Summary
В этом исследовании представлен протокол иммуноцитохимии живых 3D-клеток, применяемый к детской диффузной срединной клеточной линии глиомы, полезный для изучения в режиме реального времени экспрессии белков на плазматической мембране во время динамических процессов, таких как инвазия и миграция 3D-клеток.
Abstract
Миграция и инвазия клеток являются специфическими признаками диффузной срединной глиомы (DMG) H3K27M-мутантных опухолей. Мы уже смоделировали эти особенности с помощью трехмерного (3D) клеточного анализа инвазии и миграции. В этом исследовании мы оптимизировали эти 3D-анализы для иммунохимии живых клеток. Реагент для мечения антител был использован для обнаружения в режиме реального времени экспрессии молекулы адгезии CD44 на плазматической мембране мигрирующих и вторгающихся клеток первичной клеточной линии DMG H3K27M, полученной от пациентов. CD44 связан с фенотипом раковых стволовых клеток, миграцией и инвазией опухолевых клеток и участвует в прямом взаимодействии с внеклеточным матриксом центральной нервной системы (ЦНС). Нейросферы (НС) из клеточной линии DMG H3K27M встраивали в матрицу базальной мембраны (BMM) или помещали на тонкий слой покрытия BMM в присутствии антитела к CD44 в сочетании с реагентом для мечения антител (ALR). Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток проводили на приборе для анализа живых клеток для количественного измерения общей экспрессии CD44, в частности, мигрирующих и вторгающихся клеток. Метод также позволяет визуализировать в режиме реального времени прерывистую экспрессию CD44 на плазматической мембране мигрирующих и инвирующих клеток. Кроме того, анализ также позволил по-новому взглянуть на потенциальную роль CD44 в мезенхимальном переходе в амебоидный в клетках DMG H3K27M.
Introduction
Способность опухолевых клеток уклоняться и распространяться через окружающие ткани является отличительной чертой рака1. В частности, подвижность опухолевых клеток является характерной чертой злокачественных опухолей, будь то метастатический тип опухоли, такой как рак молочной железы 2 или колоректальныйрак 3, или местноинвазивный тип, такой как диффузная глиома 4,5.
Визуализация играет центральную роль в исследовании многих аспектов фенотипов опухолевых клеток; Тем не менее, визуализация живых клеток, безусловно, предпочтительна при изучении динамических клеточных процессов, таких как миграция и инвазия, когда происходят изменения в морфологии и межклеточном взаимодействии 6,7 и могут быть легче изучены с течением времени. Для визуализации живых клеток могут использоваться различные системы оптической микроскопии, от фазово-контрастных до конфокальных флуоресцентных микроскопов, и получение изображений выполняется в течение короткого или длительного периода времени на инвертированном микроскопе, оснащенном камерой для контроля температуры иCO2, или в системах анализа изображений с высоким содержанием изображения, которые имеют встроенные камеры, или, в качестве альтернативы, в системах изображений, которые могут находиться в инкубаторе без необходимости тревожить клетки в течение всего времени эксперимента. Выбор используемой системы часто продиктован рядом факторов, таких как необходимое разрешение, продолжительность общего времени сбора данных и временные интервалы, тип используемого сосуда и пропускная способность анализа (однокамерная или многолуночная планшет), чувствительность используемых клеток (драгоценные и/или редкие клетки) и фототоксичность клеток при наличии флуорофоров.
Что касается флуоресцентной визуализации в режиме реального времени, то это может быть достигнуто путем трансдукции клеток для экспрессии флуоресцентных белков либо для стабильной экспрессии, либо в качестве индуцируемой системы8, путем транзиторной клеточной трансфекции или с помощью клеточных красителей, которые в настоящее время доступны для мечения живых клеток7, для отслеживания живых клеток, а также для мечения субклеточных органелл9.
Недавно был разработан полезный подход для иммуноцитохимии живых клеток, при котором антитело, распознающее поверхностный маркер выбора, может быть связано с реагентом для мечения, а при добавлении питательной среды клетки, экспрессирующие специфический маркер, могут быть легко визуализированы в режиме реального времени с помощью визуализации живых клеток. Визуализация и количественная оценка экспрессии маркеров с помощью такой системы могут быть легко достигнуты при выращивании клеток в двумерных (2D) условиях культивирования10.
В этом исследовании мы оптимизировали протоколы для инвазии и миграции клеток диффузной срединной глиомы (DMG) у детей11,12. DMG являются высокоагрессивными опухолями головного мозга, поражающими детей, в подавляющем большинстве случаев связанными с драйверной мутацией K27M в вариантах гистонов H3. ДМГ возникают в стволе головного мозга и срединных отделах центральной нервной системы (ЦНС) и характеризуются высокой инфильтративной природой. Было показано, что эта инвазивная способность, по крайней мере частично, опосредована внутриопухолевой гетерогенностью и ракоподобными особенностями стволовых клеток DMG7.
В качестве примера для наших анализов использовали реагент для мечения антител (ALR) в комбинации с антителами к CD44. CD44 представляет собой трансмембранный гликопротеин и молекулу адгезии, экспрессируемую на стволовых клетках и других типах клеток, связанную с фенотипом раковых стволовых клеток, миграцией и инвазией опухолевых клеток13. Протоколы включают в себя подготовку образца, получение изображения в светлопольном и флуоресцентном режиме, а также анализ на приборе для анализа живых клеток, который позволил количественно измерить в режиме реального времени общую экспрессию CD44 на клеточной мембране DMG во время 3D-инвазии и миграции. Анализы также позволили визуализировать прерывистый флуоресцентный сигнал CD44 на отдельных клетках во время миграции и вторжения. Интересно, что также наблюдался эффект антитела к CD44, который, потенциально действуя как блокирующее антитело, также, по-видимому, уменьшал миграцию и инвазию клеток, а также индуцировал переключение паттерна инвазии с коллективного мезенхимоподобного на более одноклеточный амебоидный фенотип.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол соответствует руководящим принципам комитетов по этике исследований на людях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование было выполнено с использованием Incucyte S3 и/или SX5 Live-Cell Analysis Instrument (упоминается как инструмент для анализа живых клеток).
1. Генерация воспроизводимых размеров опухолевых сфероидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол (раздел 1), описанный Vinci et al. 2015 7,12, использовался, как описано ниже, с некоторыми изменениями:
- Соберите DMG H3K27M-мутантные нейросферы (NS) и центрифугируйте при 170 x g в течение 10 минут (мин) при комнатной температуре (RT).
- Инкубируют NS с 500 мкл раствора аккутазы в течение 3 мин при 37 °C, чтобы разбить их.
- Нейтрализуют раствор аккутазы средой из опухолевых стволовых клеток (TSM)7 и центрифугируют клеточную суспензию при 355 х г в течение 5 мин при РТ.
- Ресуспендируйте гранулы клеток в 1 мл среды TSM, а затем подсчитайте количество клеток с помощью камеры для подсчета клеток.
- Разбавляют клеточную суспензию до получения 2,5-5 x 103клеток/мл и высевают 100 мкл/лунку в 96-луночные планшеты со сверхнизким прикреплением (ULA) с круглым дном (см. Таблицу материалов). Используйте надлежащую плотность клеток для получения индивидуальных НС диаметром ~300 мкм через 4 дня после посева клеток (250-500 клеток/лунку для высокоагрессивных клеток глиомы).
- Визуально подтвердите образование НС с помощью инвертированного микроскопа через 4 суток после посева клеток.
2. Подготовка комплекса ALR/антитела и подготовка к анализу инвазии
ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедуры мечения антител используется протокол10 для иммунохимии живых клеток с некоторыми модификациями, как сообщается ниже. Для анализа инвазии следуют протоколу, описанному ранее Vinci et al. 201512 .
- Учитывайте количество лунок (например, 60 лунок) для анализа и расчета объема, необходимого для каждого реагента. Также включают лунки для отрицательного контроля (пробы с ALR, но без антител).
- Добавьте 100 мкл стерильной воды в ALR для регидратации реагента (конечная концентрация = 0,5 мг/мл). Пипеткой перемешать раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент светочувствителен; Поэтому держитесь в темноте. Аликвотируйте остатки реагента и храните при температуре -80 °C (избегать замораживания и оттаивания). - Смешайте антитело с ALR в среде TSM (или соответствующей питательной среде для выбранной клеточной линии) в многолуночной планшете с круглым дном или в янтарной пробирке и защищайте от света.
- Приготовьте достаточное количество среды для дозирования 25 мкл/лунка при 3-кратной конечной концентрации анализа. Инкубируют при РТ в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется молярное соотношение антител к ALR 1:3 с конечной (1x) концентрацией тестируемого антитела <1,5 мкг/мл. Для экспериментов по этому протоколу используется мышиное антитело к CD44 (начальная концентрация 86 мкг/мл) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл (3-кратная концентрация = 0,3 мкг/мл). Добавляют реагенты в следующем порядке: i) антитела; ii) АЮР; iii) TSM средний. Смешать пипеткой. - Разбавьте реагент для подавления фона (BSR) в среде TSM (или подходящей питательной среде для выбранной клеточной линии) в дозе 1,5 мМ (3x), чтобы получить в конце анализа конечную концентрацию 0,5 мМ.
- Анализ инвазии проводят непосредственно в 96-луночном планшете с круглым дном ULA, где клетки были первоначально засеяны. Перед началом работы проверьте NS визуально с помощью инвертированного микроскопа.
- Осторожно и медленно удалите 75 мкл/лунку среды, избегая касания дна лунки, где находится NS. Проверьте наличие NS визуально.
- Аккуратно добавьте 25 мкл BSR в каждую лунку.
- Аккуратно добавьте 25 мкл комплекса ALR/антитела в каждую лунку. Подождите 2 или 3 минуты, чтобы дать комплексу ALR/антитела смешаться со средой.
- Проверьте визуально с помощью перевернутого микроскопа, чтобы убедиться, что каждый NS расположен по центру на дне лунки. Не допускать образования пузырей. Если какой-либо пузырь присутствует, удалите его с помощью иглы.
- Поставьте тарелку на лед и подождите 5 минут, пока дно тарелки остынет.
- С помощью предварительно охлажденного наконечника p200 дозируйте 75 мкл/лунку матрицы базальной мембраны (BMM), поместив наконечник пипетки на внутреннюю стенку лунки и избегая касания дна лунки. Избегайте образования пузырьков и удаляйте стерильной иглой уже имеющиеся.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что BMM разморозился при температуре 4 °C накануне вечером. - Оставьте тарелку на льду на 5 минут, чтобы BMM смешался со средой. Проверьте визуально с помощью инвертированного микроскопа наличие НС и то, что они расположены по центру скважины. Если нет, центрифугируйте планшет при 4 °C при 180 x g в течение 5 минут.
- Перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток (таблица материалов), помещенный в инкубатор при температуре 37 °C, 5% CO2, влажности 95%.
3. Подготовка комплекса ALR/антитела и подготовка к миграционному анализу
ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедуры мечения антител используется протокол Labeling Dyes10 для иммунохимии живых клеток.
- Учитывайте количество лунок для анализа и рассчитывайте объем, необходимый для каждого реагента. Включите также скважины, необходимые для отрицательного контроля. Перед началом работы проверьте NS визуально с помощью инвертированного микроскопа.
- Используйте плоскодонные 96-луночные планшеты. Выполните процедуру нанесения покрытия, как описано в Vinci et al., 201314. Для данного исследования БММ используется в качестве тонкого покрытия.
- Когда покрытие будет готово, удалите излишки покрытия BMM с помощью наконечника p200, поместив наконечник в край колодца и не касаясь дна. При работе с несколькими лунками используйте многоканальную пипетку.
- Отрежьте наконечник p200, возьмите 50 мкл ячеистой среды + NS из каждой выбранной лунки и перенесите ее в лунку с плоским дном с покрытием. Проверьте наличие и положение НС в каждой скважине визуально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый NS должен быть расположен в центре скважины. Не опирайтесь на наконечник на краю колодца во время перекачки, но опускайте среду по центру лунки, не касаясь дна. Для клеток с высокой миграционной способностью следует учитывать большее количество репликаций, чем стандартные три репликации. Это связано с тем, что, когда NS находится слишком близко к краю скважины, мигрирующие ячейки могут покрыть меньшую площадь скважины. - Регидратируйте ALR, как описано выше (шаги 2.2-2.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент чувствителен к свету. О правильных процедурах обращения см. выше. - Смешайте антитело с ALR в соответствующей среде для выращивания клеток в многолуночном планшете с круглым дном или в янтарной пробирке и защищайте от света. Приготовьте достаточное количество для дозирования 50 мкл/лунка при 3-кратной конечной концентрации анализа. Инкубируют при РТ в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте реагенты в порядке, указанном выше (шаг 2.4). - Выполните ту же процедуру, что описана в шаге 2.5.
- Аккуратно добавьте 50 мкл BSR в каждую лунку.
- Аккуратно добавьте 50 мкл ALR/антитела в каждую лунку. Подождите 2 или 3 минуты, чтобы реагенты смешались и визуально проверили с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что большая часть реплицированных NS находится в центре лунки.
- Избегайте образования пузырьков и удаляйте все имеющиеся с помощью иглы. Осторожно перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток, помещенный в инкубатор при температуре 37 °C, 5% CO2, влажности 95%.
4. Настройка прибора для анализа живых клеток для получения изображений
- Сканируйте планшеты с помощью прибора для анализа живых клеток (технические характеристики см. в таблице материалов) с интервалами сканирования, начиная с нулевой точки времени (t0) анализов инвазии и миграции, настроенных соответственно после шага 2.14. и 3.10. до 96 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что прибор для анализа живых клеток можно утилизировать сразу после начала анализа инвазии и миграции. В зависимости от типа опухоли, клетки могут начать проникать или мигрировать из НС уже в течение 1 ч после проведения анализа. - В программном обеспечении прибора для анализа живых клеток выберите опцию Schedule to Acquire. Нажмите на вкладку + и выберите опцию Сканировать по расписанию.
- В окне программы Create or Restore Vessel нажмите на опцию New.
- Выберите конкретное приложение в приборе для анализа живых клеток для захвата инвазии и миграции. Выберите тип сканирования сфероида , 4-кратный объектив, каналы изображения Phase+Brightfield и Green для анализа инвазии. Выберите тип сканирования «Клонирование с разведением », 4-кратный объектив и фазовый и зеленый для анализа миграции.
- Выберите тип пластины и определите скважины для сканирования, выделив их на карте пластин.
- Настройте частоту сканирования (для экспериментов в этом протоколе частота сканирования составляла 15 минут для вторжения и 30 минут для миграции).
- Нажмите « Добавить в расписание » и запустите сканирование.
5. Настройка прибора для анализа живых клеток для анализа изображений
- Перейдите на вкладку Создать новое определение анализа.
- Выберите приложение Spheroid Invasion или Basic Analyzer для инвазии и миграции соответственно на вкладке .
- Выберите подходящие каналы вторжения и миграции (для Вторжения: Фаза+Светлое поле-Зеленый; для Миграции: Фаза-Зеленый) в канале изображения.
- Выберите несколько репрезентативных изображений из 3-4 лунок для предварительного просмотра и уточнения параметров анализа.
- Для анализа инвазии на вкладке Analysis Definition (Определение анализа) отрегулируйте настройки приложения в каналах Brightfield (Светлое поле) и Green (Зеленое поле) с помощью следующей настройки, чтобы создать точную сегментацию между целым сфероидом и вторгающимися ячейками (см. рис. 5; синяя маска):
Сегментация светлого поля: чувствительность всего сфероида = 50; Чувствительность вторгшейся клетки = 100; Очистка = по умолчанию.
Whole Spheroid Filters: установить все параметры по умолчанию.
Invasding Cells Filters: установить все параметры по умолчанию.
Зеленая сегментация: радиус = 900. - Для анализа миграции настройте параметры приложения в каналах Phase и Green , чтобы создать точную сегментацию между Confluence и Green Cells (см. рис. 5, желтая и розовая маски) со следующей настройкой:
Фаза: установить все параметры по умолчанию.
Зеленая сегментация: радиус = 300; Порог = 1000
Очистка: Заполнение отверстий = 400; Фильтры = по умолчанию.
Whole Well: установить все параметры по умолчанию. - Проверьте правильность настроек анализа для NS, щелкнув случайным образом по нескольким лункам. Сегментация должна очерчивать сфероид. Если нет, отрегулируйте настройку соответствующим образом.
- Выберите скважины и временные точки для анализа.
- Сохраните определение анализа и нажмите кнопку Готово.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол иммуноцитохимии живых 3D-клеток для инвазии и миграции обобщен в виде простого и воспроизводимого рабочего процесса на рисунке 1. Путем посева ячеек DMG в 96-луночные пластины с круглым дном ULA получаются NS воспроизводимого размера, которые используются на показанных этапах. Когда NS достигают идеального размера ~300 мкм (примерно через 4 дня после посева), начинают анализы на инвазию12 и миграцию14 . Добавление комплекса ALR/антитело вместе с супрессором фона в среду индивидуальной НС позволяет отслеживать специфическую экспрессию маркеров на клеточной мембране в реальном времени и в динамике. Экспрессия поверхностных маркеров во время клеточной инвазии и миграции легко отслеживается с интервалами от t = 0 до 96 ч с помощью прибора для анализа живых клеток. Эта система визуализации позволяет проводить полностью автоматизированный анализ изображений.
Первичная клеточная линия, полученная от пациента, QCTB-R059, была использована для иллюстрации свойств инвазии и миграции диссеминации опухолей DMG у детей. QCTB-R059 первоначально был показан как детская клеточная линия таламической глиобластомы (GBM)15. Позже она была обозначена как линияклеток таламической глиомы H3-K27M 16 или диффузная глиома средней линии (DMG) H3-K27M клеточная линия 11, в соответствии с классификацией опухолей головного мозга Всемирной организации здравоохранения 2016 года с введением мутанта DMG H3F3A K27M в качестве новой сущности17.
Исследована молекула адгезии CD44, которая, как известно, участвует в клеточной миграции и инвазии. CD44 экспрессируется клетками QCTB-R059, о чем свидетельствуют конфокальные изображения иммунофлуоресцентного (ИФ) окрашивания при 3D-миграции клеток на (рис. 2) и инвазии в (рис. 3) БММ.
Принимая во внимание, что 3D-инвазия и миграция являются нестатичными процессами, мы решили исследовать экспрессию CD44 с течением времени, когда клетки находятся в движении. Для этого мы использовали иммуноцитохимический анализ живых клеток и адаптировали протокол для 3D-анализов. Используя ALR в комплексе с антителом к CD44, мы можем в режиме реального времени отслеживать экспрессию CD44, когда белок экспрессируется на клеточной мембране, в то время как клетки избегают нейросфер и распространяются в BMM.
Иммуноцитохимия живых 3D-клеток позволяет визуализировать экспрессию CD44 (Дополнительное видео 1 и Дополнительное видео 2). Репрезентативные кадры таймлапса, как для миграции, так и для инвазии (рис. 4A, B), более подробно показывают прерывистую экспрессию CD44 на клеточной мембране. В частности, можно увидеть, что зеленый флуоресцентный сигнал включается (зеленый кружок), а затем выключается (черный круг) на одной и той же клетке, наблюдаемой в течение долгого времени, что позволяет предположить, что экспрессия CD44 включается и выключается во время миграции и вторжения клеток.
Процессы миграции и инвазии наблюдаются в течение 96 ч, и, как показано на рисунке 5, клетки QCTB-R059 демонстрируют высокий уровень CD44, демонстрируя, что в целом экспрессия, наблюдаемая с помощью иммуноцитохимии живых клеток, соответствует экспрессии CD44, полученной с помощью ИФ, показанной на конфокальных изображениях на рисунке 2 и рисунке 3. Интересно, однако, что мы также заметили, что когда антитела к CD44 используются на живых клетках, они влияют на морфологию клеток, индуцируя переход от мезенхимально-подобной к амебоидной инвазии. Он индуцирует снижение инвазивной и миграционной способности этих клеток (дополнительный рисунок 1). Однако мы не можем исключать, что наблюдаемое снижение миграции и инвазии клеток также частично связано с ингибированием клеточной пролиферации.
Автоматизированный анализ изображений, выполненный на приборе для анализа живых клеток, показывает количественную оценку экспрессии CD44 и ее увеличение с течением времени, измеренное по общему зеленому флуоресцентному сигналу, связанному с ALR (рис. 5B, C) как для миграции, так и для инвазии. Количественные оценки достигаются так, как показано на рисунке 5B и рисунке 5C, при этом автоматизированный анализ изображений настроен на сегментирование всей области, покрытой клетками, мигрировавшими зеленым CD44 (рисунок 4B), и всей области распространения, покрытой клетками, пораженными зеленым цветом CD44, но исключая ядро нейросферы (рисунок 5C).
Рисунок 1: Схематический рабочий процесс иммуноцитохимического анализа живых 3D-клеток. Рабочий процесс показывает этапы, связанные с методами 3D-инвазии и миграции в реальном времени, включая репрезентативные изображения педиатрических первичных клеток, полученных от пациентов DMG (QCTB-R059) после инвазии в (верхняя панель; t = 96 ч) и миграции в (нижняя панель; t = 96 ч) BMM. Стержни = 800 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспрессия CD44 при 3D-миграции опухолевых клеток. Репрезентативные иммунофлуоресцентные конфокальные изображения экспрессии CD44 в первичных клетках DMG, полученных от пациента (QCTB-R059) при миграции на BMM. Временная точка = 96 ч (красный: CD44; синий: ядра). Масштабные линейки: 500 мкм (верхняя панель) и 200 мкм (нижняя панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экспрессия CD44 при 3D-инвазии опухолевых клеток. Репрезентативные иммунофлуоресцентные конфокальные изображения экспрессии CD44 в первичных клетках, полученных от пациента DMG (QCTB-R059) при инвазии в ТКМ. Момент времени = 96 ч (красный: CD44; синий: ядра). Масштабные линейки: 250 мкм (верхняя панель) и 100 мкм (нижняя панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Экспрессия CD44 с течением времени. Выбранные кадры интервальной съемки миграции QCTB-R059 (A) и вторжения (B). Изображения были получены с помощью прибора для визуализации живых клеток. Зеленый кружок указывает на экспрессию CD44, черный кружок указывает на отсутствие экспрессии CD44 на клеточной мембране той же клетки, наблюдаемой с течением времени. Масштабные линейки: 200 мкм (A) и 100 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток на CD44: миграция и инвазия. (A) Показаны репрезентативные светлопольные, флуоресцентные (ALR с антителами к CD44) и слияния изображения миграции и инвазии клеточного иммуноцитохимии QCTB-R059 (96 ч). Масштабные линейки: 400 мкм. (B) Количественная оценка общей экспрессии CD44 в зависимости от миграции (B) и инвазии (C), определяемая с помощью анализа изображений ALR-анти-CD44 на приборе для визуализации живых клеток. Кривые показывают среднюю интенсивность экспрессии CD44 с течением времени. Значения являются средними ± SD. Две маленькие фигуры на графиках показывают сегментацию, примененную для анализа миграции (В), где рассматривалась вся область, и вторжения (С), для которой была исключена основная часть НС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Влияние антител к CD44 на морфологию клеток и степень их подвижности. Репрезентативные изображения анализа инвазии и миграции QCTB-R059 показывают эффект антител к CD44, используемых для иммунохимии живых 3D-клеток. Клетки демонстрируют сниженную способность к инвазии и миграции, а также переход от более мезенхимально-подобного к амебоидному паттерну инвазии между отрицательным контролем (без антител к CD44) и CD44 (плюс антитела к CD44). На нижней панели показано увеличение большей мощности, демонстрирующее более четкое представление о морфологическом виде клеток в отсутствие и присутствии антител к CD44 (белые стрелки). Масштабные линейки: верхняя панель 800 мкм и нижняя панель 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео 1: Покадровое видео 3D-миграции клеток QCTB-R059 на BMM в присутствии антител к CD44. Флуоресцентный зеленый сигнал, представляющий экспрессию CD44 на клеточной мембране, визуализируется с течением времени путем конъюгации антител к CD44 с ALR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Дополнительное видео 2: Покадровое видео 3D-клеточной инвазии QCTB-R059 при БКМ в присутствии антител к CD44. Флуоресцентный зеленый сигнал, представляющий экспрессию CD44 на клеточной мембране, визуализируется с течением времени путем конъюгации антител к CD44 с ALR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Иммуноцитохимия живых 3D-клеток, которую мы применили для инвазии и миграции DMG у детей, может быть легко адаптирована и для других высокоинвазивных типов опухолевых клеток, включая клеточные линии рака молочной железы и толстой кишки.
В отличие от ранее выполненных иммуноцитохимических анализов живых 2D-клеток10, при работе в 3D предлагается обращать внимание на некоторые критические этапы. В частности, для анализа инвазии, который мы описываем, рекомендуется добавлять смесь ALR/антител непосредственно в среду с NS в каждой лунке до добавления BMM, а не в BMM или поверх BMM после гелеобразования. Это необходимо для того, чтобы обеспечить хорошее смешивание реагентов со средой и обеспечить более прямой доступ реагентов к поверхности клетки. Кроме того, для обеспечения лучшего качества визуализации, несмотря на то, что протокол включает в себя использование BSR, мы рекомендуем использовать среду, не содержащую фенола, и BMM.
Еще один момент, который следует учитывать при иммунохимии живых клеток, заключается в том, что любое антитело, связывающее белок внеклеточной мембраны на живых клетках, может влиять на функцию белка, изменяя его конформацию или занимая место связывания лиганда или белка на соседней клетке, таким образом, действуя как «блокирующий агент»18,19. Хотя этот подход может быть полезен в качестве терапевтическойстратегии, он не может быть основной целью какой-либо экспериментальной установки. Поэтому, прежде чем проводить большой набор экспериментов, различные антитела, связывающие различные эпитопы одного и того же белка, должны быть протестированы, чтобы также проверить любой потенциальный «блокирующий» эффект. В этом исследовании мы использовали специфическое антитело для отслеживания в режиме реального времени экспрессии CD44 на клеточной мембране высокоагрессивной педиатрической клеточной линии DMG при 3D-инвазии и миграции. Использованный протокол позволил количественно измерить экспрессию CD44 с течением времени на клетках, вторгающихся и мигрирующих. Интересно, что в присутствии антител к CD44 мы также отметили снижение подвижности клеток по сравнению с клетками с ALR, но при отсутствии антитела. Мы не можем исключить и ингибирующее влияние на пролиферацию клеток. В присутствии антител к CD44 также наблюдалось приобретение иного паттерна инвазии с переключением с мезенхимоподобной на амебоидную морфологию клеток20. Эти неожиданные результаты свидетельствуют о том, что блокирование CD44 может способствовать мезенхимальному переходу в амебоидный при ДМГ у детей.
Что касается ограничений этого протокола, принимая во внимание разрешение ПЗС-камеры Incucyte Live-Cell Analysis Instrument и его ограниченные возможности z-стека, представленная нами установка для иммуноцитохимического анализа живых 3D-клеток может быть использована в качестве предварительного подхода в крупномасштабном многолуночном формате, прежде чем переходить к более глубокому анализу с использованием либо более мощных систем флуоресцентной визуализации (например, конфокальные микроскопы и высококомпонентные системы визуализации с конфокальной модальностью, такие как Operetta CLS или Opera Phoneix) или более совершенный подход для изучения в режиме реального времени экспрессии поверхностного белка с помощью репортерного анализа21.
Более широкое применение иммунохимии живых 3D-клеток, представленной здесь в виде монокультуры, может заключаться в 3D-анализе кокультур, созданном для визуализации и анализа прямых межклеточных взаимодействий в режиме реального времени. В этом случае можно использовать два разных ALR с разными флуорофорами для связывания белков, специфически экспрессируемых на клеточной мембране на разных типах клеток (например, опухолевых и иммунных клетках). В этом случае прямой межклеточный контакт может быть проанализирован с помощью визуализации в реальном времени путем колокализации двух различных комплексов ALR/антитело.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют соответствующей аффилированности или финансовой вовлеченности в какую-либо организацию или организацию, имеющую финансовую заинтересованность или финансовый конфликт с предметом или материалами, обсуждаемыми в рукописи.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Сильвию Содду и д-ра Джулию Федеричи (Отдел сотовых сетей и молекулярных терапевтических мишеней, Национальный институт рака IRCCS-Regina Helen, Рим, Италия) за доступ к системе визуализации живых клеток IncuCyte S3 в предварительной настройке протокола визуализации. Кроме того, мы благодарим Бернадетт Коложсвари за технические консультации. Исследование было поддержано грантом Children with Cancer UK (16-234) и Министерством здравоохранения Италии Ricerca Corrente. М. Винчи является стипендиатом программы «Дети с раком» в Великобритании. Р. Ферретти является стипендиатом Фонда Веронези (2018 и 2019). Авторы выражают благодарность Fondazione Heal за поддержку и Фонду детской больницы за финансирование Банка детских опухолей Квинсленда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
