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जलीय आवासों से हाइड्रोकार्बन मेटाबोलाइज़िंग गुणों के साथ जीवाणु प्रजातियों का अलगाव, प्रसार और पहचान

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/63101
Automatic Translation
1, 1
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences, Shiv Nadar University

Summary

हम जलीय आवासों से हाइड्रोकार्बन-अपमानजनक बैक्टीरिया को अलग करने, प्रचार करने और चिह्नित करने की प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल बैक्टीरिया अलगाव, 16 एस आरआरएनए विधि द्वारा पहचान और उनकी हाइड्रोकार्बन-अपमानजनक क्षमता के परीक्षण को रेखांकित करता है। यह लेख शोधकर्ताओं को पर्यावरणीय नमूनों में माइक्रोबियल जैव विविधता को चिह्नित करने में मदद करेगा, और विशेष रूप से बायोरेमेडिएशन क्षमता वाले रोगाणुओं के लिए स्क्रीन करेगा।

Abstract

हाइड्रोकार्बन प्रदूषक क्षरण के लिए उद्दंड हैं और पर्यावरण में उनका संचय सभी जीवन रूपों के लिए विषाक्त है। बैक्टीरिया कई उत्प्रेरक एंजाइमों को एन्कोड करते हैं और स्वाभाविक रूप से हाइड्रोकार्बन को चयापचय करने में सक्षम होते हैं। वैज्ञानिक बायोडिग्रेडेशन और बायोरेमेडिएशन क्षमता के साथ बैक्टीरिया को अलग करने के लिए जलीय पारिस्थितिक तंत्र में जैव विविधता का उपयोग करते हैं। पर्यावरण से इस तरह के आइसोलेट्स चयापचय मार्गों और एंजाइमों का एक समृद्ध सेट प्रदान करते हैं, जिनका उपयोग औद्योगिक पैमाने पर गिरावट की प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। इस लेख में, हम जलीय आवासों से जीवाणु प्रजातियों के अलगाव, प्रसार और पहचान की सामान्य प्रक्रिया को रेखांकित करते हैं और सरल तकनीकों का उपयोग करके विट्रो में एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में हाइड्रोकार्बन का उपयोग करने की उनकी क्षमता को स्क्रीन करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल 16 एस आरआरएनए विश्लेषण का उपयोग करके विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के अलगाव और उनकी बाद की पहचान का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल बैक्टीरियल आइसोलेट्स की हाइड्रोकार्बन अपमानजनक क्षमता को चिह्नित करने के लिए कदम भी प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा जो अपने जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए पर्यावरणीय आवासों से जीवाणु प्रजातियों को अलग करने की कोशिश कर रहे हैं।

Introduction

हाइड्रोकार्बन (एचसी) का बड़े पैमाने पर ईंधन और रासायनिक अनुप्रयोगों दोनों में उपयोग किया जाता है। बेंजीन, टोल्यूनि और जाइलीन जैसे सुगंधित हाइड्रोकार्बन का उपयोग सॉल्वैंट्स1 के रूप में व्यापक रूप से किया जाता है। एथिलीन और प्रोपलीन जैसे एल्केन्स क्रमशः पॉलीथीन और पॉलीप्रोपाइलीन पॉलिमर के संश्लेषण में अग्रदूत के रूप में काम करते हैं। एक अन्य हाइड्रोकार्बन, स्टाइरीन का पोलीमराइजेशन पॉलीस्टाइनिन बनाता है। मानवजनित गतिविधियाँ अपने उत्पादन और परिवहन के दौरान पर्यावरण में हाइड्रोकार्बन पेश करती हैं। मिट्टी और पानी के हाइड्रोकार्बन संदूषण से पर्यावरण और मानव स्वास्थ्य के लिए गंभीर चिंताएं हैं। सूक्ष्मजीव जैव-रासायनिक चक्रों को विनियमित करके और सब्सट्रेट्स की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करके पारिस्थितिकी तंत्र को बनाए रखने में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, जिसमें प्रदूषक और ज़ेनोबायोटिक्स भी शामिल हैं, उन्हें कार्बन और ऊर्जा स्रोत में परिवर्तित करते हैं। सूक्ष्मजीवों द्वारा पर्यावरणीय दूषित पदार्थों के विषहरण की इस प्रक्रिया को बायोरेमेडिएशन 3,4,5,6,7 के रूप में जाना जाता है।

हाइड्रोकार्बन को नीचा दिखाने की क्षमता वाले सूक्ष्मजीव जलीय और मिट्टी के आवास 8,9,10 में पाए जाते हैं। अल्केन्स और सुगंधित एचसी को नीचा दिखाने की क्षमता वाले कई बैक्टीरिया की पहचान की गई है, जैसे कि स्यूडोमोनास, एसिनेटोबैक्टर, रोडोकोकस, मैरिनोबैक्टर और ओलीबैक्टर11। तकनीकी रूप से उन्नत संस्कृति-स्वतंत्र दृष्टिकोणों के विकास ने नए एचसी-अपमानजनकमाइक्रोबियल समुदायों की खोज में मदद की है। स्रोत नमूनों से सीधे पृथक जीनोमिक सामग्री को अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) जैसे उच्च थ्रूपुट विधियों द्वारा प्रवर्धित और अनुक्रमित किया जाता है, जिसके बाद सूक्ष्मजीवों की खेती करने की आवश्यकता को समाप्त करने वाला विश्लेषण किया जाता है। एनजीएस विधियां, जैसे मेटाजीनोम विश्लेषण, महंगी हैं और प्रवर्धन प्रक्रिया13 से संबंधित कमियों से ग्रस्त हैं। चुनिंदा संवर्धन संस्कृति14 जैसी खेती की तकनीकें जो हाइड्रोकार्बन-अपमानजनक रोगाणुओं के अलगाव को लक्षित करती हैं, अभी भी उपयोगी हैं क्योंकि वे शोधकर्ताओं को बैक्टीरिया आइसोलेट्स में चयापचय मार्गों की जांच और हेरफेर करने की अनुमति देते हैं।

जीनोमिक डीएनए अलगाव और बाद में जीनोमिक सामग्री के अनुक्रमण से किसी भी जीव के बारे में मूल्यवान जानकारी का पता चलता है। संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण जीन की पहचान में मदद करता है जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध, संभावित दवा लक्ष्य, विषाणु कारक, ट्रांसपोर्टर्स, ज़ेनोबायोटिक-मेटाबोलाइज़िंग एंजाइम आदिके लिए कोड करता है। 16एसआरआरएनए एन्कोडिंग जीन का अनुक्रमण बैक्टीरियल फ़ाइलोजेनी की पहचान करने के लिए एक मजबूत तकनीक साबित हुई है। वर्षों से जीन अनुक्रम और कार्य का संरक्षण इसे अज्ञात बैक्टीरिया की पहचान करने और निकटतम प्रजातियों के साथ एक अलग की तुलना करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण बनाता है। इसके अलावा, इस जीन की लंबाई जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण18 के लिए इष्टतम है। सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग करके जीन प्रवर्धन में आसानी और जीन अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में सुधार के साथ ये सभी विशेषताएं इसे रोगाणुओं की पहचान के लिए एक स्वर्ण मानक बनाती हैं।

यहां, हम पर्यावरणीय नमूनों से एचसी-अपमानजनक क्षमता वाले खेती योग्य सूक्ष्मजीवों को पुनर्प्राप्त करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। नीचे वर्णित विधि एचसी-डिग्रेडिंग बैक्टीरिया के संग्रह और पहचान को रेखांकित करती है और इसे पांच वर्गों में विभाजित किया गया है: (1) पानी के नमूनों से बैक्टीरिया का संग्रह, (2) शुद्ध संस्कृतियों का अलगाव, (3) बैक्टीरियल आइसोलेट्स की एचसी-डिग्रेडिंग क्षमता की खोज (4) जीनोमिक डीएनए अलगाव, और (5) 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण और ब्लास्ट विश्लेषण के आधार पर पहचान। इस प्रक्रिया को कई अलग-अलग जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए बैक्टीरिया को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. नमूना संग्रह, प्रसंस्करण और विश्लेषण

नोट: यहां, हम जलीय आवासों से बैक्टीरिया को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। कुछ आइसोलेट्स रोगजनक हो सकते हैं, इसलिए, दस्ताने पहनें और उपयोग से पहले और बाद में कार्य क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।

  1. जल निकाय के विभिन्न स्थलों से पांच बाँझ कांच की बोतलों में 500 एमएल पानी का नमूना एकत्र करें। क्रमशः पीएच मीटर और थर्मामीटर का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के पीएच और तापमान को मापें।
    नोट: प्रोटोकॉल साइट-विशिष्ट नहीं है और हाइड्रोकार्बन-दूषित जल निकायों से जीवों को अलग करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
  2. सड़न रोकनेवाला स्थितियों में 0.22 μm-पोर आकार फ़िल्टर शीट के माध्यम से 100 mL के बैच में नमूने को फ़िल्टर करें।
    नोट: फ़िल्टर पेपर का व्यास पेट्री डिश व्यास से अधिक नहीं होना चाहिए। उदाहरण के लिए, 85 मिमी व्यास से अधिक फ़िल्टर पेपर 100-120 मिमी पेट्री डिश के लिए इष्टतम है।
  3. फ़िल्टर पेपर को विभिन्न पोषक तत्व मीडिया प्लेटों (PYE 19,R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M6321 और M2G22) पर रखें। विभिन्न प्रकार के विकास मीडिया विभिन्न सूक्ष्मजीवों के चयन और संवर्धन की अनुमति देते हैं। विभिन्न विकास माध्यमों की रचनाएँ तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। प्रत्येक मीडिया प्लेट के लिए एक पेपर का उपयोग करें और बाँझ बल का उपयोग करके 2 घंटे के बाद छील लें।
  4. 900 μL बाँझ पानी में एकत्रित पानी के नमूने के 100 μL जोड़कर बाँझ डबल आसुत जल में अनफ़िल्टर्ड पानी के नमूने (106 कमजोर पड़ने) को क्रमबद्ध रूप से पतला करें। इसके परिणामस्वरूप 1:10 कमजोर पड़ जाता है। इस नमूने से, 100 μL लें और 1: 100 कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए बाँझ पानी के 900 μL में जोड़ें। कमजोर पड़ने को तब तक दोहराएं जब तक कि कमजोर पड़ने की तह 1: 1,000,000 न हो जाए। पाइपटिंग द्वारा मिलाएं। प्रत्येक तनुकरण की अंतिम मात्रा 1 एमएल होगी।
  5. तीन प्रतियों में चरण 3 में उल्लिखित सभी विकास मीडिया प्लेटों पर व्यक्तिगत रूप से पतला पानी के नमूने के 100 μL फैलाएं।
  6. कॉलोनियों के विकास के आधार पर 24 से 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: अधिकांश पर्यावरणीय आइसोलेट्स 30 डिग्री सेल्सियस के इष्टतम तापमान पर बढ़ते हैं। यदि अत्यधिक तापमान वाले वातावरण से नमूने अलग करते हैं, तो प्लेटों को संग्रह स्थल के समान तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  7. इसके बाद, एक बाँझ टूथपिक या पिपेट टिप का उपयोग करके कॉलोनियों को चुनें और अलग-अलग कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए क्वाड्रंट स्ट्रीकिंग करें।
  8. प्लेटों को रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, उनकी रूपात्मक विशेषताओं जैसे रंग, बनावट, आकार, आकार, मार्जिन, ऊंचाई, आदि के आधार पर कॉलोनियों को स्क्रीन करें। शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए उपनिवेशों को फिर से तैयार करें।
  9. प्रत्येक शुद्ध संस्कृति23 का ग्राम-धुंधला प्रदर्शन करें और ग्लिसरॉल स्टॉक तैयारी के साथ आगे बढ़ें।
  10. ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करने के लिए, उचित विकास मीडिया के 3 एमएल में एक कॉलोनी को टीका लगाएं और 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। रात भर की संस्कृति से, 700 μL लें और क्रायोवियल24 में 100% ग्लिसरॉल (ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल) के 300 μL जोड़ें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए शीशियों को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

2. हाइड्रोकार्बन का क्षरण

नोट: नीचे दिया गया उदाहरण आइसोलेट्स को स्क्रीन करना है जो स्टाइरीन को नीचा दिखा सकता है। यह पिछली रिपोर्ट25 में अनुकूलित विधि का थोड़ा संशोधन है। सड़न रोकनेवाली स्थितियों के तहत चरणों का पालन करें।

  1. एक ताजी लकीर वाली प्लेट से, एक कॉलोनी चुनें और 5 मिलीलीटर ट्राइप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी)/पोषक तत्व शोरबा (एनबी) में टीका लगाएं। 200 आरपीएम पर हिलाने के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृति बढ़ाएं जब तक कि अवशोषण ~ 2 तक न पहुंच जाए।
    नोट: टीएसबी / एनबी के अलावा, किसी भी विकास माध्यम को चुना जा सकता है जिसमें बैक्टीरिया उच्च सेल घनत्व तक पहुंचते हैं।
  2. अगले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2862 x g पर कोशिकाओं को गोली दें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  3. गोली को 2 मिलीलीटर आटोक्लेव सेलाइन (0.9% NaCl) के साथ दो बार धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2862 x g पर स्पिन करें।
    नोट: खारा आइसोटोनिक है और इस प्रकार, यह बैक्टीरिया कोशिकाओं के अंदर आसमाटिक दबाव बनाए रखता है।
  4. तरल कार्बन मुक्त बेसल माध्यम (LCFBM) के 2 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। अवशोषण (ओडी600) को मापें।
  5. नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूह के लिए 150 एमएल क्षमता वाले दो बाँझ एर्लेनमेयर फ्लास्क लें। उन्हें A और B के रूप में लेबल करें।
  6. नियंत्रण समूह में, (फ्लास्क ए), 40 एमएल एलसीएफबीएम और स्टाइरीन (5 एमएम) जोड़ें।
  7. फ्लास्क बी में, एलसीएफबीएम और स्टाइरीन के 35 एमएल जोड़ें (स्टाइरीन की अंतिम एकाग्रता को 5 एमएम तक समायोजित करें)। सेल निलंबन को 0.1 ≈ कोशिकाओं के अंतिम ओडी600 के साथ जोड़ें और 40 एमएल तक एलसीएफबीएम के साथ शेष मात्रा बनाएं। फ्लास्क को 30 दिनों के लिए 200 आरपीएम पर हिलाने के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: अधिक मात्रा में हाइड्रोकार्बन रोगाणुओं के लिए विषाक्त हो सकते हैं, इसलिए, कम सांद्रता से शुरू करें और धीरे-धीरे इसे बढ़ाएं।
  8. प्रत्येक अतिरिक्त तनाव के लिए उपरोक्त को दोहराएं जिसे हाइड्रोकार्बन क्षरण के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
  9. प्रत्येक फ्लास्क के ओडी600 को हर 5 दिनों में मापें और विकास वक्र को प्लॉट करें। यदि बैक्टीरिया स्टाइरीन का उपयोग कर सकते हैं तो इनक्यूबेशन को 45 दिनों तक बढ़ाएं। ओडी600 में वृद्धि इंगित करती है कि जीवाणु स्टाइरीन को चयापचय कर सकता है।

3. बैक्टीरियल आइसोलेट्स द्वारा कैटेकोल क्षरण की स्क्रीनिंग।

नोट: स्टाइरीन, बेंजीन, जाइलीन, नेफ्थलीन, फिनोल, आदि जैसे सुगंधित हाइड्रोकार्बन का क्षरण प्रतिक्रिया मध्यवर्ती के रूप में कैटेकोल्स का उत्पादन करता है। कैटेकोल को क्रमशः ऑर्थो- और मेटा-क्लीवेज मार्गों के माध्यम से कैटेकोल 1,2-डाइऑक्सीजिनेज और कैटेकोल 2,3-डाइऑक्सीजिनेज एंजाइमों की मदद से बैक्टीरिया द्वारा चयापचय किया जाताहै। ये एंजाइम क्लोरोबेंजीन27 जैसे अन्य हाइड्रोकार्बन के क्षरण में भी शामिल हैं। नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल कैटेकोल 2, 3-डाइऑक्सीजिनेज एंजाइम परख28 के लिए पूरे सेल लाइसेट का उपयोग करता है। कैटेकोल 1, 2-डाइऑक्सीजिनेज की गतिविधि को स्क्रीन करने के लिए एक ही लाइसिस विधि का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, प्रतिक्रिया मिश्रण की संरचना अलग-अलग होगी। दोनों एंजाइम प्रकृति में इंड्यूसेबल हैं और विकास मीडिया में फिनोल के अतिरिक्त प्रेरित हो सकते हैं।

  1. एक बाँझ लूप की मदद से, बैक्टीरियल कॉलोनी को एक ताजा लकीर वाली प्लेट से खनिज लवण माध्यम (एमएसएम) में 1-4 एमएम फिनोल के साथ पूरक करें। 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें। 20 मिनट के लिए 4500 x g पर घूमकर OD600 1.4-1.6 (यानी, देर से घातीय चरण में) के बीच पहुंचने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर की कटाई करें।
  2. फॉस्फेट बफर (0.5 एम, पीएच 7.5) के साथ सेल गोली धोएं।
  3. उपर्युक्त फॉस्फेट बफर में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और अंतिम ओडी600 ≈ 1.0 को समायोजित करें।
  4. 1.5 मिनट के लिए स्पंदित सोनिकेशन द्वारा कोशिकाओं को लाइज़ करें, प्रत्येक पल्स की अवधि 15 सेकंड है। इस चरण के बाद, निलंबन स्पष्ट या कम कठोर होना चाहिए। यदि नहीं, तो दालों की संख्या बढ़ाएं और जांचें कि निलंबन स्पष्ट है या नहीं। प्रत्येक पल्स के बाद, प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए बर्फ पर नमूना रखें।
  5. ठंडे तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) को बनाए रखते हुए, 30 मिनट के लिए 9,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल मलबे और अटूट कोशिकाओं को हटा दें।
  6. स्पष्ट सतह पर तैरने वाले को ध्यान से पाइप करें। इस अंश में एंजाइम परख के लिए कच्चा अर्क है।
  7. ब्रैडफोर्ड या लॉरी की विधि29,30 द्वारा कच्चे अर्क की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
  8. कैटेकोल 2,3-डाइऑक्सीजिनेज की गतिविधि को निर्धारित करने के लिए, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा प्रतिक्रिया अंत उत्पाद (2-हाइड्रॉक्सीम्यूकोनिक सेमिएल्डिहाइड) के गठन को मापें।
  9. 20 μL कैटेकोल (50 mM), 960 μL फॉस्फेट बफर (50 mM, pH 7.5), और 20 μL कच्चे अर्क को जोड़कर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।
  10. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, फॉस्फेट बफर के साथ कच्चे अर्क को बदलें और अंतिम मात्रा को 1 एमएल में समायोजित करें।
  11. प्रतिक्रिया मिश्रण को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। निर्धारित समय अंतराल पर, अवशोषण को 375 एनएम पर मापें। अवशोषण में वृद्धि प्रतिक्रिया अंत उत्पाद, 2-हाइड्रॉक्सीम्यूकोनिक एसिड सेमीएल्डिहाइड (2-एचएमएस) के गठन को इंगित करती है। प्रयोग को तीन प्रतियों में करें।
    नोट: कैटेकोल प्रकाश-संवेदनशील और ऑक्सीजन-संवेदनशील है। प्रतिक्रिया मिश्रण को अंधेरे में स्टोर करें और कैटेकोल के प्राकृतिक क्षरण को रोकने के लिए ट्यूबों को कसकर बंद करें।

4. शुद्ध संस्कृति का जीनोमिक डीएनए अलगाव।

नोट: यह जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए सामान्य प्रोटोकॉल है। नमूना संग्रह, प्रसंस्करण और विश्लेषण चरण के दौरान ग्राम धुंधलापन किया गया था। ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की सेल दीवार मोटाई में भिन्नता के कारण, सेल लाइसिस विधि को तदनुसार संशोधित किया जाता है। डीएनए को खराब करने से न्यूक्लियस से बचने के लिए 70% इथेनॉल के साथ वर्कबेंच को अलग और कीटाणुरहित करते समय दस्ताने पहनें। नीचे उल्लिखित कुछ रसायन त्वचा पर गंभीर जलन पैदा कर सकते हैं और उन्हें संभालते समय उचित देखभाल की जानी चाहिए।

  1. ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया से जीनोमिक डीएनए का अलगाव31.
    1. एक एकल कॉलोनी चुनें और बाँझ परीक्षण ट्यूबों में एक ताजा विकास माध्यम में टीका लगाएं।
    2. ट्यूबों को 200 आरपीएम पर इनक्यूबेटर शेकर में रखें और बैक्टीरिया को 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें।
    3. अगले दिन, 3 मिनट के लिए 12,400 x g पर रात भर उगने वाली 1.5 मिलीलीटर की छर्री।
    4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 200 μL लाइसिस बफर (40 mM Tris-एसीटेट, pH 7.8, 20 mM सोडियम एसीटेट, 1 mM EDTA, 1% SDS) में गोली को फिर से निलंबित करें।
    5. NaCl घोल (5 M) के 66 μL जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएँ।
    6. परिणामी मिश्रण को 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 12,400 x g पर पेलेट करें।
    7. एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला पिपेट और क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा जोड़ें।
    8. इनवर्ट घोल को कई बार मिलाएं जब तक कि दूधिया घोल न देखा जाए।
    9. 3 मिनट के लिए 12,400 x g पर स्पिन करें और सतह पर तैरने वाले को एक साफ शीशी में स्थानांतरित करें।
    10. बर्फ-ठंडा 100% इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें; व्युत्क्रम द्वारा तब तक मिश्रित करें जब तक कि डीएनए के सफेद किस्में बाहर न निकल जाएं।
    11. अवक्षेपित डीएनए को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    12. डीएनए गोली को 70% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ धोएं और डीएनए गोली को कमरे के तापमान पर 5 मिनट तक सूखने दें।
    13. एक बार सूखने के बाद, गोली को 1x Tris-EDTA (TE) बफर के 100 μL में फिर से निलंबित करें, और डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    14. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकाग्रता (ए260/280) को मापें और डीएनए24 की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए अगारोस जेल (1%) पर डीएनए चलाएं।
  2. ग्राम-पॉजिटिव स्ट्रेन32 से जीनोमिक डीएनए का अलगाव।
    1. एक एकल कॉलोनी चुनें और बाँझ परीक्षण ट्यूबों में ताजा विकास माध्यम में टीका लगाएं।
    2. ट्यूबों को 200 आरपीएम पर एक इनक्यूबेटर शेकर में रखें और बैक्टीरिया को उपयुक्त विकास तापमान पर रात भर बढ़ने दें।
    3. अगले दिन, विकसित संस्कृति का 1.5 एमएल लें और 5 मिनट के लिए 8,600 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और टीई बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    5. टीई बफर के साथ ओडी600 = 1.0 समायोजित करें और सेल निलंबन के 740 μL को एक साफ माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. 20 μL लाइसोजाइम (100 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक) जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं। 30 मिनट (सूखे स्नान में) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. 10% SDS के 40 μL जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएँ।
    8. 8 μL Proteinase K (10 mg / mL) जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और 1-3 घंटे (सूखे स्नान में) के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। निलंबन अब बढ़ी हुई चिपचिपाहट के साथ स्पष्ट हो जाना चाहिए, कुशल सेल लाइसिस को चिह्नित करना चाहिए।
      नोट: यदि कोशिकाओं को ठीक से व्यवस्थित नहीं किया जाता है तो निलंबन को रात भर छोड़ा जा सकता है।
    9. 65 डिग्री सेल्सियस (सूखे स्नान में) पर सीटीएबी / एनएसीएल मिश्रण को पहले से गर्म करें और सेल सस्पेंशन में इस मिश्रण के 100 μL जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं।
    10. 10 मिनट (सूखे स्नान में) के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    11. क्लोरोफॉर्म के 500 μL: isoamyl अल्कोहल (24: 1) जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं। 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,900 x g पर स्पिन करें।
    12. जलीय चरण को कार्बनिक चरण (नीचे चिपचिपा चरण) से बचने के लिए एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    13. ध्यान से फिनोल के 500 μL जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: आइसोमाइल अल्कोहल (25: 24: 1) और अच्छी तरह मिलाएं। 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,900 x g पर स्पिन करें।
    14. जलीय चरण को एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लें। क्लोरोफॉर्म के 500 μL: isoamyl अल्कोहल (24: 1) जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
    15. जलीय चरण को स्थानांतरित करें और 0.6 वॉल्यूम आइसोप्रोपेनोल (-20 डिग्री सेल्सियस पर प्रीचिल्ड) जोड़ें।
    16. अवक्षेपित डीएनए किस्में धागे जैसे रूप में दिखाई देनी चाहिए। 2 घंटे से रात भर के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    17. डीएनए को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,900 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज।
    18. आइसोप्रोपेनोल को सावधानी से धोएं और किसी भी अशुद्धियों को दूर करने के लिए 1 मिलीलीटर ठंडे 70% इथेनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस पर प्रीचिल्ड) के साथ गोली को धो लें।
    19. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,900 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    20. गोली को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें या ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। सुनिश्चित करें कि गोली अधिक सूख नहीं गई है।
    21. 1x TE बफर के 100 μL में पुन: निलंबित करें और डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यदि गोली अधिक सूख जाती है और इसे फिर से सस्पेंड करना मुश्किल होता है, तो माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को डीएनए गोली और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और पाइपिंग द्वारा फिर से निलंबित करें।
    22. 1x TE बफर में 1:100 कमजोर पड़ने के बाद स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकाग्रता (A260/280) को मापें और डीएनए24 की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए Agarose जेल (1%) पर डीएनए चलाएं।

5. 16 एस आरआरएनए अनुक्रमण।

नोट: नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल बैक्टीरिया की पहचान के लिए 16 एस आरआरएनए के प्रवर्धन और अनुक्रमण के लिए है। 16 एस आरआरएनए अनुक्रम से प्राप्त जानकारी का उपयोग एक अज्ञात जीव की पहचान और विभिन्न जीवों के बीच संबंधितता का पता लगाने के लिए किया जाता है।

  1. उपभेदों की पहचान करने के लिए, पीसीआर द्वारा शुद्ध जीवाणु संस्कृतियों से अलग किए गए डीएनए को बैक्टीरिया के लिए 16 एस आरआरएनए अनुक्रम को लक्षित करने वाले सार्वभौमिक प्राइमरों के साथ बढ़ाएं: 27 एफ (5'-एजीजीटीटीटीसीजीटीसीएजी-3') और 1492 आर (5'- टीएसीजीजीटीएसीटी-33)।
  2. न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 18 μL, 10x बफर के 2.5 μL, आगे और रिवर्स प्राइमरों (100 μM स्टॉक), DNPTP मिश्रण के 2 μL (100 μM स्टॉक), 1 μL डीएनए टेम्पलेट (2-15 ng/μL) और Taq पोलीमरेज़ के 1 U के साथ बर्फ पर पीसीआर मिश्रण (25 μL प्रतिक्रियाएं) तैयार करें।
  3. 16 एस आरआरएनए जीन प्रवर्धन के लिए निम्नलिखित साइक्लिंग स्थितियों का उपयोग करें: 10 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण, (40 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विकृतीकरण, 1 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर एनीलिंग, 2 मिनट के लिए 74 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार) x 30 चक्र, 10 मिनट के लिए 74 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार।
  4. चक्र समाप्त होने के बाद, नमूना के 5 μL और 5x डीएनए लोडिंग डाई के 1 μL मिलाएं। प्रवर्धन को सत्यापित करने के लिए 1% एगारोस जेल पर चलाएं। पीसीआर उत्पादों को अल्पावधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या आगे के उपयोग तक उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  5. 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण के लिए, उच्च मात्रा (100 μL) के लिए ऊपर वर्णित समान प्रतिक्रिया सेट करें।
  6. पीसीआर उत्पाद शुद्धिकरण किट का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण24,34 के लिए एम्प्लिकॉन को शुद्ध करें या पूरे नमूने को डीएनए लोडिंग डाई के साथ मिलाएं और जेल निष्कर्षण विधि करने के लिए एक अगारोस जेल पर लोड करें।
  7. एक बार अनुक्रमण हो जाने के बाद, परिणाम फ़ाइल को एफएएसटीए प्रारूप में परिवर्तित करें और एनसीबीआई (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 35 पर मूल स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) के साथ अनुक्रम समानता की जांच करें।

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Representative Results

जलीय आवासों से बैक्टीरिया के अलगाव और स्क्रीनिंग के लिए पूरी प्रक्रिया को रेखांकित करने और 16 एस आरआरएनए विश्लेषण द्वारा उनकी बाद की पहचान को चित्र 1 में दर्शाया गया है। दादरी, भारत में एक आर्द्रभूमि से पानी के नमूने बाँझ कांच की बोतलों में एकत्र किए गए थे और प्रसंस्करण के लिए तुरंत प्रयोगशाला में ले जाया गया था। नमूने 0.22 μm छिद्र आकार के साथ फ़िल्टर शीट के माध्यम से पारित किए गए थे, और फ़िल्टर पेपर को विभिन्न मीडिया प्लेटों के संपर्क में रखा गया था। 2 घंटे के बाद, फिल्टर पेपर हटा दिए गए थे, और प्लेटों को कॉलोनियों के गठन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट किया गया था (चित्रा 2)। अगले दिन, अलग-अलग जीवाणु कालोनियों का चयन किया गया और ताजा मीडिया प्लेटों (चित्रा 2) पर लकीरें खींची गईं। उत्पन्न शुद्ध संस्कृति को संग्रहीत किया गया था और बाद में आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था। इस विधि का उपयोग करके, हम 100 से अधिक अद्वितीय जीवाणु आइसोलेट्स की एक लाइब्रेरी बनाने में सक्षम थे। हमने बैक्टीरियल आइसोलेट्स की पहचान करने का लक्ष्य रखा जो हाइड्रोकार्बन, विशेष रूप से स्टाइरीन, जो एकल उपयोग वाले प्लास्टिक का प्राथमिक घटक है, का उपयोग कर सकते हैं। पृथक बैक्टीरिया को कार्बन के एकमात्र स्रोत के रूप में तरल स्टाइरीन के अतिरिक्त संबंधित मीडिया में व्यक्तिगत रूप से उगाया गया था (चित्रा 3)। हम चार आइसोलेट्स की पहचान कर सकते हैं जो कार्बन के एकमात्र स्रोत के रूप में स्टाइरीन का उपयोग करते हैं। स्टाइरीनक्षरण के लिए दो आइसोलेट्स को बड़े पैमाने पर चित्रित किया गया था।

बैक्टीरियल आइसोलेट्स को तब हाइड्रोकार्बन चयापचय के क्षरण के लिए एंजाइमेटिक मार्गों की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया गया था। कुछ बैक्टीरिया में हाइड्रोकार्बन चयापचय के परिणामस्वरूप मध्यवर्ती के रूप में कैटेकोल्स का उत्पादन होता है, जो ऑर्थो-क्लीवेज और मेटा-क्लीवेज मार्गों द्वारा आगे खराब हो जाते हैं। कैटेकोल 1,2- डाइऑक्सीजेनेस और कैटेकोल 2,3-डाइऑक्सीजेनेस एंजाइम रिंग-क्लीवेज प्रतिक्रिया36 के लिए जिम्मेदार हैं। इन एंजाइमों को रखने वाले पर्यावरणीय बैक्टीरिया को कई सुगंधित यौगिकों को चयापचय करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, बैक्टीरियल आइसोलेट्स की एचसी-डिग्रेडिंग क्षमता का आकलन करने के लिए एक कैटेकोल डिग्रेडेशन परख की गई थी (चित्रा 4)। आइसोलेट्स में से एक के लिए एक प्रतिनिधि परख चित्रा 4 में दिखाया गया है।

बैक्टीरियल आइसोलेट्स की पहचान करने के लिए, 16 एस आरआरएनए अनुक्रमण किया गया था। बैक्टीरिया को चिह्नित करने के लिए एक प्रारंभिक ग्राम धुंधला किया गया था, जो बाद के चरणों को पहचानने और समस्या निवारण में मदद करता है। ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया आमतौर पर सेल लाइसिस बफर के लिए उद्दंड होते हैं जिससे कम जीनोमिक डीएनए उपजहोती है। इस प्रकार, जीनोमिक डीएनए अलगाव से पहले ग्राम-स्टेनिंग38 से प्राप्त परिणाम जीनोमिक डीएनए अलगाव के लिए प्रोटोकॉल चुनने में मदद करेंगे। डीएनए अलगाव के बाद, जीनोमिक डीएनए की अखंडता की पुष्टि एगारोस जेल (चित्रा 5 ए) पर डीएनए के एक छोटे से नमूने की कल्पना करके की गई थी और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके यूवी अवशोषण विधि द्वारा मात्रा निर्धारित की गई थी। 16 एस आरआरएनए जीन को सार्वभौमिक प्राइमर अनुक्रम (चित्रा 5 बी) का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था। जबकि अनुक्रमण के लिए 500 बीपी आवश्यक हैं, आदर्श परिणाम 1,300-1,500 बीपी39 के साथ प्राप्त किए जाते हैं। पृथक उपभेदों के बीच संबंधितता की डिग्री प्राप्त करने के लिए, phylogeny.fr सॉफ्टवेयर40 (चित्रा 6) का उपयोग करके एक फाइटोलैनेटिक पेड़ का निर्माण किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: अध्ययन का योजनाबद्ध वर्कफ़्लो कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: पानी के नमूनों से जीवाणु कालोनियों की छवियां। एकत्र किए गए पानी के नमूने को 0.22 μm फिल्टर पेपर के माध्यम से पारित किया गया था। फिल्टर पेपर अलग-अलग मीडिया प्लेटों पर रखे गए थे। प्लेटों को 24-48 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था जब तक कि अलग-अलग कॉलोनियों को नहीं देखा गया था। एकल कॉलोनियों को तब शुद्ध संस्कृति अलगाव के लिए ताजा प्लेटों पर लकीर ें लगाई गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: स्टाइरीन के माइक्रोबियल क्षरण और बैक्टीरिया की हाइड्रोकार्बन क्षरण क्षमता की स्क्रीनिंग के प्रतिनिधि परिणाम। कोशिकाओं को LCFBM में 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर 40 दिनों के लिए एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में 5 mM स्टाइरीन के साथ पूरक किया गया था। OD600 हर 5 दिनों में मापा गया था। नियंत्रण फ्लास्क में केवल LCFBM था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कैटेकोल के क्षरण की निगरानी के लिए कैटेकोल 2,3-डाइऑक्सीजिनेज एंजाइम परख का प्रतिनिधित्व। (ए) रंगहीन सब्सट्रेट कैटेकोल को कैटेकोल 2,3-डाइऑक्सीजिनेज की कार्रवाई से पीले रंग के उत्पाद में परिवर्तित किया जाता है। प्रतिक्रिया मिश्रण में कैटेकोल, फॉस्फेट बफर और क्रूड सेल लाइसेट होते हैं। 375 एनएम पर अवशोषण को मापकर उत्पाद के गठन का पता लगाया जाता है। (बी) पूरे सेल लाइसेट के साथ कैटेकोल 2,3-डाइऑक्सीजिनेज एंजाइम परख का प्रतिनिधि ग्राफ। नकारात्मक नियंत्रण में प्रतिक्रिया मिश्रण में सेल लाइसेट के बिना बफर और कैटेकोल सब्सट्रेट होता है। अवशोषण 10 मिनट के अंतराल पर 375 एनएम पर मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: जीनोमिक डीएनए अलगाव और 16 एस आरआरएनए पीसीआर। (ए) पृथक जीनोमिक डीएनए का जेल वैद्युतकणसंचलन। लेन एम: डीएनए आकार मार्कर, लेन 1-2: जीनोमिक डीएनए। (बी) 1% जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा 16 एस आरआरएनए जीन प्रवर्धन का सत्यापन। जैल को एथिडियम ब्रोमाइड के साथ धुंधला करके कल्पना की गई थी; लेन एम: डीएनए आकार मार्कर (1 केबी), लेन 1-4: विभिन्न उपभेदों से प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण परिणामों का विश्लेषण। phylogeny.fr कार्यक्रम का उपयोग करके प्रतिनिधि डेंड्रोग्राम निर्माण एक आर्द्रभूमि (लाल बॉक्स में हाइलाइट किए गए) से ज्ञात एक्सिगुओबैक्टीरियम एसपी के साथ अलग एक्सिगुओबैक्टीरियम उपभेदों के बीच संबंधितता को चित्रित करने के लिए। ज्ञात एक्सिगुओबैक्टीरियम एसपी के 16 एस आरआरएनए अनुक्रम एनसीबीआई से प्राप्त किए गए थे। यह आंकड़ा पिछले पेपर (चौहान et.al) से बिना किसी संशोधन के लिया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पेप्टोन खमीर अर्क (PYE)
पेप्टोन 2g
खमीर निकालने 1g
1 M MgSO4 1 मिलीलीटर
1 M CaCl2 1 मिलीलीटर
आसुत जल 1000 मिलीलीटर तक
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पीएसआई पर ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज़ करें।
रीजनर 2A (R2A)
कैसिइन एसिड हाइड्रोलाइज़ेट 0.5 ग्राम
खमीर निकालने 0.5 ग्राम
प्रोटीज पेप्टोन 0.5 ग्राम
डेक्सट्रोज 0.5g
स्टार्च, घुलनशील 0.5 ग्राम
K2HPO4 0.5 ग्राम
आसुत जल 1000 मिलीलीटर तक
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पीएसआई पर ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज़ करें।
M2G
10X M2 लवण (1L) -
Na2HPO4 17.4 ग्राम
KH2PO4 10.6 ग्राम
एनएच4सीएल 5.0 g
121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव 10X एम 2 लवण और 15 मिनट के लिए 15 पीएसआई।
10X M2 लवण 100 मिलीलीटर
50 mM MgCl2 10 मिलीलीटर
30% ग्लूकोज (w/v) 10 मिलीलीटर
0.8 mM EDTA, pH 6.8 में 1 mM FeSO4 10 मिलीलीटर
50 mM CaCl2 10 मिलीलीटर
आसुत जल 1000 मिलीलीटर तक
फ़िल्टर करें स्टरलाइज़.
लाइसोजेनी शोरबा (एलबी)
कैसिइन एंजाइमिक हाइड्रोलाइज़ेट 10 ग्राम
खमीर निकालने 5 ग्राम
NaCl 10 ग्राम
आसुत जल 1000 मिलीलीटर तक
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पीएसआई पर ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज़ करें।
पोषक तत्व शोरबा (एनबी)
पेप्टोन 15 ग्राम
खमीर निकालने 3 g
NaCl 6 g
ग्लूकोज़ 1 g
आसुत जल 1000 मिलीलीटर तक
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पीएसआई पर ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज़ करें।
ट्राइप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी)
कैसिइन का अग्नाशय ी पाचन। 17.0 g
सोयाबीन भोजन का पापाटिक पाचन 3 g
NaCl 5 ग्राम
K2HPO4 2.5 ग्राम
डेक्सट्रोज 2.5 ग्राम
आसुत जल 1000 मिलीलीटर तक
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पीएसआई पर ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज़ करें।
M63
एनएच4सीएल 2g
KH2PO4 13.6 ग्राम
FeSO4.7H 2O 0.5 मिलीग्राम
20% ग्लिसरॉल 10 मिलीलीटर
1 M MgSO4 1 मिलीलीटर
आसुत जल 1000 मिलीलीटर तक
एम 9 न्यूनतम मीडिया
5X M9 लवण
एनए2एचपीओ4.7 एच20 12.8 ग्राम
KH2PO4 3 g
एनएच4सीएल 1 g
NaCl 0.5 ग्राम
आसुत जल 200 मिलीलीटर तक
121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव 5X M9 लवण और 15 मिनट के लिए 15 PSI।
1X M9 मीडिया
5X M9 लवण 20 मिलीलीटर
20% ग्लूकोज 2 मिलीलीटर
1 M MgSO4 200 μl
1 M CaCl2 10 μl
आटोक्लेव वाला पानी 100 मिलीलीटर तक
नोट - ठोस मीडिया तैयारी के लिए, 1.5% बैक्टो एगर (15 ग्राम / एल) का उपयोग करें

तालिका 1.

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Discussion

यह अच्छी तरह से स्थापित है कि पृथ्वी पर केवल लगभग 1% बैक्टीरियाको प्रयोगशाला 6 में आसानी से खेती की जा सकती है। यहां तक कि खेती योग्य बैक्टीरिया के बीच, कई लोग अचिह्नित रहते हैं। आणविक विधियों में सुधार ने जीवाणु समुदायों के विश्लेषण और मूल्यांकन को एक नया आयाम दिया है। हालांकि, ऐसी तकनीकों की सीमाएं हैं, लेकिन वे संस्कृति विश्लेषण को निरर्थक नहीं बनाते हैं। व्यक्तिगत जीवाणु प्रजातियों को अलग करने के लिए शुद्ध संस्कृति तकनीक शारीरिक गुणों के लक्षण वर्णन के लिए प्राथमिक तंत्र बनी हुई है। मिट्टी और जलीय आवास नए एंजाइमों और मार्गों के साथ कई बैक्टीरिया को आश्रय देते हैं, जिनका उपयोग जैव प्रौद्योगिकी य उपयोगों के लिए किया जा सकता है। यह अध्ययन पारिस्थितिक नमूनों से बैक्टीरिया के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक सरल और सस्ती विधि का वर्णन करता है।

विभिन्न बैक्टीरिया की अलग-अलग पोषण संबंधी आवश्यकताएं होती हैं, इसलिए विभिन्न जीवाणु प्रजातियों को अलग करने की संभावना बढ़ाने के लिए विभिन्न विकास मीडिया का उपयोग किया गया था। इस विधि की एक प्रमुख सीमा यह है कि तेजी से विकास आवश्यकताओं वाले रोगाणुओं को बाहर रखा जा सकता है। इसके अलावा, इस कदम का मुख्य लक्ष्य नमूने से प्राप्त जीवाणु प्रजातियों की संख्या को अधिकतम करना है। नमूना पुस्तकालय में जीवाणु प्रजातियों की संख्या बायोरेमेडिएशन क्षमता के साथ रोगाणुओं को अलग करने की संभावना में सुधार करेगी। यद्यपि हम केवल विविध विकास मीडिया, अलग-अलग विकास तापमान और ऑक्सीजन एकाग्रता भी अद्वितीय प्रजातियों41,42 के साथ नमूना पुस्तकालय का विस्तार करने की संभावना ओं को बढ़ा सकते हैं।

प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम परीक्षण किए जा रहे सब्सट्रेट (हमारे मामले में स्टाइरीन) के उपयोग की जांच करना है। झूठे-नकारात्मक परिणामों से बचने के लिए देखभाल के साथ ऐसी जांच के लिए प्रयोग को डिजाइन करना महत्वपूर्ण है। विकास विशेषताओं के आधार पर, माइक्रोब तुरंत परीक्षण किए जा रहे सब्सट्रेट का उपयोग करने के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है और संवर्धन प्रक्रिया की आवश्यकता हो सकती है। हमारे मामले में, एकमात्र कार्बन स्रोत25 के रूप में हाइड्रोकार्बन के उपयोग का परीक्षण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एलसीएफबीएम माध्यम में बैक्टीरिया की वृद्धि धीमी है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, बैक्टीरिया के विकास का समर्थन करने के लिए एलसीएफबीएम माध्यम में (1% वी / वी) टीएसबी या एनबी जोड़कर प्रारंभिक संस्कृतियों को शुरू किया जा सकता है। खेती किए गए माइक्रोब की पहचान 16 एस आरआरएनए अनुक्रमण43 के माध्यम से पूरी की जाती है। यह विधि माइक्रोबियल पहचान के लिए एक मजबूत और लागत प्रभावी विधि प्रदान करती है। हालांकि, 16 एस अनुक्रमण केवल उच्च-स्तरीय टैक्सोनोमिक पहचान प्रदान कर सकता है। विशिष्ट प्रजातियों के स्तर की पहचान के लिए, अन्य परिवार-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग विभिन्न जैव रासायनिक परीक्षणों44,45 के साथ संयुक्त किया जाना चाहिए।

पूरे सेल लाइसेट के साथ एंजाइम परख को एक कुशल सेल लाइसिस विधि का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। बैक्टीरियल सेल लाइसिस आमतौर पर सोनिकेशन करके प्राप्त किया जाता है। हालांकि, एक फ्रीज-पिघलाव विधि कोमल सेल लाइसिस के लिए एक वैकल्पिक विधि है, जिसे प्रोटीन के विकृतीकरण को रोकने के लिए माना जाता है। प्रक्रिया में कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर जल्दी से फ्रीज करना और अनुक्रमिकतरीके से 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलना शामिल है। एनपी -40 या ट्राइटन-एक्स -100 जैसे हल्के डिटर्जेंट के अलावा सेल लाइसिस में भी सहायता करता है और प्रोटीन को उनकी गैर-आयनिकप्रकृति के कारण विकृत नहीं करता है। हालांकि, साइनोबैक्टीरिया48 जैसे मोटी सेल की दीवारों वाले बैक्टीरिया को डिटर्जेंट49 का उपयोग करके कोमल सेल लाइसिस विधि से लाभ नहीं हो सकता है और इस प्रकार, एंजाइम परख के लिए लाइसिस विधि को तदनुसार चुना जाना चाहिए।

पर्यावरणीय नमूनों से खेती योग्य जीवाणु आबादी पर ध्यान केंद्रित करके, शोधकर्ता जल्दी से कई अलग-अलग प्रयोग कर सकते हैं। यहां वर्णित विधियों को बहुत परिष्कृत उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है और इसे आसानी से एक मानक प्रयोगशाला सेटअप में किया जा सकता है। चूंकि हाइड्रोकार्बन और खतरनाक रसायनों का उपयोग किया जाता है, इसलिए प्रयोगशाला को मानक संचालन प्रक्रियाओं के अनुसार उचित हैंडलिंग और निपटान से लैस किया जाना चाहिए। यहां वर्णित दृष्टिकोण को कई जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए विभिन्न प्रकार की जीवाणु प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम डॉ कार्तिक कृष्णन और आरपी लैब के सदस्यों को उनकी उपयोगी टिप्पणियों और सुझावों के लिए धन्यवाद देते हैं। डीएस एसएनयू-डॉक्टरेट फैलोशिप और अर्थवॉच इंस्टीट्यूट इंडिया फैलोशिप द्वारा समर्थित है। आरपी लैब को सीएसआईआर-ईएमआर अनुदान और शिव नादर विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A4718 Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma-Aldrich A9434 Growth medium component
Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A4418 Growth medium component
Bacto-Agar Millipore 1016141000 Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2) MERCK C4901-500G Growth medium component
Catechol Sigma-Aldrich 135011 Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB Sigma-Aldrich H6269 Genomic DNA Isolation
Chloroform HIMEDIA MB109 Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S5136 Growth medium component
EDTA Sigma-Aldrich E9884 gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) Sigma-Aldrich 215422 Growth medium component
Glucose Sigma-Aldrich G7021 Growth medium component
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Growth medium component; Glycerol stocks
Isopropanol HIMEDIA MB063 Genomic DNA isolation
LB Agar Difco 244520 Growth medium
Luria-Bertani (LB) Difco 244620 Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4) MERCK M2643 Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) Sigma-Aldrich 221287 Growth medium component
Nutrient Broth (NB) Merck (Millipore) 03856-500G Growth medium
Peptone Merck 91249-500G Growth medium component
Phenol Sigma-Aldrich P1037 Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786 Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Growth medium component
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2546 Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 160016235 DNA purification
QIAquick PCR Purification kit QIAGEN 163038783 DNA purification
R2A Agar Millipore 1004160500 Growth medium
SmartSpec Plus Spectrophotometer BIO-RAD 4006221 Absorbance measurement
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma-Aldrich L3771 Genomic DNA isolation
Styrene Sigma-Aldrich S4972 Styrene biodegradation
Taq DNA Polymerase NEB M0273X 16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE) Sigma-Aldrich 93283 Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB) Merck 22092-500G Growth medium
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG Growth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) Sigma-Aldrich 221376 Growth medium component

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Sethi, D., Priyadarshini, R.… More

Sethi, D., Priyadarshini, R. Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats. J. Vis. Exp. (178), e63101, doi:10.3791/63101 (2021).

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