Summary
超音波支援抽出(UAE)は、溶媒の抽出効率を高め、 大麻 属バイオマスに適用すると、抽出に必要な時間を短縮します。これは、コストと劣化による潜在的なカンナビノイドの損失を減少させます。さらに、UAEは溶媒の使用が少ないため、グリーンメソッドと考えられています。
Abstract
工業用麻(大麻 spp.)には、潜在的な医学的利点を持つ多くの関心のある化合物があります。これらの化合物のうち、カンナビノイド、特に酸性カンナビノイドが注目の的になっています。焦点は、向精神活性の欠如のために酸性カンナビノイドに向かっている。大麻植物は酸性カンナビノイドを産生し、麻植物は低レベルの向精神性カンナビノイドを産生する。したがって、酸性カンナビノイド抽出のための麻の利用は、カンナビノイドの供給源としての抽出前の脱炭酸の必要性を排除するであろう。溶媒ベースの抽出の使用は、超臨界CO2 などの溶媒への溶解度が、それらの溶解度定数に達するために必要な高圧および温度のために制限されているため、酸性カンナビノイドを得るのに理想的である。溶解度を高めるために設計された代替方法は、超音波支援抽出である。このプロトコルでは、溶媒極性(アセトニトリル0.46、エタノール0.65、メタノール0.76、および水1.00)および濃度(20%、50%、70%、90%、および100%)が超音波支援抽出効率に及ぼす影響が調べられた。結果は、水が最も効果的でなく、アセトニトリルが最も効果的な溶媒であったことを示しています。エタノールは毒性が最も低く、一般に安全(GRAS)とみなされているため、さらに調べられました。驚くべきことに、水中の50%エタノールは、麻から最高量のカンナビノイドを抽出するのに最も効果的なエタノール濃度である。カンナビジオール酸濃度の増加は、100%エタノールと比較して28%、100%アセトニトリルと比較した場合23%であった。50%エタノールが我々の適用にとって最も有効な濃度であると決定されたが、この方法は代替溶媒で有効であることも実証されている。したがって、提案された方法は、酸性カンナビノイドの抽出に効果的かつ迅速であると考えられる。
Introduction
工業用麻(大麻属)は、 様々な植物組織(花、葉、茎)に酸性カンナビノイドを産生し、花1に見られる最高濃度を有する。 大麻業界は、 これらの化合物を抽出するためにいくつかの方法を利用しています。そのような方法の1つは、エタノールが最も一般的に使用される非極性および/または極性溶媒を利用する溶媒抽出である。しかしながら、溶媒抽出単独では、その能力において制限がある。したがって、マイクロ波支援抽出(MAE)および超音波支援抽出(UAE)などの拡張抽出技術は、収率を増加させるように設計されている。さらに、高濃度カンナビジオール(CBD)は、超臨界流体技術2を使用して抽出することができる。
抽出は動的なプロセスであり、いくつかの要因がその効率、すなわち含水率、粒子サイズ、および溶媒3に影響を与える。具体的には、UAE技術の場合、効率は温度、圧力、周波数、および時間によって支配されます4。
超音波支援抽出は、超音波が粒子を攪拌するために液体を通過するプロセスです。攪拌プロセス中、植物材料は音響キャビテーション、圧縮および膨張のサイクルを経験し、溶液中で崩壊する気泡を形成し、極端な温度および圧力の発生をもたらす5。圧力および温度変化は溶媒の物理的性質を変化させ、これは抽出6の有効性の増加をもたらし得る。さらに、キャビテーションは、植物マトリックス7からの有機および無機化合物浸出につながる分子相互作用を破壊することができる。このプロセスは、2つの主要なタイプの物理現象を含む:(1)細胞壁を横切る拡散、および(2)壁8を壊した後の細胞内容物のすすぎ。しかし、UAEの使用には落とし穴がないわけではありません。UAEが化合物9,10を分解することができるといういくつかの報告があります。さらに、キャビテーション部位で発生する温度は、カンナビノイドの脱炭酸に必要な温度を上回っています。しかし、Mudgeら11はUAEを使用し、CBDまたはテトラヒドロカンナビノール(THC)の大規模な脱炭酸を観察しなかったため、UAEが低エネルギーで迅速に抽出できるため、カンナビノイドの抽出のための効率的で緑色の方法であることを実証しました。
De Vitaら12 は、MAEおよびUAE法の使用を具体的に検討し、各方法に最適な条件を適用すると、UAEが植物材料中に存在する酸性および中性のCBDおよびTHCをより多く抽出することを見出した。同様に、Rožancら13は 、複数の抽出方法(UAE、ソックスレット、マセレーション、および超臨界流体)を比較し、抽出物の生物学的活性を調べた。Rožancは、すべての方法がカンナビノイドの抽出に有効であることを実証しました。しかし、超臨界流体とUAEはカンナビジオール酸(CBDA)の抽出に最も効果的でした。さらに、UAE抽出は、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)アッセイによって測定されたときに最も高い生物学的活性を有していた。Rožancの研究はまた、抽出プロセスが粗抽出物を製造するのに有効である一方で、抽出物の生物学的活性に影響を与える非カンナビノイド化合物の一部が残っていることを示した。さらに、これらの化合物は、粗抽出物13からの個々のカンナビノイド化合物の単離および精製を複雑にすることができる。
超臨界流体抽出(SFE)技術は、中性カンナビノイドを抽出するために使用されてきた。いくつかの研究は、SFEとエタノールなどの有機溶媒が、中性カンナビノイドのより高い抽出効率をもたらすことを実証した2,3。圧力を酸性カンナビノイドを抽出できるレベルまで上昇させたとき、非カンナビノイド含量も増加した。したがって、これらの高圧は、カンナビノイドに対するSFEの選択性が低下し、追加の後処理が必要であるため、工業的処理には実用的ではない。その結果、SFEの前に脱炭酸を行う必要があり、最大18%2のカンナビノイド損失をもたらす可能性があります。SFEにおける効率を高めるために、最終抽出物14の純度を増加させるために固相抽出などの技術と組み合わされている。しかし、最終製品として高い純度を有するにもかかわらず、中性カンナビノイドのみが得られている。
伝統的に、分析実験室では、カンナビノイドは9:1のメタノール:クロロホルム混合物中で抽出された。しかし、Mudgeら11 は、UAEを採用する場合、単一の溶媒で効果的な抽出を行うことができることを実証した。この研究は、80%メタノールが従来の9:1メタノール:クロロホルム抽出と同じくらい効果的であることを示し、それによって、より環境に優しい溶媒が同等に効果的であることを示している。そのため、UAEは、資本コストの低減、抽出時間の短縮、エネルギー使用量と溶媒量の削減など、いくつかの利点があるため、その潜在的な使用について検討されました。しかし、UAEの場合、極性溶媒を使用すると、クロロフィルおよび他の非カンナビノイドが抽出され、カラー7に問題が生じる可能性がある。その結果、商業規模で酸性カンナビノイドを得る可能性を調べるために、UAEは工業用大麻品種チェリーワインを使用して採用されました。チェリーワインは、C. サティバ と C.インディカのハイブリッドで、妻とシャーロットのチェリーの品種の交差点です。チェリーワイン品種は、低レベルのテトラヒドロカンナビノール酸(THCA)を有する高CBDA生産株(15%〜25%CBD)である。品種は C. indica優勢株で、7〜9週間の開花があります。
最適なUAE抽出プロトコルを確立するために、従来の1因子一因子(OFT)最適化と中央複合計画(CCD)を使用した実験計画法(DoE)アプローチの2つのアプローチが取られました15。DoEでは、サンプル/溶媒比、抽出時間、溶媒濃度を因子としてCBDA/CBD抽出を最適化し、得られたデータを応答曲面法(RSM)によって分析しました。結論として、記載されたプロトコルは、CBDA/CBDの最高量を抽出するための最適な方法を概説している。
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Protocol
1. 植物材料の準備
- チェリーワインの花序は、畑で栽培された植物から、南から北の構成で植えられ、植物は中央に1 m、列は1.2 m離れています(栽培は米国コロラド州ロングモントにあります)。
- 花序を35°Cで48時間空気乾燥させる。花序を177μmに設定した粉砕機を用いて粉砕する。
- 粉砕物を80メッシュ目の篩に通す。得られた粉末を室温で密封された袋に保管し、将来の使用に備えます。
2. 超音波抽出
- 大麻花序粉末0.5gを50mLの円錐形のチューブに秤量する。40mLの溶媒(例えば、脱イオン水中の50%エタノール)を容器に加える。
- 抽出容器を40kHzおよび室温に設定した超音波浴中に置く(超音波処理電力は100Wである)。
- 超音波浴中で抽出を30分間行い、浴の温度を25°Cから30°Cに上昇させた。
- 抽出流体を遠沈管にデカントする。
- 流体を3,000 x g で15°Cで15分間遠心分離する。上澄み液を真空下で8μmのろ紙でろ過する。
3. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)定量分析
- カンナビクロメン(CBC)、CBD、CBDA、カンナビノール(CBN)、テトラヒドロカンナビノール酸(THCA)、Δ 8-THC、およびΔ9-THCの7つのカンナビノイド規格を100%メタノール中の100、50、25、および12.5μg/mLの動作濃度に希釈する。混合し、超音波処理 5 分 超音波浴で 40 kHz と超音波処理パワー 100 W に設定されました。
- 0.45 μm のポリテトラフルオロエチレン (PTFE) シリンジフィルターで標準品をろ過します。サンプル上清を (ステップ 2.5 から) 0.45 μm PTFE シリンジフィルターでろ過します。
- 分析対象のサンプルを1.5 mLバイアルに入れ、HPLCオートサンプラーに入れ、一度に10 μLをロードします。
- 表1に提供された条件およびパラメータに従ってHPLCを実行します。生成された標準曲線から50-200μg/mLのカンナビノイド濃度を導き出す。
- 抽出プロセスで使用した溶媒(40mL)の容量を掛けて、μgのカンナビノイドを得る。カンナビノイドのμgを1000で割ってカンナビノイドのmgに変換します。
- 抽出に使用した植物材料(0.5g)の元の重量で割って、mg/g乾燥重量を求める。
4. 応答曲面手法を用いた最適化
- データ分析ツールを使用して、 表4 に示すように、12の要因点と3つの中心点を持つ15の実験実行からなるモデルを確立します。
- 応答曲面法と中心複合計画を使用して、抽出パラメータ、抽出時間(T)、溶媒濃度(S)、サンプル/溶媒比(R)を最適化します。変数 T、S、R の範囲をそれぞれ 5 ~ 30 分、20% ~ 100%、および 60 ~ 100 (1:X) に設定します。
- 親油性抽出物の総収量および抽出されたCBDおよびCBDAの収量を応答因子(RF)として選択する。
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Representative Results
利用される溶媒は、極性指数の中央(0.460 - ACN)から極性(1.000 - 水)までの範囲である。 表2から、カンナビノイドは疎水性のために水への溶解度が限られているため、水はカンナビノイドに有効な抽出剤を作らなかったことが分かりますが、これは予想外ではありません13。水とは対照的に、他の溶媒はCBDおよびCBDAの抽出値が類似しており、最低極性溶媒アセトニトリル(ACN)は2つのアルコールと比較してより高い抽出量を有する。統計的に低いものの、エタノールはACNとメタノールによって抽出された主要なカンナビノイドCBDAのほぼ93%および99%の増加をそれぞれ抽出することができました。さらに、エタノール抽出物は、Δ9−THCの前駆体であるTHCAの最低レベルを有していた。THCAのレベルの低下は、向精神性Δ9−THCへの変換の可能性を制限するために望まれた、産業用途のための懸念事項16。すべての有機溶媒は一般に安全(GRAS)とみなされているが、エタノールのみが最終生成物2中のその量に制限はない。エタノールとメタノールについて得られた値の差は、それらのいずれかを使用することができることを保証するであろうが、エタノールの毒性が低いため、商業的使用のためのより良い選択となる。同様に、ACNは抽出物中により多くのカンナビノイドを産出したが、CBDA濃度に7%の増加しかない場合、許容される低レベルの残留ACNは、微量を除去するための追加の精製に照らしてその使用を正当化しなかった。
エタノール水溶液がカンナビノイド濃度に与える影響の検討を 表3に示す。溶液濃度が抽出効率に影響を与え得ることが示された17、18。UAEを使用したカンナビノイドの抽出も例外ではありません。最大抽出は、50%エタノール濃度で観察された。これは、CBDAの抽出のための100%エタノールに対する39.7%の増加を表す。さらに、50%エタノールはまた、抽出されたTHCAのレベルを20.3%減少させた。
OFT最適化の結果を確認するために、RSMを用いてDoE(表4)を 表5に示すように調べた。RSM分析(図1)により、30分間の抽出と1:100のサンプル対溶媒比が確認されました。RSM分析の結果、水中の理想的な濃度は53.4%エタノールでした。これは、OFTによって得られた50%を確認する。DoEによる最適エタノール濃度はOFTによる50%よりわずかに高いことが判明したが、調製の利便性およびCBDA/CBD抽出全体のわずかな減少のために、プロトコルでは50%エタノールが使用された。
UAEに対して50%エタノールを用いて得られた結果を、 表6に示すように、揉捻用に50%エタノール(大麻花序粉末0.5gを50mLチューブに秤量し、容器に50mLの50%エタノールを単独で添加)用いた結果と比較した。得られたCBDA抽出量は、揉捻試料と比較してUAE試料において約55%高かった。さらに、抽出されたCBD濃度も2倍になったことに注意することが重要です。
図1.最適化グラフ。 大麻の抽出時間、溶媒濃度、サンプル/溶媒比の応答曲面の最適化グラフ 。 黒い線はプロットされたy値を示し、青い線は最大のy値を示し、その数値も青で言及され、赤い線はy値が最大値のときのx値を示し、これらすべてのパラメータの数値は各グラフの上部に赤で示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1. HPLCカンナビノイド分析に利用されるパラメータ。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 2. 100%溶媒に由来する抽出物の個々のカンナビノイドをHPLC(mg / g乾燥重量)で分析した。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 3. エタノール水溶液に由来する抽出物の個々のカンナビノイドをHPLC(mg / g乾燥重量)によって分析した。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 4. 応答曲面法による中心複合計画に基づく 大麻 のCBDA+ CBDに関する実験データ。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 5. 大麻の抽出条件についてRSMプログラムによって計算された多項式方程式。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 6. 50%エタノール溶媒からの抽出物中の個々のカンナビノイド量(mg / g)のマセレーション抽出(超音波なし)と比較した超音波支援抽出。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
溶媒の極性は、化合物の効果的な抽出において重要な役割を果たします。酸性カンナビノイドは本質的にわずかに極性であるため、主にカルボン酸部分に起因して、メタノールまたはエタノールなどの極性溶媒が最も効果的であると仮定された。ギャレットとハント19は、THCを用いた彼らの研究において、含水エタノールへの溶解度が溶液中のパーセントエタノールおよび溶液のイオン強度に基づいていることを実証した。イオン強度は現在の研究では調べられなかったが、50%エタノールでの抽出効率の向上に重要な役割を果たしたと推測できる。さらに、ギャレットおよびハント19によって実証されるように、pHは水溶液中での溶解度に影響を及ぼす。Metcalf20 はまた、水溶液中のカンナビジオールのpKaが9.13〜9.64であるという他の報告とは対照的に、水溶液中のカンナビジオールのpKaが8.0〜8.5の間であることを示したpHの重要性を強調している。
さらに水溶液の使用を支持するのは、水を用いた無溶媒抽出の実施である。このプロセスは、植物材料21から毛様体を取り除くための大麻の動的浸軟を含む。その後、トリコームおよび抽出剤を乾燥させて、さらなる処理に利用可能なハッシュ製品をもたらすことができる。現在の研究では、UAEの使用は、トリコームの内容物の放出のための手段を提供する。水の代わりに水溶液を利用すると、酸性カンナビノイドのより良い可溶化が可能になります。UAEに関連する追加の利点は、酸性カンナビノイドを元の形態で抽出して保持する能力である22。Lewis-Bakkerら22はまた、UAEがSFEやソックスレットよりもCBDAの抽出に効率的であることを実証した。
Brighenti et al.23 は、非脱炭酸麻において、室温エタノールを用いていくつかの技術によって抽出された個々のカンナビノイドに有意差がなく、抽出溶媒としてわずかに良好に機能することを見出した。その結果、Brighenti23 研究と現在の研究は両方とも選択溶媒としてエタノールを使用しました。この研究におけるエタノールの選択は、採用されると予想される下流処理方法によってさらに支持された。エタノールの選択は、採用される冬化プロセスと互換性があり、フラッシュまたは遠心分配クロマトグラフィー3などの方法を使用した抽出物の濃縮および精製を可能にする。さらに、微量のエタノールは、その使用に関連する許容可能な限界のために懸念されない24。
溶媒濃度は抽出プロセスに影響を与え、プロトコールにおいて最も重要な因子であると決定された。有機溶媒を水で希釈すると、極性が修飾され、時には物理化学的性質が変更された溶媒が生成されます。極性が1.00の水は、温度が上昇するにつれて誘電率が低下し、極性5も低下するというユニークな特徴があります。さらに、温度の上昇は、表面張力および粘度を低下させ、それによってマトリックス17の浸透を改善する。最後に、水温の上昇は、抽出17の分析物拡散および物質移動動力学を改善する。UAEの主力は、圧縮 によって 熱を発生し、音圧変化から解放される超音波です。気泡内で経験される高温は、Rae25によって見られるようにアルコールの存在によって緩和される。気泡中のアルコールの存在は、気体混合物25の熱容量を増加させる。その結果、水の抽出性が向上し、マイクロバブルのキャビテーションも起こり、それによって細胞壁が破壊され、溶媒抽出が容易になる。
文献には、カンナビノイド4、17、26、27、28の抽出のための複数の方法が含まれています。エタノール中でのマセレーション(超音波処理なし)などの従来の方法は、その容易さおよび超臨界流体21などの現代の方法に関連するコストのために、依然として広く採用されている。超音波支援抽出は、収率を高めるように設計された最新の抽出技術で従来の溶媒抽出方法を強化する機会を提供する。超音波支援抽出は、緑色溶媒(すなわち、水、エタノールなど)の使用を可能にし、収率を高め、時間とコストを削減する。他の抽出技術の前処理としてのUAEの使用は、まだ広く未開拓です。しかしながら、ソックスレー抽出28の前にUAEを用いて粗抽出物収率の24%の増加が得られ、それによって、抽出の併用方法の可能性を実証した。現在提案されている方法は、UAEのみを利用した工業用大麻からの酸性カンナビノイドの抽出に焦点を当てていますが、他の代替および従来の抽出方法と組み合わせてさらに利用する可能性は、将来の研究のための興味深い道を提供します。
結論として、この研究から、様々な抽出溶媒および抽出溶媒比がカンナビノイド抽出にどのように影響するかが確立されました。UAEの方法論は、最終製品の許容量に基づいて、業界での潜在的な用途のために選択された溶媒を調べるために採用されました。これらの知見に基づいて、UAEの雇用は、浸軟と比較してカンナビノイドのより高い抽出をもたらした。さらに、DoEおよびRSMを用いて観察されたところ、53.4%エタノールは他のエタノール濃度と比較してカンナビノイドの抽出量が高いことが判明した。したがって、これらの知見は、UAEがカンナビノイド抽出を増加させる手段として有効であることを示唆しているため、産業能力でさらに検討する必要があります。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
Acknowledgments
この研究は、コロラド州立大学プエブロ校の大麻研究所、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国イノベーション財団助成金(2021-DD-UP-0379)、春川市(麻の研究開発と工業化、2020-2021)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | J.K.Baker | 9017-88 | solvent |
| Cannabichromene | Cerilliant | C-143 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiol | Cerilliant | C-045 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiolic acid | Cerilliant | C-144 | Cannabinoids standard |
| Cannabidivarin | Cerilliant | C-140 | Cannabinoids standard |
| Cannabigerol | Cerilliant | C-141 | Cannabinoids standard |
| Cannabinol | Cerilliant | C-046 | Cannabinoids standard |
| Centrifuge | Hanil Scientific Inc | Supra 22K | Centrifuge |
| Cherry Wine hemp | CFH, Ltd. | - | Flower extraction material |
| Distilled water | TEDIA | WS2211-001 | solvent |
| Ethanol | TEDIA | ES1431-001 | solvent |
| Filter paper | Whatman | #2 | Filtering |
| Grinder | Daesung Artlon | DA280-S | Milling |
| HPLC | Shimadzu | LC-10 system | Analysis of Cannabinoid |
| Methanol | TEDIA | MS1922-001 | solvent |
| Minitab 16.2.0 | Minitab Inc. | ||
| Syringe filters | Whatman | 6779-1304 | Filtering |
| Tetrahydrocannabivarin | Cerilliant | T-094 | Cannabinoids standard |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031-1L | HPLC flow solvent |
| Untrasonic bath | Jinwoo | 4020P | Ultrasonic extraction |
| Zorbax Eclipse plus C18 HPLC column | Agilent | 9599990-902 | HPLC column |
| Δ8 - Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-032 | Cannabinoids standard |
| Δ9 - Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-005 | Cannabinoids standard |
| Δ9 - Tetrahydrocannabinolic acid | Cerilliant | T-093 | Cannabinoids standard |
References
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