Summary
Een gedetailleerd protocol wordt hier gepresenteerd om een in vitro organoïde model van menselijke neusepitheelcellen te beschrijven. Het protocol heeft opties voor metingen die standaard laboratoriumapparatuur vereisen, met extra mogelijkheden voor gespecialiseerde apparatuur en software.
Abstract
Geïndividualiseerde therapie voor patiënten met cystische fibrose (CF) kan worden bereikt met een in vitro ziektemodel om de baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activiteit en herstel van kleine molecuulverbindingen te begrijpen. Onze groep heeft zich onlangs gericht op het opzetten van een goed gedifferentieerd organoïdemodel dat rechtstreeks is afgeleid van primaire menselijke neusepitheelcellen (HNE). Histologie van gesneden organoïden, whole-mount immunofluorescente kleuring en beeldvorming (met behulp van confocale microscopie, immunofluorescente microscopie en helder veld) zijn essentieel om organoïden te karakteriseren en epitheliale differentiatie te bevestigen ter voorbereiding op functionele assays. Bovendien produceren HNE-organoïden lumen van verschillende grootte die correleren met CFTR-activiteit, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen CF- en niet-CF-organoïden. In dit manuscript wordt de methodologie voor het kweken van HNE-organoïden in detail beschreven, met de nadruk op de beoordeling van differentiatie met behulp van de beeldvormingsmodaliteiten, waaronder de meting van het lumengebied (een methode voor CFTR-activiteitsmeting in organoïden die elk laboratorium met een microscoop kan gebruiken) evenals de ontwikkelde geautomatiseerde benadering van een functionele test (die meer gespecialiseerde apparatuur vereist).
Introduction
Inleiding tot de techniek
Ex vivo op cultuur gebaseerde assays zijn een steeds vaker gebruikt hulpmiddel voor precisiegeneeskunde en de studie van ziektepathofysiologie. Primaire humane neusepitheel (HNE) celcultuur is gebruikt in talrijke studies van cystische fibrose 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , een autosomaal recessieve ziekte die de epitheelcelfunctie in meerdere organen beïnvloedt. HNE-cultuur biedt een hernieuwbare bron van luchtwegepithelia die prospectief kan worden verkregen en vat elektrofysiologische en biochemische kwaliteiten samen om cystic fibrosis transmembraangeleidingsregulator (CFTR) -activiteit te testen. HNE-cellen kunnen worden bemonsterd met minimale bijwerkingen14, vergelijkbaar met gewone virale respiratoire swabs. Onderzoekswerk dat een model beschrijft voor cystische fibrosestudie afgeleid van HNE-borstelbiopten is onlangs gepubliceerd11,13. Vergelijkbaar met andere modellen met primair HNE 2,3 en darmweefsel 15,16,17,18,19, wordt hier gedetailleerde karakterisering van de differentiatie en beeldvorming van dit model beschreven voor gebruik in CF-onderzoek en voor hulp bij de studies van andere luchtwegaandoeningen 13 . Het organoïde model is niet onbeperkt zoals onsterfelijke cellijnen, maar kan worden uitgebreid door voorwaardelijke herprogrammering (met behulp van bestraalde en geïnactiveerde feeder fibroblasten en Rho-kinaseremmers) tot een meer stamcelachtige toestand 20,21,22,23. De verwerking van HNE-borstelbiopten met behulp van deze methode levert grote aantallen epitheelcellen op voor gebruik in meerdere toepassingen met een hogere doorvoer, terwijl het vermogen om volledig te differentiëren behouden blijft. Hoewel dit protocol is ontwikkeld met behulp van feedercellen, kunnen andere methodologieën worden gebruikt door onderzoekers die feederceltechnologie willen vermijden 14,24.
Belang van de techniek voor de longbiologie
Een belangrijke studie is gewijd aan het begrijpen hoe de afwezigheid van regelmatige, functionerende CFTR in het celmembraan van epitheelcellen resulteert in disfunctie in de longen, pancreas, lever, darm of andere weefsels. Disfunctioneel epitheelionentransport, met name dat van chloride en bicarbonaat, resulteert in een verminderd volume van de epitheliale voeringvloeistoffen en veranderingen in slijmafscheidingen, wat leidt tot slijmstasis en obstructie. Bij andere luchtwegaandoeningen, zoals primaire ciliaire dyskinesie, schaadt veranderde ciliaire beweging de mucociliaire klaring en leidt tot slijmstasis en obstructie25. Daarom is het huidige HNE-organoïdemodel ontwikkeld voor verschillende toepassingen, afhankelijk van het experimentele ontwerp en de middelen van de onderzoeker. Dit omvat live-cell imaging met behulp van live-cell vlekken; fixatie en sectie om de morfologie te karakteriseren; immunofluorescentiekleuring met antilichamen en confocale beeldvorming in de hele mount om verstoring van intraluminale structuren te voorkomen; en bright-field imaging en micro-optische coherentietomografie voor kwantitatieve metingen van ciliaire slagfrequentie en mucociliair transport13. Om uitbreiding naar andere onderzoekers te vergemakkelijken, werden commercieel beschikbare reagentia en benodigdheden gebruikt voor het kweken. Er werd een functionele test ontwikkeld die gebruik maakte van gangbare microscooptechnieken en meer gespecialiseerde apparatuur. Over het algemeen, terwijl het huidige model is ontworpen om CFTR-activiteit bij baseline of als reactie op therapeutica te beoordelen, kunnen de in dit protocol beschreven technieken worden toegepast op andere ziekten waarbij epitheelcelfunctie betrokken is, met name epitheelcelvloeistoftransport.
Vergelijking met andere methodologieën
Onlangs werd het nut van dit organoïdemodel ontwikkeld door in vitro CFTR-modulatorresponsen van organoïden van patiënten te correleren met hun klinische respons11. Met name is ook aangetoond dat het huidige model parallel liep met kortsluitstroomresponsen, de huidige gouden standaard voor het beoordelen van de CFTR-functie, bij dezelfde patiënten. Kortsluitstroom verschilt van de zwellingstest omdat de eerste de CFTR-functie meet via ionentransport26. Deze test meet daarentegen een meer stroomafwaarts effect met vloeistoftransport en geeft aanvullende informatie over de totale functie van CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortsluitstroommetingen zijn nog steeds een veelgebruikte en betrouwbare methode voor het bepalen van cftr-chloridekanaalactiviteit 1,33. Deze elektrofysiologische assays vereisen gespecialiseerde, dure apparatuur, vereisen vele malen meer cellen voor elke experimentele replicatie dan de organoïde assay, kunnen niet gemakkelijk worden geautomatiseerd en zijn niet vatbaar voor opschaling voor toepassingen met een hogere doorvoer. Een ander organoïde model afgeleid van intestinale epithelia heeft extra voordelen 15,16,17,18, zoals een meer uitstekend replicerend vermogen, maar is niet afgeleid van een luchtwegweefsel en is ook niet universeel beschikbaar. HNE-borstels worden verkregen met goedkope cytologieborstels zonder de noodzaak van sedatie en met minimaal risico. Het krijgen van het poetsen vereist geen clinicus en kan worden uitgevoerd door getrainde onderzoekscoördinatoren en ander onderzoekspersoneel14. Het HNE-organoïdemodel kan worden gekweekt door elk laboratorium met primaire celkweekmogelijkheden en sommige toepassingen kunnen worden uitgevoerd met standaardmicroscopietechnieken. Al met al bieden deze voordelen extra toegang tot technologie voor het beoordelen van de luchtwegepitheelfunctie die anders misschien niet beschikbaar zou zijn voor sommige laboratoria. Bovendien kunnen HNE-organoïden worden gebruikt om andere ziektetoestanden te bestuderen die de luchtwegen beïnvloeden, zoals primaire ciliaire dyskinesie25 of virale infectie, die intestinale organoïden niet kunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HNE-monsters werden verzameld in het Children's of Alabama-ziekenhuis. Alle hier beschreven procedures en methoden zijn goedgekeurd door de IRB University of Alabama in Birmingham (UAB IRB #151030001). Om de expansie te vergemakkelijken en de functie van menselijke neusepitheelcellen (HNE's) te verbeteren, zijn de huidige kweekmethoden aangepast van de bekende lucht-vloeistof interface (ALI) kweekmethode 28,34. HNE's werden aanvankelijk verzameld door borstelbiopsie zoals eerder beschreven 12,14, met als enige verschil het gebruik van een cytologieborstel. Alle monsterverwerkingsstappen en celkweek werden uitgevoerd in de bioveiligheidskast.
1. Celkweek en uitbreiding van nasale epitheelcellen
- Bewaar na het poetsen het nasale biopsiemonster in 8 ml RPMI-media in een conische buis van 15 ml op ijs en breng het binnen 4 uur (niet meer dan 24 uur) over naar het laboratorium.
- Dissocieer de neusborstelbiopsie in 8 ml RPMI-media in een conische buis van 15 ml door de cytologieborstel meerdere keren door een pipetpunt met grote boring van 1 ml te laten gaan (snijd de punt af) totdat de borstel vrij is van weefsel.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant en suspensie de celkorrel vervolgens opnieuw in 3 ml celloslatingsoplossing (zie materiaaltabel) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 16 minuten om te verteren.
- Gebruik 5 ml expansiemedia (tabel 1) om de cellen tweemaal te wassen. Voeg vervolgens cellen toe aan een T75-kolf die is voorgezaaid met doorstraalde en geïnactiveerde 3T3-fibroblasten22 (50% -60% confluentie) om de cellen samen te kweken en gedurende 7-14 dagen uit te breiden in de expansiemedia (zie figuur 1 voor de juiste kolonie). Test voor gebruik de bestraalde 3T3-fibroblasten om er zeker van te zijn dat ze zich niet kunnen vermenigvuldigen, wat de epitheelcelexpansie negatief zal beïnvloeden.
OPMERKING: Gooi de cellen weg als de samenvloeiing van de neusepitheelcel niet binnen 14 dagen 70% bereikt. - Voor de cellen afgeleid van patiënten met CF, introduceer vier antibiotica (100 μg / ml tobramycine, 2,5 μg / ml amfotericine B, 100 μg / ml ceftazidim, 100 μg / ml vancomycine, zie tabel met materialen) in de expansiemedia voor desinfectie van de cellen gedurende de eerste 3 dagen van de kweek, en vervang vervolgens de media door antibioticavrije expansiemedia die de media om de 2 dagen veranderen.
OPMERKING: Dit beperkte gebruik van antibiotica is bedoeld om cultuurverlies als gevolg van bacteriële kolonisatie te verminderen en tegelijkertijd proliferatie aan te moedigen nadat de extra antibiotica zijn verwijderd. Deze antibiotica kunnen worden afgestemd op de specifieke microbiologische resultaten van de patiënt, met gevoeligheden, indien nodig. - Oogst HNE's uit co-cultuur met behulp van de dubbele trypsinisatiemethode22 zodra de cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken. Deze methode zorgt ervoor dat de doorstraalde en geïnactiveerde 3T3-fibroblasten uit de kolf worden verwijderd en dat ze de daaropvolgende organoïde zaaiing niet verontreinigen.
- Was de cellen met 1x DPBS en voeg vervolgens 1,5 ml 0,05% trypsine-EDTA toe aan de T75-kolf gedurende 4 minuten bij 37 °C om de doorstraalde en geïnactiveerde 3T3 fibroblast uit de kweek te verwijderen.
- Spoel de T75-kolf tweemaal met 1x DPBS om de resterende 3T3-fibroblasten grondig weg te spoelen; voeg gedurende 10 minuten bij 37 °C 1,5 ml 0,05% trypsine-EDTA toe aan de T75-kolf om de HNE's los te maken.
- Neutraliseer de trypsine met soja-trypsineremmer (zie Materiaaltabel) in een verhouding van 1:1. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g en verwijder vervolgens het supernatant. Na het eenmaal wassen van de cellen met 5 ml expansiemedia, zijn de cellen klaar om te zaaien om organoïden te laten groeien.
OPMERKING: HNE's met een passagenummer van drie worden aanbevolen om te worden gebruikt voor verdere experimenten.
2. Groei en differentiatie van organoïden in dia's en kweekinzetstukken
- Ontdooi de organoïde cultuur extracellulaire matrix (ECM) 's nachts bij 4 °C. Koel pipetpunten tot 4 °C en 15-well angiogeneseglaasjes (zie Materiaaltabel) gedurende de nacht bij 4 °C.
OPMERKING: ECM moet de nacht voordat de celoogst moet worden uitgevoerd op 4 °C worden geplaatst. - Bestrijk de dia's met 5 μL koude 100% ECM op ijs (pipetteer 5 μL koude 100% ECM met een koude pipetpunt in elke put van de 15-well slide) en plaats ze vervolgens in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten voor consolidatie.
- Tel de HNE's geoogst uit co-cultuur met behulp van een hemocytometer en verdun de cellen tot 500 cellen / μL in totaal aantal met 20% ECM verdund door differentiatiemedia (tabel 2) op ijs. Zaai vervolgens 5 μL van het koude cel/ECM-mengsel in elke put van de met ECM bedekte dia's.
- Breng de glaasjes onmiddellijk over in een kweekincubator bij 37 °C gedurende 1 uur om het cel/ECM-mengsel te consolideren.
- Voed de cellen in elke put van de 15-well angiogeneseglaasjes met 50 μL differentiatiemedia. Verander de media om de andere dag totdat de organoïden klaar zijn voor verdere experimenten.
OPMERKING: Organoïden kunnen meestal na 1-2 dagen worden gevisualiseerd. Er zijn 20-90 organoïden die gewoonlijk worden gevormd in elke put van de dia's. De organoïden kunnen meestal 40-60 dagen overleven in ECM met voeding om de andere dag wanneer ze in een bevochtigde incubator bij 37 °C worden bewaard. - Kweek de organoïden in de kweekinzetstukken (zie Tabel met materialen) voor een grotere hoeveelheid voor specifieke toepassingen (zoals sectie voor histologie of immunofluorescentie) volgens de onderstaande stappen.
- Om organoïden in de kweekinzetstukken te laten groeien, bereidt u de organoïde cultuur-ECM, pipetpunten en inserts voor zoals vermeld in stap 2.1-2.2. Bestrijk de inzetstukken met 100 μL koude 100% ECM.
- Zaad 60 μL cel/ECM-mengsel (500 cellen/μL met 20% ECM in differentiatiemedia) bovenop de ECM-coating in het inzetstuk.
OPMERKING: Alle andere stappen voor het maken van organoïden in de inserts zijn dezelfde als die in de dia's, stappen 2.4-2.5. - Voeg 600 μL van de differentiatiemedia toe aan het onderste deel van de insert. Verander de media elke andere dag totdat de organoïden worden gebruikt voor experimenten, meestal 2-3 weken.
3. Voorbereiding en isolatie van organoïden voor immunofluorescentie in het geheel
- Isolatie en fixatie van organoïden
- Behandel 8-well glasbodemkamerglijden voor met cellijm (zie materiaaltabel) gedurende 30 minuten na referentie35. Na het weggooien van de oplossing, droogt u de putten gedurende 30 minuten aan de lucht.
- Om de organoïden te oogsten, verwijdert u de media van de bovenkant van de ECU en voegt u vervolgens 50 μL koude 1x PBS toe aan elke put van de 15-putglijbanen op ijs (1: 1 met ECM-volume).
- Pipetteer 3-5 keer op en neer met behulp van 200 μL van de pipetpunt met grote boring en doseer de oplossing vervolgens op het midden van een put van de 8-putkamerglijbanen.
- Verwijder onmiddellijk overtollige vloeistof uit de putjes door een pipet met fijne punt. Plaats vervolgens de kamerschuif gedurende 40 minuten in een incubator van 37 °C om de organoïde die zich aan de glazen bodem hecht te verbeteren.
- Na tweemaal voorzichtig wassen met 1x PBS, bevestigt u de organoïden met 300 μL 4% paraformaldehyde in elke put gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Tweemaal wassen met 1x PBS en de organoïden bewaren in 1x PBS bij 4 °C voor immunostaining gedurende maximaal 2 weken.
- Immunofluorescentiekleuring
- Om autofluorescentie te verminderen, voegt u 250 μL van 50 mM NH4Cl in 1x PBS toe aan elke put van de dia's bij RT gedurende 30 minuten terwijl u zachtjes schudt op een shaker bij 20 tpm.
- Na tweemaal wassen met 1x PBS, permeabiliseer de cellen met 0,1% Triton X-100 gedurende 30 minuten bij RT terwijl u zachtjes schudt bij 20 tpm.
- Voeg na tweemaal wassen met 1x PBS 300 μL blokkeringsoplossing, inclusief 5% BSA en 0,1% Triton X-100 in 1x PBS, toe aan elke put gedurende 1 uur bij RT.
- Voeg na het wassen primaire antilichamen toe aan de juiste putjes, gevolgd door secundaire antilichamen (zie Tabel met materialen). Bereid primaire en secundaire antilichaamoplossingen voor in 2% BSA en 0,3% Triton X-100 in 1x PBS. Incubeer alle primaire antilichamen bij 4 °C gedurende 2 dagen en alle secundaire antilichamen bij 4 °C gedurende 1 dag.
OPMERKING: De uiteindelijke concentraties zijn afhankelijk van het eiwit dat gewenst is voor het experiment. Controleer de voorraadconcentratie op de datasheet van de fabrikant. Bereken vervolgens de uiteindelijke concentraties op basis van de verdunningen die in de tabel met materialen worden gebruikt. - Was de putten na incubatie grondig met 1x PBS en voeg DAPI toe in 2% BSA en 0,3% Triton X-100 in elke put voor nucleaire kleuring.
- Stel de organoïden voor met behulp van een confocale laserscanmicroscoop, met een 20-60x olie-onderdompelingsobjectief (zie Tabel met materialen). Gebruik de Z-stack-modus om de boven- en ondergrenzen van de afbeelding in te stellen en gebruik de aanbevolen optimale Z-stapgrootte die is bepaald door de confocale software.
OPMERKING: De volgende vier confocale laserexcitatiegolflengten werden gebruikt: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm en 637,9 nm.
4. Voorbereiding en isolatie van organoïden voor histologische sectie
- Om de organoïden te oogsten voor histologisch onderzoek, verwijdert u de media uit de cultuur en voegt u 50 μL koude 1x PBS toe aan elke put van de dia's op ijs.
- Pipetteer drie tot vijf keer op en neer met behulp van een pipetpunt met grote boring van 200 μL, combineer alle oplossingen van de 15-well slide of culture inserts in een conische buis van 15 ml op ijs. Stel het totale oplossingsvolume in de buis in op 10 ml door extra koude 1x PBS toe te voegen.
- Centrifugeer de buis bij 4 °C, 300 x g gedurende 5 minuten; aspiraleer het supernatant en voeg 60 μL warme histogel (zie Tabel met materialen) toe om te mengen met de organoïde pellet met behulp van een 200 μL van de pipetpunt met grote boring.
- Breng de suspensie onmiddellijk over in een histologiemal. Na de consolidatie van de histogel bij kamertemperatuur, breng het schimmelblok in 4% paraformaldehyde voor fixatie 's nachts bij 4 °C.
- Na inbedding in paraffine snijdt u het histogelblok in doorsneden van 5 μm (bijvoorbeeld met een microtoom), bevestigt u de secties op glazen dia's en kleurt u met hematoxyline en eosine (H & E) of immunofluorescentie-gelabelde antilichamen. Maak foto's met een helderveldmicroscoop of omgekeerde epifluorescentiemicroscoop (zie Materialentabel).
5. Beeldvorming van levende organoïden
OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem (zie Tabel met materialen). Verschillende beeldvormingssystemen moeten deze stappen aanpassen volgens de instructies van hun specifieke fabrikant. Ongeacht de gebruikte apparatuur, vereisen het afbeelden van levende organoïden een temperatuurgecontroleerde en bevochtigde omgevingskamer met een bijbehorende CO 2-gasregelaar.
- Om de differentiatie van organoïden te controleren voordat een functionele zwellingstest36 wordt uitgevoerd, legt u de hele diabeelden handmatig vast met een helderveldmicroscoop of met een geautomatiseerd beeldvormingssysteem, zoals hieronder beschreven.
- Schakel de stroom naar het geautomatiseerde beeldvormingssysteem en de CO2/O2-gascontroller in en laat het systeem de geautomatiseerde kalibratie voltooien (~ 30 minuten).
- Stel na voltooiing de temperatuur van het beeldvormingssysteem in op 37 °C; voeg 15 ml steriel water toe aan het bevochtigingsreservoir, open de CO2-kleppen , sluit de deksels en laat het beeldvormingssysteem minimaal 30 minuten voor de beeldvorming vooraf incuberen.
- Open de geautomatiseerde beeldvormingssoftware om een protocol voor beeldvorming in te stellen en kies de locatie waar de onbewerkte experimentele gegevens moeten worden opgeslagen.
OPMERKING: Een voorbeeldprotocolbestand (aanvullend bestand 1), specifiek voor het beeldvormingssysteem, is verstrekt als sjabloon voor de geautomatiseerde beeldvorming van organoïden om organoïdedifferentiatie te controleren. - Zodra aan de omgevingsinstellingen is voldaan, brengt u onmiddellijk maximaal twee dia's met 15 putten met deksels over naar de omgevingskamer in de diahouder van het geautomatiseerde beeldsysteem (zie Materiaaltabel).
- Selecteer de putten die in beeld moeten worden gebracht en begin met het afbeelden om de beeldvorming van de gewenste putten te voltooien.
OPMERKING: De aanbevolen basisinstellingen zijn: 4x en 10x luchtdoel, helder veldkanaal, 2 x 2 montage voor 4x objectief om het hele putgebied te bestrijken, 4 x 4 montage voor een 10x-objectief. Z-stack-instellingen: drie tot zes Z-stack-segmenten, Z-stapgrootte = 50-100 μm, één tot twee segmenten onder het autofocuspunt en drie tot vijf segmenten erboven.
- Om levende organoïden in beeld te brengen voor gebruik in een forskoline-geïnduceerde zwelling (FIS) -test, gebruikt u een microscoop met een geautomatiseerde fase uitgerust met een milieubediende beeldvormingskamer die temperatuur- en CO2-controle mogelijk maakt.
- Begin met stap 5.1.1-5.1.4 en vervang het protocolbestand in stap 5.1.3 door het bestand in het voorbeeldprotocolbestand (aanvullend bestand 2) met instellingen die specifiek zijn voor het uitvoeren van een FIS-test.
- Pas vóór elk experiment de belichtingsinstellingen aan door ten minste drie putjes voor elke dia te evalueren (uiterst links, midden en uiterst rechts). Pas de X- en Y-coördinatenverschuivingen toe om ervoor te zorgen dat het doel zich in het midden van de put bevindt voor alle putten.
OPMERKING: De aanbevolen basisinstellingen zijn: 4x luchtdoel, Kanaal 1 = Helder veld, Kanaal 2 = DAPI, 2 x 2 montage (vier beeldtegels). Z-stack-instellingen: drie tot vier Z-stack-segmenten, Z-stapgrootte = 50-100 μm, één segment onder het autofocuspunt en twee tot drie segmenten erboven. Beeldacquisitietijd: 8 uur met intervallen van 20 minuten (Totaal aflezingen = 25; Lees 1 is T = 0). - Zodra alle instellingen op de juiste manier zijn geselecteerd, kiest u de putten die u voor beide dia's wilt weergeven of selecteert u alles en begint u met de uitvoering volgens de instructies van de apparatuur.
- Sla na het uitvoeren het experiment op, sluit de beeldbewerkingssoftware en sluit het beeldvormingssysteemaf 37.
6. Lumenmetingen bij aanvang
OPMERKING: Dit wordt gedaan met behulp van handmatige beeldvormingsanalysesoftware (zie Tabel met materialen). Een vergelijkbare methodologie kan worden gevolgd met behulp van een open-source software38 of software die de oppervlakte van een regio op een afbeelding kan meten.
- Open in de software het geautomatiseerde meetpaneel door met de rechtermuisknop op de onderkant van het scherm te klikken, Meting en vervolgens Geautomatiseerde meetresultaten te selecteren. Het gemeten gebied van elke regio van belang (ROI) wordt daar weergegeven.
- Open het organoïdebeeld in de software en selecteer 5-10 organoïden met zichtbare lumen.
OPMERKING: Lumen is een cirkelvormig gebied in het midden van de organoïde dat zichtbaar anders van kleur is dan de rest van de organoïde (figuur 2A). - Gebruik de polygoon ROI-meetfunctie om met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken om het menu te openen en selecteer Polygonal ROI om de volledige organoïde te schetsen om het totale oppervlak (TSA) van de organoïde te verkrijgen. Gebruik vervolgens dezelfde functie om het lumengebied (LA) te schetsen (figuur 2B).
- Herhaal dit voor de resterende organoïden in de put en alle putten in de test.
- Exporteer de gegevens naar Excel. Deel de LA door de TSA en gemiddelde alle organoïden uit het monster om de Baseline Lumen Ratio (BLR)11,13 te krijgen.
OPMERKING: Typisch, ~ 87% van de niet-CF organoïden zal een BLR hebben van meer dan 0,6, en 97% zal meer dan 0,5 zijn, terwijl slechts 14% van de CF-organoïden een BLR van meer dan 0,6 zal hebben en 31% zal meer dan 0,5 zijn.
7. Voorbehandeling en geautomatiseerde beeldvorming van HNE-organoïden
OPMERKING: Alle voorbehandelingsstappen worden uitgevoerd in een schone bioveiligheidskast. Stel het geautomatiseerde beeldvormingssysteem en de software voor het opnemen van de test vóór stap 7.1 vooraf in. De incubatie met DAPI is optioneel, maar wordt aanbevolen als een fail-safe als de kwaliteit van heldere veldbeelden wordt aangetast. In dit geval kan in plaats daarvan het DAPI-kanaal (377 nm) worden geanalyseerd.
- Incubeer de organoïden in een put van 15-putglaasjes met 50 μL differentiatiemedia die DAPI bevatten met of zonder 100 μM CFTRinh-172 (zie Materiaaltabel) gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C. Terwijl de organoïden incuberen, voert u stap 5.2.1 uit met behulp van een aangepast protocol voor zwellingstests volgens aanvullend bestand 2.
- Verwijder het pre-incubatiemedium met behulp van een glazen Pasteur pipet met aspiratie. Voeg 10 μM forskolin en 100 μM IBMX (stimulatiecocktails) (zie Tabel met materialen) toe voor een totaal volume van 50 μL differentiatiemedia in elke put.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen bubbels in de putten worden geïntroduceerd. Bubbels op de afbeeldingen hebben invloed op de geautomatiseerde analyse. - Begin onverwijld met het FIS-beeldvormingsprotocol na stap 5.2.2 tot en met 5.2.4. Verkrijg beelden elke 20 minuten in elke put, met een totale looptijd van 8 uur.
8. Geautomatiseerde analyse van forskoline-geïnduceerde zwellingstest op HNE-organoïden
- Open de geautomatiseerde beeldanalysesoftware, zoek het experiment dat eerder is opgeslagen uit stap 7.3 en haal de afbeeldingen van het experiment tevoorschijn.
- Kies het vatvenster dat moet worden geëvalueerd en selecteer de optie met de verwerkte afbeeldingen die zijn gestikt en z-geprojecteerd. Deze stap moet een beeld geven van de hele put met alle organoïden binnen het beeldvormingskader voor het maskeren van beoordeling en metingen.
- Kies de putafbeelding om te beoordelen. Selecteer Analyseren. Herhaal dit proces voor andere afbeeldingen om te zorgen voor de juiste maskering voor alle afbeeldingen die zijn opgenomen in de geautomatiseerde metingen. Sla de instellingsparameters op.
- Nadat u de analyse-instellingen hebt voltooid, past u de wijzigingen toe. De software zal de metingen wijzigen op basis van de instellingen.
OPMERKING: Nadat de eerste voorbewerking van de afbeelding is voltooid, moeten kwaliteitscontroles (QC) worden uitgevoerd om een consistente maskering te garanderen. Deze omvatten het handmatig beoordelen van alle putten om ervoor te zorgen dat organoïden zich binnen het beeldvormingsframe bevinden, bubbels of puin niet ongepast worden gemaskeerd en het controleren van de maskering in heldere veld- en DAPI-kanalen. - Exporteer de gegevens voor de samenvattende analyse (inclusief grafieken en statistische analyse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De uitbreiding van HNE's is essentieel voor een bloeiende organoïde cultuur. HNE's van een succesvolle monsterverzameling moeten zich rond 10 dagen uitbreiden tot meer dan 70% samenvloeiing. Een voorbeeld van succesvolle en niet-succesvolle steekproeven is weergegeven in respectievelijk figuur 1A en figuur 1B. De cellen moeten worden weggegooid als ze 14 dagen na cocultuur met bestraalde 3T3-cellen geen 70% confluentie kunnen bereiken. Alle besmette cellen moeten onmiddellijk worden weggegooid als ze niet snel kunnen worden gered met extra antimicrobiële middelen.
De groei van de organoïden werd vergeleken in 15-well dia's en kweekinzetstukken. De cultuurinzetstukken zijn dikker en verder van het doel dan de optisch geoptimaliseerde dia's, wat van invloed is op het beeld en de resolutie. Desondanks werd bij deze twee kweekmethoden geen significant verschil in de morfologie waargenomen, zoals te zien is in figuur 2. Morfologische verschillen zijn te zien tussen niet-CF en CF organoïden, zoals weergegeven in figuur 3A. Niet-CF-organoïden hebben de neiging om een groter lumen te hebben dat meer vloeistof bevat. CF-organoïden daarentegen hebben meestal een kleiner lumen met minder vloeistof en zijn soms gevuld met slijm en puin. De lumengrootte werd handmatig gemeten (figuur 3B) en de uitgangslumenverhouding werd berekend en weergegeven in figuur 3C. Dwarsdoorsnede organoïden werden gekarakteriseerd met behulp van H & E en immunofluorescentiekleuring. De representatieve afbeeldingen zijn weergegeven in figuur 4A,B. Luchtwegepitheelmarkers zoals trilharen, slijm en tight junction worden aangetoond in organoïden door immunofluorescente kleuring van de hele vatting in figuur 5A-D. Afhankelijk van de toepassing kan gesneden of whole-mount immunofluorescentie worden gebruikt. De whole-mount methode handhaaft de driedimensionale aard van de organoïde, waardoor het binnenste van de organoïde intact blijft, zoals getoond in het eerder gepubliceerde werk13.
De CFTR-functie werd beoordeeld door middel van forskoline-geïnduceerde zwelling (FIS) -test met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem. Slechts 15-well dia's worden gebruikt voor functionele assays vanwege de betere beeldresolutie. Een representatief forskoline dosis-respons experiment van niet-CF vrijwilligers (n = 5 proefpersonen) wordt getoond in figuur 6A om de redenering van de geoptimaliseerde beeldvormingstijd en analyse te illustreren. Gegevens die niet-CF- en CF-organoïderesponsen vergelijken, zijn gedetailleerd in eerdere publicaties11,13. Een dosis-respons toont de incrementele verandering in CFTR-activiteit om de beste benadering van metingen aan te tonen. De testduur van 1 uur en 8 uur werd geëvalueerd (figuur 6B,C) en analyse met gemiddelde fractionele verandering (AFC) versus oppervlakte onder de curve (AUC) is te zien in figuren 6C,D. Op basis van onze eerdere ervaring, zwelling voor de meeste proefpersonen en aandoeningen plateau na 8 uur, en in sommige gevallen resulteert in het barsten van de organoïden in die tijd. Daarom waren de assays beperkt tot slechts 8 uur. Bij deze verlengde testlengte wordt de zwelling niet-lineair. Bij het gebruik van de AUC wordt ook rekening gehouden met zowel de veranderingen in grootte als de snelheid van verandering. Daarom werd de AUC van meer dan 8 uur gebruikt voor alle FIS-assays in de uiteindelijke methodologie.
Figuur 1: Bright-field beelden van HNE's in co-cultuur. HNE's breiden uit in expansiemedia met bestraalde en geïnactiveerde 3T3 fibroblasten gedurende 10 dagen. Een omgekeerde helderveldmicroscoop wordt gebruikt voor het afbeelden van de cellen. (A) HNE's groeien goed in een grote cluster (zwarte pijl). In (B) daarentegen groeien de HNE's slecht in twee kleine clusters (zwarte pijlen) rond bestraalde 3T3-cellen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: HNE organoïde formatie in een 15-well slide en culture insert. Bright-field beelden van organoïden werden vastgelegd met behulp van een omgekeerde bright-field microscoop gedurende 21 dagen. Organoïden in de 15-put dia (A) hebben nauwkeurigere en scherpere beelden dan die in de kweekinvoeg (B). Er werd geen morfologisch verschil waargenomen tussen de organoïden die in de dia en de insert werden gekweekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Organoïde lumengrootte (paneel A) en lumenmetingen (paneel B en C). (A) Niet-CF organoïden hebben meestal een groter lumen en meer vloeistof dan CF (F508del / F508del) organoïden. (B) Een methode om handmatig het totale oppervlak (TSA) te meten, aangegeven door de rode omtrek en het lumenoppervlak (LA) aangegeven door de groene omtrek in een enkele organoïde. (C) Een voorbeeld voor het gebruik van het totale oppervlak en het lumenoppervlak om de lumenverhouding (LA: TSA) te berekenen in organoïden van een niet-CF versus een CF-proefpersoon. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Doorsnede van de organoïden ingebed in paraffine. (A) Een voorbeeld van H&E-kleuring in organoïden van een niet-CF en CF (F508del/F508del) onderwerp. (B) Immunofluorescente kleuring van trilharen in een organoïde. Groen is de trilharen (witte pijl) gekleurd met geacetyleerd tubuline en FITC gelabeld secundair antilichaam, en blauw is de kernen gelabeld met DAPI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Confocale beelden van whole-mount immunofluorescentie in organoïden. (A,C) Maximale projectiebeelden van de twee representatieve organoïden. (B,D) Driedimensionale reconstructiebeelden van respectievelijk (A) en (C). Een 8-well glasbodemplaat werd op het platform van een confocale microscoop gemonteerd en de 40x-lens werd gebruikt om de fotomicrografen te maken. Beeldanalysesoftware werd toegepast voor beeldvorming en reconstructie van de beelden. Witte pijlen duiden op slijm (in B) en trilharen (in C) in het lumen van de organoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Motivering voor de lengte van de zwellingstest en analysemethoden. Forskolin (FSK)-geïnduceerde zwelling (FIS) assay om cftr functie te testen op de primaire neus epitheelcellen. Verschillende doses forskoline die in de cijfers werden aangegeven, werden toegediend in 21 dagen oude organoïden in de differentiatiemedia; organoïde zwelling werd onmiddellijk geregistreerd met de geautomatiseerde imager gedurende 8 uur. Na 8 uur wordt zwelling getoond bij (A) (n = 5, niet-CF-proefpersonen) met behulp van gemiddelde fractionele verandering (AFC). FSK dosis-respons wordt vergeleken met AFC bij 1 h (B) vs. bij 8 h (C), wat suggereert dat de 8 h-assay een significanter zwellingsverschil kan veroorzaken tussen verschillende FSK-doses dan die bij 1 h. AFC (C) versus het gebied onder de curve, AUC (D) na 8 h worden vergeleken, wat aangeeft dat AUC een klein zwellingsverschil kan weerspiegelen dan AFC. De X-as in panelen (B-D) vertegenwoordigt de verschillende behandelingsomstandigheden die overeenkomen met de symbolen in de figuurlegende. Alle foutbalken in de cijfers geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Alle componenten voor het maken van de uitbreidingsmedia. De gedetailleerde informatie over de concentratie van de reagensvoorraad, de voorraadopslag, de hoeveelheid voorraad voor het maken van een medium van 500 ml en de uiteindelijke concentratie zijn beschreven. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Alle componenten voor het maken van differentiatiemedia. De gedetailleerde informatie over de concentratie van de reagensvoorraad, de voorraadopslag, de hoeveelheid voorraad voor het maken van een medium van 500 ml en de uiteindelijke concentratie zijn beschreven. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Een voorbeeldprotocolbestand dat specifiek is voor het beeldvormingssysteem wordt geleverd als sjabloon voor de geautomatiseerde beeldvorming van organoïden om organoïdedifferentiatie te controleren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Een voorbeeldprotocolbestand met instellingen die specifiek zijn voor het uitvoeren van een FIS-test. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript biedt gedetailleerde methodologieën voor uitgebreide live en vaste beeldvorming van de luchtwegepitheelorganoïden afgeleid van HNE-borstelbiopsie. Het beschrijft functionele assays die cftr-activiteit in een individu kunnen bepalen. HNE's bieden een minimaal invasief, primair weefsel voor een verscheidenheid aan toepassingen. De hier aangeboden expansietechnieken kunnen worden gebruikt voor het modelleren van luchtwegaandoeningen, waaronder organoïden. Organoïden kunnen worden gebruikt voor precisietherapeutische benaderingen en om de stabiliteit van gen- of mRNA-gebaseerde therapieën in de loop van de tijd te bewaken, voor precisieonderzoeksontwerp en om te helpen bij het oplossen van niet-overtuigende diagnoses39. Het huidige onderzoek gaat over CF, maar deze modellen hebben toepassingen voor andere ziekten die de epitheliale functie beïnvloeden.
De eerste uitbreiding van HNE na biopsie is essentieel. Er is waargenomen dat cytologieborstels grotere initiële celaantallen en betere resultaten opleveren dan andere biopsiehulpmiddelen14. Uit eerdere ervaringen hebben we geconcludeerd dat het combineren van borstels van beide neusgaten in één monster en het verwerken van dat monster binnen 4 uur de beste resultaten oplevert. Andere onderzoekers hebben langere tijdframes gebruikt van biopsie tot verwerking met succes3. De juiste initiële verzameling biopsieën is van vitaal belang voor latere expansie en zaaien als organoïden. Hoogwaardige bestraalde en geïnactiveerde fibroblasten voor co-kweek zijn vereist, die in ons laboratorium worden gekweekt en behandeld, maar ook commercieel kunnen worden gekocht. Onderzoekers wordt geadviseerd dat niet alle 3T3 fibroblasten dezelfde cellijn zijn en vóór gebruik moeten worden gevalideerd.
Voor specimens waarvan niet wordt verwacht dat ze pathogene bacteriële of schimmelcultuur hebben, is de behandeling met antibiotica beperkt tot standaard penicilline- en streptomycinebehandeling voor de experimenten die in dit manuscript worden beschreven. Voor degenen waarvan bekend is dat ze chronische kolonisatie van de bovenste luchtwegen hebben, wordt een hierboven beschreven antibioticacocktail slechts 3 dagen gebruikt omdat antibiotica de epitheliale expansie lijken te vertragen en slechtere resultaten opleveren in de hier beschreven experimenten. Drie dagen werden geselecteerd om het besmettingsrisico in evenwicht te brengen met een vergelijkbare expansiesnelheid voor zowel CF- als niet-CF-monsters. Voor personen met ongebruikelijke pathogenen kan een op maat gemaakte antimicrobiële behandeling besmette culturen redden als ze vroeg worden herkend of a priori worden gestart. Voor initiële biopsieën die ongewoon langzaam groeien, zullen de resultaten meestal slecht zijn voor organoïde studies. Onderzoekers moeten zowel de groeisnelheid als de morfologie dagelijks volgen. De interne kweekmedia en reagentia die worden gebruikt, zijn het meest nuttig voor functionele zwellingstests, maar andere commercieel beschikbare media kunnen andere toepassingen ten goede komen 12,25,40,41, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Het type ECM dat wordt gebruikt, kan leiden tot verschillende morfologie en verschillende resultaten, en reproduceerbare resultaten zijn van cruciaal belang. Alle reagentia die in dit protocol worden gebruikt, worden routinematig getest voordat ze voor experimenten worden gebruikt. Ondanks deze ervaring zullen sommige culturen er om onverklaarbare redenen niet in slagen om organoïden uit te breiden of te genereren. Onderzoekers worden aangemoedigd om rekening te houden met deze factoren bij het optimaliseren van dit protocol voor hun toepassingen.
Een specifiek type 15-well slide wordt gebruikt in dit protocol dat is geoptimaliseerd voor optische beeldvorming, waarbij minimale volumes worden gebruikt en replicaties worden gemaximaliseerd terwijl de kosten worden verlaagd. Deze dia's hebben een onderste en bovenste kamer bevestigd op een polymeer coverslip die menisci minimaliseert (wat anders de beeldvorming zou schaden) en ook mediavervanging zonder risico op ontwrichting van de matrix en vernietiging van de organoïde culturen. Deze dia's maken bright-field imaging en live vlekmicroscopie eenvoudig, met initiële zaaiing, groei en beeldvorming in dezelfde schotel. Organoïden gaan verloren tijdens het verzamel-, fixatie- en kleuringsproces, dus tijdens elke stap moet zorgvuldig worden gezorgd en er moeten voldoende startnummers worden verkregen om succes te garanderen. Het kweken van organoïden in kweekinzetstukken kan helpen bij de ontwikkeling van deze technieken.
Beeldvormingstechnieken die gebruikmaken van gemeenschappelijke laboratoriummicroscopen zijn inbegrepen. De geautomatiseerde functionele assays maken echter gebruik van een beeldvormingssysteem dat complex is en een goed opgeleide gebruiker vereist. Dit protocol is ontwikkeld voor gebruikers met een basisniveau van ervaring met behulp van deze microscoop en zijn software. Het wordt aanbevolen om eerst de personen te trainen in het primaire gebruik van het instrument en de software door vertegenwoordigers van de fabrikant; dezelfde praktijk wordt gevolgd in ons lab. Een minimum van 4 weken training was nodig om deze microscoop effectief te gebruiken voor experimenten.
Zoals hierboven beschreven, heeft deze methodologie enkele beperkingen. Expertise in biopsieverzameling, snelle verwerkingstijd en faciliteit met feederfibroblasten zijn nodig om HNE-organoïden met succes uit te breiden en te kweken. Deze methode is ontwikkeld met behulp van specifieke reagentia en apparatuur die mogelijk niet universeel beschikbaar zijn. De methodologie is nuttig gebleken voor onderzoek naar cystische fibrose 3,11,13 en is mogelijk niet zo toepasbaar op andere ziekteprocessen 25. Andere methoden en apparatuur kunnen echter worden gebruikt om soortgelijke strategieën te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JSG staat vermeld als uitvinder op een patentaanvraag 20170242033 van de Universiteit van North Carolina die een soortgelijk model beschrijft. Wanneer gelicentieerde technologie van UNC royalty's oplevert, ontvangen de uitvinders een deel van de inkomsten. Anders verklaren de auteurs geen belangenconflicten. De financiers hadden geen rol in de opzet van de studie, in het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens, in het schrijven van het manuscript of in de beslissing om de resultaten te publiceren.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de bijdragen van alle deelnemers die HNE-borstelbiopten hebben gedoneerd om dit protocol te ontwikkelen. We bedanken Latona Kersh en medewerkers van de Children's Research Unit voor het coördineren van de werving van onderzoeksvrijwilligers en het verzamelen van monsters. We bedanken Lily Deng, Johnathan Bailey en Stephen Mackay, voormalige stagiaires in ons laboratorium, voor technische assistentie. We bedanken Zhong Liu en Rui Zhao voor hun technische hulp. Steven M. Rowe, directeur van het CF Research Center bij UAB, biedt leiderschap en middelen, zonder welke dit werk niet mogelijk zou zijn. We willen ook Sarah Guadiana van Biotek bedanken voor hulp bij instrumenttraining, Robert Grabski voor confocale microscopie-assistentie bij de UAB High-Resolution Imaging Facility en Dezhi Wang voor histologische hulp bij de UAB Histology Core. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (aan JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (aan JSG), het Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 en DK072482 en het CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], en het UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , Discovery Labware, Inc. Bedford, MA. (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
