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Environment

水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定

Published: December 07, 2021
doi:
10.3791/63101
,
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences,Shiv Nadar University

Summary

水生生物の生息地から炭化水素分解細菌を分離、増殖、および特性評価するプロセスを紹介します。このプロトコルは、細菌の分離、16S rRNA法による同定、およびそれらの炭化水素分解の可能性のテストの概要を示しています。この記事は、研究者が環境サンプル中の微生物の生物多様性を特徴付け、特にバイオレメディエーションの可能性がある微生物をスクリーニングするのに役立ちます。

Abstract

炭化水素汚染物質は劣化に抵抗性があり、環境への蓄積はすべての生命体に有毒です。細菌は多数の触媒酵素をコードし、自然に炭化水素を代謝することができます。科学者は、水生生態系の生物多様性を利用して、生分解とバイオレメディエーションの可能性がある細菌を分離します。環境からのこのような単離物は、代謝経路および酵素の豊富なセットを提供し、これらはさらに、工業規模で分解プロセスをスケールアップするために利用することができる。この記事では、水生生息地からの細菌種の分離、繁殖、および同定の一般的なプロセスの概要を説明し、簡単な手法を使用してin vitro で炭化水素を唯一の炭素源として利用する能力をスクリーニングします。本プロトコルは、16S rRNA分析を用いた様々な細菌種の単離およびその後の同定を記載する。このプロトコルは、細菌分離株の炭化水素分解の可能性を特徴付けるためのステップも提示しています。このプロトコルは、バイオテクノロジーアプリケーションのために環境生息地から細菌種を分離しようとする研究者に役立ちます。

Introduction

炭化水素(HC)は、燃料としても化学用途でも広く使用されています。溶媒1としては、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素が広く用いられている。エチレンおよびプロピレンなどのアルケンは、それぞれポリエチレンおよびポリプロピレンポリマーの合成における前駆体として役立つ。他の炭化水素の重合、スチレンはポリスチレンを形成する。人為的活動は、その生産および輸送中に炭化水素を環境に導入します。土壌や水の炭化水素汚染は、環境と人間の健康に深刻な懸念を抱いています。微生物は、生物地球化学的循環を調節し、汚染物質や生体異物を含む幅広い基質を利用して炭素やエネルギー源に変換することにより、生態系を維持する上で主要な役割を果たしています。微生物による環境汚染物質の解毒のこのプロセスは、バイオレメディエーション3、4、5、6、7として知られています。

炭化水素を分解する能力を持つ微生物は、水生および土壌の生息地で見られます8,9,10。シュードモナス、アシネトバクター、ロドコッカス、マリノバクター、オレイバクター11など、アルカンや芳香族HCを分解する可能性のある多くの細菌が確認されています。技術的に高度な培養に依存しないアプローチの開発は、新しいHC分解微生物群集の発見に役立っています12。ソースサンプルから直接分離されたゲノム材料は、次世代シーケンシング(NGS)などのハイスループット法によって増幅およびシーケンシングされ、その後分析されるため、微生物を培養する必要がなくなります。メタゲノム解析などのNGS法は高価であり、増幅プロセスに関連する欠点に悩まされている13。炭化水素分解微生物の分離を標的とする選択的濃縮培養14などの培養技術は、研究者が細菌分離株の代謝経路を調査および操作できるようにするため、依然として有用です。

ゲノムDNAの単離とそれに続くゲノム材料の配列決定により、あらゆる生物に関する貴重な情報が明らかになります。全ゲノムシーケンシングは、抗生物質耐性、潜在的な薬物標的、病原性因子、トランスポーター、生体異物代謝酵素などをコードする遺伝子の同定に役立ちます15,16,17。16SrRNAコード遺伝子の配列決定は、細菌の系統発生を特定するための堅牢な技術であることが証明されています。長年にわたる遺伝子配列と機能の保存により、未知の細菌を同定し、分離株を最も近い種と比較するための信頼できるツールになります。また、この遺伝子の長さはバイオインフォマティクス解析に最適である18。これらすべての特徴に加えて、ユニバーサルプライマーを使用した遺伝子増幅の容易さと遺伝子シーケンシング技術の改善により、微生物の同定のゴールドスタンダードとなっています。

ここでは、環境試料からHC分解能を有する培養可能な微生物を回収する手順について述べる。以下に説明する方法は、HC分解細菌の収集と同定の概要を示しており、(1)水サンプルからの細菌の収集、(2)純粋培養物の分離、(3)細菌分離株のHC分解能力の探索、(4)ゲノムDNAの分離、および(5)16S rRNA遺伝子シーケンシングとBLAST分析に基づく同定の5つのセクションに分かれています。この手順は、多くの異なるバイオテクノロジー用途のために細菌を単離するために適応させることができます。

Protocol

1. サンプルの収集、処理、分析 注:ここでは、水生生物の生息地から細菌を分離するためのプロトコルを示します。一部の分離株は病原性である可能性があるため、手袋を着用し、使用の前後に作業領域を消毒してください。 水域のさまざまな場所から500 mLの水サンプルを5つの滅菌ガラス瓶に収集します。各サンプルのpHと温度をそれぞれpHメーター?…

Representative Results

水生生息地からの細菌の単離とスクリーニング、およびその後の16S rRNA分析による同定の手順全体を概説した概略図を図1に示します。インドのダドリの湿地からの水サンプルは、滅菌ガラス瓶に集められ、すぐに処理のために実験室に運ばれました。サンプルを孔径0.22μmのフィルターシートに通し、ろ紙を異なるメディアプレートに接触させた。2時間後、…

Discussion

実験室6では、地球上の細菌の約1%しか容易に培養できないことは十分に確立されています。培養可能な細菌の中でも、多くは特徴付けられていないままです。分子法の改良は、細菌群集の分析と評価に新しい次元を与えました。ただし、このような手法には制限がありますが、培養分析が冗長になるわけではありません。個々の細菌種を単離するための純粋な培養技術は、?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Karthik Krishnan博士とRPラボのメンバーの有益なコメントや提案に感謝します。DSは、SNU-Doctorフェローシップとアースウォッチ・インスティテュート・インド・フェローシップの支援を受けています。RPラボは、シブナダール大学からのCSIR-EMR助成金とスタートアップ資金によってサポートされています。

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A4718 Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma-Aldrich A9434 Growth medium component
Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A4418 Growth medium component
Bacto-Agar Millipore 1016141000 Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2) MERCK C4901-500G Growth medium component
Catechol Sigma-Aldrich 135011 Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB Sigma-Aldrich H6269 Genomic DNA Isolation
Chloroform HIMEDIA MB109 Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S5136 Growth medium component
EDTA Sigma-Aldrich E9884 gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) Sigma-Aldrich 215422 Growth medium component
Glucose Sigma-Aldrich G7021 Growth medium component
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Growth medium component; Glycerol stocks
Isopropanol HIMEDIA MB063 Genomic DNA isolation
LB Agar Difco 244520 Growth medium
Luria-Bertani (LB) Difco 244620 Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4) MERCK M2643 Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) Sigma-Aldrich 221287 Growth medium component
Nutrient Broth (NB) Merck (Millipore) 03856-500G Growth medium
Peptone Merck 91249-500G Growth medium component
Phenol Sigma-Aldrich P1037 Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786 Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Growth medium component
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2546 Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 160016235 DNA purification
QIAquick PCR Purification kit QIAGEN 163038783 DNA purification
R2A Agar Millipore 1004160500 Growth medium
SmartSpec Plus Spectrophotometer BIO-RAD 4006221 Absorbance measurement
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma-Aldrich L3771 Genomic DNA isolation
Styrene Sigma-Aldrich S4972 Styrene biodegradation
Taq DNA Polymerase NEB M0273X 16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE) Sigma-Aldrich 93283 Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB) Merck 22092-500G Growth medium
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG Growth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) Sigma-Aldrich 221376 Growth medium component
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References

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Keywords: Hydrocarbon-degrading MicroorganismsAquatic HabitatsIsolationCultivationIdentificationBacterial SpeciesWater SampleNutrient MediaDilutionColony ScreeningGram StainingGlycerol StocksHydrocarbon Metabolism
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Sethi, D., Priyadarshini, R. Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats. J. Vis. Exp. (178), e63101, doi:10.3791/63101 (2021).
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