Summary
Presentamos el proceso de aislamiento, propagación y caracterización de bacterias degradadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos. El protocolo describe el aislamiento bacteriano, la identificación mediante el método de ARNr 16S y las pruebas de su potencial de degradación de hidrocarburos. Este artículo ayudaría a los investigadores a caracterizar la biodiversidad microbiana en muestras ambientales y, específicamente, a detectar microbios con potencial de biorremediación.
Abstract
Los hidrocarburos contaminantes son recalcitrantes a la degradación y su acumulación en el medio ambiente es tóxica para todas las formas de vida. Las bacterias codifican numerosas enzimas catalíticas y son naturalmente capaces de metabolizar hidrocarburos. Los científicos aprovechan la biodiversidad de los ecosistemas acuáticos para aislar bacterias con potencial de biodegradación y biorremediación. Estos aislados del medio ambiente proporcionan un rico conjunto de vías metabólicas y enzimas, que pueden utilizarse aún más para ampliar el proceso de degradación a escala industrial. En este artículo, describimos el proceso general de aislamiento, propagación e identificación de especies bacterianas de hábitats acuáticos y evaluamos su capacidad para utilizar hidrocarburos como única fuente de carbono in vitro utilizando técnicas simples. El presente protocolo describe el aislamiento de diversas especies bacterianas y su posterior identificación mediante el análisis de ARNr 16S. El protocolo también presenta pasos para caracterizar el potencial de degradación de hidrocarburos de los aislados bacterianos. Este protocolo será útil para los investigadores que intentan aislar especies bacterianas de hábitats ambientales para sus aplicaciones biotecnológicas.
Introduction
Los hidrocarburos (HC) se utilizan ampliamente como combustibles y en aplicaciones químicas. Los hidrocarburos aromáticos como el benceno, el tolueno y el xileno se utilizan ampliamente como disolventes1. Alquenos como el etileno y el propileno sirven como precursores en la síntesis de polímeros de polietileno y polipropileno, respectivamente. La polimerización de otro hidrocarburo, el estireno forma poliestireno. Las actividades antropogénicas introducen hidrocarburos en el medio ambiente durante su producción y transporte. La contaminación del suelo y el agua por hidrocarburos preocupa seriamente el medio ambiente y la salud humana. Los microbios desempeñan un papel importante en el mantenimiento del ecosistema mediante la regulación de los ciclos biogeoquímicos y la utilización de una amplia gama de sustratos, que incluyen también contaminantes y xenobióticos, convirtiéndolos en carbono y fuente de energía. Este proceso de desintoxicación de contaminantes ambientales por microorganismos se conoce como biorremediación 3,4,5,6,7.
Los microorganismos con capacidad para degradar hidrocarburos se encuentran en hábitats acuáticos y edáficos 8,9,10. Se han identificado muchas bacterias con el potencial de degradar alcanos y HC aromáticos, como Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter y Oleibacter11. El desarrollo de enfoques tecnológicamente avanzados e independientes de la cultura ha ayudado a descubrir nuevas comunidades microbianas que degradan el HC12. El material genómico aislado directamente de las muestras de origen se amplifica y secuencia mediante métodos de alto rendimiento, como la secuenciación de nueva generación (NGS), seguida de un análisis, lo que elimina la necesidad de cultivar microorganismos. Los métodos de NGS, como el análisis del metagenoma, son caros y sufren inconvenientes relacionados con el proceso de amplificación13. Las técnicas de cultivo, como el cultivo de enriquecimiento selectivo14, que tienen como objetivo el aislamiento de microbios que degradan hidrocarburos, siguen siendo útiles, ya que permiten a los investigadores sondear y manipular las vías metabólicas en aislados bacterianos.
El aislamiento del ADN genómico y la posterior secuenciación del material genómico revelan información valiosa sobre cualquier organismo. La secuenciación del genoma completo ayuda en la identificación de genes que codifican la resistencia a los antibióticos, posibles dianas farmacológicas, factores de virulencia, transportadores, enzimas metabolizadoras de xenobióticos, etc.15,16,17. Se ha demostrado que la secuenciación del gen que codifica el 16SrRNA es una técnica robusta para identificar la filogenia bacteriana. La conservación de la secuencia y la función del gen a lo largo de los años lo convierte en una herramienta fiable para identificar bacterias desconocidas y comparar un aislado con las especies más cercanas. Además, la longitud de este gen es óptima para el análisis bioinformático18. Todas estas características, junto con la facilidad de amplificación de genes mediante cebadores universales y la mejora en la tecnología de secuenciación de genes, lo convierten en un estándar de oro para la identificación de microbios.
En este trabajo se describe un procedimiento para recuperar microorganismos cultivables con potencial de degradación de HC a partir de muestras ambientales. El método que se describe a continuación describe la recolección e identificación de bacterias degradadoras de HC y se divide en cinco secciones: (1) recolección de bacterias a partir de muestras de agua, (2) aislamiento de cultivos puros, (3) exploración de la capacidad de degradación de HC de aislados bacterianos, (4) aislamiento de ADN genómico y (5) identificación basada en la secuenciación del gen 16S rRNA y el análisis BLAST. Este procedimiento se puede adaptar para aislar bacterias para muchas aplicaciones biotecnológicas diferentes.
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Protocol
1. Recolección, procesamiento y análisis de muestras
NOTA: A continuación, presentamos un protocolo para aislar bacterias de hábitats acuáticos. Algunos de los aislados pueden ser patógenos, por lo tanto, use guantes y desinfecte el área de trabajo antes y después de su uso.
- Recoja 500 ml de muestra de agua en cinco botellas de vidrio estériles de diferentes sitios del cuerpo de agua. Mida el pH y la temperatura de cada muestra con un medidor de pH y un termómetro, respectivamente.
NOTA: El protocolo no es específico del sitio y también se puede adaptar fácilmente para aislar organismos de cuerpos de agua contaminados con hidrocarburos. - Filtre la muestra en un lote de 100 ml a través de láminas filtrantes de 0,22 μm de tamaño de poro, en condiciones asépticas.
NOTA: El diámetro del papel de filtro no debe exceder el diámetro de la placa de Petri. Por ejemplo, el papel de filtro que no supere los 85 mm de diámetro es óptimo para una placa de Petri de 100-120 mm. - Mantenga los papeles de filtro sobre diferentes placas de medios nutritivos (PYE 19, R2A20,M9, LB, NB, TSB, M63 21 y M2G22). Los diferentes tipos de medios de cultivo permiten la selección y enriquecimiento de diferentes microorganismos. Las composiciones de varios medios de crecimiento se enumeran en la Tabla 1. Utilice un papel para cada placa de medios y despegue después de 2 h con pinzas estériles.
- Diluir en serie las muestras de agua sin filtrar (dilución 106 ) en agua bidestilada estéril añadiendo 100 μL de la muestra de agua recogida en 900 μL de agua estéril. Esto da como resultado una dilución de 1:10. A partir de esta muestra, tomar 100 μL y añadir 900 μL de agua estéril para obtener una dilución 1:100. Repita la dilución hasta que el pliegue de dilución sea 1:1.000.000. Mezclar por pipeteo. El volumen final de cada dilución será de 1 mL.
- Extienda 100 μL de la muestra de agua diluida individualmente en todas las placas de medios de crecimiento mencionadas en el paso 3 por triplicado.
- Incubar las placas a 30 °C durante 24 a 48 h dependiendo del crecimiento de las colonias.
NOTA: La mayoría de los aislados ambientales crecen a una temperatura óptima de 30 °C. Si aísla las muestras de un ambiente con temperaturas extremas, incube las placas a la misma temperatura que la del sitio de recolección. - A continuación, recoja las colonias con un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta y realice un rayado de cuadrante para obtener colonias aisladas.
- Incuba las placas durante la noche. Al día siguiente, examine las colonias en función de sus características morfológicas, como el color, la textura, la forma, el tamaño, el margen, la elevación, etc. Repintar las colonias para obtener cultivos puros.
- Realice la tinción de Gram de cada cultivo puro23 y proceda con la preparación del caldo de glicerol.
- Para preparar las reservas de glicerol, inocular una sola colonia en 3 ml de medio de cultivo adecuado e incubar a 30 °C. Del cultivo nocturno, tomar 700 μL y añadir 300 μL de glicerol al 100% (esterilizado en autoclave) en crioviales24. Congele los viales a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
2. Degradación de hidrocarburos
NOTA: El siguiente ejemplo es para examinar los aislados que pueden degradar el estireno. Se trata de una ligera modificación del método adaptado en un informe anterior25. Siga los pasos en condiciones asépticas.
- De un plato recién rayado, elija una colonia e inocule en 5 ml de caldo de soja tríptico (TSB)/caldo nutritivo (NB). Cultive el cultivo durante la noche a 30 °C con agitación a 200 rpm hasta que la absorbancia alcance ~2.
NOTA: Aparte de TSB/NB, se puede elegir cualquier medio de cultivo en el que las bacterias alcancen una alta densidad celular. - Al día siguiente, pegue las células a 2862 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante.
- Lavar el pellet dos veces con 2 ml de solución salina esterilizada en autoclave (0,9% NaCl) y centrifugar a 2862 x g durante 5 min a 4 °C.
NOTA: La solución salina es isotónica y, por lo tanto, mantiene la presión osmótica dentro de las células bacterianas. - Resuspenda el pellet en 2 mL de medio basal líquido libre de carbono (LCFBM). Mida la absorbancia (OD600).
- Tomar dos matraces estériles Erlenmeyer con capacidad de 150 mL para el control y el grupo experimental. Etiquétalos como A y B.
- En el grupo no inoculado/control (matraz A), añadir 40 mL de LCFBM y estireno (5 mM).
- En el matraz B, añadir 35 mL de LCFBM y estireno (ajustar la concentración final de estireno a 5 mM). Añadir la suspensión celular con un diámetro exterior final de600 células ≈ 0,1 y compensar el volumen restante con LCFBM hasta 40 mL. Incubar los matraces a 30 °C agitando a 200 rpm durante 30 días.
NOTA: Los hidrocarburos en exceso pueden ser tóxicos para los microbios, por lo tanto, comience con baja concentración y auméntela gradualmente. - Repita lo anterior para cada deformación adicional que deba evaluarse para la degradación de hidrocarburos.
- Mida el OD600 de cada matraz cada 5 días y trace una curva de crecimiento. Aumente la incubación hasta 45 días si las bacterias pueden utilizar estireno. Un aumento en OD600 indica que la bacteria puede metabolizar el estireno.
3. Cribado de la degradación de catecol por aislados bacterianos
NOTA: La degradación de hidrocarburos aromáticos como estireno, benceno, xileno, naftaleno, fenoles, etc. produce catecoles como intermediarios de reacción. Los catecoles son metabolizados por las bacterias con la ayuda de las enzimas catecol 1,2-dioxigenasa y catecol 2,3-dioxigenasa a través de las vías de orto- y meta-escisión, respectivamente26. Estas enzimas también intervienen en la degradación de otros hidrocarburos como el clorobenceno27. El protocolo que se menciona a continuación utiliza lisado de células enteras para el ensayo de la enzima catecol 2, 3-dioxigenasa28. El mismo método de lisis se puede utilizar para detectar la actividad de la catecol 1,2-dioxigenasa. Sin embargo, la composición de la mezcla de reacción variará. Ambas enzimas son de naturaleza inducible y pueden ser inducidas por la adición de fenol al medio de crecimiento.
- Con la ayuda de un asa estéril, inocule la colonia bacteriana de una placa recién rayada en un medio de sales minerales (MSM) suplementado con 1-4 mM de fenol. Incubar el cultivo a 30 °C y 200 rpm. Coseche el cultivo a 4 °C cuando el DO 600 alcance entre 1,4 y 1,6 (es decir, en fase exponencial tardía) centrifugando a4500 x g durante 20 min.
- Lavar el gránulo celular con tampón de fosfato (0,5 M, pH 7,5).
- Vuelva a suspender las células en el tampón de fosfato mencionado anteriormente y ajuste el ODfinal 600 ≈ 1,0.
- Lisar las células mediante sonicación pulsada durante 1,5 min, siendo la duración de cada pulso de 15 s. Después de este paso, la suspensión debe ser clara o menos turbia. Si no es así, aumente el número de pulsos y compruebe si la suspensión está despejada. Después de cada pulso, mantenga la muestra en hielo para evitar la degradación de las proteínas.
- Eliminar los restos celulares y las células intactas mediante centrifugación a 9.000 x g durante 30 min, manteniendo la temperatura fría (4 °C).
- Pipetear con cuidado el sobrenadante transparente. Esta fracción tiene el extracto crudo para el ensayo enzimático.
- Determinar la concentración proteica del extracto crudo por el método de Bradford o Lowry29,30.
- Para determinar la actividad de la catecol 2,3-dioxigenasa, se mide la formación del producto final de la reacción (semialdehído 2-hidroximucónico) mediante un espectrofotómetro.
- Prepare la mezcla de reacción añadiendo 20 μL de catecol (50 mM), 960 μL de tampón fosfato (50 mM, pH 7,5) y 20 μL de extracto crudo.
- Para el control negativo, reemplace el extracto crudo con tampón de fosfato y ajuste el volumen final a 1 mL.
- Incubar la mezcla de reacción durante 30 min. A intervalos de tiempo establecidos, mida la absorbancia a 375 nm. Un aumento en la absorbancia indica la formación del producto final de la reacción, el semialdehído del ácido 2-hidroximucónico (2-HMS). Realice el experimento por triplicado.
NOTA: El catecol es sensible a la luz y al oxígeno. Guarde la mezcla de reacción en la oscuridad y cierre bien los tubos para evitar la degradación natural del catecol.
4. Aislamiento genómico del ADN del cultivo puro
NOTA: Este es el protocolo general para el aislamiento de ADN genómico. La tinción de Gram se realizó durante la etapa de recolección, procesamiento y análisis de la muestra. Debido a la variación en el grosor de la pared celular de las bacterias grampositivas y gramnegativas, el método de lisis celular se modifica en consecuencia. Use guantes mientras aísla y desinfecte el banco de trabajo con etanol al 70% para evitar que las nucleasas degraden el ADN. Algunos de los productos químicos que se mencionan a continuación pueden causar quemaduras graves en la piel y se debe tener el cuidado adecuado al manipularlos.
- Aislamiento de ADN genómico de bacterias gramnegativas31.
- Elija una sola colonia e inocule en un medio de cultivo fresco en tubos de ensayo estériles.
- Coloque los tubos en un agitador de incubadora a 200 rpm y deje que las bacterias crezcan durante la noche a 30 °C.
- Al día siguiente, pelines de 1,5 ml de cultivo cultivado durante la noche a 12.400 x g durante 3 min.
- Retirar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 200 μL de tampón de lisis (40 mM de acetato de tris, pH 7,8, 20 mM de acetato de sodio, 1 mM de EDTA, 1% de SDS).
- Añadir 66 μL de solución de NaCl (5 M) y mezclar bien.
- Gellet la mezcla resultante a 12.400 x g durante 10 min (4 °C).
- Pipetear el sobrenadante transparente en un tubo de microcentrífuga nuevo y añadir un volumen igual de cloroformo.
- Invierta, mezcle la solución varias veces hasta que se observe una solución lechosa.
- Girar a 12.400 x g durante 3 min y transferir el sobrenadante a un vial limpio.
- Agregue 1 ml de etanol 100% helado; mezclar por inversión hasta que se precipiten hebras blancas de ADN.
- Centrifugar el ADN precipitado a 2.200 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Lave el gránulo de ADN con 1 ml de etanol al 70% y deje que el gránulo de ADN se seque durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Una vez seco, vuelva a suspender el gránulo en 100 μL de 1x tampón Tris-EDTA(TE) y almacene el ADN a -20 °C.
- Mida la concentración (A260/280) con un espectrofotómetro y ejecute el ADN en gel de agarosa (1%) para evaluar la calidad del ADN24.
- Aislamiento de ADN genómico de la cepa grampositiva32
- Elija una sola colonia e inocule en medio de cultivo fresco en tubos de ensayo estériles.
- Coloque los tubos en un agitador de incubadora a 200 rpm y deje que las bacterias crezcan durante la noche a una temperatura de crecimiento adecuada.
- Al día siguiente, tome 1,5 ml del cultivo cultivado y centrifugue a 8.600 x g durante 5 minutos.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el tampón TE.
- Ajuste el diámetro exterior600 = 1,0 con tampón TE y transfiera 740 μL de la suspensión celular a un tubo de microfuga limpio.
- Añadir 20 μL de lisozima (100 mg/ml de stock) y mezclar bien pipeteando. Incubar a 37 °C durante 30 min (en baño seco).
- Añadir 40 μL de SDS al 10% y mezclar bien.
- Añadir 8 μL de proteinasa K (10 mg/mL). Mezclar bien e incubar a 56 °C durante 1-3 h (en baño seco). La suspensión debería aclararse ahora con una mayor viscosidad, lo que marca una lisis celular eficiente.
NOTA: La suspensión se puede dejar toda la noche si las células no se lisan correctamente. - Precalentar la mezcla CTAB/NaCl a 65 °C (en baño seco) y añadir 100 μL de esta mezcla a la suspensión celular. Mezclar bien.
- Incubar a 65 °C durante 10 min (en baño seco).
- Añadir 500 μL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y mezclar bien. Centrifugar a 16.900 x g durante 10 min a 25 °C.
- Transferir la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga fresco evitando la fase orgánica (fase viscosa en la parte inferior).
- Agregue con cuidado 500 μL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y mezcle bien. Centrifugar a 16.900 x g durante 10 min a 25 °C.
- Tomar la fase acuosa en un tubo de microcentrífuga nuevo. Añadir 500 μL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y mezclar bien.
- Trasvasar la fase acuosa y añadir isopropanol de 0,6 volúmenes (preenfriado a -20 °C).
- Las hebras de ADN precipitadas deben ser visibles en forma filiforme. Incubar a -20 °C durante 2 h o toda la noche.
- Centrifugar a 16.900 x g durante 15 min a 4 °C para granular el ADN.
- Decantar el isopropanol con cuidado y lavar el pellet con 1 ml de etanol frío al 70% (preenfriado a -20 °C) para eliminar las impurezas.
- Centrifugar a 16.900 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Deje que el gránulo se seque a temperatura ambiente durante 20 minutos o mantenga el tubo a 37 °C. Asegúrese de que el gránulo no esté demasiado seco.
- Vuelva a suspender en 100 μL de tampón TE 1x y almacene el ADN a -20 °C.
NOTA: Si el gránulo se seca demasiado y es difícil de resuspender, incubar el tubo de microcentrífuga con gránulo de ADN y agua libre de nucleasa a 37 °C durante 15-20 min y volver a suspender mediante pipeteo. - Mida la concentración (A260/280) con un espectrofotómetro después de realizar una dilución 1:100 en tampón TE 1x y ejecute el ADN en gel de agarosa (1%) para evaluar la calidad del ADN24.
5. Secuenciación del ARNr 16S
NOTA: El protocolo que se describe a continuación es para la amplificación y secuenciación del ARNr 16S para la identificación bacteriana. La información derivada de la secuencia de ARNr 16S se utiliza para la identificación de un organismo desconocido y para encontrar la relación entre diferentes organismos.
- Para identificar las cepas, amplifique el ADN aislado de los cultivos bacterianos puros mediante PCR con cebadores universales dirigidos a la secuencia de ARNr 16S para bacterias: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') y 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- Prepare la mezcla de PCR (reacciones de 25 μL) en hielo con 18 μL de agua esterilizada en autoclave/libre de nucleasas, 2,5 μL de tampón 10x, 0,5 μL de cebadores directos e inversos (100 μM de stock), 2 μL de la mezcla de dNTPs (100 μM de stock), 1 μL de molde de ADN (2-15 ng/μL) y 1 U de Taq Polimerasa.
- Utilice las siguientes condiciones cíclicas para la amplificación del gen ARNr 16S: desnaturalización inicial a 94 °C durante 10 min, (desnaturalización final a 94 °C durante 40 s, recocido de cebador a 56 °C durante 1 min, extensión a 74 °C durante 2 min) x 30 ciclos, extensión final a 74 °C durante 10 min.
- Una vez finalizado el ciclo, mezcle 5 μL de muestra y 1 μL de colorante de carga de ADN 5x. Aplicar gel de agarosa al 1% para verificar la amplificación. Almacene los productos de PCR a 4 °C a corto plazo o congélelos a -20 °C hasta su uso posterior.
- Para la secuenciación del gen ARNr 16S, configure la misma reacción que se mencionó anteriormente para un volumen mayor (100 μL).
- Purifique los amplicones para la secuenciación Sanger24,34 utilizando el kit de purificación de productos de PCR o mezcle toda la muestra con un colorante de carga de ADN y cárguela en un gel de agarosa para realizar el método de extracción en gel.
- Una vez realizada la secuenciación, convierta el archivo de resultados en formato FASTA y compruebe la similitud de la secuencia con la herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST) en NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.
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Representative Results
En la Figura 1 se representa el esquema que describe todo el procedimiento para el aislamiento y cribado de bacterias de hábitats acuáticos y su posterior identificación mediante análisis de ARNr 16S. Se recogieron muestras de agua de un humedal en Dadri, India, en botellas de vidrio estériles e inmediatamente se llevaron al laboratorio para su procesamiento. Las muestras se pasaron a través de láminas de filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm, y los papeles de filtro se mantuvieron en contacto con diferentes placas de medios. Después de 2 h, se retiraron los papeles de filtro y las placas se incubaron durante la noche a 30 °C para la formación de colonias (Figura 2). Al día siguiente, se seleccionaron colonias bacterianas individuales y se colocaron en placas de medios frescos (Figura 2). El cultivo puro generado se almacenó y posteriormente se utilizó para su posterior análisis. Usando este método, pudimos crear una biblioteca de más de 100 aislados bacterianos únicos. Nuestro objetivo fue identificar aislados bacterianos que puedan utilizar hidrocarburos, especialmente estireno, que es el componente principal del plástico de un solo uso. Las bacterias aisladas se cultivaron individualmente en los medios respectivos con la adición de estireno líquido como única fuente de carbono (Figura 3). Pudimos identificar cuatro aislados que utilizan estireno como única fuente de carbono. Dos de los aislados fueron ampliamente caracterizados para la degradación del estireno25.
A continuación, se analizaron los aislados bacterianos para detectar la presencia de vías enzimáticas para la degradación del metabolismo de los hidrocarburos. El metabolismo de los hidrocarburos en algunas bacterias da lugar a la producción de catecoles como intermediarios, que se degradan aún más por las vías de ortoescisión y metaescisión. Las enzimas catecol 1,2-dioxigenasa y catecol 2,3-dioxigenasa son responsables de la reacción de escisión del anillo36. Se ha demostrado que las bacterias ambientales que poseen estas enzimas metabolizan varios compuestos aromáticos. Por lo tanto, se realizó un ensayo de degradación de catecol para evaluar el potencial de degradación de HC de aislados bacterianos (Figura 4). En la Figura 4 se muestra un ensayo representativo de uno de los aislados.
Para identificar los aislamientos bacterianos, se realizó la secuenciación del ARNr 16S. Se realizó una tinción de Gram preliminar para caracterizar las bacterias, lo que ayuda a identificar y solucionar los pasos posteriores. Las bacterias grampositivas suelen ser recalcitrantes a los tampones de lisis celular, lo que conduce a un bajo rendimiento genómicodel ADN 37. Por lo tanto, los resultados obtenidos de la tinción de Gram38 antes del aislamiento del ADN genómico ayudarían a elegir el protocolo para el aislamiento del ADN genómico. Después del aislamiento del ADN, la integridad del ADN genómico se confirmó visualizando una pequeña muestra de ADN en gel de agarosa (Figura 5A) y se cuantificó mediante el método de absorbancia UV utilizando un espectrofotómetro. El gen 16S rRNA se amplificó utilizando la secuencia de cebadores universales (Figura 5B). Mientras que 500 pb son esenciales para la secuenciación, los resultados ideales se obtienen con 1.300-1.500 pb39. Para obtener el grado de parentesco entre cepas aisladas, se construyó un árbol filogenético utilizando el software phylogeny.fr40 (Figura 6).
Figura 1: Flujo de trabajo esquemático del estudio Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de colonias bacterianas a partir de muestras de agua. La muestra de agua recolectada se pasó a través de un papel de filtro de 0,22 μm. Los papeles de filtro se mantuvieron sobre diferentes placas de medios. Las placas se incubaron durante 24-48 h hasta que se observaron colonias aisladas. A continuación, las colonias individuales se colocaron en platos frescos para el aislamiento puro de la cultura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de la degradación microbiana del estireno y el potencial de degradación de hidrocarburos de las bacterias. Las células se cultivaron en LCFBM suplementado con 5 mM de estireno como única fuente de carbono durante 40 días a 30 °C y 200 rpm. Se midió OD600 cada 5 días. El matraz de control solo tenía LCFBM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representación del ensayo de la enzima catecol 2,3-dioxigenasa para monitorizar la degradación del catecol. (A) El sustrato incoloro catecol se convierte en un producto de color amarillo por la acción de la catecol 2,3-dioxigenasa. La mezcla de reacción contiene catecol, tampón fosfato y lisado celular crudo. La formación del producto se detecta midiendo la absorbancia a 375 nm. (B) Gráfico representativo del ensayo de la enzima catecol 2,3-dioxigenasa con lisado de células enteras. La mezcla de reacción en control negativo tiene tampón y sustrato catecol sin lisado celular. La absorbancia se midió a 375 nm en un intervalo de 10 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Aislamiento de ADN genómico y PCR de ARNr 16S. (A) Electroforesis en gel de ADN genómico aislado. Carril M: marcador de tamaño de ADN, Carril 1-2: ADN genómico. (B) Verificación de la amplificación del gen ARNr 16S mediante electroforesis en gel al 1%. Los geles se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio; Carril M: Marcador de tamaño de ADN (1 kb), Carril 1-4: Productos de PCR amplificados de diferentes cepas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis de los resultados de la secuenciación del gen 16S rRNA. Construcción representativa de dendrogramas utilizando el programa phylogeny.fr para representar la relación entre cepas de Exiguobacterium aisladas de un humedal (resaltadas en el recuadro rojo) con el conocido Exiguobacterium sp. Las secuencias de ARNr 16S de Exiguobacterium sp. conocidas se obtuvieron del NCBI. Esta cifra ha sido tomada de un artículo anterior (Chauhan et.al.) sin ninguna modificación25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Extracto de levadura de peptona (PYE) | |
| Peptona | 2g |
| Extracto de levadura | 1g |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| 1M CaCl2 | 1 ml |
| Agua destilada | Hasta 1000 ml |
| Esterilizar en autoclave a 121 °C y 15 PSI durante 15 min. | |
| Razonador 2A (R2A) | |
| Hidrolizado de ácido de caseína | 0,5 g |
| Extracto de levadura | 0,5 g |
| Peptona proteasa | 0,5 g |
| Dextrosa | 0,5 g |
| Almidón soluble | 0,5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| Agua destilada | Hasta 1000 ml |
| Esterilizar en autoclave a 121 °C y 15 PSI durante 15 min. | |
| M2G | |
| 10X sales M2 (1L) - | |
| Na2HPO4 | 17,4 g |
| KH2PO4 | 10,6 g |
| NH4Cl | 5,0 g |
| Autoclave 10X sales M2 a 121 °C y 15 PSI durante 15 min. | |
| 10X sales M2 | 100 ml |
| 50mM MgCl2 | 10 ml |
| 30% de glucosa (p/v) | 10 ml |
| 1 mM FeSO4 en 0,8 mM EDTA, pH 6,8 | 10 ml |
| 50 mM CaCl2 | 10 ml |
| Agua destilada | Hasta 1000 ml |
| Esterilizar con filtro. | |
| Caldo de Lisogenia (LB) | |
| Hidrolizado enzimático de caseína | 10 g |
| Extracto de levadura | 5 g |
| NaCl | 10 g |
| Agua destilada | Hasta 1000 ml |
| Esterilizar en autoclave a 121 °C y 15 PSI durante 15 min. | |
| Caldo nutritivo (NB) | |
| Peptona | 15 g |
| Extracto de levadura | 3 g |
| NaCl | 6 g |
| Glucosa | 1 g |
| Agua destilada | Hasta 1000 ml |
| Esterilizar en autoclave a 121 °C y 15 PSI durante 15 min. | |
| Caldo de soja tríptico (TSB) | |
| Digestión pancreática de la caseína | 17,0 g |
| Digestión papaica de harina de soja | 3 g |
| NaCl | 5 g |
| K2HPO4 | 2,5 g |
| Dextrosa | 2,5 g |
| Agua destilada | Hasta 1000 ml |
| Esterilizar en autoclave a 121 °C y 15 PSI durante 15 min. | |
| M63 | |
| NH4Cl | 2g |
| KH2PO4 | 13,6 g |
| FeSO4.7H 2O | 0,5 mg |
| 20% glicerol | 10 ml |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| Agua destilada | Hasta 1000 ml |
| Medios mínimos M9 | |
| 5 sales M9 | |
| Na 2HPO4.7H 20 | 12,8 g |
| KH2PO4 | 3 g |
| NH4Cl | 1 g |
| NaCl | 0,5 g |
| Agua destilada | Hasta 200 ml |
| Autoclave 5X sales M9 a 121°C y 15 PSI durante 15 min. | |
| 1 medio M9 | |
| 5 sales M9 | 20 ml |
| 20% de glucosa | 2 ml |
| 1M MgSO4 | 200 μl |
| 1M CaCl2 | 10 μl |
| Agua esterilizada en autoclave | Hasta 100 ml |
| NOTA – Para la preparación de medios sólidos, utilice Bacto Agar al 1,5% (15 g/L) |
Tabla 1.
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Discussion
Está bien establecido que solo aproximadamente el 1% de las bacterias de la Tierra se pueden cultivar fácilmente en el laboratorio6. Incluso entre las bacterias cultivables, muchas permanecen sin caracterizar. Las mejoras en los métodos moleculares han dado una nueva dimensión al análisis y evaluación de las comunidades bacterianas. Sin embargo, estas técnicas tienen limitaciones, pero no hacen que los análisis de la cultura sean redundantes. Las técnicas de cultivo puro para aislar especies bacterianas individuales siguen siendo el mecanismo principal para la caracterización de las propiedades fisiológicas. El suelo y los hábitats acuáticos albergan muchas bacterias con enzimas y vías novedosas, que pueden aprovecharse para usos biotecnológicos. Este estudio describe un método simple y económico para el aislamiento y caracterización de bacterias a partir de muestras ecológicas.
Las diferentes bacterias tienen diferentes requisitos nutricionales, por lo que se utilizaron varios medios de cultivo para aumentar la probabilidad de aislar diversas especies bacterianas. Una limitación importante de este método es que los microbios con requisitos de crecimiento exigentes pueden ser excluidos. Además, el objetivo principal de este paso es maximizar el número de especies bacterianas obtenidas de la muestra. El número de especies bacterianas en la biblioteca de muestras mejoraría las posibilidades de aislar microbios con potencial de biorremediación. Aunque solo variamos los medios de cultivo, variar la temperatura de crecimiento y la concentración de oxígeno también puede aumentar las posibilidades de ampliar aún más la biblioteca de muestras con especies únicas41,42.
Un paso crítico del protocolo es comprobar la utilización del sustrato que se está probando (estireno en nuestro caso). Es importante diseñar el experimento para dicha investigación con cuidado para evitar resultados falsos negativos. Dependiendo de las características de crecimiento, es posible que el microbio no se adapte inmediatamente a la utilización del sustrato que se está probando y puede requerir un proceso de enriquecimiento. En nuestro caso, el crecimiento bacteriano es lento en el medio LCFBM utilizado para probar la utilización de hidrocarburos como única fuente de carbono25. Para evitar este problema, los cultivos iniciales pueden iniciarse añadiendo (1% v/v) TSB o NB al medio LCFBM para favorecer el crecimiento bacteriano. La identificación del microbio cultivado se realiza a través de la secuenciación del ARNr 16S43. Este método ofrece un método robusto y rentable para la identificación microbiana. Sin embargo, la secuenciación de 16S solo puede proporcionar una identificación taxonómica de alto nivel. Para la identificación a nivel de especie específica, se deben utilizar otros cebadores específicos de la familia combinados con diversas pruebas bioquímicas44,45.
El ensayo enzimático con lisado de células enteras requiere el uso de un método eficiente de lisis celular. La lisis de las células bacterianas suele lograrse realizando la sonicación. Sin embargo, un método de congelación y descongelación es un método alternativo para la lisis celular suave, que se cree que evita la desnaturalización de las proteínas. El procedimiento consiste en congelar rápidamente las células a -80 °C y descongelarlas a 4 °C de forma secuencial46. La adición de detergentes suaves como NP-40 o Triton-X-100 también ayuda en la lisis celular y no desnaturaliza las proteínas, debido a su naturaleza no iónica47. Sin embargo, es posible que las bacterias con paredes celulares gruesas, como las cianobacterias48 , no se beneficien del método de lisis celular suave que utiliza detergentes49 y, por lo tanto, el método de lisis para el ensayo enzimático debe elegirse en consecuencia.
Al centrarse en la población bacteriana cultivable a partir de muestras ambientales, los investigadores pueden realizar rápidamente muchos experimentos diferentes. Los métodos descritos aquí no requieren el uso de instrumentos muy sofisticados y se pueden realizar fácilmente en una configuración de laboratorio estándar. Dado que se utilizan hidrocarburos y productos químicos peligrosos, el laboratorio debe estar equipado con una manipulación y eliminación adecuadas de acuerdo con los procedimientos operativos estándar. El enfoque descrito aquí se puede adaptar fácilmente para estudiar una variedad de especies bacterianas para numerosas aplicaciones biotecnológicas.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Karthik Krishnan y a los miembros del laboratorio de RP por sus útiles comentarios y sugerencias. DS cuenta con el apoyo de la beca de doctorado de SNU y la beca del Earthwatch Institute India. El laboratorio RP cuenta con el apoyo de una subvención CSIR-EMR y fondos iniciales de la Universidad Shiv Nadar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
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