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Medicine

मानव नाक उपकला Organoids की संस्कृति और इमेजिंग

Published: December 17, 2021 doi: 10.3791/63064
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Research Center, University of Alabama at Birmingham (UAB), 2Department of Pediatrics, Division of Pulmonary and Sleep Medicine, UAB

Summary

मानव नाक उपकला कोशिकाओं से एक इन विट्रो ऑर्गेनोइड मॉडल का वर्णन करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल में मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता वाले माप के लिए विकल्प हैं, जिसमें विशेष उपकरण और सॉफ्टवेयर के लिए अतिरिक्त संभावनाएं हैं।

Abstract

सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) रोगियों के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा को बेसलाइन सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) गतिविधि और छोटे अणु यौगिकों से बहाली को समझने के लिए इन विट्रो रोग मॉडल के साथ प्राप्त किया जा सकता है। हमारे समूह ने हाल ही में प्राथमिक मानव नाक उपकला कोशिकाओं (एचएनई) से सीधे व्युत्पन्न एक अच्छी तरह से विभेदित ऑर्गेनोइड मॉडल स्थापित करने पर ध्यान केंद्रित किया है। अनुभागित ऑर्गेनोइड्स, पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग, और इमेजिंग (कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, इम्यूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग करके) के हिस्टोलॉजी ऑर्गेनोइड्स को चिह्नित करने और कार्यात्मक assays की तैयारी में उपकला भेदभाव की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, एचएनई ऑर्गेनोइड्स अलग-अलग आकारों के लुमेन का उत्पादन करते हैं जो सीएफटीआर गतिविधि के साथ सहसंबंधित होते हैं, सीएफ और गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स के बीच अंतर करते हैं। इस पांडुलिपि में, एचएनई ऑर्गेनोइड्स को संवर्धित करने के लिए पद्धति का विस्तार से वर्णन किया गया है, जिसमें इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग करके भेदभाव के आकलन पर ध्यान केंद्रित किया गया है, जिसमें बेसलाइन लुमेन क्षेत्र का माप शामिल है (ऑर्गेनोइड्स में सीएफटीआर गतिविधि माप की एक विधि जो माइक्रोस्कोप के साथ किसी भी प्रयोगशाला को नियोजित कर सकती है) के साथ-साथ एक कार्यात्मक परख के लिए विकसित स्वचालित दृष्टिकोण (जिसके लिए अधिक विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता होती है)।

Introduction

तकनीक का परिचय
पूर्व विवो संस्कृति आधारित assays सटीक दवा और रोग pathophysiology के अध्ययन के लिए एक तेजी से इस्तेमाल उपकरण हैं। प्राथमिक मानव नाक उपकला (एचएनई) सेल संस्कृति का उपयोग सिस्टिक फाइब्रोसिस 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 के कई अध्ययनों में किया गया है , एक ऑटोसोमल रिसेसिव रोग जो कई अंगों में उपकला कोशिका समारोह को प्रभावित करता है। एचएनई संस्कृति वायुमार्ग एपिथेलिया का एक नवीकरणीय स्रोत प्रदान करती है जिसे संभावित रूप से प्राप्त किया जा सकता है और सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) गतिविधि का परीक्षण करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और जैव रासायनिक गुणों को पुन: प्राप्त किया जा सकता है। एचएनई कोशिकाओं को न्यूनतम साइडइफेक्ट्स 14 के साथ नमूना लिया जा सकता है, जो सामान्य वायरल श्वसन स्वैब के समान है। एचएनई ब्रश बायोप्सी से व्युत्पन्न सिस्टिक फाइब्रोसिस अध्ययन के लिए एक मॉडल का वर्णन करने वाले शोध कार्य को हाल ही में11,13 प्रकाशित किया गया है। जबकि प्राथमिक एचएनई 2,3 और आंतों के ऊतक 15,16,17,18,19 का उपयोग करने वाले अन्य मॉडलों के समान, इस मॉडल के भेदभाव और इमेजिंग के विस्तृत लक्षण वर्णन को सीएफ अनुसंधान में उपयोग के लिए और अन्य वायुमार्ग रोगों के अध्ययन में सहायता के लिए यहां वर्णित किया गया है। . ऑर्गेनोइड मॉडल अमर सेल लाइनों की तरह असीमित नहीं है, लेकिन सशर्त रीप्रोग्रामिंग (विकिरणित और निष्क्रिय फीडर फाइब्रोब्लास्ट्स और रो-किनेज इनहिबिटर का उपयोग करके) को अधिक स्टेम सेल जैसी स्थिति 20,21,22,23 तक विस्तारित किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके एचएनई ब्रश बायोप्सी का प्रसंस्करण उच्च थ्रूपुट पर कई अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए बड़ी संख्या में उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करता है, जबकि अभी भी पूरी तरह से अंतर करने की क्षमता को बनाए रखता है। जबकि इस प्रोटोकॉल को फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित किया गया था, फीडर सेल तकनीक14,24 से बचने के इच्छुक जांचकर्ताओं द्वारा अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है।

फुफ्फुसीय जीव विज्ञान के लिए तकनीक का महत्व
एक महत्वपूर्ण अध्ययन यह समझने के लिए समर्पित किया गया है कि उपकला कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली में नियमित, कार्यशील सीएफटीआर की अनुपस्थिति के परिणामस्वरूप फेफड़ों, अग्न्याशय, यकृत, आंत या अन्य ऊतकों में शिथिलता कैसे होती है। बेकार उपकला आयन परिवहन, विशेष रूप से क्लोराइड और बाइकार्बोनेट के परिणामस्वरूप, उपकला अस्तर तरल पदार्थों की मात्रा में कमी और श्लेष्मा स्राव में परिवर्तन होता है, जिससे श्लेष्मा स्टैसिस और रुकावट होती है। अन्य वायुमार्ग रोगों में, जैसे कि प्राथमिक सिलियरी डिस्किनेसिया, परिवर्तित सिलिअरी गति म्यूकोसिलियरी निकासी को बाधित करती है और श्लेष्म स्टैसिस और रुकावट25 की ओर ले जाती है। इसलिए, वर्तमान एचएनई ऑर्गेनोइड मॉडल को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है, जो अन्वेषक के प्रयोगात्मक डिजाइन और संसाधनों पर निर्भर करता है। इसमें लाइव-सेल दाग का उपयोग करके लाइव-सेल इमेजिंग शामिल है; आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए निर्धारण और विभाजन; इंट्राल्यूमिनल संरचनाओं को बाधित करने से बचने के लिए एंटीबॉडी और पूरे-माउंट कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला; और चमकीले क्षेत्र इमेजिंग और माइक्रो ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी सिलियरी बीट आवृत्ति और mucociliary परिवहन के मात्रात्मक मापके लिए 13. अन्य जांचकर्ताओं के विस्तार की सुविधा के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और आपूर्ति का उपयोग खेती के लिए किया गया था। एक कार्यात्मक परख विकसित किया गया था कि आम माइक्रोस्कोप तकनीकों और अधिक विशेष उपकरणों का इस्तेमाल किया. कुल मिलाकर, जबकि वर्तमान मॉडल को बेसलाइन पर या चिकित्सीय के जवाब में सीएफटीआर गतिविधि का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीकों को उपकला सेल फ़ंक्शन, विशेष रूप से उपकला सेल द्रव परिवहन से जुड़ी अन्य बीमारियों पर लागू किया जा सकता है।

अन्य तरीकों की तुलना
हाल ही में इस ऑर्गेनोइड मॉडल की उपयोगिता को उनकी नैदानिक प्रतिक्रिया11 के साथ रोगियों के ऑर्गेनोइड्स के इन विट्रो सीएफटीआर मॉड्यूलेटर प्रतिक्रियाओं को सहसंबद्ध करके विकसित किया गया था। विशेष रूप से, यह भी प्रदर्शित किया गया है कि वर्तमान मॉडल ने शॉर्ट-सर्किट वर्तमान प्रतिक्रियाओं को समानांतर किया, सीएफटीआर फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक, एक ही रोगियों में। शॉर्ट-सर्किट वर्तमान सूजन परख से अलग है क्योंकि पूर्व उपायों CFTR आयन परिवहन26 के माध्यम से समारोह. इसके विपरीत, यह परख तरल पदार्थ परिवहन के साथ एक और अधिक डाउनस्ट्रीम प्रभाव को मापता है, CFTR 27,28,29,30,31,32 के समग्र कार्य के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। शॉर्ट-सर्किट वर्तमान माप सीएफटीआर क्लोराइड चैनल गतिविधि 1,33 को निर्धारित करने के लिए एक सामान्य और विश्वसनीय विधि बनी हुई है। इन electrophysiological assays विशेष, महंगा उपकरण की आवश्यकता है, organoid परख की तुलना में प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए कई बार अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता है, आसानी से स्वचालित नहीं किया जा सकता है, और उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए स्केलिंग करने के लिए अनुकूल नहीं हैं। आंतों के एपिथेलिया से व्युत्पन्न एक अन्य ऑर्गेनोइड मॉडल के अतिरिक्त लाभ 15,16,17,18 हैं, जैसे कि अधिक उत्कृष्ट प्रतिकृति क्षमता, लेकिन न तो वायुमार्ग के ऊतकों से व्युत्पन्न है और न ही सार्वभौमिक रूप से उपलब्ध है। एचएनई ब्रशिंग को बेहोश करने की क्रिया की आवश्यकता के बिना और न्यूनतम जोखिम पर सस्ती साइटोलॉजी ब्रश के साथ प्राप्त किया जाता है। ब्रशिंग प्राप्त करने के लिए एक चिकित्सक की आवश्यकता नहीं होती है और प्रशिक्षित अनुसंधान समन्वयकों और अन्य शोध कर्मचारियों द्वारा किया जा सकताहै। एचएनई ऑर्गेनोइड मॉडल को प्राथमिक सेल संस्कृति क्षमताओं के साथ किसी भी प्रयोगशाला द्वारा सुसंस्कृत किया जा सकता है, और कुछ अनुप्रयोगों को मानक माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ किया जा सकता है। कुल मिलाकर, ये फायदे वायुमार्ग उपकला समारोह का आकलन करने के लिए प्रौद्योगिकी तक अतिरिक्त पहुंच प्रदान करते हैं जो अन्यथा कुछ प्रयोगशालाओं के लिए अनुपलब्ध हो सकते हैं। इसके अलावा, एचएनई ऑर्गेनोइड्स का उपयोग अन्य रोग राज्यों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो वायुमार्ग को प्रभावित करते हैं, जैसे कि प्राथमिक सिलिअरी डिस्किनेसिया25 या वायरल संक्रमण, जो आंतों के ऑर्गेनोइड्स नहीं कर सकते हैं।

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Protocol

एचएनई नमूने अलबामा अस्पताल के बच्चों के बच्चों में एकत्र किए गए थे। यहां वर्णित सभी प्रक्रियाओं और तरीकों को बर्मिंघम में अलबामा के आईआरबी विश्वविद्यालय (यूएबी आईआरबी # 151030001) द्वारा अनुमोदित किया गया है। मानव नाक उपकला कोशिकाओं (एचएनई) के विस्तार और कार्य में सुधार करने के लिए, वर्तमान संस्कृति विधियों को प्रसिद्ध वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृति विधि28,34 से अनुकूलित किया जाता है। एचएनई को शुरू में ब्रश बायोप्सी द्वारा एकत्र किया गया था जैसा कि पहले12,14 वर्णित किया गया था, जिसमें एकमात्र अंतर एक साइटोलॉजी ब्रश का उपयोग था। सभी नमूना प्रसंस्करण चरणों और सेल संस्कृति biosafety कैबिनेट में प्रदर्शन किया गया था।

1. सेल संस्कृति और नाक उपकला कोशिकाओं का विस्तार

  1. ब्रश करने के बाद, नाक बायोप्सी नमूने को बर्फ पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में आरपीएमआई मीडिया के 8 मिलीलीटर में स्टोर करें और इसे 4 घंटे (24 घंटे से अधिक नहीं) के भीतर प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें।
  2. नाक ब्रश बायोप्सी को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में आरपीएमआई मीडिया के 8 मिलीलीटर में अलग करें, जब तक कि ब्रश ऊतक से स्पष्ट न हो जाए, तब तक कई बार एक एमएल बड़े बोर पिपेट टिप (टिप को काट दें) के माध्यम से साइटोलॉजी ब्रश को पारित करके।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, supernatant को हटा दें, और फिर सेल टुकड़ी समाधान के 3 मिलीलीटर में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और पचाने के लिए 16 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. कोशिकाओं को दो बार धोने के लिए विस्तार मीडिया (तालिका 1) के 5 मिलीलीटर का उपयोग करें। फिर, कोशिकाओं को सह-संस्कृति के लिए विकिरणित और निष्क्रिय 3T3 फाइब्रोब्लास्ट्स22 (50% -60% संगम) के साथ पूर्व-बीज वाले T75 फ्लास्क में कोशिकाओं को जोड़ें और 7-14 दिनों के लिए विस्तार मीडिया में विस्तार करें (उपयुक्त कॉलोनी के लिए चित्रा 1 देखें)। उपयोग करने से पहले, विकिरणित 3T3 फाइब्रोब्लास्ट्स का परीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे फैल नहीं सकते हैं, जो उपकला कोशिका विस्तार को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा।
    नोट: नाक उपकला सेल संगम 14 दिनों के भीतर 70% तक नहीं पहुँचता है, तो कोशिकाओं को छोड़ दें।
  5. CF के साथ रोगियों से व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए, चार एंटीबायोटिक्स (टोब्रामाइसिन के 100 μg / mL, एम्फोटेरिसिन बी के 2.5 μg / mL, ceftazidime के 100 μg / mL, vancomycin के 100 μg / mL, सामग्री की तालिका देखें) को संस्कृति के पहले 3 दिनों के लिए कोशिकाओं के कीटाणुशोधन के लिए विस्तार मीडिया में पेश करें, और फिर मीडिया को एंटीबायोटिक-मुक्त विस्तार मीडिया के साथ बदलें जो हर 2 दिनों में मीडिया को बदलते हैं।
    नोट: एंटीबायोटिक दवाओं के इस सीमित उपयोग का उद्देश्य अतिरिक्त एंटीबायोटिक दवाओं को हटाने के बाद प्रसार को प्रोत्साहित करते हुए जीवाणु उपनिवेशीकरण के कारण संस्कृति के नुकसान को कम करना है। इन एंटीबायोटिक दवाओं को रोगी के विशिष्ट माइक्रोबायोलॉजी परिणामों के अनुरूप बनाया जा सकता है, संवेदनशीलता के साथ, यदि आवश्यक हो।
  6. कोशिकाओं के लगभग 80% संगम तक पहुंचने के बाद डबल ट्रिप्सिनाइजेशन विधि22 का उपयोग करके सह-संस्कृति से एचएनई की कटाई करें। यह विधि सुनिश्चित करती है कि विकिरणित और निष्क्रिय 3T3 फाइब्रोब्लास्ट को फ्लास्क से हटा दिया जाता है, और वे बाद के ऑर्गेनोइड सीडिंग को दूषित नहीं करते हैं।
    1. 1x DPBS के साथ कोशिकाओं को धोएं, और फिर संस्कृति से विकिरणित और निष्क्रिय 3T3 फाइब्रोब्लास्ट को हटाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए T75 फ्लास्क में 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. किसी भी शेष 3T3 फाइब्रोब्लास्ट को अच्छी तरह से धोने के लिए दो बार 1x DPBS के साथ T75 फ्लास्क को कुल्ला; 1.5 mL के 0.05% ट्रिप्सिन-EDTA T75 फ्लास्क में 37 °C पर 10 मिनट के लिए HNEs अलग करने के लिए जोड़ें.
    3. सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें ( सामग्री की तालिका देखें) 1: 1 अनुपात पर। 5 मिनट के लिए 500 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर supernatant को हटा दें। एक बार विस्तार मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद, कोशिकाएं ऑर्गेनोइड्स विकसित करने के लिए सीडिंग के लिए तैयार होती हैं।
      नोट: तीन की एक मार्ग संख्या के साथ HNEs आगे प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं।

2. विकास और स्लाइड और संस्कृति आवेषण में organoids के भेदभाव

  1. ऑर्गेनोइड कल्चर एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पिघलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस और 15-अच्छी तरह से एंजियोजेनेसिस स्लाइड ( सामग्री की तालिका देखें) के लिए कूल पिपेट युक्तियाँ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर।
    नोट: ईसीएम को सेल कटाई करने की आवश्यकता से पहले रात को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।
  2. बर्फ पर ठंडे 100% ईसीएम के 5 μL के साथ स्लाइड को कोट करें (15-अच्छी तरह से स्लाइड के प्रत्येक कुएं में एक ठंडे पिपेट टिप के साथ ठंडे 100% ईसीएम के पिपेट 5 μL), और फिर उन्हें समेकन के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें।
  3. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सह-संस्कृति से काटे गए एचएनई की गणना करें और बर्फ पर भेदभाव मीडिया (तालिका 2) द्वारा पतला 20% ईसीएम के साथ कुल संख्या में कोशिकाओं को 500 कोशिकाओं / μL तक पतला करें। फिर, ईसीएम के साथ लेपित स्लाइड के प्रत्येक कुएं में ठंडे सेल / ईसीएम मिश्रण के बीज 5 μL।
  4. सेल / ईसीएम मिश्रण को समेकित करने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक संस्कृति इनक्यूबेटर में स्लाइड को तुरंत स्थानांतरित करें।
  5. विभेदन मीडिया के 50 μL के साथ 15-अच्छी तरह से एंजियोजेनेसिस स्लाइड के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं को खिलाएं। हर दूसरे दिन मीडिया को बदलें जब तक कि ऑर्गेनोइड्स आगे के प्रयोगों के लिए तैयार न हों।
    नोट: ऑर्गेनोइड्स को आमतौर पर 1-2 दिनों के बाद विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है। स्लाइड के प्रत्येक कुएं में आमतौर पर 20-90 ऑर्गेनोइड्स बनते हैं। ऑर्गेनोइड्स आमतौर पर ईसीएम में 40-60 दिनों तक जीवित रह सकते हैं, जब हर दूसरे दिन 37 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रखा जाता है।
  6. संस्कृति संस्कृति आवेषण ( सामग्री की तालिका देखें) विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए अधिक मात्रा के लिए (जैसे histology या immunofluorescence के लिए अनुभागन के रूप में) नीचे उल्लिखित चरणों के अनुसार organoids संस्कृति आवेषण .
    1. संस्कृति आवेषण में organoids विकसित करने के लिए, organoid संस्कृति ईसीएम, पिपेट युक्तियाँ, और आवेषण तैयार के रूप में चरण 2.1-2.2 में उल्लेख किया गया है. ठंडा 100% ईसीएम के 100 μL के साथ आवेषण कोट.
    2. सम्मिलित करने में ईसीएम कोटिंग के शीर्ष पर सेल / ईसीएम मिश्रण के बीज 60 μL (विभेदन मीडिया में 20% ईसीएम के साथ 500 कोशिकाएं / μL)।
      नोट:: आवेषण में organoids बनाने के लिए अन्य सभी चरण स्लाइड, चरण 2.4-2.5 में आयोजित उन लोगों के समान हैं।
    3. सम्मिलित करें के निचले भाग में विभेदन मीडिया के 600 μL जोड़ें। हर वैकल्पिक दिन मीडिया को तब तक बदलें जब तक कि ऑर्गेनोइड्स का उपयोग प्रयोगों के लिए नहीं किया जाता है, आमतौर पर 2-3 सप्ताह।

3. तैयारी और पूरे माउंट immunofluorescence के लिए organoids के अलगाव

  1. ऑर्गेनोइड्स का अलगाव और निर्धारण
    1. पूर्व-उपचार 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड्स सेल चिपकने वाला के साथ ( सामग्री की तालिका देखें) संदर्भ35 के बाद 30 मिनट के लिए। समाधान को छोड़ने के बाद, 30 मिनट के लिए कुओं को हवा से सुखाएं।
    2. ऑर्गेनोइड्स की कटाई के लिए, ईसीएम के शीर्ष से मीडिया को हटा दें, और फिर बर्फ पर 15-अच्छी तरह से स्लाइड (ईसीएम वॉल्यूम के साथ 1: 1) के प्रत्येक कुएं में 50 μL ठंडे 1x पीबीएस जोड़ें।
    3. बड़े बोर पिपेट टिप के 200 μL का उपयोग करके 3-5 बार पिपेट ऊपर और नीचे, और फिर 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के एक कुएं के केंद्र पर समाधान वितरित करें।
    4. तुरंत एक ठीक टिप पिपेट द्वारा कुओं से अतिरिक्त तरल निकालें। फिर, कक्ष स्लाइड को 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें ताकि कांच के तल का पालन करने वाले ऑर्गेनोइड को बढ़ाया जा सके।
    5. धीरे से 1x PBS के साथ दो बार धोने के बाद, कमरे के तापमान (RT) पर 30 मिनट के लिए प्रत्येक कुएं में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 300 μL के साथ ऑर्गेनोइड्स को ठीक करें।
    6. 1x PBS के साथ दो बार धोएं और 2 सप्ताह तक immunostaining के लिए 4 °C पर 1x PBS में ऑर्गेनोइड्स को स्टोर करें।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    1. ऑटो-प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए, 30 मिनट के लिए आरटी पर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में 1x पीबीएस में 50 mM NH4Cl के 250 μL जोड़ें, जबकि धीरे से 20 rpm पर एक शेकर पर मिलाते हुए।
    2. 1x PBS के साथ दो बार धोने के बाद, RT पर 30 मिनट के लिए 0.1% Triton X-100 के साथ कोशिकाओं को permeabilize करें, जबकि धीरे से 20 rpm पर मिलाते हुए।
    3. 1x PBS के साथ दो बार धोने के बाद, 5% BSA और 0.1% Triton X-100 1x PBS में सहित 300 μL ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें, RT पर 1 h के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से में।
    4. धोने के बाद, माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद उपयुक्त कुओं में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। 2% बीएसए और 0.3% ट्राइटन एक्स -100 में 1x पीबीएस में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी प्राथमिक एंटीबॉडी और 1 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी माध्यमिक एंटीबॉडी को इनक्यूबेट करें।
      नोट: अंतिम सांद्रता प्रयोग के लिए वांछित प्रोटीन पर निर्भर करती है। कृपया निर्माता के डेटाशीट पर स्टॉक एकाग्रता की जाँच करें. फिर, सामग्री की तालिका में उपयोग किए जाने वाले dilutions के आधार पर अंतिम सांद्रता की गणना करें।
    5. इनक्यूबेशन बाद, कुओं को 1x PBS के साथ अच्छी तरह से धो लें और परमाणु दाग के लिए प्रत्येक कुएं में 2% BSA और 0.3% ट्राइटन एक्स -100 में DAPI जोड़ें।
    6. एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर organoids छवि, एक 20-60x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ ( सामग्री की तालिका देखें). छवि की ऊपरी और निचली सीमाओं को सेट करने के लिए Z-स्टैक मोड का उपयोग करें और confocal सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित अनुशंसित इष्टतम Z-चरण आकार का उपयोग करें।
      नोट: निम्नलिखित चार confocal लेजर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग किया गया था: 408.7 एनएम, 489.1 एनएम, 561.7 एनएम, और 637.9 एनएम।

4. हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग के लिए ऑर्गेनोइड्स की तैयारी और अलगाव

  1. हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए ऑर्गेनोइड्स की कटाई करने के लिए, संस्कृति से मीडिया को हटा दें और बर्फ पर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में ठंडे 1x पीबीएस के 50 μL जोड़ें।
  2. पिपेट ऊपर और नीचे तीन से पांच बार एक 200 μL बड़े बोर पिपेट टिप का उपयोग कर, 15-अच्छी तरह से स्लाइड या संस्कृति से सभी समाधानों को बर्फ पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सम्मिलित करते हैं। अतिरिक्त ठंडा 1x PBS जोड़कर 10 mL करने के लिए ट्यूब में कुल समाधान मात्रा को समायोजित करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, 5 मिनट के लिए 300 x g ; supernatant बाहर aspirate और गर्म histogel के 60 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) बड़े बोर पिपेट टिप के एक 200 μL का उपयोग कर organoid गोली के साथ मिश्रण करने के लिए.
  4. तुरंत निलंबन को एक हिस्टोलॉजी मोल्ड में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर हिस्टोजेल के समेकन के बाद, मोल्ड ब्लॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर निर्धारण के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में रखें।
  5. पैराफिन में एम्बेड करने के बाद, हिस्टोजेल ब्लॉक को 5 μm क्रॉस-सेक्शन (उदाहरण के लिए, माइक्रोटोम के साथ) में काटें, ग्लास स्लाइड पर अनुभागों को ठीक करें, और हेमेटोक्सिलिन और इओसिन (एच एंड ई) या इम्यूनोफ्लोरेसेंस-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग दें। एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप या उल्टे एपि-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को लें ( सामग्री की तालिका देखें)।

5. लाइव organoids की इमेजिंग

नोट:: एक स्वचालित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग कर निम्न चरणों को पूरा किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। विभिन्न इमेजिंग सिस्टम को अपने विशिष्ट निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए इन चरणों को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। उपयोग किए गए उपकरणों के बावजूद, इमेजिंग लाइव ऑर्गेनोइड्स को सीओ2 गैस नियंत्रक के साथ तापमान-नियंत्रित और ह्यूमिडिफाइड पर्यावरण कक्ष की आवश्यकता होती है।

  1. एक कार्यात्मक सूजन परख36 प्रदर्शन करने से पहले organoids के भेदभाव की निगरानी करने के लिए, किसी भी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ या एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली के साथ मैन्युअल रूप से पूरे स्लाइड छवियों पर कब्जा, के रूप में नीचे विस्तृत.
    1. स्वचालित इमेजिंग सिस्टम और सीओ 2/ ओ 2 गैस नियंत्रक के लिए शक्ति को चालू करें और सिस्टम को स्वचालित अंशांकन (~ 30 मिनट) को पूरा करने की अनुमति दें।
    2. पूरा होने के बाद, इमेजिंग सिस्टम का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें; आर्द्रता जलाशय में बाँझ पानी के 15 मिलीलीटर जोड़ें, सीओ2 वाल्व खोलें, ढक्कन बंद करें, और इमेजिंग सिस्टम को इमेजिंग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए पूर्व-इनक्यूबेट करें।
    3. इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल सेट करने के लिए स्वचालित इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें और कच्चे प्रयोगात्मक डेटा को सहेजने के लिए स्थान चुनें।
      नोट:: एक उदाहरण प्रोटोकॉल फ़ाइल (अनुपूरक फ़ाइल 1), इमेजिंग सिस्टम के लिए विशिष्ट, organoid भेदभाव की निगरानी करने के लिए organoids के स्वचालित इमेजिंग के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रदान किया गया है।
    4. एक बार पर्यावरण सेटिंग्स से मिलने के बाद, तुरंत स्वचालित छवि प्रणाली के स्लाइड धारक सम्मिलित करें ( सामग्री की तालिका देखें) में पर्यावरण कक्ष में ढक्कन के साथ दो 15-अच्छी तरह से स्लाइड तक स्थानांतरित करें।
    5. छवियों के लिए कुओं का चयन करें और वांछित कुओं की इमेजिंग को पूरा करने के लिए इमेजिंग शुरू करें।
      नोट: बुनियादी अनुशंसित सेटिंग्स हैं: 4x और 10x हवा उद्देश्य, उज्ज्वल क्षेत्र चैनल, 2 x 2 असेंबल 4x उद्देश्य के लिए पूरे अच्छी तरह से क्षेत्र को कवर करने के लिए, 4 x 4 असेंबल एक 10x उद्देश्य के लिए. जेड-स्टैक सेटिंग्स: तीन से छह जेड-स्टैक स्लाइस, जेड-चरण आकार = 50-100 μm, ऑटोफोकस बिंदु के नीचे एक से दो स्लाइस, और ऊपर तीन से पांच स्लाइस।
  2. एक forskolin-प्रेरित सूजन (एफआईएस) परख में उपयोग के लिए लाइव organoids छवि करने के लिए, एक पर्यावरणीय रूप से नियंत्रित इमेजिंग कक्ष है कि तापमान और सीओ2 नियंत्रण की अनुमति देता है के साथ सुसज्जित एक स्वचालित चरण के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    1. चरण 5.1.1-5.1.4 के साथ शुरू करें, उदाहरण प्रोटोकॉल फ़ाइल (अनुपूरक फ़ाइल 2) में प्रदान की गई एक के साथ चरण 5.1.3 में प्रोटोकॉल फ़ाइल को प्रतिस्थापित करें जिसमें एफआईएस परख करने के लिए विशिष्ट सेटिंग्स शामिल हैं।
    2. प्रत्येक प्रयोग से पहले, प्रत्येक स्लाइड के लिए कम से कम तीन कुओं का मूल्यांकन करके एक्सपोज़र सेटिंग्स को समायोजित करें (अभी तक बाएं, मध्य और अभी तक दाएं)। यह सुनिश्चित करने के लिए एक्स और वाई समन्वय ऑफसेट लागू करें कि उद्देश्य सभी कुओं के लिए कुएं के केंद्र में होगा।
      नोट: मूल अनुशंसित सेटिंग्स हैं: 4x हवा उद्देश्य, चैनल 1 = उज्ज्वल क्षेत्र, चैनल 2 = DAPI, 2 x 2 असेंबल (चार छवि टाइल्स). जेड-स्टैक सेटिंग्स: तीन से चार जेड-स्टैक स्लाइस, जेड-स्टेप आकार = 50-100 μm, ऑटोफोकस बिंदु के नीचे एक टुकड़ा और ऊपर दो से तीन स्लाइस। छवि अधिग्रहण समय: 20 मिनट के अंतराल के साथ 8 ज (कुल पढ़ता है = 25; पढ़ें 1 T = 0 है)।
    3. एक बार जब सभी सेटिंग्स उचित रूप से चयनित हो जाती हैं, तो दोनों स्लाइड्स के लिए छवि के लिए कुओं का चयन करें, या सभी का चयन करें, और उपकरण के निर्देशों के अनुसार रन शुरू करें।
    4. चलने के बाद, प्रयोग को सहेजें, इमेजिंग सॉफ़्टवेयर को बंद करें, और इमेजिंग सिस्टम37 को बंद कर दें।

6. बेसलाइन लुमेन माप

नोट: यह मैन्युअल इमेजिंग विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। एक ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर38 या किसी भी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक समान पद्धति का पालन किया जा सकता है जो किसी छवि पर किसी क्षेत्र के क्षेत्र को माप सकता है।

  1. सॉफ़्टवेयर में, स्क्रीन के निचले भाग पर राइट-क्लिक करके स्वचालित मापन कक्ष खोलें, मापन का चयन करें, और तब स्वचालित माप परिणाम. मापा ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र (ROI) का क्षेत्र वहाँ दिखाई देगा।
  2. सॉफ्टवेयर में organoid छवि खोलें और दृश्यमान lumens के साथ 5-10 organoids का चयन करें।
    नोट: लुमेन ऑर्गेनोइड के बीच में एक गोलाकार क्षेत्र होगा जो बाकी ऑर्गेनोइड (चित्रा 2 ए) की तुलना में रंग में स्पष्ट रूप से अलग है।
  3. बहुभुज ROI माप सुविधा का उपयोग करते हुए, मेनू खोलने के लिए छवि पर राइट क्लिक करें और ऑर्गेनोइड के कुल सतह क्षेत्र (टीएसए) को प्राप्त करने के लिए पूर्ण ऑर्गेनोइड को रेखांकित करने के लिए बहुभुज आरओआई का चयन करें। फिर उसी सुविधा का उपयोग करते हुए, लुमेन क्षेत्र (एलए) (चित्रा 2 बी) की रूपरेखा तैयार करें।
  4. अच्छी तरह से और परख में सभी कुओं में शेष organoids के लिए दोहराएँ.
  5. Excel में डेटा निर्यात करें. टीएसए द्वारा ला को विभाजित करें और बेसलाइन लुमेन अनुपात (बीएलआर) 11,13 प्राप्त करने के लिए नमूने से सभी ऑर्गेनोइड्स का औसत करें।
    नोट: आमतौर पर, गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स के ~ 87% में 0.6 से अधिक बीएलआर होगा, और 97% 0.5 से अधिक होगा, जबकि केवल 14% सीएफ ऑर्गेनोइड्स में 0.6 से अधिक बीएलआर होगा, और 31% 0.5 से अधिक होगा।

7. पूर्व उपचार और HNE organoids के स्वचालित इमेजिंग

नोट: सभी पूर्व उपचार कदम एक स्वच्छ जैव सुरक्षा कैबिनेट में किए जाते हैं। पूर्व सेटअप स्वचालित इमेजिंग प्रणाली और 7.1 कदम से पहले परख रिकॉर्डिंग के लिए सॉफ्टवेयर. DAPI के साथ इनक्यूबेशन वैकल्पिक है, लेकिन एक असफल-सुरक्षित के रूप में अनुशंसित है यदि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों की गुणवत्ता से समझौता किया जाता है। इस मामले में, DAPI चैनल (377 nm) के बजाय विश्लेषण किया जा सकता है।

  1. पूर्व-15-अच्छी तरह से स्लाइड के एक कुएं में ऑर्गेनोइड्स को 50 μL भेदभाव मीडिया के साथ या बिना DAPI युक्त CFTRinh-172 के 100 μM के साथ या बिना ( सामग्री की तालिका देखें) 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। जबकि organoids incubate, पूरक फ़ाइल 2 के बाद एक सूजन परख कस्टम प्रोटोकॉल का उपयोग कर चरण 5.2.1 प्रदर्शन.
  2. आकांक्षा के साथ एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पूर्व-इनक्यूबेशन माध्यम को हटा दें। प्रत्येक अच्छी तरह से 50 μL विभेदन मीडिया की कुल मात्रा के लिए forskolin के 10 μM और IBMX (उत्तेजना कॉकटेल) के 100 μM जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कुओं में कोई बुलबुले पेश नहीं किए जाते हैं। छवियों पर बुलबुले स्वचालित विश्लेषण को प्रभावित करेंगे।
  3. देरी के बिना, चरण 5.2.2 करने के लिए 5.2.4 के बाद FIS इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रारंभ करें। प्रत्येक अच्छी तरह से हर 20 मिनट में छवियों को प्राप्त करें, जिसमें 8 घंटे का कुल रनटाइम होता है।

8. HNE organoids पर forskolin प्रेरित सूजन परख के स्वचालित विश्लेषण

  1. स्वचालित इमेजिंग विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें, पहले चरण 7.3 से सहेजे गए प्रयोग को ढूंढें, और प्रयोग की छवियों को लाएं।
  2. मूल्यांकन करने के लिए पोत विंडो चुनें और संसाधित छवियों वाले विकल्प का चयन करें जिन्हें सिला गया है और जेड-प्रक्षेपित किया गया है। इस चरण को मास्किंग मूल्यांकन और माप के लिए इमेजिंग फ्रेम के भीतर सभी ऑर्गेनोइड्स के साथ पूरे कुएं की एक तस्वीर प्रदान करनी चाहिए।
  3. आकलन करने के लिए अच्छी तरह से छवि चुनें। विश्लेषण का चयन करें। स्वचालित माप में शामिल सभी छवियों के लिए उपयुक्त मास्किंग सुनिश्चित करने के लिए अन्य छवियों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। सेटिंग पैरामीटर सहेजें.
  4. विश्लेषण सेटिंग्स को पूरा करने के बाद, परिवर्तन लागू करें। सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स के आधार पर माप को बदल देगा।
    नोट:: प्रारंभिक छवि पूर्व-संसाधन पूरा होने के बाद, गुणवत्ता नियंत्रण (QC) उपायों को लगातार मास्किंग सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए। इनमें यह सुनिश्चित करने के लिए मैन्युअल रूप से सभी कुओं की समीक्षा करना शामिल है कि ऑर्गेनोइड्स इमेजिंग फ्रेम के भीतर हैं, बुलबुले या मलबे को अनुचित रूप से नकाबपोश नहीं किया गया है, और उज्ज्वल क्षेत्र और डीएपीआई चैनलों में मास्किंग की जांच करना शामिल है।
  5. सारांश विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात करें (ग्राफ़िंग और सांख्यिकीय विश्लेषण सहित).

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Representative Results

एचएनई विस्तार एक संपन्न ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए आवश्यक है। एक सफल नमूना संग्रह से एचएनई को 10 दिनों के आसपास 70% से अधिक संगम तक विस्तारित करना चाहिए। सफल और असफल नमूनों का एक उदाहरण क्रमशः चित्र 1A और चित्र 1B में दिखाया गया है। कोशिकाओं को छोड़ दिया जाना चाहिए यदि वे विकिरणित 3T3 कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति के बाद 14 दिनों तक 70% संगम तक नहीं पहुंच सकते हैं। किसी भी दूषित कोशिकाओं को तुरंत छोड़ दिया जाना चाहिए यदि अतिरिक्त रोगाणुरोधी एजेंटों के साथ जल्दी से बचाव करने में असमर्थ हैं।

ऑर्गेनोइड्स के विकास की तुलना 15-अच्छी तरह से स्लाइड और संस्कृति आवेषण में की गई थी। संस्कृति आवेषण ऑप्टिकल रूप से अनुकूलित स्लाइड की तुलना में उद्देश्य से मोटे और आगे होते हैं, जो छवि और रिज़ॉल्यूशन को प्रभावित करते हैं। इसके बावजूद, इन दो संस्कृति विधियों में आकृति विज्ञान में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। गैर-सीएफ और सीएफ ऑर्गेनोइड्स के बीच रूपात्मक अंतर देखा जा सकता है, जैसा कि चित्र 3 ए में दिखाया गया है। गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स में एक बड़ा लुमेन होता है जिसमें इसके भीतर अधिक तरल पदार्थ होता है। इसके विपरीत, सीएफ ऑर्गेनोइड्स में आमतौर पर कम तरल पदार्थ के साथ एक छोटा लुमेन होता है और कभी-कभी बलगम और मलबे से भरा होता है। लुमेन आकार को मैन्युअल रूप से मापा गया था (चित्रा 3 बी), और बेसलाइन लुमेन अनुपात की गणना की गई थी और चित्र 3 सी में दिखाया गया था। क्रॉस-सेक्शन्ड ऑर्गेनोइड्स को एच एंड ई और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का उपयोग करके विशेषता दी गई थी। प्रतिनिधि छवियों को चित्र 4A, B में दिखाया गया है। वायुमार्ग उपकला मार्कर जैसे सिलिया, बलगम, और तंग जंक्शन को पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग द्वारा ऑर्गेनोइड्स में प्रदर्शित किया जाता है जो चित्र 5ए-डी में दिखाया गया है। आवेदन के आधार पर, अनुभागित या पूरे माउंट immunofluorescence नियोजित किया जा सकता है। पूरे-माउंट विधि ऑर्गेनोइड की तीन आयामी प्रकृति को बनाए रखती है, ऑर्गेनोइड के इंटीरियर को बरकरार रखती है, जैसा कि पहले प्रकाशित काम13 में दिखाया गया है।

CFTR समारोह forskolin-प्रेरित सूजन (एफआईएस) परख द्वारा एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था. बेहतर छवि रिज़ॉल्यूशन के कारण कार्यात्मक assays के लिए केवल 15-अच्छी तरह से स्लाइड का उपयोग किया जाता है। गैर-सीएफ स्वयंसेवकों (एन = 5 विषयों) के एक प्रतिनिधि फॉरस्कोलिन खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग को अनुकूलित इमेजिंग समय और विश्लेषण के तर्क को चित्रित करने के लिए चित्र 6 ए में दिखाया गया है। गैर-सीएफ और सीएफ ऑर्गेनोइड प्रतिक्रियाओं की तुलना करने वाले डेटा पिछले प्रकाशनों11,13 में विस्तृत हैं। एक खुराक-प्रतिक्रिया माप के लिए सबसे अच्छा दृष्टिकोण प्रदर्शित करने के लिए CFTR गतिविधि में वृद्धिशील परिवर्तन दिखाती है। 1 ज और 8 ज की परख अवधि का मूल्यांकन किया गया था (चित्रा 6 बी, सी) साथ ही साथ औसत भिन्नात्मक परिवर्तन (एएफसी) बनाम वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र का उपयोग करके विश्लेषण को आंकड़े 6 सी, डी में देखा गया है। हमारे पिछले अनुभव के आधार पर, अधिकांश विषयों और स्थितियों के लिए सूजन 8 घंटे के बाद पठार, और कुछ मामलों में, उस समय ऑर्गेनोइड्स के फटने के परिणामस्वरूप। इसलिए, assays केवल 8 ज तक सीमित थे। इस विस्तारित परख लंबाई पर, सूजन गैर रैखिक हो जाता है. एयूसी का उपयोग आकार में परिवर्तन और परिवर्तन की दर दोनों पर भी विचार करता है। इसलिए, 8 ज से अधिक AUC का उपयोग अंतिम पद्धति में सभी एफआईएस assays के लिए किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: सह-संस्कृति में एचएनई की उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। एचएनई 10 दिनों के लिए विकिरणित और निष्क्रिय 3T3 फाइब्रोब्लास्ट के साथ विस्तार मीडिया में विस्तार मीडिया में विस्तार करते हैं। कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए एक उल्टे उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है। (ए) एचएनई एक बड़े क्लस्टर (काले तीर) में अच्छी तरह से बढ़ते हैं। इसके विपरीत, (बी) में, एचएनई विकिरणित 3टी 3 कोशिकाओं के आसपास के दो छोटे समूहों (काले तीर) में खराब रूप से बढ़ते हैं। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एक 15-अच्छी तरह से स्लाइड और संस्कृति डालने में एचएनई ऑर्गेनोइड गठन। ऑर्गेनोइड्स की ब्राइट-फील्ड छवियों को 21 दिनों में एक उल्टे उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया था। 15-अच्छी तरह से स्लाइड (ए) में ऑर्गेनोइड्स में संस्कृति सम्मिलित (बी) में उन लोगों की तुलना में अधिक सटीक और तेज छवियां होती हैं। स्लाइड और सम्मिलित करने में सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स के बीच कोई रूपात्मक अंतर नहीं देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Organoid लुमेन आकार (पैनल ए) और लुमेन माप (पैनल बी और सी)। (ए) गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स में आमतौर पर सीएफ (F508del / F508del) ऑर्गेनोइड्स की तुलना में एक बड़ा लुमेन और अधिक तरल पदार्थ होता है। (बी) एक एकल ऑर्गेनोइड में हरी रूपरेखा द्वारा इंगित लाल रूपरेखा और लुमेन क्षेत्र (एलए) द्वारा इंगित कुल सतह क्षेत्र (टीएसए) को मैन्युअल रूप से मापने की एक विधि। (सी) कुल सतह क्षेत्र और लुमेन क्षेत्र का उपयोग करने के लिए एक उदाहरण के लिए एक गैर-सीएफ बनाम एक सीएफ विषय से organoids में बेसलाइन लुमेन अनुपात (LA: TSA) की गणना करने के लिए। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पैराफिन में एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स का क्रॉस-सेक्शन। (ए) एक गैर-सीएफ और सीएफ (F508del / F508del) विषय से ऑर्गेनोइड्स में एच एंड ई धुंधला होने का एक उदाहरण। (बी) एक ऑर्गेनोइड में सिलिया का इम्युनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना। हरा सिलिया (सफेद तीर) एसिटाइलेटेड-ट्यूबुलिन और FITC लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सना हुआ है, और नीला DAPI के साथ लेबल नाभिक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ऑर्गेनोइड्स में पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरेसेंस की कॉन्फोकल छवियां। (A,C) दो प्रतिनिधि organoids की अधिकतम प्रक्षेपण छवियों. (B,D) क्रमशः (ए) और (सी) की त्रि-आयामी पुनर्निर्माण छवियां। एक 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम स्लाइड को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के मंच पर फिट किया गया था, और फोटोमाइक्रोग्राफ बनाने के लिए 40x लेंस का उपयोग किया गया था। इमेजिंग विश्लेषण सॉफ़्टवेयर इमेजिंग और छवियों के पुनर्निर्माण के लिए लागू किया गया था। सफेद तीर बलगम (बी में) और सिलिया (सी में) को ऑर्गेनोइड्स के लुमेन के भीतर इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: सूजन परख लंबाई और विश्लेषण विधियों के लिए तर्क. Forskolin (FSK) प्रेरित सूजन (एफआईएस) परख प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं पर CFTR समारोह का परीक्षण करने के लिए। आंकड़ों में इंगित किए गए forskolin की विभिन्न खुराक को भेदभाव मीडिया में 21-दिवसीय पुराने ऑर्गेनोइड्स में प्रशासित किया गया था; ऑर्गेनोइड सूजन को तुरंत 8 ज के लिए स्वचालित इमेजर के साथ दर्ज किया गया था। 8 घंटे के बाद, औसत भिन्नात्मक परिवर्तन (एएफसी) का उपयोग करके सूजन (ए) (एन = 5, गैर-सीएफ विषयों) में दिखाया गया है। FSK खुराक-प्रतिक्रिया की तुलना एएफसी के साथ 1 ज (बी) बनाम 8 एच (सी) पर की जाती है, जो बताता है कि 8 एच परख 1 घंटे की तुलना में विभिन्न एफएसके खुराक के बीच अधिक महत्वपूर्ण सूजन अंतर पैदा कर सकता है एएफसी (सी) बनाम वक्र के तहत क्षेत्र, एयूसी (डी) की तुलना में 8 ज, यह दर्शाता है कि एयूसी एएफसी की तुलना में मामूली सूजन अंतर को प्रतिबिंबित कर सकता है। पैनलों (बी-डी) में एक्स-अक्ष आकृति किंवदंती में प्रतीकों के अनुरूप विभिन्न उपचार स्थितियों का प्रतिनिधित्व करता है। आंकड़ों में सभी त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: विस्तार मीडिया बनाने के लिए सभी घटकों। अभिकर्मक स्टॉक एकाग्रता, स्टॉक भंडारण, 500 एमएल मीडिया बनाने के लिए स्टॉक की मात्रा और अंतिम एकाग्रता के बारे में विस्तृत जानकारी का वर्णन किया गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: भेदभाव मीडिया बनाने के लिए सभी घटकों. अभिकर्मक स्टॉक एकाग्रता, स्टॉक भंडारण, 500 एमएल मीडिया बनाने के लिए स्टॉक की मात्रा और अंतिम एकाग्रता के बारे में विस्तृत जानकारी का वर्णन किया गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: इमेजिंग सिस्टम के लिए विशिष्ट एक उदाहरण प्रोटोकॉल फ़ाइल ऑर्गेनोइड भेदभाव की निगरानी के लिए ऑर्गेनोइड्स के स्वचालित इमेजिंग के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रदान की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 2: एक एफआईएस परख करने के लिए विशिष्ट सेटिंग्स युक्त एक उदाहरण प्रोटोकॉल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यह पांडुलिपि एचएनई ब्रश बायोप्सी से व्युत्पन्न वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स के व्यापक लाइव और फिक्स्ड इमेजिंग के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करती है। यह कार्यात्मक assays का वर्णन करता है जो किसी व्यक्ति में CFTR गतिविधि को निर्धारित कर सकता है। एचएनई विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव, प्राथमिक ऊतक प्रदान करते हैं। यहां पेश की गई विस्तार तकनीकों का उपयोग वायुमार्ग रोग के मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है, जिसमें ऑर्गेनोइड्स भी शामिल हैं। ऑर्गेनोइड्स का उपयोग सटीक चिकित्सीय दृष्टिकोण के लिए किया जा सकता है और समय के साथ जीन या एमआरएनए-आधारित उपचारों की स्थिरता की निगरानी करने के लिए, सटीक परीक्षण डिजाइन के लिए, और अनिर्णायक निदान को हल करने में सहायता करने के लिए39। वर्तमान शोध सीएफ पर है, लेकिन इन मॉडलों में उपकला समारोह को प्रभावित करने वाली अन्य बीमारियों के लिए आवेदन हैं।

बायोप्सी के बाद एचएनई का प्रारंभिक विस्तार आवश्यक है। यह देखा गया है कि साइटोलॉजी ब्रश अन्य बायोप्सी उपकरणों की तुलना में बड़ी प्रारंभिक सेल संख्या और बेहतर परिणाम उत्पन्न करतेहैं। पिछले अनुभवों से, हमने निष्कर्ष निकाला है कि एक ही नमूने में दोनों nares से brushings के संयोजन और प्रसंस्करण है कि नमूना 4 घंटे के भीतर सबसे अच्छा परिणाम उपज. अन्य जांचकर्ताओं ने सफलता के साथ प्रसंस्करण के लिए बायोप्सी से अधिक विस्तारित समय सीमा का उपयोग कियाहै। बायोप्सी का उचित प्रारंभिक संग्रह बाद के विस्तार और ऑर्गेनोइड्स के रूप में सीडिंग के लिए महत्वपूर्ण है। सह-संस्कृति के लिए उच्च गुणवत्ता वाले विकिरणित और निष्क्रिय फाइब्रोब्लास्ट की आवश्यकता होती है, जो हमारी प्रयोगशाला में घर में उगाए जाते हैं और इलाज किए जाते हैं, लेकिन व्यावसायिक रूप से भी खरीदे जा सकते हैं। जांचकर्ताओं को सलाह दी जाती है कि सभी 3T3 फाइब्रोब्लास्ट एक ही सेल लाइन नहीं हैं और उपयोग से पहले मान्य किया जाना चाहिए।

रोगजनक जीवाणु या कवक संस्कृति वाले नमूनों के लिए, एंटीबायोटिक उपचार इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगों के लिए मानक पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन उपचार तक सीमित है। उन लोगों के लिए जिन्हें ऊपरी वायुमार्ग के पुराने उपनिवेशीकरण के लिए जाना जाता है, ऊपर वर्णित एक एंटीबायोटिक कॉकटेल का उपयोग केवल 3 दिनों के लिए किया जाता है क्योंकि एंटीबायोटिक्स उपकला विस्तार को धीमा करने और यहां वर्णित प्रयोगों में खराब परिणाम उत्पन्न करने लगते हैं। CF और गैर-CF नमूनों दोनों के लिए एक समान विस्तार दर प्रदान करने के साथ संदूषण जोखिम को संतुलित करने के लिए तीन दिनों का चयन किया गया था। असामान्य रोगजनकों वाले व्यक्तियों के लिए, अनुरूप रोगाणुरोधी उपचार दूषित संस्कृतियों को बचा सकता है यदि जल्दी मान्यता प्राप्त हो या एक प्राथमिकता शुरू की जाए। प्रारंभिक बायोप्सी के लिए जो असामान्य रूप से बढ़ने के लिए धीमी गति से होते हैं, परिणाम आमतौर पर ऑर्गेनोइड अध्ययन के लिए खराब होंगे। जांचकर्ताओं को दैनिक विकास दर और आकृति विज्ञान दोनों की निगरानी करने की आवश्यकता है। इन-हाउस संस्कृति मीडिया और अभिकर्मकों का उपयोग कार्यात्मक सूजन assays के लिए सबसे उपयोगी हैं, लेकिन अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मीडिया प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अन्य अनुप्रयोगों 12,25,40,41 को लाभ पहुंचा सकते हैं। उपयोग किए जाने वाले ईसीएम के प्रकार से विभिन्न आकृति विज्ञान और विभिन्न परिणाम हो सकते हैं, और पुनरुत्पादक परिणाम महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों को प्रयोगों के लिए उपयोग करने से पहले नियमित रूप से परीक्षण किया जाता है। इस अनुभव के बावजूद, कुछ संस्कृतियां अकथनीय कारणों से ऑर्गेनोइड्स का विस्तार या उत्पन्न करने में विफल रहेंगी। जांचकर्ताओं को इन कारकों पर विचार करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है क्योंकि वे अपने अनुप्रयोगों के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते हैं।

ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए अनुकूलित इस प्रोटोकॉल में एक विशिष्ट प्रकार की 15-अच्छी तरह से स्लाइड का उपयोग किया जाता है, जो लागत को कम करते हुए न्यूनतम वॉल्यूम का उपयोग करता है और प्रतिकृति को अधिकतम करता है। इन स्लाइड्स में एक बहुलक कवरस्लिप पर एक निचला और ऊपरी कक्ष तय किया गया है जो मेनिसी को कम करता है (जो अन्यथा इमेजिंग को खराब करेगा) और मैट्रिक्स को हटाने और ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को नष्ट करने के जोखिम के बिना मीडिया प्रतिस्थापन भी करता है। ये स्लाइड्स उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग और लाइव स्टेन माइक्रोस्कोपी को सीधा बनाती हैं, जिसमें एक ही डिश में प्रारंभिक सीडिंग, विकास और इमेजिंग होती है। ऑर्गेनोइड्स संग्रह, निर्धारण और धुंधला प्रक्रिया के दौरान खो जाएंगे, इसलिए प्रत्येक चरण के दौरान सावधानीपूर्वक देखभाल की जानी चाहिए, और सफलता सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त शुरुआती संख्या प्राप्त की जानी चाहिए। संस्कृति आवेषण में बढ़ते ऑर्गेनोइड्स इन तकनीकों के विकसित होने में मदद कर सकते हैं।

इमेजिंग तकनीकें जो सामान्य प्रयोगशाला माइक्रोस्कोप का उपयोग करती हैं, उन्हें शामिल किया जाता है। हालांकि, स्वचालित कार्यात्मक assays एक इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करते हैं जो जटिल है और एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित उपयोगकर्ता की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल को इस माइक्रोस्कोप और इसके सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अनुभव के बुनियादी स्तर वाले उपयोगकर्ताओं के लिए विकसित किया गया है। निर्माता के प्रतिनिधियों द्वारा पहले उपकरण और सॉफ़्टवेयर के प्राथमिक उपयोग पर व्यक्तियों को प्रशिक्षित करने की सिफारिश की जाती है; यह एक ही अभ्यास हमारी प्रयोगशाला में पालन किया जाता है. प्रयोगों के लिए इस माइक्रोस्कोप का प्रभावी ढंग से उपयोग करने के लिए कम से कम 4 सप्ताह के प्रशिक्षण की आवश्यकता थी।

जैसा कि ऊपर वर्णित है, इस पद्धति की कुछ सीमाएं हैं। बायोप्सी संग्रह में विशेषज्ञता, त्वरित प्रसंस्करण समय, और फीडर फाइब्रोब्लास्ट के साथ सुविधा सफलतापूर्वक विस्तार और संस्कृति एचएनई ऑर्गेनोइड्स की आवश्यकता होती है। इस विधि को विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग करके विकसित किया गया था जो सार्वभौमिक रूप से उपलब्ध नहीं हो सकते हैं। यह पद्धति सिस्टिक फाइब्रोसिस 3,11,13 में अनुसंधान के लिए उपयोगी साबित हुई है और अन्य रोग प्रक्रियाओं के लिए लागू नहीं हो सकतीहै। हालांकि, इसी तरह की रणनीतियों को विकसित करने के लिए अन्य तरीकों और उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

जेएसजी को उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय से 20170242033 एक पेटेंट आवेदन पर एक आविष्कारक के रूप में सूचीबद्ध किया गया है जो एक समान मॉडल का वर्णन करता है। जब UNC से लाइसेंस प्राप्त तकनीक रॉयल्टी का उत्पादन करती है, तो आविष्कारकों को राजस्व का एक हिस्सा प्राप्त होता है। अन्यथा, लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की। अध्ययन के डिजाइन में, डेटा के संग्रह, विश्लेषण, या व्याख्या में, पांडुलिपि के लेखन में, या परिणामों को प्रकाशित करने के निर्णय में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Acknowledgments

हम कृतज्ञतापूर्वक उन सभी प्रतिभागियों के योगदान को स्वीकार करते हैं जिन्होंने इस प्रोटोकॉल को विकसित करने के लिए एचएनई ब्रश बायोप्सी दान की थी। हम अध्ययन स्वयंसेवक भर्ती और नमूना संग्रह के समन्वय के लिए Latona Kersh और बच्चों की अनुसंधान इकाई के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं। हम लिली डेंग, जॉनथन बेली और स्टीफन मैके, हमारी प्रयोगशाला में पूर्व प्रशिक्षुओं को तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। हम झोंग लियू और रुई झाओ को उनकी तकनीकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। यूएबी में सीएफ रिसर्च सेंटर के निदेशक स्टीवन एम रोवे नेतृत्व और संसाधन प्रदान करते हैं, जिसके बिना यह काम संभव नहीं होगा। हम भी साधन प्रशिक्षण के साथ सहायता के लिए Biotek में सारा Guadiana धन्यवाद करना चाहते हैं, रॉबर्ट Grabski UAB उच्च संकल्प इमेजिंग सुविधा में confocal माइक्रोस्कोपी सहायता के लिए, और UAB Histology कोर में हिस्टोलॉजिकल सहायता के लिए Dezhi वांग. इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा समर्थित किया गया था। अनुदान K23HL143167 (जेएसजी के लिए), सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (CFF) अनुदान GUIMBE18A0-Q (जेएसजी के लिए), ग्रेगरी फ्लेमिंग जेम्स सिस्टिक फाइब्रोसिस केंद्र [NIH अनुदान R35HL135816 और DK072482 और बर्मिंघम (UAB) अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (Rowe19RO)] में अलबामा के CFF विश्वविद्यालय, और नैदानिक और ट्रांसलेशनल विज्ञान के लिए UAB केंद्र (NIH19RO)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal brush Medical Packaging CYB1 CYB-1 Length: 8 inches, width approximately 7 mm
Large-Orifice Pipette Tips ThermoFisher Scientific 02-707-141 Large bore pipette tips
Accutase ThermoFisher Scientific A1110501 Cell detachment solution
0.05% trypsin -EDTA Gibco 25300-054
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS
Matrigel matrix Corning 356255 Extracellular matrix (EM)
µ-Slide Angiogenesis Ibidi 81506 15-well slide
24-Well Transwell Corning 7200154 Culture insert
Chambered Coverglass ThermoFisher Scientific 155409 8-well glass-bottom chamber slides
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific 354240 Cell adhesive
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 50980487
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
BSA ThermoFisher Scientific BP1600-100
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 DAPI
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) Nikon Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope
Nikon A1R-HD25 Nikon Confocal microscope
NIS Elements- Basic Research Nikon manual imaging analysis software
Histogel ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Disposable Base Molds ThermoFisher Scientific 41-740
Lionheart FX BioTek BTLFX Automated image system
Lionheart Cover BioTek BT1450009 Environmental Control Lid
Humidity Chamber BioTek BT1450006 Stage insert (environmental chamber)
Gas Controller for CO2 and O2 BioTek BT1210013 Gas controller
Microplate/Slide Stage Insert BioTek BT1450527 Slide holder
Gen5 Imaging Prime Software BioTek BTGEN5IPRIM Automated imaging analysis software
4x Phase Contrast Objective BioTek BT1320515
10x Phase Contrast Objective BioTek BT1320516
LED Cube BioTek BT1225007
Filter Cube (DAPI) BioTek BT1225100 DAPI
CFTRinh-172 Selleck Chemicals S7139
Forskolin Sigma F6886
IBMX Sigma I5879
Expansion Media
DMEM ThermoFisher Scientific 11965
F12 Nutrient mix ThermoFisher Scientific 11765
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific  16140-071
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific  15-140-122
Cholera Toxin Sigma  C8052
Epidermal Growth Factor (EGF) ThermoFisher Scientific  PHG0314
Hydrocortisone (HC) Sigma  H0888
Insulin Sigma  I9278
Adenine Sigma  A2786
Y-27632 Stemgent  04-0012-02
Antibiotic Media
Ceftazidime Alfa Aesar  J66460-03
Tobramycin Alfa Aesar  J67340
Vancomycin Alfa Aesar  J67251
Amphotericin B Sigma  A2942
Differentiation Media
DMEM/F-12 (1:1) ThermoFisher Scientific  11330-32
Ultroser-G Pall  15950-017
Fetal Clone II Hyclone  SH30066.03
Bovine Brain Extract Lonza  CC-4098
Insulin Sigma  I-9278
Hydrocortisone Sigma  H-0888
Triiodothyronine Sigma  T-6397
Transferrin Sigma  T-0665
Ethanolamine Sigma  E-0135
Epinephrine Sigma E-4250
O-Phosphorylethanolamine Sigma P-0503
Retinoic Acid Sigma R-2625
Primary antibodies
Human CFTR antibody R&D Systems MAB1660 Dilution: 100x
ZO-1 antibody Thermo Fisher MA3-39100-A647 Dilution: 1000x
Anti-MUC5B antibody Sigma HPA008246 Dilution: 100x
Anti-acetylated tubulin Sigma T7451 Dilution: 100x
Anti-beta IV Tubulin antibody Abcam Ab11315 Dilution: 100x
Secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A21202 Dilution: 2000x
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 Invitrogen A21207 Dilution: 2000x

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चिकित्सा अंक 178
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Liu, Z., Anderson, J. D., Natt, J., Guimbellot, J. S. Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids. J. Vis. Exp. (178), e63064, doi:10.3791/63064 (2021).

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