Summary
ヒト鼻上皮細胞からの インビトロ オルガノイドモデルを記述するために、詳細なプロトコールがここに提示される。このプロトコルには、標準的な実験装置を必要とする測定用のオプションがあり、特殊な装置およびソフトウェア用の追加の可能性があります。
Abstract
嚢胞性線維症(CF)患者に対する個別化治療は、ベースラインの嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)活性および小分子化合物からの回復を理解するために 、in vitro 疾患モデルを用いて達成することができる。私たちのグループは最近、初代ヒト鼻上皮細胞(HNE)から直接誘導される高分化型オルガノイドモデルの確立に着目しました。切片化されたオルガノイドの組織学、ホールマウント免疫蛍光染色、およびイメージング(共焦点顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡、および明視野を使用)は、オルガノイドを特徴付け、機能アッセイの準備において上皮分化を確認するために不可欠です。さらに、HNEオルガノイドは、CFTR活性と相関する様々なサイズのルーメンを産生し、CFオルガノイドと非CFオルガノイドを区別する。本稿では、HNEオルガノイドの培養方法論を詳細に説明し、ベースライン内腔領域の測定(顕微鏡を備えたどの研究室でも採用できるオルガノイドにおけるCFTR活性測定方法)や、機能アッセイへの自動アプローチ(より特殊な装置を必要とする)の開発など、イメージングモダリティを用いた分化の評価に焦点を当てている。
Introduction
テクニックの紹介
エクスビボ培養ベースのアッセイは、精密医療および疾患病態生理学の研究にますます利用されているツールです。初代ヒト鼻上皮(HNE)細胞培養は、嚢胞性線維症の多数の研究に用いられてきた1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、複数の臓器の上皮細胞機能に影響を与える常染色体劣性疾患。HNE培養は、前向きに得られる可能性のある気道上皮の再生可能な供給源を提供し、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)活性をテストするために電気生理学的および生化学的性質を反復する。HNE細胞は、一般的なウイルス呼吸スワブと同様に、最小限の副作用14でサンプリングすることができる。HNEブラシ生検に由来する嚢胞性線維症研究のモデルを記述する研究研究が最近発表された11、13。原発性HNE 2,3および腸組織15,16,17,18,19を用いた他のモデルと同様であるが、CF研究においての使用および他の気道疾患の研究を支援するために、このモデルの分化および画像化の詳細な特徴付けがここに記載されている13。.オルガノイドモデルは、不死化細胞株のように無制限ではないが、条件付きリプログラミング(照射および不活化されたフィーダー線維芽細胞およびRhoキナーゼ阻害剤を使用)によって、より幹細胞様の状態に拡張することができる20、21、22、23。この方法を用いたHNEブラシ生検の処理は、完全に分化する能力を維持しながら、より高いスループットで複数のアプリケーションで使用するための多数の上皮細胞を生じる。このプロトコルはフィーダー細胞を用いて開発されたが、フィーダー細胞技術を避けたい研究者によって他の方法論が使用される可能性がある14,24。
肺生物学におけるこの技術の重要性
上皮細胞の細胞膜に規則的で機能するCFTRがないと、肺、膵臓、肝臓、腸、または他の組織で機能不全が生じる方法を理解することに重要な研究が捧げられてきました。機能不全の上皮イオン輸送、特に塩化物および重炭酸塩の輸送は、上皮内層液の体積の減少および粘液分泌物の変化をもたらし、粘液の停滞および閉塞をもたらす。原発性毛様体ジスキネジアなどの他の気道疾患では、毛様体運動の変化は粘膜繊毛クリアランスを損ない、粘液の停滞および閉塞をもたらす25。したがって、現在のHNEオルガノイドモデルは、研究者の実験計画およびリソースに応じて、様々な用途のために開発されている。これには、生細胞染色を用いた生細胞イメージングが含まれます。形態を特徴付けるための固定および切片化;抗体による免疫蛍光染色および管腔内構造の破壊を避けるための全マウント共焦点イメージング;毛様体拍動頻度および粘膜繊毛輸送の定量的測定のための明視野画像化およびマイクロ光コヒーレンス断層撮影法13を含む。他の研究者への拡大を容易にするために、市販の試薬および供給品を培養に使用した。一般的な顕微鏡技術とより特殊な装置を使用した機能アッセイが開発されました。全体として、本モデルはベースライン時または治療薬に応答してCFTR活性を評価するように設計されているが、このプロトコールに記載される技術は、上皮細胞機能、特に上皮細胞液輸送を伴う他の疾患に適用することができる。
他の方法論との比較
最近、このオルガノイドモデルの有用性は、患者のオルガノイドのインビトロCFTRモジュレーター応答を臨床応答と相関させることによって開発された11。注目すべきことに、本モデルが、CFTR機能を評価するための現在のゴールドスタンダードである短絡電流応答を同じ患者において並列化していることも実証されている。短絡電流は、前者がイオン輸送26を介してCFTR機能を測定するので、膨潤アッセイと異なる。対照的に、このアッセイは、流体輸送によるより下流の効果を測定し、CFTR27、28、29、30、31、32の全体的な機能に関する追加情報を提供する。短絡電流測定は、CFTR塩化物チャネル活性1,33を決定するための一般的で信頼性の高い方法であり続けている。これらの電気生理学的アッセイは、特殊で高価な装置を必要とし、各実験複製にオルガノイドアッセイよりも何倍もの細胞を必要とし、容易に自動化することができず、より高いスループットアプリケーションのためのスケールアップには適していません。腸上皮に由来する別のオルガノイドモデルは、より優れた複製能力などのさらなる利点15、16、17、18を有するが、気道組織に由来するものではなく、普遍的に利用可能でもない。HNEブラッシングは、鎮静を必要とせず、最小限のリスクで安価な細胞診ブラシで得られる。ブラッシングを受けることは、臨床医を必要とせず、訓練を受けた研究コーディネーターおよび他の研究スタッフ14によって行うことができる。HNEオルガノイドモデルは、初代細胞培養能力を有する任意の実験室で培養することができ、アプリケーションのいくつかは標準的な顕微鏡技術で行うことができる。全体として、これらの利点は、他の方法では一部の研究室では利用できないかもしれない気道上皮機能を評価するための技術へのさらなるアクセスを提供する。さらに、HNEオルガノイドは、腸管オルガノイドでは不可能な原発性毛様体ジスキネジー25またはウイルス感染など、気道に影響を及ぼす他の疾患状態を研究するために利用することができる。
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Protocol
HNEサンプルはアラバマ州小児病院で収集された。ここで説明するすべての手順と方法は、アラバマ大学バーミンガム校(UAB IRB #151030001)によって承認されています。ヒト鼻上皮細胞(HNE)の増殖を促進し、機能を改善するために、本培養方法は、周知の気液界面(ALI)培養法28,34から適合される。HNEsは、前述のようにブラシ生検によって最初に収集された12,14が、唯一の違いは細胞診ブラシの使用であった。全てのサンプル処理ステップおよび細胞培養は、バイオセーフティキャビネット内で実施した。
1. 鼻上皮細胞の細胞培養と増殖
- ブラッシング後、鼻生検サンプルを氷上の15mL円錐管内の8mLのRPMI培地に保管し、4時間以内(24時間以内)にラボに移す。
- ブラシが組織から透明になるまで、細胞診ブラシを1mLの大口径ピペットチップ(先端を切り取る)に数回通すことによって、鼻ブラシ生検を15mL円錐管内の8mLのRPMI培地に解離させる。
- 細胞を500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去し、次いで細胞ペレットを3mLの細胞剥離溶液( 材料表を参照)に再懸濁し、室温で16分間インキュベートして消化する。
- 5mLの膨張培地(表1)を使用して、細胞を2回洗浄する。次いで、照射および不活化された3T3線維芽細胞22 (50%〜60%コンフルエント)を予め播種したT75フラスコに細胞を加えて細胞を共培養し、膨張培地中で7〜14日間拡大させた(適切なコロニーについては 図1 を参照のこと)。使用前に、照射された3T3線維芽細胞をテストして、上皮細胞の増殖に悪影響を及ぼす増殖できないことを確認してください。
注:鼻上皮細胞の合流点が14日以内に70%に達しない場合は、細胞を廃棄してください。 - CF患者由来の細胞については、培養の最初の3日間、細胞を消毒するために、4つの抗生物質(トブラマイシン100μg/mL、アンホテリシンB2.5μg/mL、セフタジジム100μg/mL、バンコマイシン100μg/mL、 材料表を参照)を増殖培地に導入し、その後、2日ごとに培地を交換する抗生物質を含まない拡張培地と培地を交換する。
注:抗生物質のこの限定的な使用は、追加の抗生物質が除去された後の増殖を促進しながら、細菌のコロニー形成による培養損失を減少させることを意図している。これらの抗生物質は、必要に応じて感受性とともに、患者の特定の微生物学の結果に合わせて調整することができる。 - 細胞が約80%コンフルエントに達したら、二重トリプシン法22 を用いて共培養からHNEsを採取する。この方法は、照射および不活性化された3T3線維芽細胞がフラスコから除去されることを保証し、その後のオルガノイド播種を汚染しない。
- 細胞を1x DPBSで洗浄し、次いで1.5mLの0.05%トリプシン-EDTAをT75フラスコに37°Cで4分間加え、照射および不活化された3T3線維芽細胞を培養物から除去した。
- T75フラスコを1x DPBSで2回すすぎ、残りの3T3線維芽細胞を完全に洗い流す。1.5 mLの0.05%トリプシン-EDTAをT75フラスコに37°Cで10分間加え、HNEを剥離した。
- トリプシンを大豆トリプシン阻害剤( 材料表を参照)で1:1の比率で中和する。細胞を500 x g で5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を5mLの増殖培地で1回洗浄した後、細胞はオルガノイドを増殖させるために播種する準備ができている。
注: 継代番号が 3 の HNE は、さらなる実験に使用することをお勧めします。
2. スライドおよび培養インサートにおけるオルガノイドの成長および分化
- オルガノイド培養細胞外マトリックス(ECM)を4°Cで一晩解凍する。 4°Cおよび15ウェル血管新生スライド( 材料表を参照)に冷却し、4°Cで一晩。
注:ECMは、細胞採取を行う必要がある前夜に4°Cに置く必要があります。 - スライドを氷上で5 μLの冷たい100% ECMでコーティングし(15ウェルスライドの各ウェルに冷たい100% ECMの冷たい100% ECMのピペット5 μLをコーティングし)、37°Cの細胞培養インキュベーターに少なくとも30分間入れて固結させます。
- 血球計数器を用いて共培養から採取したHNEをカウントし、氷上で分化培地で希釈した20%ECMで細胞を総数500細胞/μLに希釈する(表2)。次に、コールドセル/ECM混合物5 μLをECMでコーティングしたスライドの各ウェルにシードします。
- 直ちにスライドを37°Cの培養インキュベーターに1時間移し、細胞/ECM混合物を固結させた。
- 15ウェル血管新生スライドの各ウェル内の細胞を50 μLの分化培地で供給する。オルガノイドがさらなる実験の準備が整うまで、1日おきに培地を交換してください。
注:オルガノイドは通常、1〜2日後に視覚化することができます。スライドの各ウェルに一般的に形成される20〜90個のオルガノイドがある。オルガノイドは通常、37°Cの加湿インキュベーターに保管すると、1日おきに給餌してECMで40〜60日間生存することができます。 - 培養中のオルガノイドを培養し、下記のステップに従って、特定の用途(組織学または免疫蛍光のための切片化など)のためにより大きな量を挿入する( 材料表を参照)。
- 培養インサート中でオルガノイドを増殖させるには、ステップ2.1〜2.2で述べたようにオルガノイド培養ECM、ピペットチップ、およびインサートを準備する。インサートを100 μLの冷たい100%ECMでコーティングします。
- インサート内のECMコーティングの上に60μLの細胞/ECM混合物(分化培地中の20%ECMを含む500細胞/μL)をシードする。
メモ:インサートでオルガノイドを作成するための他のすべての手順は、スライドの手順2.4~2.5で行った手順と同じです。 - 600 μLの分化培地をインサートの底部に加える。オルガノイドが実験に使用されるまで、通常は2〜3週間、隔日ごとに培地を交換してください。
3. 全マウント免疫蛍光のためのオルガノイドの調製と単離
- オルガノイドの単離と固定
- 8ウェルガラス底チャンバースライドを細胞接着剤( 材料表を参照)で30分間、参考文献35に従って前処理します。溶液を捨てた後、ウェルを30分間風乾する。
- オルガノイドを採取するには、ECMの上部から培地を取り出し、氷上の15ウェルスライドの各ウェルに50μLの冷たい1x PBSを加えます(ECM容量で1:1)。
- 200 μLの大口径ピペットチップを使用してピペットを3〜5回上下させ、次いで溶液を8ウェルチャンバースライドのウェルの中心に分配する。
- すぐに細かい先端ピペットでウェルから余分な液体を取り除きます。その後、チャンバースライドを37°Cのインキュベーター内に40分間置き、ガラス底に付着したオルガノイドを増強した。
- 1x PBSで穏やかに2回洗浄した後、オルガノイドを各ウェル中の300μLの4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で30分間固定する。
- 1x PBSで2回洗浄し、オルガノイドを1x PBSに4°Cで保存し、免疫染色を最大2週間行う。
- 免疫蛍光染色
- 自己蛍光を低減するには、20 rpm のシェーカーで軽く振とうしながら、1x PBS 中の 50 mM NH4Cl 250 μL を RT でスライドの各ウェルに 30 分間加えます。
- 1x PBSで2回洗浄した後、20rpmで穏やかに振とうしながら、0.1%Triton X-100で細胞をRTで30分間透過処理する。
- 1x PBSで2回洗浄した後、1x PBS中の5%BSAおよび0.1%Triton X-100を含む300μLのブロッキング溶液をRTで1時間各ウェルに加える。
- 洗浄後、一次抗体を適切なウェルに加え、続いて二次抗体を加えます( 材料表を参照)。1x PBS中の2%BSAおよび0.3%Triton X-100中の一次抗体および二次抗体溶液を調製する。すべての一次抗体を4°Cで2日間、およびすべての二次抗体を4°Cで1日間インキュベートする。
注:最終濃度は、実験に望ましいタンパク質に依存する。在庫濃度はメーカーのデータシートでご確認ください。次に、 材料表で使用されている希釈液に基づいて最終濃度を計算します。 - インキュベーション後、ウェルを1x PBSで十分に洗浄し、核染色のために2%BSAおよび0.3%Triton X-100中のDAPIを各ウェルに加える。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてオルガノイドを20~60倍の油浸対物レンズで撮像する( 材料表を参照)。Zスタックモードを使用して、画像の上限と下限を設定し、共焦点ソフトウェアによって決定される推奨される最適なZステップサイズを使用します。
注:次の4つの共焦点レーザー励起波長が使用されました:408.7nm、489.1nm、561.7nm、および637.9nm。
4. 組織学的切片化のためのオルガノイドの調製と単離
- 組織学的研究のためにオルガノイドを採取するには、培養物から培地を除去し、氷上のスライドの各ウェルに50μLの冷たい1x PBSを加える。
- 200 μLの大口径ピペットチップを使用してピペットを3〜5回上下させ、15ウェルスライドまたは培養インサートからのすべての溶液を氷上の15mL円錐管に組み合わせる。追加の冷たい1x PBSを加えることによって、チューブ内の全溶液量を10mLに調整する。
- チューブを4°Cで遠心分離し、300 x g で5分間遠心分離する。上清を吸引し、60 μLの温かいヒストゲル( 材料表を参照)を加えて、200 μLの大口径ピペットチップを使用してオルガノイドペレットと混合する。
- 直ちに懸濁液を組織学の型に移す。室温でヒストゲルを固結させた後、モールドブロックを4%パラホルムアルデヒドに入れ、4°Cで一晩固定した。
- パラフィンに包埋した後、ヒストゲルブロックを5μmの断面(例えば、ミクロトームで)に切断し、切片をスライドガラス上に固定し、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)または免疫蛍光標識抗体を用いて染色する。明視野顕微鏡または倒立落射蛍光顕微鏡を用いて画像を撮影する( 材料表参照)。
5. 生オルガノイドのイメージング
メモ: 次の手順は、自動イメージングシステムを使用して実行されます( 材料表を参照)。異なるイメージングシステムは、特定の製造元の指示に従ってこれらの手順を適応させる必要があります。使用される機器に関係なく、イメージングライブオルガノイドには、CO2 ガスコントローラを備えた温度制御および加湿環境チャンバが必要です。
- 機能的腫脹アッセイ36を実行する前にオルガノイドの分化を監視するには、以下に詳述するように、任意の明視野顕微鏡または自動画像化システムを用いて、スライド画像全体を手動でキャプチャする。
- 自動イメージングシステムとCO2/O2ガスコントローラの電源を入れ、システムが自動校正を完了できるようにします(約30分)。
- 終了後、イメージングシステム温度を37°Cに設定します。加湿リザーバに滅菌水15 mLを加え、CO2 バルブを開き、蓋を閉め、イメージングシステムをイメージング前に最低30分間プレインキュベートさせます。
- 自動イメージングソフトウェアを開いてイメージングのプロトコルを設定し、生の実験データを保存する場所を選択します。
注:画像化システムに固有のプロトコルファイルの例(補足ファイル1)は、オルガノイドの分化を監視するためのオルガノイドの自動イメージングのためのテンプレートとして提供されています。 - 環境設定が満たされたら、蓋付きの15ウェルスライドを最大2枚まで、自動画像システムのスライドホルダーインサートの環境チャンバーに直ちに移します( 材料表を参照)。
- イメージングするウェルを選択し、イメージングを開始して、目的のウェルのイメージングを完了します。
メモ:基本的な推奨設定は、4xおよび10x対気、明視野チャンネル、井戸領域全体をカバーする4x対物レンズの場合は2 x 2モンタージュ、10x目標の場合は4 x 4モンタージュです。Z スタック設定: 3 ~ 6 個の Z スタックスライス、Z ステップサイズ = 50 ~ 100 μm、オートフォーカスポイントより 1 ~ 2 個のスライス、および 3 ~ 5 個のスライス上。
- フォルスコリン誘発腫脹(FIS)アッセイで使用する生オルガノイドを画像化するには、温度およびCO2 制御を可能にする環境制御イメージングチャンバを備えた自動ステージを備えた顕微鏡を使用します。
- ステップ 5.1.1 から 5.1.4 から始めて、ステップ 5.1.3 のプロトコル・ファイルを、FIS アッセイの実行に固有の設定を含むサンプル・プロトコル・ファイル (補足ファイル 2) に示されているものに置き換えます。
- 各実験の前に、各スライドに対して少なくとも 3 つのウェル (左端、中央、右端) を評価して、露出設定を調整します。X 座標オフセットと Y 座標オフセットを適用して、目標がすべてのウェルのウェルの中央にあることを確認します。
メモ: 基本的な推奨設定は、4x 対気、チャンネル 1 = ブライトフィールド、チャンネル 2 = DAPI、2 x 2 モンタージュ(4 つの画像タイル)です。Zスタック設定: 3 ~ 4 個の Z スタックスライス、Z ステップサイズ = 50 ~ 100 μm、オートフォーカスポイントより 1 つのスライス、上に 2 ~ 3 個のスライス。画像取得時間:8時間、20分間隔(合計読み取り数= 25;読み取り 1 は T = 0 です)。 - すべての設定が適切に選択されたら、両方のスライドの画像化するウェルを選択するか、すべてを選択して、機器の指示に従って実行を開始します。
- 実行後、実験を保存し、撮像ソフトウェアを閉じ、撮像システム37をシャットダウンする。
6. ベースラインルーメン測定
メモ:これは、手動イメージング解析ソフトウェアを使用して行われます( 材料表を参照)。同様の方法論を、オープンソースソフトウェア38 または画像上の領域の面積を測定できる任意のソフトウェアを用いて従うことができる。
- ソフトウェアで、画面の下部を右クリックして自動測定 パネル を開き、[ 測定]、[ 自動測定結果]の順に選択します。測定された各関心領域(ROI)の領域がそこに表示されます。
- ソフトウェアでオルガノイド画像を開き、ルーメンが見える5〜10個のオルガノイドを選択します。
注:ルーメンはオルガノイドの中央にある円形の領域で、オルガノイドの残りの部分とは色が目に見えて異なります(図2A)。 - ポリゴンROI測定機能を使用して、画像を右クリックしたままメニューを開き、[ ポリゴンROI ]を選択してオルガノイド全体の輪郭を描き、オルガノイドの総表面積(TSA)を取得します。次に、同じ特徴を使用して、ルーメン領域(LA)を概説する(図2B)。
- ウェル内の残りのオルガノイドおよびアッセイ中のすべてのウェルについて繰り返します。
- データをエクセルにエクスポートします。LAをTSAで割り、サンプルからのすべてのオルガノイドを平均して、ベースラインルーメン比(BLR)11、13を得る。
注:通常、非CFオルガノイドの〜87%が0.6を超えるBLRを有し、97%が0.5を超えるが、CFオルガノイドの14%のみが0.6を超えるBLRを有し、31%が0.5を超える。
7. HNEオルガノイドの前処理と自動イメージング
注:すべての前処理ステップは、クリーンなバイオセーフティキャビネットで行われます。ステップ7.1の前に、アッセイを記録するための自動イメージングシステムとソフトウェアを事前にセットアップします。DAPIによるインキュベーションはオプションですが、明視野画像の品質が損なわれた場合はフェイルセーフとして推奨されます。この場合、代わりにDAPIチャンネル(377nm)を分析できます。
- オルガノイドを15ウェルスライドのウェルに、100μMのCFTRinh-172( 材料表を参照)の有無にかかわらずDAPIを含む50μLの分化培地と共に、37°Cのインキュベーター内で1時間プレインキュベートする。オルガノイドがインキュベートしている間、 補足ファイル2に続く腫脹アッセイカスタムプロトコルを使用してステップ5.2.1を実行します。
- 吸引性ガラスパスツールピペットを用いてプレインキュベーション培地を除去する。10 μM のフォルスコリンおよび 100 μM の IBMX (刺激カクテル) ( 材料表を参照) を加え、50 μL の分化培地を各ウェルに総量で加えます。
メモ: ウェルに気泡が導入されていないことを確認します。画像上のバブルは、自動分析に影響します。 - 遅滞なく、手順5.2.2~5.2.4に従ってFISイメージングプロトコルを開始します。各ウェルで 20 分ごとに画像を取得し、合計実行時間は 8 時間です。
8. HNEオルガノイドに対するフォルスコリン誘導腫脹アッセイの自動分析
- 自動画像解析ソフトウェアを開き、手順 7.3 で以前に保存した実験を見つけて、実験の画像を表示します。
- 評価する容器ウィンドウを選択し、ステッチおよびZ投影された処理された画像を含むオプションを選択します。このステップでは、マスキング評価と測定のために、イメージングフレーム内のすべてのオルガノイドを含む井戸全体の画像を提供する必要があります。
- 評価する井戸画像を選択します。[分析] を選択します。他の画像についてもこのプロセスを繰り返して、自動測定に含まれるすべての画像に適切なマスキングを確保します。設定パラメータを保存します。
- 分析設定が完了したら、変更を適用します。ソフトウェアは、設定に基づいて測定値を変更します。
メモ: 最初の画像の前処理が完了したら、品質管理 (QC) 対策を行って、一貫したマスキングを確保する必要があります。これには、オルガノイドがイメージングフレーム内にあり、気泡や破片が不適切にマスクされていないことを確認するためにすべてのウェルを手動でレビューすること、明視野とDAPIチャンネルでマスキングをチェックすることが含まれます。 - 要約分析 (グラフ作成および統計分析を含む) 用のデータをエクスポートします。
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Representative Results
HNEsの拡大は、オルガノイド培養の成功に不可欠です。成功したサンプル収集からのHNEは、約10日間で70%以上の合流点に拡大する必要があります。成功したサンプルと失敗したサンプルの例を、それぞれ図 1A と図 1B に示します。照射された3T3細胞との共培養後14日までに70%のコンフルエントに到達できない場合は、細胞を廃棄しなければならない。汚染された細胞は、追加の抗菌剤で迅速に救助できない場合は、直ちに廃棄する必要があります。
オルガノイドの成長を、15ウェルスライドおよび培養インサートにおいて比較した。培養インサートは、光学的に最適化されたスライドよりも厚く、対物レンズから離れており、画像と解像度に影響を与えます。それにもかかわらず、図2に示すように、これら 2つの培養方法では形態に有意差は認められなかった。 図3Aに示すように、非CFおよびCFオルガノイドの間に形態学的差異が見られる。非CFオルガノイドは、その中により多くの流体を含むより大きな内腔を有する傾向がある。対照的に、CFオルガノイドは通常、より少ない流体でより小さな内腔を有し、時には粘液および破片で満たされる。ルーメンサイズを手動で測定し(図3B)、ベースラインルーメン比を計算し、 図3Cに示した。断面オルガノイドは、H&Eおよび免疫蛍光染色を用いて特徴付けた。代表的な画像を 図4A、Bに示す。繊毛、粘液、およびタイトジャンクションなどの気道上皮マーカーは、 図5A〜Dに示される全マウント免疫蛍光染色によってオルガノイドにおいて実証される。用途に応じて、切片化または全マウント免疫蛍光を採用することができます。ホールマウント法は、以前に出版された作品13に示すように、オルガノイドの内部をそのまま維持し、オルガノイドの3次元的性質を維持する。
CFTR機能は、自動画像化システムを用いたフォルスコリン誘発腫脹(FIS)アッセイによって評価した。画像解像度が高いため、機能アッセイに使用されるのは15ウェルスライドのみです。非CFボランティア(n=5人の被験者)の代表的なフォルスコリン用量反応実験を図6Aに示し、最適化された画像化時間と分析の理論的根拠を説明する。非CFおよびCFオルガノイド応答を比較したデータは、以前の刊行物11、13に詳述されている。用量反応は、CFTR活性の漸進的な変化を示し、測定への最良のアプローチを実証する。1時間および8時間のアッセイ持続時間を評価(図6B、C)ならびに平均分数変化(AFC)対曲線下面積(AUC)を用いた分析が図6C、Dに見られる。我々の以前の経験に基づいて、ほとんどの被験者および状態の腫脹は8時間後に頭打ちになり、場合によっては、その間にオルガノイドの破裂をもたらす。したがって、アッセイは8時間のみに限定された。この延長アッセイ長では、腫脹は非線形になる。AUC の使用では、サイズの変化と変化率の両方も考慮されます。したがって、8時間にわたるAUCを、最終方法論におけるすべてのFISアッセイに使用した。
図1:共培養におけるHNEの明視野画像。 HNEは、照射および不活性化された3T3線維芽細胞を10日間照射して拡張培地中で膨張する。倒立明視野顕微鏡は、細胞をイメージングするために使用されます。(A)HNEは大きなクラスター内でよく成長します(黒い矢印)。対照的に、(B)では、HNEsは、照射された3T3細胞を囲む2つの小さなクラスター(黒い矢印)ではあまり成長しない。スケール バー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:15ウェルスライドおよび培養インサートにおけるHNEオルガノイド形成。 オルガノイドの明視野画像は、21日間にわたって倒立明視野顕微鏡を用いて撮影した。15ウェルスライド(A)のオルガノイドは、培養インサート(B)のオルガノイドよりも正確で鮮明な画像を有する。スライドとインサートで培養したオルガノイドとの間に形態学的差は認められなかった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:オルガノイド内腔サイズ(パネルA)および内腔測定値(パネルBおよびC)。 (A)非CFオルガノイドは、典型的には、CF(F508del/F508del)オルガノイドよりも大きな内腔およびより流動的である。(b)赤色の輪郭で示す総表面積(TSA)と緑色の輪郭で示す内腔面積(LA)とを単一のオルガノイドで手動で測定する方法。(c)非CF対CF被験者由来のオルガノイドにおけるベースラインルーメン比(LA:TSA)を計算するために、総表面積および内腔面積を使用する例。エラーバーは標準偏差を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:パラフィンに埋め込まれたオルガノイドの断面。 (A)非CFおよびCF(F508del/F508del)被験者由来のオルガノイドにおけるH&E染色の例。(b)オルガノイド中の繊毛の免疫蛍光染色。緑はアセチル化チューブリンとFITC標識二次抗体で染色された繊毛(白矢印)、青はDAPIで標識された核です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:オルガノイドにおける全マウント免疫蛍光の共焦点画像。 (A、C)2つの代表的なオルガノイドの最大投影像。(B、D)(A)及び(C)の3次元再構成画像を、それぞれ示す。共焦点顕微鏡のプラットフォームに8ウェルのガラス底スライドを取り付け、40xレンズを使用して顕微鏡写真を作成しました。画像解析ソフトウェアは、画像のイメージングと再構成に適用されました。白い矢印は、オルガノイドの内腔内の粘液( B)および繊毛( C)を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:腫脹アッセイの長さおよび分析方法の理論的根拠。 フォルスコリン(FSK)誘導腫脹(FIS)アッセイは、初代鼻上皮細胞上のCFTR機能を試験する。図に示されたフォルスコリンの異なる用量は、分化培地中の21日齢オルガノイドに投与された。オルガノイドの腫脹を直ちに自動イメージャで8時間記録した。8時間後、腫脹は、平均分数変化(AFC)を用いて(A)(n=5、非CF被験者)に示される。FSK用量反応は、1時間(B)対8時間(C)のAFCと比較され、これは、8時間のアッセイが、1時間のものよりも異なるFSK用量間でより有意な腫脹差を生じ得ることを示唆している。パネルのX軸(B-D)は、図の凡例の記号に対応する異なる処理条件を表す。図中の全てのエラーバーは標準偏差を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:拡張メディアを作成するためのすべてのコンポーネント試薬ストック濃度、ストック保存、500mL培地を作製するためのストック量、および最終濃度に関する詳細情報が記載されている。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:分化培地を作製するためのすべての成分。試薬ストック濃度、ストック保存、500mL培地を作製するためのストック量、および最終濃度に関する詳細情報が記載されている。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:画像化システムに固有のプロトコルファイルの例が、オルガノイドの分化を監視するためのオルガノイドの自動画像化のためのテンプレートとして提供される。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 2: FIS アッセイの実行に固有の設定を含むプロトコル ファイルの例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この原稿は、HNEブラシ生検に由来する気道上皮オルガノイドの包括的なライブおよび固定画像化のための詳細な方法論を提供する。個体におけるCFTR活性を決定することができる機能的アッセイを記載する。HNEは、さまざまな用途に低侵襲の一次組織を提供します。ここで提供される拡張技術は、オルガノイドを含む気道疾患をモデル化するために使用することができる。オルガノイドは、精密な治療アプローチ、遺伝子またはmRNAベースの治療法の経時的な安定性のモニタリング、精密な試験設計、および決定的でない診断の解決を支援するために使用することができる39。現在の研究はCFに関するものですが、これらのモデルは上皮機能に影響を与える他の疾患にも応用できます。
生検後のHNEの初期拡張は必須である。細胞診ブラシは、他の生検ツールよりも大きな初期細胞数とより良い結果をもたらすことが観察されている14。以前の経験から、我々は、両方の鼻孔からのブラッシングを単一のサンプルに組み合わせ、そのサンプルを4時間以内に処理することが最良の結果をもたらすと結論付けました。他の研究者は、生検から処理までのより長い時間枠を使用しており、成功しています3。生検の適切な初期収集は、その後の拡張およびオルガノイドとしての播種に不可欠である。共培養には高品質の照射・不活化線維芽細胞が求められており、当研究室では社内で増殖・処理されていますが、市販品を購入することもできます。研究者らは、すべての3T3線維芽細胞が同じ細胞株であるわけではなく、使用前に検証する必要があることを助言される。
病原性細菌または真菌培養を有すると予想されない検体の場合、抗生物質治療は、この原稿に記載されている実験のための標準的なペニシリンおよびストレプトマイシン治療に限定される。上気道の慢性的なコロニー形成を有することが知られているものについては、抗生物質が上皮の拡張を遅らせ、ここで記載した実験においてより貧弱な結果をもたらすように見えるので、上述の抗生物質カクテルはわずか3日間しか利用されない。汚染リスクとCF試料と非CF試料の両方に同様の膨張率を提供するとのバランスをとるために、3日間を選択しました。異常な病原体を有する個体の場合、カスタマイズされた抗菌処理は、早期に認識されるか、先験的に開始された場合、汚染された培養物を救助することができる。成長が異常に遅い初期生検の場合、オルガノイド研究の結果は通常貧弱です。研究者は、成長速度と形態の両方を毎日監視する必要があります。使用される社内培養培地および試薬は、機能的膨潤アッセイに最も有用であるが、他の市販の培地は、実験計画に応じて他の用途に利益をもたらす可能性がある12、25、40、41。使用されるECMのタイプは、異なる形態および異なる結果をもたらす可能性があり、再現性のある結果は重要である。このプロトコルで使用されるすべての試薬は、実験に使用する前に定期的にテストされます。この経験にもかかわらず、いくつかの文化は不可解な理由でオルガノイドを拡大または生成することに失敗するでしょう。研究者は、アプリケーション向けにこのプロトコルを最適化する際に、これらの要因を考慮することをお勧めします。
このプロトコルでは、特定のタイプの15ウェルスライドが光学イメージング用に最適化され、最小限のボリュームを使用し、コストを削減しながら複製を最大化します。これらのスライドは、ポリマーカバースリップに固定された下部および上部チャンバを有し、メニスチ(そうでなければイメージングを損なうであろう)およびマトリックスを脱落させ、オルガノイド培養を破壊する危険なしに培地交換を最小化する。これらのスライドにより、明視野イメージングとライブ染色顕微鏡が簡単になり、最初の播種、成長、イメージングを同じ皿に収めます。オルガノイドは収集、固定、染色の過程で失われるため、各段階では細心の注意を払い、成功を確実にするために十分な開始数を取得する必要があります。培養インサート中のオルガノイドの成長は、これらの技術が開発されるにつれて助けることができる。
一般的な実験室顕微鏡を利用するイメージング技術が含まれています。しかし、自動機能アッセイは、複雑で十分な訓練を受けたユーザーを必要とするイメージングシステムを使用します。このプロトコルは、この顕微鏡とそのソフトウェアを使用した基本的なレベルの経験を持つユーザー向けに開発されました。最初に、製造業者の代表者による機器とソフトウェアの主な使用について個人を訓練することをお勧めします。この同じ練習が私たちの研究室でも続いています。この顕微鏡を実験に効果的に使用するには、最低4週間のトレーニングが必要でした。
上述のように、この方法論にはいくつかの制限がある。生検収集、迅速な処理時間、およびフィーダー線維芽細胞を備えた施設の専門知識は、HNEオルガノイドを正常に拡大および培養するために必要です。この方法は、普遍的に利用可能ではないかもしれない特定の試薬および装置を使用して開発された。この方法論は、嚢胞性線維症の研究に有用であることが証明されており3,11,13であり、他の疾患プロセスにはそれほど適用できない可能性がある25。しかしながら、同様の戦略を開発するために、他の方法および装置が使用されてもよい。
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Disclosures
JSGは、ノースカロライナ大学から20170242033れた同様のモデルを記述する特許出願書に発明者としてリストされています。UNCからライセンスされた技術がロイヤリティを生み出すとき、発明者は収益の分け前を受け取ります。それ以外の場合、著者は利益相反を宣言しません。資金提供者は、研究のデザイン、データの収集、分析、または解釈、原稿の執筆、または結果の公表の決定において、何の役割も有さなかった。
Acknowledgments
我々は、このプロトコルを開発するためにHNEブラシ生検を寄贈したすべての参加者の貢献に感謝する。ラトナ・カーシュと児童研究ユニットのスタッフが、研究ボランティアの募集とサンプル収集を調整してくれたことに感謝します。リリー・デン、ジョナサン・ベイリー、スティーブン・マッケイ、元研究室研修生の技術支援に感謝します。Zhong LiuとRui Zhaoの技術的な支援に感謝します。UABのCF研究センターのディレクターであるスティーブン・M・ロウは、リーダーシップとリソースを提供していますが、それなしではこの作業は不可能です。また、機器トレーニングの支援をしてくれたBiotekのSarah Guadiana氏、UAB高解像度イメージング施設での共焦点顕微鏡検査支援にRobert Grabski氏、UAB組織学コアでの組織学的支援をしてくれたDezhi Wang氏にも感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の支援を受けました。Grant K23HL143167 (to JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (to JSG), the Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 and DK072482 and the CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)]、および UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
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