Summary
超声波辅助提取（UAE）提高了溶剂的提取效率，当应用于 大麻 属生物质时，它减少了提取所需的时间。这降低了由于降解而导致的成本和潜在的大麻素损失。此外，由于溶剂使用率低，阿联酋被认为是一种绿色方法。
Abstract
工业大麻（大麻属）具有许多具有潜在医疗益处的感兴趣化合物。在这些化合物中，大麻素已成为人们关注的焦点，特别是酸性大麻素。由于缺乏精神活性，重点正在转向酸性大麻素。大麻植物产生酸性大麻素，大麻植物产生低水平的精神药物大麻素。因此，利用大麻进行酸性大麻素提取将消除提取前作为大麻素来源的脱羧需求。使用溶剂萃取是获得酸性大麻素的理想选择，因为它们在超临界CO2等溶剂中的溶解度受到限制，因为达到其溶解度常数所需的高压和温度。另一种旨在增加溶解度的方法是超声辅助提取。在该方案中，研究了溶剂极性（乙腈0.46，乙醇0.65，甲醇0.76和水1.00）和浓度（20%，50%，70%，90%和100%）对超声辅助提取效率的影响。结果表明，水是最有效的，乙腈是最有效的溶剂。乙醇被进一步检查，因为它具有最低的毒性，并且通常被认为是安全的（GRAS）。令人惊讶的是，水中50%乙醇是从大麻中提取最大量大麻素的最有效乙醇浓度。与100%乙醇相比，大麻二酸浓度增加28%，与100%乙腈相比增加23%。虽然确定50%乙醇是我们应用中最有效的浓度，但该方法也被证明对替代溶剂有效。因此，所提出的方法被认为有效且快速地提取酸性大麻素。
Introduction
工业大麻（大麻 属）在各种植物组织（花，叶和茎）中产生酸性大麻素，在花中发现的浓度最高1。 大麻 行业利用几种方法来提取这些化合物。其中一种方法是利用非极性和/或极性溶剂的溶剂萃取，其中乙醇是最常用的。然而，单独使用溶剂萃取的能力有限;因此，增强提取技术，如微波辅助提取（MAE）和超声辅助提取（UAE），旨在提高产量。此外，可以使用超临界流体技术提取高浓度大麻二酚（CBD）2.
萃取是一个动态过程，有几个因素会影响其效率，即水分含量，粒度和溶剂3。具体而言，对于阿联酋技术，效率由温度，压力，频率和时间4控制。
超声波辅助提取是超声波通过液体搅拌颗粒的过程。在搅拌过程中，植物材料经历声空化，压缩和膨胀循环，形成气泡，在溶液中坍塌，导致产生极端温度和压力5。压力和温度的变化改变了溶剂的物理性质，这可导致提取6的效率增加。此外，空化可以破坏分子相互作用，导致有机和无机化合物从植物基质7中浸出。该过程涉及两种主要类型的物理现象：（1）扩散到细胞壁上，以及（2）在打破细胞壁8后冲洗细胞内容物。然而，阿联酋的使用并非没有陷阱;有几份报告称，阿联酋可以降解化合物9，10。此外，在空化部位产生的温度高于大麻素脱羧所需的温度。然而，Mudge等人使用阿联酋 ，没有观察到CBD或四氢大麻酚（THC）的大量脱羧，从而证明阿联酋是提取大麻素的有效和绿色方法，因为它们可以使用低能量快速提取。
De Vita等人12 专门检查了MAE和UAY方法的使用，发现当对每种方法应用最佳条件时，UAE提取了更多存在于植物材料中的酸性和中性CBD和THC。同样，Rožanc等人13 比较了多种提取方法（阿联酋，索氏，浸渍和超临界流体），并检查了提取物的生物活性。Rožanc证明所有方法都有效提取大麻素;然而，超临界流体和阿联酋在提取大麻二酸（CBDA）方面最有效。此外，当通过2，2-二苯基-1-苦味酰肼（DPPH）测定时，阿联酋提取具有最高的生物活性。Rožanc的研究还表明，虽然提取过程在生产粗提取物方面是有效的，但仍有一部分非大麻素化合物会影响提取物的生物活性。此外，这些化合物可以使从粗提取物13中分离和纯化单个大麻素化合物变得复杂。
超临界流体萃取（SFE）技术已被用于提取中性大麻素。几项研究表明，SFE加上有机溶剂，如乙醇，导致中性大麻素2，3的提取效率更高。当压力增加到能够提取酸性大麻素的水平时，非大麻素含量也增加。因此，这些高压对于工业加工是不切实际的，因为SFE对大麻素的选择性降低，需要额外的后处理。因此，脱羧必须在SFE之前进行，这可能导致大麻素损失高达18%2。为了提高SFE中的效率，已经与固相萃取等技术相结合，以增加最终萃取物14的纯度。然而，尽管具有高纯度作为最终产品，但只获得中性大麻素。
传统上，在分析实验室中，大麻素在9：1甲醇：氯仿混合物中提取。然而，Mudge等人11 证明，在使用阿联酋时，可以使用单一溶剂进行有效的提取。研究表明，80%甲醇与传统的9：1甲醇：氯仿提取一样有效，从而表明更环保的溶剂可以同样有效。因此，由于具有几个好处，包括低资本成本，减少提取时间以及降低能源使用和溶剂量，因此对阿联酋的潜在用途进行了检查。然而，在阿联酋的情况下，当使用极性溶剂时，可以提取叶绿素和其他非大麻素，这可能会导致颜色7的问题。因此，为了研究在商业规模上获得酸性大麻素的潜力，阿联酋使用工业大麻品种樱桃酒。Cherry Wine是 C. sativa 和 C. indica的杂交种，是The Wife和Charlotte's Cherries品种之间的杂交种。樱桃酒品种是一种高CBDA生产菌株（15%至25%CBD），具有低水平的四氢大麻酸（THCA）。该品种是籼稻为主的 C. indica菌株，开花7至9周。
为了建立最佳的阿联酋提取方案，采用了两种方法：传统的一次一个因素（OFT）优化和使用中央复合材料设计（CCD）的实验设计（DoE）方法15。对于DoE，基于样品/溶剂比，提取时间和溶剂浓度作为因素优化了CBDA / CBD提取，并通过响应表面方法（RSM）分析了结果数据。总之，所描述的方案概述了提取最大量的CBDA / CBD的最佳方法。
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Protocol
1. 植物材料制备
- 从田间种植的植物中获得樱桃酒花序，以南北向的配置种植，植物中心相距1米，行距1.2米（种植位于美国科罗拉多州朗蒙特）。
- 在35°C下风干花序48小时。使用177μm的研磨机研磨花序。
- 将粉碎后的物料通过80号筛网。将产生的粉末储存在室温下的密封袋中，以备将来使用。
2. 超声提取
- 称取0.5g 大麻 花序粉末到50mL锥形管中。向容器中加入40mL溶剂（例如，去离子水中的50%乙醇）。
- 将提取容器置于设置为40 kHz和室温（超声处理功率为100 W）的超声波浴中。
- 在超声波浴中进行提取30分钟，将浴的温度从25°C提高到30°C。
- 将提取液倾析到离心管中。
- 在15°C下以3，000× g 离心流体15分钟。通过8μm滤纸在真空下过滤上清液。
3. 高效液相色谱（HPLC）定量分析
- 将七种大麻素标准品：大麻双色胺（CBC），CBD，CBD，CBDA，大麻酚（CBN），四氢大麻酚（THCA），Δ8-THC和Δ9-THC稀释至100%，50，25和12.5μg/ mL在100%甲醇中的工作浓度。在 40 kHz 的超声波浴中混合并超声处理 5 分钟，超声处理功率为 100 W
- 通过0.45μm聚四氟乙烯（PTFE）注射器过滤器过滤标准品。通过0.45μm PTFE注射器过滤器过滤样品上清液（从步骤2.5开始）。
- 将要分析的样品放入1.5 mL小瓶中，放入HPLC自动进样器中，一次加载10 μL。
- 按照 表1中提供的条件和参数运行HPLC。从生成的标准曲线中得出50-200μg/ mL的大麻素浓度。
- 与提取过程中使用的溶剂（40mL）的体积相乘，以获得μg大麻素。通过将大麻素除以1000，将大麻素的μg转换为mg大麻素。
- 除以提取所用植物原料的原始重量（0.5克），得到mg/g干重。
4. 使用响应面方法进行优化
- 使用数据分析工具建立模型，包括15个实验运行，其中有12个阶乘点和3个中心点，如 表4 所示。
- 使用响应表面方法和中央复合材料设计优化提取参数、提取时间 （T）、溶剂浓度 （S） 和样品/溶剂比 （R）。将变量 T、S 和 R 的范围分别设置为 5-30 分钟、20%-100% 和 60-100 （1：X）。
- 选择亲脂性提取物的总产量以及提取的CBD和CBDA的产量作为响应因子（RF）。
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Representative Results
使用的溶剂范围从极性指数的中间（0.460 - ACN）到极性（1.000 - 水）。从表2可以看出，水没有成为大麻素的有效提取剂，这并不意外，因为大麻素由于其疏水性而在水中的溶解度有限13。与水相比，其他溶剂具有相似的CBD和CBDA的提取值，与两种醇相比，极性最低的溶剂乙腈（ACN）具有更高的提取率。虽然统计上较低，但乙醇能够分别提取ACN和甲醇提取的主要大麻素CBDA的近93%和99%。此外，乙醇提取物具有最低水平的THCA，这是Δ 9-THC的前体。为了限制转化为精神药物Δ 9-THC的可能性，需要降低THCA的水平，这是工业应用关注的问题16。虽然所有有机溶剂通常被认为是安全的（GRAS），但只有乙醇对其在最终产品中的数量没有限制2。乙醇和甲醇的值之间的差异将保证它们中的任何一个都可以使用，但是，乙醇的较低毒性使其成为商业用途的更好选择。同样，虽然ACN在提取物中产生了更多的大麻素，但允许的低水平残留ACN并不能证明其使用，因为当CBDA浓度仅增加7%时，通过额外的纯化去除痕量。
乙醇水溶液对大麻素浓度的影响的检查如 表3所示。已经证明，溶液浓度可以影响提取效率17，18。使用阿联酋提取大麻素也不例外。在50%乙醇浓度下观察到最大提取。这代表了用于提取CBDA的100%乙醇增加39.7%。此外，50%乙醇还使提取的THCA水平降低了20.3%。
为了确认OFT优化的结果，检查了使用RSM的DoE（表4），如 表5所示。RSM分析（图1）证实了30分钟的提取和1：100的样品与溶剂比。RSM分析得出水中理想浓度为53.4%乙醇。这证实了OFT获得的50%。虽然DoE发现的最佳乙醇浓度略高于OFT的50%，但由于其制备的便利性和整体CBDA / CBD提取的可忽略不计的降低，因此在方案中使用了50%乙醇。
使用50%乙醇获得的结果与使用50%乙醇浸渍（称取0.5g大麻花序粉末到50mL管中并向容器中加入50mL乙醇）获得的结果进行比较，如 表6所示。与浸渍样品相比，阿联酋样品中产生的CBDA提取量高出约55%。此外，重要的是要注意，提取的CBD浓度也翻了一番。
图 1.优化图。 大麻提取时间，溶剂浓度和样品/溶剂比的响应表面的优化图 。 黑线表示绘制的 y 值，蓝线表示最大 y 值，其数值也以蓝色提及，红线表示 y 值为最大值时的 x 值，所有这些参数的数值在每个图形的顶部以红色提及。 请点击此处查看此图的大图。
表 1. 用于HPLC大麻素分析的参数。 请按此下载此表格。
表 2. 通过HPLC分析的100%溶剂衍生的提取物的单个大麻素（mg / g干重）。 请按此下载此表格。
表 3. 通过HPLC（mg / g干重）分析来自乙醇水的提取物的单个大麻素。 请按此下载此表格。
表 4. 基于响应面法中心复合设计的 大麻 CBDA+CBD实验数据。 请按此下载此表格。
表 5. 由RSM程序计算的 大麻提取条件的多项式方程。 请按此下载此表格。
表 6. 超声辅助提取与浸渍提取（无超声波）的比较，从50%乙醇溶剂中提取单个大麻素量（mg / g）。 请按此下载此表格。
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Discussion
溶剂的极性在化合物的有效提取中起着至关重要的作用。由于酸性大麻素在性质上略带极性，这在很大程度上是由于羧酸部分，因此假设甲醇或乙醇等极性溶剂最有效。Garrett和Hunt19在他们使用THC的研究中证明，乙醇水溶液中的溶解度基于溶液中的乙醇百分比和溶液的离子强度。虽然在目前的研究中没有检查离子强度，但可以假设它在提高50%乙醇的提取效率方面发挥了重要作用。此外，正如Garrett盖瑞特和Hunt19所证明的那样，pH值对水溶液中的溶解度有影响。Metcalf20 还强调了pH值的重要性，他们表明水溶液中大麻二酚的pKa在8.0至8.5之间，而其他报告的pKa为9.13至9.64。
进一步支持使用水溶液的是用水进行无溶剂萃取的做法。该过程涉及 大麻 的动态浸渍以从植物材料21中移出毛状体。然后可以干燥毛状体和萃取剂，以产生可用于进一步处理的哈希产品。在目前的研究中，阿联酋的使用为释放毛状体内容物提供了手段。利用水溶液代替水可以更好地溶解酸性大麻素。与阿联酋相关的另一个好处是它能够以原始形式提取和保留酸性大麻素22。Lewis-Bakker等人22 还表明，阿联酋在提取CBDA方面比SFE或soxhlet更有效。
Brighenti等人23 在非脱羧大麻中发现，通过几种技术提取的单个大麻素没有显着差异，室温乙醇作为提取溶剂的性能略好。因此，Brighenti23 研究和目前的研究都使用乙醇作为首选溶剂。本研究中乙醇的选择得到了预期的下游加工方法的进一步支持。乙醇的选择与要采用的冬季化过程相容，并允许使用诸如闪蒸或离心分区色谱3之类的方法浓缩提取和纯化。此外，由于与其使用相关的可接受限值24，任何痕量的乙醇都不令人担忧。
溶剂浓度影响提取过程，并被确定为方案中最重要的因素。用水稀释有机溶剂会产生具有改性极性且有时具有改性物理化学性质的溶剂。极性为1.00的水具有独特的特征，因为随着温度的升高，介电常数降低，极性也随之降低5。此外，温度的升高降低了表面张力和粘度，从而提高了基质17的渗透性。最后，水温的升高改善了萃取17的分析物扩散和传质动力学。阿联酋的主要力量是超声波， 通过 压缩产生热量并从声压变化中释放出来。气泡内经历的高温通过Rae25所看到的酒精的存在来缓解。气泡中酒精的存在增加了气态混合物25的热容。因此，这提高了水的可萃取性，并且还导致微气泡的空化，从而破坏细胞壁，从而更容易地提取溶剂。
文献包含多种提取大麻素的方法4，17，26，27，28。传统的方法，例如乙醇浸渍（没有超声波），由于其易用性以及与现代方法相关的成本（例如超临界流体21）而仍然被广泛使用。超声辅助萃取提供了通过旨在提高产量的现代萃取技术来增强传统溶剂萃取方法的机会。超声辅助萃取允许使用绿色溶剂（即水、乙醇等），提高产量，并减少时间和成本。使用阿联酋作为其他提取技术的预处理仍然被广泛探索。然而，在索氏提取28之前使用阿联酋获得24%的粗提取产量增加，从而证明了组合提取方法的潜力。目前提出的方法侧重于仅利用阿联酋从工业大麻中提取酸性大麻素，然而，与其他替代和常规提取方法相结合的进一步利用潜力为未来的研究提供了有趣的途径。
从这项研究中可以得出结论，确定了各种提取溶剂和提取溶剂比例如何影响大麻素提取。采用阿联酋方法根据最终产品中的允许量来检查选定的溶剂，以便在工业中的潜在应用。基于这些发现，与浸渍相比，阿联酋的就业导致大麻素的提取率更高。此外，使用DoE和RSM观察到，与其他乙醇浓度相比，发现53.4%乙醇具有更高的大麻素提取率。因此，这些发现表明，阿联酋作为增加大麻素提取的有效手段，因此应该在工业能力上进一步研究。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
这项研究得到了科罗拉多州立大学普韦布洛分校大麻研究所，韩国政府资助的韩国创新基金会赠款（MSIT）（2021-DD-UP-0379）和春川市（大麻研发和工业化，2020-2021）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | J.K.Baker | 9017-88 | solvent |
| Cannabichromene | Cerilliant | C-143 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiol | Cerilliant | C-045 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiolic acid | Cerilliant | C-144 | Cannabinoids standard |
| Cannabidivarin | Cerilliant | C-140 | Cannabinoids standard |
| Cannabigerol | Cerilliant | C-141 | Cannabinoids standard |
| Cannabinol | Cerilliant | C-046 | Cannabinoids standard |
| Centrifuge | Hanil Scientific Inc | Supra 22K | Centrifuge |
| Cherry Wine hemp | CFH, Ltd. | - | Flower extraction material |
| Distilled water | TEDIA | WS2211-001 | solvent |
| Ethanol | TEDIA | ES1431-001 | solvent |
| Filter paper | Whatman | #2 | Filtering |
| Grinder | Daesung Artlon | DA280-S | Milling |
| HPLC | Shimadzu | LC-10 system | Analysis of Cannabinoid |
| Methanol | TEDIA | MS1922-001 | solvent |
| Minitab 16.2.0 | Minitab Inc. | ||
| Syringe filters | Whatman | 6779-1304 | Filtering |
| Tetrahydrocannabivarin | Cerilliant | T-094 | Cannabinoids standard |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031-1L | HPLC flow solvent |
| Untrasonic bath | Jinwoo | 4020P | Ultrasonic extraction |
| Zorbax Eclipse plus C18 HPLC column | Agilent | 9599990-902 | HPLC column |
| Δ8 - Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-032 | Cannabinoids standard |
| Δ9 - Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-005 | Cannabinoids standard |
| Δ9 - Tetrahydrocannabinolic acid | Cerilliant | T-093 | Cannabinoids standard |
References
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