Summary
Denne undersøgelse præsenterer en protokol for live-3D-celleimmunocytokemi anvendt på en pædiatrisk diffus midterliniegliomcellelinje, nyttig til i realtid at studere ekspressionen af proteiner på plasmamembranen under dynamiske processer som 3D-celleinvasion og migration.
Abstract
Cellemigration og invasion er specifikke kendetegn ved diffus midterliniegliom (DMG) H3K27M-mutante tumorer. Vi har allerede modelleret disse funktioner ved hjælp af tredimensionelle (3D) cellebaserede invasions- og migrationsanalyser. I denne undersøgelse har vi optimeret disse 3D-assays til levende celleimmuncytokemi. Et antistofmærkningsreagens blev brugt til i realtid at detektere ekspressionen af adhæsionsmolekylet CD44 på plasmamembranen i migrerende og invaderende celler i en DMG H3K27M primær patientafledt cellelinje. CD44 er forbundet med kræft stamcelle fænotype og tumorcelle migration og invasion og er involveret i de direkte interaktioner med centralnervesystemet (CNS) ekstracellulære matrix. Neurosfærer (NS) fra DMG H3K27M-cellelinjen blev indlejret i basalmembranmatrixen (BMM) eller anbragt på et tyndt belægningslag af BMM i nærvær af et anti-CD44-antistof i forbindelse med antistofmærkningsreagenset (ALR). Live-3D-celle immuncytokemi billedanalysen blev udført på et levende celleanalyseinstrument for kvantitativt at måle den samlede CD44-ekspression, specifikt på de migrerende og invaderende celler. Metoden tillader også visualisering i realtid af den intermitterende ekspression af CD44 på plasmamembranen i migrerende og invaderende celler. Desuden gav analysen også ny indsigt i CD44's potentielle rolle i den mesenkymale til amoeboide overgang i DMG H3K27M-celler.
Introduction
Tumorcellernes evne til at undvige og sprede sig gennem det omgivende væv er et kendetegn ved kræft1. Især tumorcellemotilitet er et karakteristisk træk ved maligne tumorer, uanset om det er en metastatisk tumortype såsom bryst2 eller kolorektal cancer3 eller en lokalt invasiv type såsom diffust gliom 4,5.
Billeddannelse har en central rolle i undersøgelsen af mange aspekter af tumorcellefænotyper; Imidlertid er levende cellebilleddannelse absolut at foretrække, når man studerer dynamiske cellulære processer som migration og invasion, når ændringer i morfologi og celle-celle-interaktion 6,7 forekommer og lettere kan undersøges over tid. Til levende cellebilleddannelse kan forskellige optiske mikroskopisystemer anvendes, fra fasekontrast til konfokale fluorescerende mikroskoper, og billedoptagelse udføres over en kort eller lang periode på et omvendt mikroskop udstyret med et kammer til temperatur og CO2 -kontrol eller i billedanalysesystemer med højt indhold, der har indbyggede kamre, eller alternativt i billedsystemer, der kan sidde i inkubatoren uden behov for at forstyrre cellerne under hele varigheden af eksperimentet. Valget af det anvendte system dikteres ofte af en række faktorer såsom nødvendig opløsning, længden af den samlede anskaffelsestid og tidsintervaller, anvendt beholdertype og analysens gennemstrømning (enkeltkammer eller multibrøndplade), følsomheden af de anvendte celler (ædle og/eller sjældne celler) og cellernes fototoksicitet, hvis fluoroforer er til stede.
Med hensyn til fluorescerende billeddannelse i levende tilstand kan dette opnås ved transducering af celler til ekspression af fluorescerende proteiner enten til stabil ekspression eller som et inducerbart system8, ved forbigående celletransfektion eller ved at bruge cellefarvestoffer, som nu er tilgængelige til mærkning af levende celler7, til sporing af levende celler samt til mærkning af subcellulære organeller9.
En nyttig tilgang er for nylig blevet udviklet til levende celleimmuncytokemi, hvor et antistof, der genkender en overflademarkør efter eget valg, kan bindes til et mærkningsreagens, og ud over kulturmediet kan celler, der udtrykker den specifikke markør, let afbildes i realtid ved levende cellebilleddannelse. Visualisering og kvantificering af markørekspression ved hjælp af et sådant system kan let opnås, når celler dyrkes i todimensionelle (2D) kulturbetingelser10.
I denne undersøgelse optimerede vi protokoller for live-3D-celle immuncytokemi invasion og migration af pædiatrisk diffust midline gliom (DMG) patientafledte celler11,12. DMG er meget aggressive hjernetumorer, der påvirker børn, for langt de fleste forbundet med drivermutationen K27M i histon H3-varianter. DMG opstår i hjernestammen og midterlinjeregionerne i centralnervesystemet (CNS) og er kendetegnet ved en meget infiltrativ karakter. Denne invasive kapacitet har vist sig at være i det mindste delvist medieret af intratumorheterogeniteten og de kræftstammelignende træk ved DMG-celler7.
For at eksemplificere vores analyser blev der anvendt et antistofmærkningsreagens (ALR) i kombination med et antistof mod CD44. CD44 er et transmembranglycoprotein og adhæsionsmolekyle udtrykt på stamceller og andre celletyper, forbundet med kræftstamcellefænotype og tumorcellemigration og invasion13. Protokollerne omfatter prøveforberedelsen, billedoptagelsen i brightfield og fluorescerende tilstand og analysen på et live-celleanalyseinstrument, der gjorde det muligt kvantitativt at måle i realtid det samlede CD44-udtryk på DMG-cellemembranen under 3D-invasion og migration. Assays tillod også muligheden for at visualisere det intermitterende fluorescerende signal fra CD44 på individuelle celler under migrering og invasion. Interessant nok blev der også observeret en effekt af anti-CD44-antistoffet, som potentielt fungerede som et blokerende antistof, også syntes at reducere cellemigration og invasion samt at fremkalde et skift af invasionsmønsteret fra en kollektiv mesenkymallignende til en mere enkeltcelle amoeboidlignende fænotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne fra institutionernes etiske komitéer for humant forskning.
BEMÆRK: Denne undersøgelse blev udført ved hjælp af Incucyte S3 og/eller SX5 Live-Cell Analysis Instrument (refereret som levende celleanalyseinstrument).
1. Generering af tumorsfæroider af reproducerbar størrelse
BEMÆRK: Protokollen (afsnit 1) beskrevet af Vinci et al. 2015 7,12 blev brugt som rapporteret nedenfor med nogle ændringer:
- DMG H3K27M-mutante neurosfærer (NS) opsamles og centrifugeres ved 170 x g i 10 minutter (min) ved stuetemperatur (RT).
- NS inkuberes med 500 μL accutaseopløsning i 3 minutter ved 37 °C for at bryde dem op.
- Neutraliser accutaseopløsningen med tumorstamcellemedium7 og centrifuger cellesuspensionen ved 355 x g i 5 minutter ved RT.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml TSM-medium, og tæl derefter cellerne ved hjælp af et celletællekammer.
- Fortynd cellesuspensionen for at opnå 2,5-5 x 103celler/ml og frø 100 μL/brønd i ultra-lav vedhæftning (ULA) 96-brønds rundbundede plader (se materialetabel). Brug en korrekt celletæthed til at opnå individuel NS med ~ 300 μm diameter, 4 dage efter cellesåning (250-500 celler / brønd for meget aggressive gliomceller).
- Bekræft visuelt NS-dannelsen ved hjælp af et omvendt mikroskop 4 dage efter cellesåning.
2. Forberedelse af ALR/antistofkomplekset og opsætning til invasionsanalysen
BEMÆRK: Til antistofmærkningsproceduren anvendes antistofmærkningsfarveprotokol10 for levende celleimmunocytokemi med nogle ændringer, som rapporteret nedenfor. Til invasionsanalysen følges protokollen, der tidligere er beskrevet af Vinci et al. 201512 .
- Overvej antallet af brønde (f.eks. 60 huller) for at analysere og beregne det nødvendige volumen for hvert reagens. Inkluder også hullerne til negativ kontrol (prøver med ALR, men uden antistof).
- Tilsæt 100 μL sterilt vand til ALR for at rehydrere reagenset (slutkoncentration = 0,5 mg/ml). Pipette for at blande opløsningen.
BEMÆRK: Reagenset er lysfølsomt; Hold derfor i mørket. Det resterende reagens prøves og opbevares ved -80 °C (fryses og optøes ikke). - Bland antistoffet med ALR i TSM-mediet (eller passende cellevækstmedier til den valgte cellelinje) i en rundbundet multibrøndplade eller i et gult rør og beskyt mod lys.
- Der fremstilles tilstrækkelig mængde af substratet til at dispensere 25 μL/brønd ved 3x den endelige analysekoncentration. Inkuber ved RT i 15 min.
BEMÆRK: Et 1:3 molært forhold mellem antistof og ALR anbefales med en endelig (1x) koncentration af testantistoffet <1,5 μg/ml. Til forsøgene i denne protokol anvendes et anti-humant CD44-museantistof (startkoncentration 86 μg/ml) ved en slutkoncentration på 0,1 μg/ml (3x koncentration = 0,3 μg/ml). Reagenserne tilsættes i følgende rækkefølge: i) antistof; ii) ALR iii) TSM-medium. Bland ved pipettering. - Fortynd baggrundssuppressorreagenset (BSR) i TSM-medium (eller passende cellevækstmedier til den valgte cellelinje) ved 1,5 mM (3x) for at opnå en slutkoncentration på 0,5 mM ved afslutningen af assayet.
- Udfør invasionsanalysen direkte i ULA 96-brøndens rundbundede plade, hvor celler oprindeligt blev podet. Kontroller NS visuelt ved hjælp af et omvendt mikroskop, før du starter.
- Fjern forsigtigt og langsomt 75 μL/hul af mediet, og undgå at røre bunden af brønden, hvor NS sidder. Kontroller tilstedeværelsen af NS visuelt.
- Der tilsættes forsigtigt 25 μL BSR til hvert hul.
- Der tilsættes forsigtigt 25 μL ALR/antistofkomplekset til hvert hul. Vent 2 eller 3 minutter for at lade ALR/antistofkomplekset blandes med mediet.
- Kontroller visuelt ved hjælp af et omvendt mikroskop for at sikre, at hver NS er centralt placeret i bunden af brønden. Undgå dannelse af bobler. Hvis der er en boble, skal du fjerne den ved hjælp af en nål.
- Læg pladen på is og vent 5 minutter for at lade bunden af pladen blive kold.
- Med en forkølet p200-spids dispenseres 75 μL/hul basalmembranmatrix (BMM), idet pipettespidsen placeres på brøndens indvendige væg, og bunden af brønden undgås. Undgå dannelse af bobler og fjern med en steril nål de eksisterende.
BEMÆRK: Sørg for at have optøet BMM ved 4 °C fra aftenen før. - Lad pladen stå på is i 5 minutter for at lade BMM blande sig med mediet. Kontroller visuelt ved hjælp af et omvendt mikroskop tilstedeværelsen af NS, og at de er centralt placeret i brønden. Hvis ikke, centrifugeres pladen ved 4 °C ved 180 x g i 5 min.
- Pladen overføres i det levende celleanalyseinstrument (materialetabel), der er anbragt i inkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % fugtighed.
3. Forberedelse af ALR/antistofkomplekset og opsætning til migrationsanalysen
BEMÆRK: Til antistofmærkningsproceduren anvendes mærkningsfarveprotokollen10 for levende celleimmunocytokemi.
- Overvej antallet af brønde til analyse og beregning af det nødvendige volumen for hvert reagens. Medtag også de brønde, der er nødvendige for de negative kontroller. Kontroller NS visuelt ved hjælp af et omvendt mikroskop, før du starter.
- Brug fladbundede plader med 96 brønde. Udfør belægningsproceduren som beskrevet af Vinci et al., 201314. Til denne undersøgelse anvendes BMM som en tynd belægning.
- Når belægningen er klar, fjernes overskydende BMM-belægning med en p200-spids, der placerer spidsen i kanten af brønden og undgår at røre bunden. Hvis du arbejder med flere huller, skal du bruge en multikanalpipette.
- Skær en p200-spids, tag 50 μL af cellemediet + NS fra hvert valgt hul, og overfør det til en belagt fladbundet brønd. Kontroller tilstedeværelsen og placeringen af NS i hver brønd visuelt.
BEMÆRK: Hver NS skal være centralt placeret i brønden. Undgå at læne dig på spidsen på kanten af brønden under overførslen, men slip mediet centralt i brønden uden at røre bunden. For stærkt migrerende celler skal der overvejes et højere antal replikater end de tre standardreplikater. Dette skyldes, at når NS sidder for tæt på kanten af brønden, kan de migrerende celler dække et mindre område af brønden. - ALR rehydreres som beskrevet ovenfor (trin 2.2-2.3).
BEMÆRK: Reagens er lysfølsomt. Se ovenfor for gode håndteringsprocedurer. - Antistoffet blandes med ALR i det relevante komplette cellevækstmedie i en rundbundet multibrøndplade eller i et gult rør og beskytter mod lys. Der fremstilles tilstrækkelig mængde til at dispensere 50 μL/brønd ved 3x den endelige analysekoncentration. Inkuber ved RT i 15 min.
BEMÆRK: Tilføj reagenserne i den rækkefølge, der er angivet ovenfor (trin 2.4). - Følg samme procedure som rapporteret i trin 2.5.
- Der tilsættes forsigtigt 50 μL BSR til hvert hul.
- Der tilsættes forsigtigt 50 μL ALR/antistof til hvert hul. Vent 2 eller 3 minutter for at lade reagenserne blande og kontroller visuelt ved hjælp af et omvendt mikroskop for at sikre, at det meste af det replikate NS er centralt placeret i brønden.
- Undgå dannelse af bobler og fjern eventuelle eksisterende ved hjælp af en nål. Pladen overføres forsigtigt i det levende celleanalyseinstrument, der er anbragt i inkubatoren, ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % fugtighed.
4. Live-celle analyse instrument indstilling til billedoptagelse
- Scan pladerne ved hjælp af live-celle-analyseinstrumentet (for specifikationer, se materialetabel) med scanningsintervaller startende fra tidspunkt nul (t0) for invasions- og migrationsassays oprettet henholdsvis efter trin 2.14. og 3.10. op til 96 timer.
BEMÆRK: Sørg for at kunne bortskaffe live-celleanalyseinstrumentet umiddelbart efter starten af invasionen og migrationsanalysen. Afhængigt af tumortypen kan celler begynde at invadere eller migrere fra NS allerede inden for 1 time fra analyseopsætningen. - På live-cell-analyseinstrumentsoftwaren skal du vælge indstillingen Planlæg at anskaffe. Klik på fanen + , og vælg indstillingen Scan efter tidsplan.
- I softwarevinduet Opret eller gendan fartøj skal du klikke på indstillingen Ny.
- Vælg den specifikke applikation i live-cell-analyseinstrumentet til invasion og migrationserhvervelse. Vælg sfæroidscanningstype , 4x målsætning, fase + Brightfield og grønne billedkanaler til invasionsanalysen. Vælg Fortyndingskloningsscanningstype , 4x målsætning og Fase og grøn for migreringsanalysen.
- Vælg pladetypen, og definer de brønde, der skal scannes, ved at fremhæve dem på pladekortet.
- Indstil scanningsfrekvensen (for eksperimenterne i denne protokol var scanningsfrekvensen 15 min for invasion og 30 min for migration).
- Klik på Tilføj til tidsplan og start scanningen.
5. Indstilling af live-celleanalyseinstrument til billedanalyse
- Vælg fanen Opret ny analysedefinition.
- Vælg Spheroid Invasion eller Basic Analyzer-applikation til henholdsvis invasion og migration på fanen.
- Vælg de relevante invasions- og overførselskanaler (for Invasion: Phase+Brightfield-Green; for Migration: Phase-Green) i billedkanalen.
- Vælg få repræsentative billeder fra 3-4 brønde til forhåndsvisning og finjustering af analyseindstillingen.
- For invasionsanalysen skal du under fanen Analysedefinition justere programindstillingerne i Brightfield - og Green-kanalerne med følgende indstilling for at generere en præcis segmentering mellem hele sfæroid- og invaderende celler (se figur 5; blå maske):
Brightfield-segmentering: Hele sfærisk følsomhed = 50; invaderende cellefølsomhed = 100; Ryd op = standard.
Hele sfæroidfiltre: Indstil alle parametre som standard.
Invaderende cellefiltre: Indstil alle parametre som standard.
Grøn segmentering: radius = 900. - Til migreringsanalyse skal du justere programindstillingerne i kanalerne Fase og Grøn for at generere en præcis segmentering mellem Confluence og Green Cells (se figur 5, gule og lyserøde masker) med følgende indstilling:
Fase: Indstil alle parametre som standard.
Grøn segmentering: radius = 300; Tærskel = 1000
Oprydning: hulfyldning = 400; Filtre = standard.
Hele brønden: Indstil alle parametre som standard. - Kontroller, at analyseindstillingerne er korrekte for NS ved at klikke tilfældigt på flere huller. Segmenteringen skal skitsere sfæroiden. Hvis ikke, skal du justere indstillingen i overensstemmelse hermed.
- Vælg de brønde og tidspunkter, der skal analyseres.
- Gem analysedefinitionen , og klik på Udfør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-3D-celle immuncytokemi protokol for invasion og migration er opsummeret i en ligetil og reproducerbar arbejdsgang i figur 1. Ved såning af DMG-cellerne i ULA 96-brønds rundbundsplader opnås og anvendes NS i reproducerbar størrelse i de viste trin. Når NS har nået den ideelle størrelse på ~ 300 μm (ca. 4 dage efter såning), indledes invasionen12 og migration14 assays. Tilføjelsen af ALR / antistofkomplekset sammen med baggrundssuppressoren i mediet for den enkelte NS, tillader at følge det specifikke markørudtryk på cellemembranen, i levende billeddannelse og over tid. Overflademarkørekspressionen under celleinvasionen og migrationen overvåges let med intervaller fra t = 0 op til 96 timer ved hjælp af live-celleanalyseinstrumentet. Dette billedbehandlingssystem muliggør en fuldautomatisk billedanalyse.
En primær patientafledt cellelinje, QCTB-R059, blev brugt til at eksemplificere invasionen og migrationsegenskaberne ved pædiatrisk DMG-tumorspredning. QCTB-R059 blev oprindeligt indikeret som et pædiatrisk thalamus glioblastom (GBM) cellelinje15. Senere er det blevet angivet som H3-K27M thalamus gliomcellelinje 16 eller diffust midterliniegliom (DMG) H3-K27M cellelinje11, efter Verdenssundhedsorganisationens klassificering af hjernetumorer i 2016 med introduktionen af DMG H3F3A K27M-mutant som en ny enhed17.
CD44, et adhæsionsmolekyle, der vides at være involveret i cellemigration og invasion, blev undersøgt. CD44 udtrykkes af QCTB-R059-celler som demonstreret ved konfokale billeder af immunofluorescerende (IF) farvning ved 3D-cellemigration på (figur 2) og invasion i (figur 3) BMM.
Under hensyntagen til, at 3D-invasion og migration begge er ikke-statiske processer, tænkte vi at undersøge ekspressionen af CD44 over tid, når celler er i bevægelse. For at gøre dette anvendte vi live-cell immunocytochemistry assay og tilpassede protokollen til 3D-assays. Ved at bruge ALR i kompleks med et anti-CD44-antistof er vi i stand til i realtid at følge ekspressionen af CD44, når proteinet udtrykkes på cellemembranen, mens cellerne undgår neurosfærerne og spredes på og ind i BMM.
Live-3D-celleimmuncytokemien tillader visualisering af CD44-ekspression (supplerende video 1 og supplerende video 2). De repræsentative rammer for time-lapse, for både migration og invasion (figur 4A, B), viser mere detaljeret den intermitterende ekspression af CD44 på cellemembranen. Især er det muligt at se det grønne fluorescerende signal være tændt (grøn cirkel) og derefter slukket (sort cirkel) på den samme celle observeret over tid, hvilket tyder på, at ekspressionen af CD44 er tændt og slukket, mens celler migrerer og invaderer.
Migrations- og invasionsprocesserne følges over 96 timer, og som vist i figur 5 viser QCTB-R059-celler et højt niveau af CD44, hvilket viser, at den ekspression, der observeres med levende celleimmuncytokemi, samlet set er i overensstemmelse med ekspressionen af CD44 opnået ved IF vist på konfokale billeder i figur 2 og figur 3. Interessant nok bemærkede vi dog også, at når anti-CD44-antistoffet anvendes på levende celler, påvirker det cellemorfologi og inducerer en overgang fra mesenkymallignende til amoeboidlignende invasion. Det inducerer en reduktion af disse cellers invasive og migrerende kapacitet (supplerende figur 1). Vi kan dog ikke udelukke, at den observerede reduktion i cellemigration og invasion også delvis skyldes en hæmning af celleproliferation.
Den automatiserede billedanalyse udført på live-celleanalyseinstrumentet viser kvantificeringen af CD44-ekspression og dens stigning over tid målt ved det samlede grønne fluorescerende signal forbundet med ALR (figur 5B,C) for både migration og invasion. Kvantificeringerne opnås som eksemplificeret i figur 5B og figur 5C, idet den automatiserede billedanalyse er indstillet til at segmentere hele det område, der er dækket af CD44-grønmigrerede celler (figur 4B) og alt det spredte område, der er dækket af CD44-grøninvaderede celler, men eksklusive neurosfærekernen (figur 5C).
Figur 1: Skematisk arbejdsgang af Live-3D-celle immuncytokemiske assays. Arbejdsprocessen viser de trin, der er involveret i 3D-invasionen og migrationsbilleddannelsesmetoderne, herunder repræsentative billeder af pædiatriske primære DMG-patientafledte celler (QCTB-R059) efter invasion i (øverste panel; t = 96 h) og migration til (nederste panel; t = 96 h) BMM. Stænger = 800 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: CD44-ekspression i 3D-tumorcellemigration. Repræsentative immunofluorescerende konfokale billeder af CD44-ekspression i primære DMG-patientafledte celler (QCTB-R059) ved migration til BMM. Tidspunkt = 96 timer (rød:CD44; blå: kerner). Skalastænger: 500 μm (øverste panel) og 200 μm (nederste panel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: CD44-ekspression i 3D-tumorcelleinvasion. Repræsentative immunofluorescerende konfokale billeder af CD44-ekspression i primære DMG-patientafledte celler (QCTB-R059) ved invasion i BMM. Tidspunkt = 96 timer (rød:CD44; blå: kerner). Skalastænger: 250 μm (øverste panel) og 100 μm (nederste panel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: CD44-udtryk over tid. Udvalgte rammer for QCTB-R059 migrering (A) og invasion (B) time-lapse. Billeder blev opnået på live-celle billeddannelsesinstrumentet. Grøn cirkel angiver ekspressionen af CD44, sort cirkel angiver ingen CD44-ekspression på cellemembranen i den samme celle observeret over tid. Skalastænger: 200 μm (A) og 100 μm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Live-3D-celle immuncytokemiske assays for CD44: migration og invasion. (A) Repræsentative brightfield, fluorescerende (ALR med anti-CD44 antistof) og fusionere billeder af QCTB-R059 celle immuncytokemi migration, og invasion (96 timer) er vist. Skalastænger: 400 μm. (B) Kvantificering af CD44's samlede ekspression i forhold til migration (B) og invasion (C), bestemt ved ALR-anti-CD44-billedanalyse på live-cellebilleddannelsesinstrumentet. Kurverne viser den grønne middelintensitet af CD44-ekspression over tid. Værdier er gennemsnitlige ± SD. De to små figurer i observationsområderne viser den segmentering, der blev anvendt til analysen af migrationen (B), hvor hele området blev overvejet, og invasionen (C), for hvilken NS-kernedelen blev udelukket. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Effekt af anti-CD44 antistof på cellemorfologi og grad af cellemotilitet. Repræsentative billeder af QCTB-R059 invasion og migrationsanalyse viser effekten af anti-CD44-antistof anvendt til live-3D-celleimmuncytokemi. Celler viser en reduceret invasions- og migrationskapacitet samt overgangen fra et mere mesenkymallignende til amøbelignende invasionsmønster mellem den negative kontrol (uden anti-CD44-antistof) og CD44 (plus anti-CD44-antistof). Nederste panel viser højere effektforstørrelse og viser et mere klart billede af cellernes morfologiske udseende i fravær og tilstedeværelsen af anti-CD44-antistoffet (hvide pile). Skalastænger: 800 μm øverste panel og 100 μm nedre panel. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video 1: Time-lapse video af QCTB-R059 3D-cellemigration på BMM i nærvær af anti-CD44-antistof. Fluorescerende grønt signal, der repræsenterer ekspressionen af CD44 på cellemembranen, visualiseres over tid ved konjugering af anti-CD44-antistoffet med ALR. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video 2: Time-lapse video af QCTB-R059 3D celleinvasion i BMM i nærvær af anti-CD44 antistof. Fluorescerende grønt signal, der repræsenterer ekspressionen af CD44 på cellemembranen, visualiseres over tid ved konjugering af anti-CD44-antistoffet med ALR. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den levende 3D-celle immuncytokemi, vi har vedtaget her til pædiatrisk DMG invasion og migration, kunne let tilpasses også til andre meget invasive tumorcelletyper, herunder bryst- og tyktarmskræftcellelinjer.
Forskellig fra tidligere udførte live-2D-celle immunocytokemiske assays10, når man arbejder i 3D, foreslås det at være opmærksom på nogle kritiske trin. Især til den invasionsanalyse, vi beskriver, anbefales det at tilføje ALR / antistofblandingen direkte til mediet med NS i hvert hul inden tilsætning af BMM og ikke i BMM eller oven på BMM, når den er geleret. Dette er for at tillade en god blanding af reagenserne med mediet og sikre mere direkte adgang for reagenserne til celleoverfladen. For at sikre en bedre kvalitet af billeddannelsen, selvom protokollen inkluderer brugen af BSR, anbefaler vi desuden at bruge phenol rødfrit medium og BMM.
Et andet punkt at overveje for levende celleimmuncytokemi er, at ethvert antistof, der binder et ekstracellulært membranprotein på levende celler, kan påvirke proteinfunktionen ved at ændre dets konformation eller ved at optage bindingsstedet for en ligand eller et protein på en tilstødende celle og derfor fungere som et "blokeringsmiddel"18,19. Selvom denne tilgang kan være nyttig som en terapeutisk strategi19, er det muligvis ikke det primære mål for nogen eksperimentel opsætning. Før der udføres et stort sæt eksperimenter, bør forskellige antistoffer, der binder forskellige epitoper af det samme protein, derfor testes for også at verificere enhver potentiel "blokerende" effekt. I denne undersøgelse brugte vi et specifikt antistof til i realtid at følge ekspressionen af CD44 på cellemembranen i en meget aggressiv pædiatrisk DMG-cellelinje i 3D-invasion og migration. Den anvendte protokol tillod os kvantitativt at måle ekspressionen af CD44 over tid på celler, der invaderer og migrerer. Interessant nok bemærkede vi i nærvær af anti-CD44-antistoffet også en reduktion i cellemotilitet sammenlignet med cellerne med ALR, men i fravær af antistoffet. Vi kan dog ikke udelukke en hæmmende effekt på celleproliferation. Erhvervelsen af et andet invasionsmønster med et skift fra mesenkymallignende til amoeboidlignende cellemorfologi20 blev også observeret i nærvær af anti-CD44-antistoffer. Disse uventede resultater tyder på, at blokering af CD44 kan bidrage til mesenkymal til amoeboid overgang i pædiatrisk DMG.
Med hensyn til begrænsningerne i denne protokol, under hensyntagen til opløsningen af CCD-kameraet i Incucyte Live-Cell Analysis Instrument og dets begrænsede z-stack-kapacitet, kan den opsætning, vi præsenterer for live-3D-celle immuncytokemiske assays, bruges som en foreløbig tilgang i et storstilet multi-well-format, inden vi går videre til en mere dybtgående analyse ved hjælp af enten mere kraftfulde fluorescerende billeddannelsessystemer (f.eks. konfokale mikroskoper og billeddannelsessystem med højt indhold med en konfokal modalitet såsom Operetta CLS eller Opera Phoneix) eller en mere raffineret tilgang til at studere i realtid ekspressionen af et overfladeprotein via et reporterassay21.
En bredere anvendelse af live-3d-celle immuncytokemi præsenteret her som en monokultur, kunne være et 3D-co-kulturassay etableret for at afbilde og analysere i realtid direkte celle-celle-interaktioner. I dette tilfælde kan to forskellige ALR anvendes med forskellige fluoroforer til at binde proteiner, der specifikt udtrykkes på cellemembranen på forskellige celletyper (f.eks. tumorcelle- og immunceller). I dette tilfælde kan direkte celle-celle-kontakt analyseres med levende billeddannelse ved co-lokalisering af de to forskellige ALR / antistofkomplekser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante tilknytninger eller økonomisk engagement med nogen organisation eller enhed med en økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med emnet eller materialerne, der diskuteres i manuskriptet.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Silvia Soddu og Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rom, Italien) for adgang til IncuCyte S3 Live Cell Imaging System i den foreløbige opsætning af billeddannelsesprotokollen. Desuden takker vi Bernadett Kolozsvari for den tekniske rådgivning. Undersøgelsen blev støttet af Children with Cancer UK-tilskuddet (16-234) og det italienske sundhedsministerium Ricerca Corrente. M Vinci er en Børn med Cancer UK Fellow. R Ferretti er modtager af Fondazione Veronesi Fellowship (2018 og 2019). Forfatterne anerkender Fondazione Heal for deres støtte og Children's Hospital Foundation for finansiering af Queensland Children's Tumor Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
