Summary
Il presente protocollo descrive un sistema di "movimento passivo della testa" progettato su misura, che riproduce le accelerazioni meccaniche alle teste dei roditori generate durante il loro tapis roulant che corre a velocità moderate. Permette di sezionare fattori/elementi meccanici dagli effetti benefici dell'esercizio fisico.
Abstract
L'esercizio fisico è ampiamente riconosciuto come efficace per varie malattie e disturbi fisici, compresi quelli legati alla disfunzione cerebrale. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base degli effetti benefici dell'esercizio fisico sono poco conosciuti. Molti allenamenti fisici, in particolare quelli classificati come esercizi aerobici come jogging e camminata, producono forze impulsive al momento del contatto del piede con il terreno. Pertanto, è stato ipotizzato che l'impatto meccanico potrebbe essere implicato nel modo in cui l'esercizio contribuisce all'omeostasi dell'organismo. Per testare questa ipotesi sul cervello, è stato sviluppato un sistema di "movimento passivo della testa" progettato su misura (di seguito denominato PHM) in grado di generare accelerazioni verticali con grandezze e modalità controllate e definite e riprodurre la stimolazione meccanica che potrebbe essere applicata alle teste dei roditori durante la corsa del tapis roulant a velocità moderate, un tipico intervento per testare gli effetti dell'esercizio fisico negli animali. Utilizzando questo sistema, è stato dimostrato che PHM ricapitola la segnalazione del recettore della serotonina (5-idrossitriptamina, di seguito denominata 5-HT) sottotipo 2A (5-HT2A) nei neuroni della corteccia prefrontale (PFC) dei topi. Questo lavoro fornisce protocolli dettagliati per l'applicazione del PHM e la misurazione delle conseguenti accelerazioni meccaniche alle teste dei roditori.
Introduction
L'esercizio fisico è utile per trattare o prevenire diversi disturbi fisici, tra cui malattie legate allo stile di vita come il diabete mellito e l'ipertensione essenziale1. In relazione a questo, sono state accumulate anche prove per quanto riguarda gli effetti positivi dell'esercizio sulle funzioni cerebrali2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dei benefici dell'esercizio fisico per il cervello rimangono principalmente non chiariti. La maggior parte delle attività fisiche e degli allenamenti generano accelerazioni meccaniche alla testa, almeno in una certa misura. Mentre vari fenomeni fisiologici sono regolati meccanicamente, l'importanza del carico meccanico è stata, nella maggior parte dei casi, documentata nel sistema muscolo-scheletrico 3,4,5. Sebbene il cervello sia anche soggetto a forze meccaniche durante le attività fisiche, in particolare i cosiddetti esercizi di impatto, la regolazione meccanica della funzione cerebrale fisiologica è stata raramente studiata. Poiché la generazione di accelerazioni meccaniche alla testa è relativamente comune agli allenamenti fisici, è stato ipotizzato che la regolazione meccanica potrebbe essere implicata nei benefici dell'esercizio fisico per le funzioni cerebrali.
La segnalazione del recettore 5-HT2A è essenziale nella regolazione delle emozioni e dei comportamenti tra i vari segnali biochimici che funzionano nel sistema nervoso. È coinvolto in molteplici malattie psichiatriche 6,7,8, su cui l'esercizio fisico ha dimostrato di essere terapeuticamente efficace. Il recettore 5-HT2A è un sottotipo del recettore 5-HT2 che appartiene alla famiglia della serotonina ed è anche un membro della famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR), la cui segnalazione è modulata dalla sua internalizzazione, ligando-dipendente o -indipendente9. La contrazione della testa è un comportamento caratteristico dei roditori, la cui quantità (frequenza) rappresenta esplicitamente l'intensità della segnalazione del recettore 5-HT2A nei loro neuroni della corteccia prefrontale (PFC)10,11. Sfruttando la stretta specificità di questa risposta allucinogena alla 5-HT somministrata (risposta a contrazione della testa, di seguito denominata HTR; vedi filmato supplementare 1), è stata testata l'ipotesi sopra menzionata sulle implicazioni meccaniche negli effetti dell'esercizio sulle funzioni cerebrali. Pertanto, abbiamo analizzato e confrontato l'HTR di topi sottoposti a esercizio forzato (corsa su tapis roulant) o intervento meccanico che imita l'esercizio (PHM).
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro nazionale di riabilitazione per persone con disabilità. I ratti maschi di Sprague-Dawley di 8-9 settimane sono stati utilizzati per misurare le accelerazioni alla testa durante la corsa sul tapis roulant e il PHM. Topi maschi C57BL/6 di 9-10 settimane sono stati utilizzati per test comportamentali e analisi istologiche del PFC. Gli animali sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Misurazione delle grandezze delle accelerazioni lungo gli assi x, y e z durante la corsa sul tapis roulant
- Anestetizzare il ratto con inalazione di isoflurano all'1,5%.
NOTA: I ratti sono stati utilizzati dopo almeno 1 settimana di acclimatazione all'ambiente di laboratorio. Assicurarsi che il ratto non risponda a un pizzico della punta posteriore. - Fissare l'accelerometro (vedi Tabella dei materiali) sulla parte superiore della testa del topo usando del nastro chirurgico.
- Dopo il completo recupero dall'anestesia, posizionare il ratto nella macchina per tapis roulant (vedere la tabella dei materiali) e regolare il tapis roulant a una velocità moderata (20 m/min)12 (Figura 1A).
NOTA: Ci sono voluti almeno 20 minuti per confermare il pieno recupero del ratto dall'anestesia dopo la cessazione dell'inalazione di isoflurano e iniziare l'esperimento sul tapis roulant. Assicurati che il ratto sia sensibile a un pizzico del dito posteriore, essendo in grado di camminare o correre senza apparente barcollare. - Misurare l'entità delle accelerazioni verticali durante la corsa sul tapis roulant utilizzando il software applicativo seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Estrarre 10 onde seriali e calcolare singolarmente le accelerazioni medie lungo gli assi 3-dimensionali (assi x, y e z, Figura 1B). Le magnitudini di picco sono state quantificate definendo le onde sincronizzate a gradini (frequenza ~ 2 Hz) come accelerazioni indotte dalla corsa sul tapis roulant (Figura 1C). I ratti sono stati utilizzati per questo studio poiché le loro dimensioni corporee più grandi erano adatte per misurare in modo affidabile l'accelerazione verticale alla testa, cosa che non era possibile nei topi. Tuttavia, i topi sono stati utilizzati per ulteriori studi a causa della facilità e dell'affidabilità per quanto riguarda l'analisi quantitativa della risposta testa-contrazione.
2. Regolazione del sistema PHM e applicazione del PHM ai topi
- Preimpostare l'ampiezza dell'oscillazione della piattaforma e la velocità di rotazione della camma a forma di elica nel sistema PHM (Figura 1D) in modo che l'entità e la frequenza dell'accelerazione verticale corrispondano ai valori ottenuti al punto 1.4.
NOTA: Il sistema PHM comprende una struttura metallica e una piattaforma in legno. La velocità del motore può essere modificata e controllata regolando la manopola collegata al driver integrato (vedere Tabella dei materiali). La scala del quadrante di 600 corrisponde a 2 Hz, Figura 1E. La camma a forma di elica ha quattro pale con altezze di passo di 5 mm (Figura 1F). - Anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano all'1,2%.
NOTA: I topi sono stati utilizzati dopo almeno 1 settimana di acclimatazione agli ambienti di laboratorio. Assicurarsi che il mouse non risponda a un pizzicamento della punta dell'arto posteriore. - Posizionare il mouse in posizione prona con la testa e il resto del corpo situati rispettivamente sulle piattaforme oscillabili e statiche.
NOTA: Tenere il topo anestetizzato (isoflurano all'1,2%). - Accendere il motore per far oscillare la piattaforma verticalmente e applicare PHM al mouse.
NOTA: la velocità del motore è stata regolata per oscillare la piattaforma a 2 Hz (vedere il punto 2.1). Anestetizzare e posizionare il mouse di controllo sulla piattaforma PHM allo stesso modo, ma lasciare il motore spento.
3. Esecuzione del mouse sul tapis roulant
- Posizionare il mouse sul tapis roulant e regolare il tapis roulant a una velocità moderata (10 m/min)13.
4. Quantificazione della risposta testa-contrazione del topo (HTR)
- Impostare la videocamera (frame rate: 24 fps) per registrare l'intero spazio nella custodia in plastica trasparente.
NOTA: La gabbia di plastica è stata utilizzata per mantenere il mouse nel campo della registrazione video. - Somministrare per via intraperitoneale 5-idrossitriptofano (5-HTP) (100 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali), il precursore della 5-HT, ad un topo.
- Posizionare il mouse nella gabbia trasparente e iniziare a registrare per 30 minuti.
- Rivedi il video registrato (velocità 1/2x o 1/3x), contando manualmente le contrazioni della testa.
NOTA: Gli analisti non sono stati ciechi alla procedura sperimentale. Il caratteristico movimento rapido "simile a un tic" del topo (vedi Filmato supplementare 1) è stato conteggiato come contrazioni della testa, che raramente si verificano in un normale ambiente riproduttivo.
5. Analisi immunoistochimica della PFC di topo
- Una volta completati i test HTR, anestetizzare il topo somministrando la miscela di midazolam (4,0 mg / kg), butorfanolo (4,0 mg / kg) e medetomidina (0,3 mg / kg), perfondere con paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS e quindi asportare il cervello seguendo i rapporti precedentemente pubblicati14,15.
- Post-fissare il cervello in 4% PFA in PBS per ulteriori 24 ore a 4 °C, e conservare in 30% di saccarosio / PBS fino a quando non affondano. Congelare il composto a temperatura di taglio ottimale fissa (composto OCT, vedere Tabella dei materiali).
- Recuperare le criosezioni del cervello del topo dalla scatola di scorrimento (vedere Tabella dei materiali). Lasciare i vetrini su salviette pulite a temperatura ambiente fino a quando i campioni non si disidratano completamente.
NOTA: Sezioni sagittali spesse venti micrometri (laterali +0,5-1,5 mm) sono state preparate da campioni congelati incorporati in un composto OCT utilizzando un criostato (vedi Tabella dei materiali). - Utilizzare una penna bloccante liquido (vedere Tabella dei materiali) per disegnare un cerchio attorno al tessuto criosezionato sul vetrino per limitare l'area di diffusione della soluzione (0,1% Tween-20 in soluzione salina tamponata Tris (TBS-T).
- Posizionare salviette inumidite sul fondo di un vassoio che contiene le diapositive per creare un ambiente umido.
- Dopo permeabilizzazione con TBS-T, bloccare con siero d'asino al 4% (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 1 ora.
- Risciacquare i vetrini una volta per 5 minuti di immersione in TBS-T.
- Applicare 100 μL di anticorpo primario opportunamente diluito e miscela DAPI (vedere Tabella dei materiali) su ciascun vetrino, coprire il vassoio per evitare di asciugare il campione e incubare per una notte a temperatura ambiente.
- Risciacquare con TBS-T tre volte (5 minuti di incubazione ciascuna).
- Applicare 100 μL di anticorpo secondario fluorescente abbinato alla specie opportunamente diluito (coniugato con Alexa Fluor 488, 568 o 645) (vedere Tabella dei materiali) su ciascun vetrino e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Risciacquare con TBS-T tre volte (5 minuti di incubazione ciascuna).
- Montare le guide con il supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali). Coprire le diapositive con dei vetrini.
- Visualizza il campione al microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
L'entità di picco delle accelerazioni verticali alla testa dei ratti durante il loro tapis roulant che correva a velocità moderata (20 m / min) era di circa 1,0 × g (Figura 1C). Il sistema PHM (Figura 1D) è stato impostato per generare picchi di accelerazione verticale di 1,0 × g alle teste dei roditori.
L'applicazione di PHM (2 Hz, 30 min/die per 7 giorni) ai topi ha attenuato significativamente il loro HTR rispetto ai topi di controllo (anestetizzati quotidianamente senza PHM per 30 min/die per 7 giorni) (Figura 2). Ciò rappresenta un effetto soppressivo della PHM sulla segnalazione del recettore 5-HT2A nei neuroni PFC.
Il tapis roulant in esecuzione e il PHM hanno migliorato significativamente l'internalizzazione del recettore 5-HT2A nei neuroni PFC del topo (Figura 3). Coerentemente, sia il tapis roulant in esecuzione che l'espressione di c-Fos indotta da 5-HTP down-regolata da PHM, l'evento cellulare a valle dell'attivazione del recettore 5-HT2A 14, nei neuroni PFC del topo (Figura 4). Questi risultati suggeriscono che la corsa su tapis roulant e il PHM internalizzano i recettori 5-HT2A nei neuroni PFC, attenuando la segnalazione rilevante.
Figura 1: Misurazione dell'entità delle accelerazioni durante la corsa sul tapis roulant. (A) Illustrazione per la misurazione delle accelerazioni generate alla testa dei ratti durante la corsa sul tapis roulant. (B) Definizione degli assi x-(sinistra-destra), y-(rostrale-caudale) e z-(dorsale-ventrale) utilizzati in questo studio. (C) Le accelerazioni sono state generate alla testa dei ratti durante il tapis roulant che correva a 20 m/min e PHM (frequenza: 2 Hz) (n = 3 ratti per ciascun gruppo). Il sistema PHM è stato regolato per produrre picchi di accelerazione verticale equivalenti a quelli durante la corsa su tapis roulant di 20 m / min (1,0 × g). Barra scala ad angolo retto, 0,5 × g / 0,5 s. Le immagini rappresentano tre esperimenti indipendenti con risultati simili. (D) Fotografia dell'intero sistema PHM. € Fotografia della camma a forma di elica collegata ad un motore dotato di conducente. (F) Fotografia della camma a forma di elica comprendente quattro pale con altezze di 5 mm (vedi freccia rossa a due punte). La figura è stata modificata da Ryu et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Applicazione di PHM ai topi . (A) Illustrazione per l'analisi degli effetti della PHM sull'HTR. (B,C) PHM mitigato 5-HTP-indotto HTR. Contrazioni della testa è stato contato in blocchi di 5 minuti (B) e blocchi di 30 minuti (C) dopo somministrazione di 5-HTP. Il controllo 2 rappresenta topi che sono stati anestetizzati e posizionati sulla piattaforma PHM lasciati non oscillati. I dati sono presentati come medie ± SEM. *, P < 0,05, test t spaiato (n = 10 topi per ciascun gruppo). La figura è stata modificata da Ryu et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: La corsa sul tapis roulant e l'applicazione PHM hanno migliorato l'internalizzazione del recettore 5-HT 2A nei neuroni PFC del topo. (A) Micrografie dell'immunocolorazione anti-5-HT2A del recettore 2A (5-HT2AR; rosso) e anti-NeuN (verde) del PFC di topi iniettati con 5-HTP (o veicolo) dopo una settimana di PHM giornaliero. Le immagini ad alto ingrandimento dell'immunocolorazione del recettore anti-5-HT2A delle cellule a punta di freccia sono mostrate con una scala di grigi. Le linee gialle indicano i margini di soma delineati dai segnali NeuN-positivi e le punte delle frecce ciano indicano gli immunosegnali internalizzati del recettore anti-5-HT2A. Barre scala, 20 μm. Le immagini sono rappresentative di cinque topi. (B) Quantificazione dell'internalizzazione del recettore 5-HT2A nei neuroni PFC di topo. Le aree interne e associate alla membrana positive al recettore 5-HT2A sono state quantificate come valori relativi all'area NeuN-positiva nel PFC del topo. Il controllo 1 rappresenta i topi posizionati nella macchina del tapis roulant lasciato spento e il controllo 2 rappresenta i topi che sono stati anestetizzati e posizionati sulla piattaforma PHM lasciati non oscillati. Sono stati analizzati da trentacinque a quaranta somi neuronali NeuN-positivi per ciascun topo (internalizzato: grafico sinistro, p < 0,001, ANOVA unidirezionale con test di Bonferroni post hoc; grafico destro, P = 0,0027, t-test spaiato; Associato a membrana: grafico sinistro, P < 0,001, ANOVA unidirezionale con test Bonferroni post hoc; grafico destro, P = 0,0025, test t spaiato; n = 5 topi per ogni gruppo). I dati sono rappresentati come mezzi ± SEM. **P < 0,01, ***P < 0,001; ns, non significativo. La figura è stata modificata da Ryu et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: L'esecuzione del tapis roulant e l'applicazione del PHM hanno down-regolato l'espressione di c-Fos indotta da 5-HTP nei neuroni PFC del topo. (A) Micrografie di anti-c-Fos (verde), anti-5-HT2A recettore (rosso) e anti-NeuN (blu) immunocolorazione del PFC di topi somministrati per via intraperitoneale con 5-HTP (o veicolo) dopo una settimana di PHM giornaliero. Barra scala, 100 μm. Le immagini sono rappresentative di quattro o cinque topi. (B) Quantificazione dell'espressione di c-Fos in neuroni positivi al recettore 5-HT2A in PFC di topo. Il controllo 1 rappresenta i topi collocati nella macchina del tapis roulant lasciato spento e il controllo 2 rappresenta i topi che sono stati anestetizzati e posizionati sulla piattaforma PHM lasciati non oscillati. Viene mostrata la popolazione relativa (%) di cellule c-Fos-positive di 300 cellule positive al recettore NeuN e 5-HT2A (grafico a sinistra: P < 0,001, ANOVA unidirezionale con test di Bonferroni post hoc; grafico a destra: P < 0,001, t-test spaiato; n = 4 topi per la colonna 1, n = 5 topi per le colonne da 2 a 5). I dati sono rappresentati come mezzi ± SEM. ***P < 0,001. La figura è stata modificata da Ryu et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Filmato supplementare 1: La risposta di contrazione della testa da parte del mouse. Il film di 2 minuti e 46 secondi inizia 6 minuti dopo l'iniezione di HTP. Le contrazioni della testa si osservano nei punti temporali di 0:03, 0:39, 1:39 e 2:42. Clicca qui per scaricare questo film.
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Discussion
Utilizzando il sistema di applicazione PHM sviluppato, abbiamo dimostrato che la segnalazione 5-HT nei loro neuroni PFC è regolata meccanicamente. A causa della complessità degli effetti dell'esercizio, è stato difficile analizzare con precisione le conseguenze dell'esercizio nel contesto della promozione della salute. L'attenzione si concentra sugli aspetti meccanici per impedire il coinvolgimento o il contributo di eventi metabolici che possono verificarsi con o successivamente alle attività di esercizio, come il consumo di energia. Il metodo qui descritto dovrebbe essere più ampiamente utile nella ricerca biomedica che esplora i meccanismi alla base degli effetti dell'esercizio sulle funzioni cerebrali.
Il sistema attuale richiede l'anestesia per sottoporre gli animali da esperimento a PHM, che può influenzare (dannoso o meno) il comportamento e i processi delle cellule nervose nel cervello. Potrebbe essere possibile applicare PHM senza anestesia modificando il sistema, comprese le grandezze, i modi e le forme d'onda delle accelerazioni meccaniche generate da PHM. Ad esempio, picchi di accelerazione più piccoli con onde sinusoidali invece di picchi impulsivi di 1 × g dell'attuale PHM possono essere "sentiti" come stimolazione più confortevole da parte degli animali. In alternativa, è possibile implementare nuovi metodi per tenere animali da esperimento sulla piattaforma oscillante con uno stress minimo. Queste modifiche e miglioramenti sono fattibili, principalmente perché le accelerazioni generate da PHM si riferiscono a un moderato esercizio fisico in linea di principio ed è improbabile che siano stress "doloroso" per gli animali da esperimento.
Molti studi precedenti hanno riportato un moderato esercizio fisico come una procedura efficace per trattare o prevenire numerose malattie e disturbi16,17. La soglia del lattato, in cui la concentrazione plasmatica di lattato aumenta esponenzialmente con la secrezione di ormone adrenocorticotropo (ACTH), un indicatore di stress18, viene utilizzata per determinare gli esercizi come lievi o moderati19. Tuttavia, l'esercizio "ottimale" rimane da definire a livello molecolare. Poiché non solo il cervello, ma alla fine tutti gli altri organi corporei sono soggetti a forze meccaniche durante l'esercizio, l'attuale approccio che impiega perturbazioni meccaniche può essere utile per rivelare i meccanismi molecolari alla base degli effetti dell'esercizio in contesti più ampi e aiutare a definire "qual è l'esercizio ottimale" con misure scientifiche.
Tuttavia, il metodo attuale soffre di alcune limitazioni. Non siamo riusciti a fissare stabilmente l'accelerometro sulla testa del mouse a causa della mancanza di compatibilità delle dimensioni. Sebbene la misurazione preliminare indichi che la magnitudo di picco delle accelerazioni meccaniche generate dalla corsa sul tapis roulant sulla testa del topo è anche di circa 1,0 × g, sono necessari ulteriori studi per quantificarla in modo più accurato.
Il presente protocollo ha dettagliato le procedure del sistema PHM progettato su misura, che ha permesso di sezionare elementi / fattori meccanici dall'esercizio fisico. L'approccio fornisce informazioni significative sui benefici dell'esercizio fisico per le funzioni cerebrali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è alcun interesse concorrente associato al lavoro descritto in questo articolo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Fondo di ricerca intramurale del Ministero giapponese della salute, del lavoro e del welfare; sovvenzioni per la ricerca scientifica della Società giapponese per la promozione della scienza (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); Programma supportato da MEXT per la Fondazione di ricerca strategica presso università private, 2015-2019 dal Ministero giapponese dell'istruzione, della cultura, dello sport, della scienza e della tecnologia (S1511017); la Naito Science & Engineering Foundation. Questa ricerca ha anche ricevuto finanziamenti dall'Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), che è supportata dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) e dal National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) del National Institutes of Health con il numero di premio P2CHD086843.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
| Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
| C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
| DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
| Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
| Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
| Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
| OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
| Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
| Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
| Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |
References
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