt 1x PBS i hver brønd af de 15 brønde dias på is (1: 1 med ECM-volumen).
- Pipette op og ned 3-5 gange ved hjælp af 200 μL af pipettespidsen med stor boring, og dispenser derefter opløsningen på midten af en brønd i de 8-brønds kammerglider.
- Fjern straks overskydende væske fra brøndene med en finspidspipette. Anbring derefter kammerglideren i en 37 ° C inkubator i 40 minutter for at forbedre organoidet, der klæber til glasbunden.
- Efter forsigtig vask med 1x PBS to gange, fastgør organoiderne med 300 μL 4% paraformaldehyd i hver brønd i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Vask to gange med 1x PBS og opbevar organoiderne i 1x PBS ved 4 °C til immunbevarelse i op til 2 uger.
- Immunofluorescensfarvning
- For at reducere autofluorescens tilsættes 250 μL 50 mMNH4Cl i 1x PBS i hver brønd af diasene ved RT i 30 minutter, mens du forsigtigt ryster på en ryster ved 20 o / min.
- Efter vask med 1x PBS to gange, permeabiliseres cellerne med 0,1% Triton X-100 i 30 minutter ved RT, mens de forsigtigt rystes ved 20 o / min.
- Efter vask med 1x PBS to gange tilsættes 300 μL blokerende opløsning, herunder 5% BSA og 0,1% Triton X-100 i 1x PBS, i hver brønd i 1 time ved RT.
- Efter vask tilsættes primært antistof i de relevante brønde efterfulgt af sekundære antistoffer (se materialetabellen). Forbered primære og sekundære antistofopløsninger i 2% BSA og 0,3% Triton X-100 i 1x PBS. Inkuber alle de primære antistoffer ved 4 °C i 2 dage og alle de sekundære antistoffer ved 4 °C i 1 dag.
BEMÆRK: De endelige koncentrationer afhænger af det protein, der ønskes til forsøget. Kontroller lagerkoncentrationen på producentens datablad. Beregn derefter de endelige koncentrationer baseret på de fortyndinger, der anvendes i materialetabellen. - Efter inkubation vaskes brøndene grundigt med 1x PBS og tilsættes DAPI i 2% BSA og 0,3% Triton X-100 i hver brønd til nuklear farvning.
- Forestil dig organoiderne ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop med et 20-60x olienedsænkningsmål (se Tabel over materialer). Brug Z-stack-tilstand til at indstille billedets øvre og nedre grænser, og brug den anbefalede optimale Z-trinstørrelse bestemt af den konfokale software.
BEMÆRK: Følgende fire konfokale laserexcitationsbølgelængder blev anvendt: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm og 637,9 nm.
4. Forberedelse og isolering af organoider til histologisk sektionering
- For at høste organoiderne til histologiske undersøgelser skal du fjerne medierne fra kulturen og tilføje 50 μL kold 1x PBS i hver brønd af diasene på is.
- Pipette op og ned tre til fem gange ved hjælp af en 200 μL pipettespids med stor boring, kombiner alle opløsningerne fra 15-brønds glide- eller kulturindsatserne i et 15 ml konisk rør på is. Juster det samlede opløsningsvolumen i røret til 10 ml ved at tilføje yderligere kold 1x PBS.
- Centrifugering af røret ved 4 °C, 300 x g i 5 minutter; aspirer supernatanten ud, og tilsæt 60 μL varm histogel (se materialetabel) for at blande med organoidpillen ved hjælp af en 200 μL af pipettespidsen med stor boring.
- Overfør straks suspensionen til en histologiform. Efter konsolideringen af histoglen ved stuetemperatur sættes formblokken i 4% paraformaldehyd til fiksering natten over ved 4 °C.
- Efter indlejring i paraffin skal du skære histogelblokken i 5 μm tværsnit (for eksempel med et mikrotome), fastgør sektionerne på glasrutschebaner og pletter ved hjælp af hæmatoxylin og eosin (H & E) eller immunofluorescensmærkede antistoffer. Tag billeder ved hjælp af et lysfeltmikroskop eller omvendt epifluorescensmikroskop (se Materialetabel).
5. Billeddannelse af levende organoider
BEMÆRK: Følgende trin udføres ved hjælp af et automatiseret billedbehandlingssystem (se Materialetabel). Forskellige billedbehandlingssystemer skal tilpasse disse trin ved at følge deres specifikke producentens anvisninger. Uanset hvilket udstyr der anvendes, kræver billeddannelse af levende organoider et temperaturstyret og befugtet miljøkammer med en ledsaget CO2 - gasregulator.
- For at overvåge differentieringen af organoider, før du udfører et funktionelt hævelsesassay36, skal du tage hele diasbillederne manuelt med et hvilket som helst lysfeltmikroskop eller med et automatiseret billeddannelsessystem som beskrevet nedenfor.
- Tænd for strømmen til det automatiserede billedbehandlingssystem og CO2/O 2-gasregulatoren, og lad systemet fuldføre den automatiserede kalibrering (~ 30 min).
- Efter færdiggørelsen indstilles billedbehandlingssystemets temperatur til 37 °C; Tilsæt 15 ml sterilt vand til befugtningsbeholderen, åbn CO2 - ventilerne, luk lågene, og lad billedbehandlingssystemet forinkubere i mindst 30 minutter før billeddannelse.
- Åbn den automatiserede billedbehandlingssoftware for at oprette en protokol til billeddannelse, og vælg det sted, hvor de rå eksperimentelle data skal gemmes.
BEMÆRK: Et eksempel på en protokolfil (supplerende fil 1), der er specifik for billeddannelsessystemet, er blevet leveret som en skabelon til automatiseret billeddannelse af organoider til overvågning af organoiddifferentiering. - Når miljøindstillingerne er opfyldt, skal du straks overføre op til to 15-brønds dias med låg til miljøkammeret i det automatiserede billedsystems diasholderindsats (se Materialetabel).
- Vælg de brønde, der skal afbildes, og start billeddannelsen for at fuldføre billeddannelsen af de ønskede brønde.
BEMÆRK: De grundlæggende anbefalede indstillinger er: 4x og 10x luftmål, lysfeltkanal, 2 x 2 montage til 4x mål for at dække hele brøndområdet, 4 x 4 montage til et 10x mål. Z-stack-indstillinger: tre til seks Z-stack-skiver, Z-trinstørrelse = 50-100 μm, en til to skiver under autofokuspunktet og tre til fem skiver ovenfor.
- For at afbilde levende organoider til brug i et forskolin-induceret hævelse (FIS) assay, brug et mikroskop med et automatiseret trin udstyret med et miljøkontrolleret billeddannelseskammer, der tillader temperatur og CO2 - kontrol.
- Begynd med trin 5.1.1-5.1.4, erstat protokolfilen i trin 5.1.3 med den, der er angivet i eksempelprotokolfilen (Supplerende fil 2), der indeholder indstillinger, der er specifikke for udførelse af et FIS-assay.
- Før hvert eksperiment skal du justere eksponeringsindstillingerne ved at evaluere mindst tre brønde for hvert dias (yderst til venstre, midt og yderst til højre). Anvend X- og Y-koordinatforskydningerne for at sikre, at målet vil være i midten af brønden for alle brøndene.
BEMÆRK: De grundlæggende anbefalede indstillinger er: 4x luftmål, Kanal 1 = Lyst felt, Kanal 2 = DAPI, 2 x 2 montage (fire billedfliser). Z-stack-indstillinger: tre til fire Z-stack-skiver, Z-trinstørrelse = 50-100 μm, et udsnit under autofokuspunkt og to til tre skiver over. Billedoptagelsestid: 8 timer med 20 minutters intervaller (I alt læser = 25; Læs 1 er T = 0). - Når alle indstillinger er valgt korrekt, skal du vælge de brønde, der skal afbildes for begge dias, eller vælge alle og starte kørslen i henhold til udstyrets instruktioner.
- Når du har kørt, skal du gemme eksperimentet, lukke billedbehandlingssoftwaren og lukke billedbehandlingssystemet37.
6. Målinger af basislinjelumen
BEMÆRK: Dette gøres ved hjælp af manuel billedanalysesoftware (se Tabel over materialer). En lignende metode kan følges ved hjælp af en open source-software38 eller enhver software, der kan måle arealet af et område på et billede.
- Åbn panelet Automatiseret måling i softwaren ved at højreklikke nederst på skærmen, vælge Måling og derefter Automatiske måleresultater. Området for hver målt interesseregion (ROI) vises der.
- Åbn organoidbilledet i softwaren, og vælg 5-10 organoider med synlige lumen.
BEMÆRK: Lumen vil være et cirkulært område midt i organoidet, der er synligt anderledes i farve end resten af organoidet (figur 2A). - Brug polygon-ROI-målefunktionen til at holde højreklik på billedet for at åbne menuen og vælge Polygonal ROI for at skitsere den fulde organoid for at opnå organoidens samlede overfladeareal (TSA). Brug derefter den samme funktion til at skitsere lumenområdet (LA) (figur 2B).
- Gentag for de resterende organoider i brønden og alle brøndene i analysen.
- Eksportér dataene til Excel. Del LA med TSA og gennemsnit alle organoider fra prøven for at få Baseline Lumen Ratio (BLR) 11,13.
BEMÆRK: Typisk vil ~ 87% af ikke-CF-organoider have en BLR over 0,6, og 97% vil være over 0,5, mens kun 14% af CF-organoiderne vil have en BLR over 0,6, og 31% vil være over 0,5.
7. Forbehandling og automatiseret billeddannelse af HNE-organoider
BEMÆRK: Alle forbehandlingstrin udføres i et rent biosikkerhedsskab. Foropsæt det automatiserede billedbehandlingssystem og softwaren til optagelse af assay før trin 7.1. Inkubationen med DAPI er valgfri, men anbefales som en fejlsikker, hvis kvaliteten af lyse feltbilleder er kompromitteret. I dette tilfælde kan DAPI-kanalen (377 nm) analyseres i stedet.
- Præinkubere organoiderne i en brønd med 15 brønde med 50 μL differentieringsmedier indeholdende DAPI med eller uden 100 μM CFTRinh-172 (se materialetabel) i en 37 °C inkubator i 1 time. Mens organoiderne inkuberer, skal du udføre trin 5.2.1 ved hjælp af en tilpasset protokol til hævelsesassay efter supplerende fil 2.
- Fjern forinkubationsmediet ved hjælp af en glasPasteur-pipette med aspiration. Der tilsættes 10 μM forskolin og 100 μM IBMX (stimuleringscocktails) (se materialetabellen) for et samlet volumen på 50 μL differentieringsmedier i hver brønd.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke indføres bobler i brøndene. Bobler på billederne vil påvirke den automatiserede analyse. - Start straks FIS-billedbehandlingsprotokollen efter trin 5.2.2 til 5.2.4. Få billeder hvert 20. minut i hver brønd med en samlet driftstid på 8 timer.
8. Automatiseret analyse af forskolin-induceret hævelse assay på HNE organoider
- Åbn den automatiserede billedanalysesoftware, find eksperimentet, der tidligere er gemt fra trin 7.3, og hent billederne af eksperimentet.
- Vælg det beholdervindue, der skal evalueres, og vælg indstillingen, der indeholder de behandlede billeder, der er syet og z-projiceret. Dette trin skal give et billede af hele brønden med alle organoider inden for billedrammen til maskering af vurdering og målinger.
- Vælg det brøndbillede, der skal vurderes. Vælg Analysér. Gentag denne proces for andre billeder for at sikre passende maskering for alle billeder, der er inkluderet i de automatiserede målinger. Gem indstillingsparametrene.
- Når du har gennemført analyseindstillingerne, skal du anvende ændringerne. Softwaren ændrer målingerne baseret på indstillingerne.
BEMÆRK: Når den indledende billedforbehandling er afsluttet, skal der udføres kvalitetskontrolforanstaltninger (QC) for at sikre ensartet maskering. Disse omfatter manuel gennemgang af alle brønde for at sikre, at organoider er inden for billeddannelsesrammen, bobler eller snavs ikke er uhensigtsmæssigt maskeret, og kontrol af maskeringen i lyse felt- og DAPI-kanaler. - Eksportér dataene til den sammenfattende analyse (herunder graf og statistisk analyse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HNE's ekspansion er afgørende for en blomstrende organoidkultur. HVE'er fra en vellykket prøveindsamling bør udvides til over 70% sammenløb omkring 10 dage. Et eksempel på vellykkede og mislykkede prøver er vist i henholdsvis figur 1A og figur 1B. Cellerne skal kasseres, hvis de ikke kan nå 70% sammenløb inden for 14 dage efter co-kultur med bestrålede 3T3-celler. Eventuelle forurenede celler skal straks kasseres, hvis de ikke er i stand til hurtigt at redde med yderligere antimikrobielle midler.
Organoidernes vækst blev sammenlignet i 15-brønds dias og kulturindsatser. Kulturindsatserne er tykkere og længere fra målet end de optisk optimerede dias, hvilket påvirker billedet og opløsningen. På trods af dette blev der ikke observeret nogen signifikant forskel i morfologien i disse to kulturmetoder, som vist i figur 2. Morfologiske forskelle kan ses mellem ikke-CF- og CF-organoider, som vist i figur 3A. Ikke-CF-organoider har tendens til at have et større lumen, der indeholder mere væske i det. I modsætning hertil har CF-organoider normalt et mindre lumen med mindre væske og er undertiden fyldt med slim og snavs. Lumenstørrelsen blev målt manuelt (figur 3B), og baseline-lumenforholdet blev beregnet og vist i figur 3C. Tværsnitsorganoider blev karakteriseret ved anvendelse af H & E og immunofluorescensfarvning. De repræsentative billeder er vist i figur 4A,B. Luftvejsepitelmarkører såsom cilia, slim og tæt kryds er demonstreret i organoider ved helmonteret immunofluorescerende farvning vist i figur 5A-D. Afhængigt af applikationen kan sektioneret eller helmonteret immunofluorescens anvendes. Helmonteringsmetoden opretholder organoidens tredimensionelle karakter og holder organoidens indre intakt, som vist i det tidligere offentliggjorte værk13.
CFTR-funktionen blev vurderet ved forskolin-induceret hævelse (FIS) assay ved hjælp af et automatiseret billeddannelsessystem. Kun 15-brønds dias bruges til funktionelle assays på grund af den bedre billedopløsning. Et repræsentativt forskolin dosis-respons eksperiment af ikke-CF frivillige (n = 5 forsøgspersoner) er vist i figur 6A for at illustrere begrundelsen for den optimerede billeddannelsestid og analyse. Data, der sammenligner ikke-CF- og CF-organoidresponser, er beskrevet i tidligere publikationer11,13. Et dosisrespons viser den trinvise ændring i CFTR-aktivitet for at demonstrere den bedste tilgang til målinger. Analysens varighed på 1 time og 8 timer blev evalueret (figur 6B,C), ligesom analysen ved hjælp af gennemsnitlig fraktionsændring (AFC) versus areal under kurven (AUC) ses i figur 6C,D. Baseret på vores tidligere erfaring plateau hævelse for de fleste emner og tilstande plateau efter 8 timer, og i nogle tilfælde resulterer i sprængning af organoiderne i løbet af den tid. Derfor var assays begrænset til kun 8 timer. Ved denne udvidede assaylængde bliver hævelse ikke-lineær. Brugen af AUC tager også højde for både ændringerne i størrelse og ændringshastigheden. Derfor blev AUC over 8 timer brugt til alle FIS-assays i den endelige metode.
Figur 1: Lysfeltbilleder af HNE'er i co-kultur. HNE'er udvides i ekspansionsmedier med bestrålede og inaktiverede 3T3 fibroblaster i 10 dage. Et omvendt lysfeltmikroskop bruges til billeddannelse af cellerne. (A) HNE'er vokser godt i en stor klynge (sort pil). I modsætning hertil vokser HNE'erne i (B) dårligt i to små klynger (sorte pile), der omgiver bestrålede 3T3-celler. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: HNE organoiddannelse i en 15-brønds dias- og kulturindsats. Lysfeltbilleder af organoider blev taget ved hjælp af et omvendt lysfeltmikroskop over 21 dage. Organoider i 15-brønds dias (A) har mere præcise og skarpere billeder end dem i kulturindsatsen (B). Der blev ikke observeret nogen morfologisk forskel mellem de organoider, der blev dyrket i diaset og indsatsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Organoid lumen størrelse (panel A) og lumen målinger (panel B og C). (A) Ikke-CF-organoider har typisk et større lumen og mere flydende end CF (F508del/F508del) organoider. B) En metode til manuel måling af det samlede overfladeareal (TSA), der er angivet med det røde omrids og lumenareal (LA), der er angivet med det grønne omrids i en enkelt organoid. (C) Et eksempel på anvendelse af det samlede overfladeareal og lumenarealet til beregning af basislinje-lumenforholdet (LA: TSA) i organoider fra et ikke-CF vs. et CF-emne. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tværsnit af de organoider, der er indlejret i paraffin. (A) Et eksempel på H&E-farvning i organoider fra et emne uden for CF og CF (F508del/F508del). (B) Immunofluorescerende farvning af cilier i en organoid. Grøn er cilia (hvid pil) farvet med acetyleret tubulin og FITC mærket sekundært antistof, og blå er kernerne mærket med DAPI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Konfokale billeder af helmonteret immunfluorescens i organoider. (A,C) Maksimale projektionsbilleder af de to repræsentative organoider. (B,D) Tredimensionelle rekonstruktionsbilleder af henholdsvis (A) og (C). Et 8-brønds glasbundsglas blev monteret på platformen af et konfokalmikroskop, og 40x-objektivet blev brugt til at skabe fotomikrograferne. Billedanalysesoftware blev anvendt til billeddannelse og rekonstruktion af billederne. Hvide pile angiver slim (i B) og cilia (i C) inden for organoidernes lumen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Begrundelse for hævelsesanalyselængden og analysemetoderne. Forskolin (FSK) -induceret hævelse (FIS) assay for at teste CFTR-funktion på de primære nasale epitelceller. Forskellig dosis forskolin angivet i tallene blev administreret til 21 dage gamle organoider i differentieringsmediet; organoid hævelse blev straks registreret med det automatiserede billedapparat i 8 timer. Efter 8 timer vises hævelse i (A) (n = 5, ikke-CF-emner) ved hjælp af gennemsnitlig fraktioneret ændring (AFC). FSK-dosisrespons sammenlignes med AFC ved 1 time (B) vs. ved 8 timer (C), hvilket tyder på, at 8 timers assay kan producere en mere signifikant hævelsesforskel mellem forskellige FSK-doser end dem ved 1 h. AFC (C) vs. området under kurven sammenlignes AUC (D) ved 8 timer, hvilket indikerer, at AUC kan afspejle en mindre hævelsesforskel end AFC. X-aksen i paneler (B-D) repræsenterer de forskellige behandlingsbetingelser, der svarer til symbolerne i figurforklaringen. Alle fejllinjer i tallene angiver standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Alle komponenter til fremstilling af udvidelsesmediet. De detaljerede oplysninger om reagensbestandskoncentration, lagerlagring, lagermængde til fremstilling af et 500 ml medie og endelig koncentration er blevet beskrevet. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Alle komponenter til fremstilling af differentieringsmedier. De detaljerede oplysninger om reagensbestandskoncentration, lagerlagring, lagermængde til fremstilling af et 500 ml medie og endelig koncentration er blevet beskrevet. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: Et eksempel på en protokolfil, der er specifik for billeddannelsessystemet, leveres som en skabelon til automatiseret billeddannelse af organoider til overvågning af organoiddifferentiering. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Et eksempel på en protokolfil, der indeholder indstillinger, der er specifikke for at udføre et FIS-assay. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript giver detaljerede metoder til omfattende levende og fast billeddannelse af luftvejsepitelorganoiderne afledt af HNE børstebiopsi. Det beskriver funktionelle assays, der kan bestemme CFTR-aktivitet hos et individ. HVE'er giver et minimalt invasivt, primært væv til en række applikationer. De ekspansionsteknikker, der tilbydes her, kan bruges til modellering af luftvejssygdomme, herunder organoider. Organoider kan bruges til præcisionsterapeutiske tilgange og til at overvåge stabiliteten af gen- eller mRNA-baserede terapier over tid, til præcisionsforsøgsdesign og til at hjælpe med at løse ufattelige diagnoser39. Den nuværende forskning er på CF, men disse modeller har anvendelser for andre sygdomme, der påvirker epitelfunktionen.
Den indledende udvidelse af HNE efter biopsi er afgørende. Det er blevet observeret, at cytologibørster giver større indledende celletal og bedre resultater end andre biopsiværktøjer14. Fra tidligere erfaringer har vi konkluderet, at kombination af børstninger fra begge narer i en enkelt prøve og behandling af denne prøve inden for 4 timer giver de bedste resultater. Andre efterforskere har brugt mere udvidede tidsrammer fra biopsi til behandling med succes3. Den passende indledende indsamling af biopsier er afgørende for efterfølgende ekspansion og såning som organoider. Højkvalitets bestrålede og inaktiverede fibroblaster til co-kultur er påkrævet, som dyrkes og behandles internt i vores laboratorium, men kan også købes kommercielt. Efterforskere rådes til, at ikke alle 3T3 fibroblaster er den samme cellelinje og bør valideres før brug.
For prøver, der ikke forventes at have patogen bakterie- eller svampekultur, er antibiotikabehandling begrænset til standard penicillin- og streptomycinbehandling for de forsøg, der er beskrevet i dette manuskript. For dem, der vides at have kronisk kolonisering af den øvre luftvej, anvendes en antibiotikacocktail beskrevet ovenfor i kun 3 dage, fordi antibiotika synes at bremse epiteludvidelsen og give dårligere resultater i de her beskrevne eksperimenter. Tre dage blev valgt for at afbalancere kontamineringsrisikoen med en lignende ekspansionshastighed for både CF- og ikke-CF-prøver. For personer med usædvanlige patogener kan skræddersyet antimikrobiel behandling redde forurenede kulturer, hvis de anerkendes tidligt eller påbegyndes a priori. For indledende biopsier, der er usædvanligt langsomme til at vokse, vil resultaterne typisk være dårlige for organoidundersøgelser. Efterforskere skal overvåge både vækstrate og morfologi dagligt. De interne kulturmedier og reagenser, der anvendes, er mest nyttige til funktionelle hævelsesassays, men andre kommercielt tilgængelige medier kan gavne andre applikationer 12,25,40,41 afhængigt af det eksperimentelle design. Den anvendte type ECM kan føre til forskellig morfologi og forskellige resultater, og reproducerbare resultater er kritiske. Alle reagenser, der anvendes i denne protokol, testes rutinemæssigt før brug til eksperimenter. På trods af denne erfaring vil nogle kulturer undlade at udvide eller generere organoider af uforklarlige årsager. Efterforskere opfordres til at overveje disse faktorer, da de optimerer denne protokol til deres applikationer.
En bestemt type 15-brønds dias bruges i denne protokol, der er optimeret til optisk billeddannelse, ved hjælp af minimale volumener og maksimering af replikater, samtidig med at omkostningerne reduceres. Disse dias har et nedre og øvre kammer fastgjort på et polymerdæksler, der minimerer menisci (hvilket ellers ville forringe billeddannelsen) og også medieudskiftning uden risiko for at fjerne matrixen og ødelægge organoidkulturerne. Disse dias gør lysfeltbilleddannelse og levende pletmikroskopi ligetil med indledende såning, vækst og billeddannelse i samme skål. Organoider vil gå tabt under indsamlings-, fikserings- og farvningsprocessen, så der skal udvises omhyggelig omhu under hvert trin, og der skal opnås tilstrækkelige startnumre for at sikre succes. Voksende organoider i kulturindsatser kan hjælpe, da disse teknikker udvikles.
Billeddannelsesteknikker, der bruger almindelige laboratoriemikroskoper, er inkluderet. De automatiserede funktionelle assays bruger dog et billedbehandlingssystem, der er komplekst og kræver en veluddannet bruger. Denne protokol er udviklet til brugere med et grundlæggende niveau af erfaring ved hjælp af dette mikroskop og dets software. Det anbefales først at træne individerne i den primære anvendelse af instrumentet og softwaren af repræsentanter for producenten; den samme praksis følges i vores laboratorium. Mindst 4 ugers træning var nødvendig for at bruge dette mikroskop effektivt til eksperimenter.
Som beskrevet ovenfor har denne metode nogle begrænsninger. Ekspertise inden for biopsiindsamling, hurtig behandlingstid og facilitet med feederfibroblaster er nødvendig for med succes at udvide og dyrke HNE-organoider. Denne metode blev udviklet ved hjælp af specifikke reagenser og udstyr, der muligvis ikke er universelt tilgængelige. Metoden har vist sig nyttig til forskning i cystisk fibrose 3,11,13 og er muligvis ikke så anvendelig for andre sygdomsprocesser 25. Andre metoder og andet udstyr kan dog anvendes til at udvikle lignende strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JSG er opført som opfinder på en patentansøgning 20170242033 fra University of North Carolina, der beskriver en lignende model. Når licenseret teknologi fra UNC producerer royalties, modtager opfinderne en andel af indtægterne. Ellers erklærer forfatterne ingen interessekonflikter. Bidragyderne havde ingen rolle i undersøgelsens design, i indsamlingen, analyserne eller fortolkningen af data, i skrivningen af manuskriptet eller i beslutningen om at offentliggøre resultaterne.
Acknowledgments
Vi anerkender taknemmeligt bidragene fra alle de deltagere, der donerede HNE børstebiopsier til at udvikle denne protokol. Vi takker Latona Kersh og Children's Research Unit personale for at koordinere rekruttering af frivillige studier og prøvesamlinger. Vi takker Lily Deng, Johnathan Bailey og Stephen Mackay, tidligere praktikanter i vores laboratorium, for teknisk assistance. Vi takker Zhong Liu og Rui Zhao for deres tekniske hjælp. Steven M. Rowe, direktør for CF Research Center ved UAB, leverer lederskab og ressourcer, uden hvilke dette arbejde ikke ville være muligt. Vi vil også gerne takke Sarah Guadiana hos Biotek for hjælp med instrumenttræning, Robert Grabski for konfokal mikroskopi assistance på UAB High-Resolution Imaging Facility og Dezhi Wang for histologisk bistand på UAB Histology Core. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (til JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (til JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 og DK072482 og CFF University of Alabama i Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], og UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , Discovery Labware, Inc. Bedford, MA. (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
