Summary
Apresentamos o processo de isolamento, propagação e caracterização de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos de habitats aquáticos. O protocolo descreve o isolamento bacteriano, a identificação pelo método 16S rRNA e o teste de seu potencial degradador de hidrocarbonetos. Este artigo ajudará os pesquisadores na caracterização da biodiversidade microbiana em amostras ambientais e, especificamente, na triagem de micróbios com potencial de biorremediação.
Abstract
Os hidrocarbonetos poluentes são recalcitrantes à degradação e seu acúmulo no meio ambiente é tóxico para todas as formas de vida. As bactérias codificam numerosas enzimas catalíticas e são naturalmente capazes de metabolizar hidrocarbonetos. Os cientistas aproveitam a biodiversidade nos ecossistemas aquáticos para isolar bactérias com potencial de biodegradação e biorremediação. Tais isolados do ambiente fornecem um rico conjunto de vias metabólicas e enzimas, que podem ser posteriormente utilizadas para escalar o processo de degradação em escala industrial. Neste artigo, descrevemos o processo geral de isolamento, propagação e identificação de espécies bacterianas de habitats aquáticos e selecionamos sua capacidade de utilizar hidrocarbonetos como única fonte de carbono in vitro usando técnicas simples. O presente protocolo descreve o isolamento de várias espécies bacterianas e sua posterior identificação utilizando a análise do 16S rRNA. O protocolo também apresenta etapas para a caracterização do potencial degradador de hidrocarbonetos de isolados bacterianos. Este protocolo será útil para pesquisadores que tentam isolar espécies bacterianas de habitats ambientais para suas aplicações biotecnológicas.
Introduction
Os hidrocarbonetos (HC) são amplamente utilizados tanto como combustíveis quanto em aplicações químicas. Hidrocarbonetos aromáticos como benzeno, tolueno e xileno são amplamente utilizados como solventes1. Alcenos como etileno e propileno servem como precursores na síntese de polímeros de polietileno e polipropileno, respectivamente. Polimerização de outro hidrocarboneto, estireno forma poliestireno. As atividades antrópicas introduzem hidrocarbonetos no meio ambiente durante sua produção e transporte. A contaminação do solo e da água por hidrocarbonetos preocupa seriamente o ambiente e a saúde humana. Os micróbios desempenham um papel importante na manutenção do ecossistema, regulando os ciclos biogeoquímicos e utilizando uma ampla gama de substratos, que incluem poluentes e xenobióticos também, convertendo-os em carbono e fonte de energia. Esse processo de desintoxicação de contaminantes ambientais por microrganismos é conhecido como biorremediação 3,4,5,6,7.
Microrganismos com capacidade de degradar hidrocarbonetos são encontrados em habitats aquáticos e de solo 8,9,10. Muitas bactérias com potencial para degradar alcanos e HCs aromáticos têm sido identificadas, como Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter e Oleibacter11. O desenvolvimento de abordagens tecnologicamente avançadas independentes de cultura tem ajudado a descobrir novas comunidades microbianas degradadoras de HC12. O material genômico isolado diretamente das amostras de origem é amplificado e sequenciado por métodos de alto rendimento, como o Next Generation Sequencing (NGS), seguido de análise, eliminando a necessidade de cultivar microrganismos. Métodos de NGS, como a análise do metagenoma, são caros e sofrem de inconvenientes relacionados ao processo deamplificação13. Técnicas de cultivo como a cultura de enriquecimento seletivo14 que visam o isolamento de micróbios degradadores de hidrocarbonetos ainda são úteis, pois permitem aos pesquisadores sondar e manipular vias metabólicas em isolados bacterianos.
O isolamento do DNA genômico e o subsequente sequenciamento do material genômico revelam informações valiosas sobre qualquer organismo. O sequenciamento do genoma completo auxilia na identificação de genes que codificam resistência a antibióticos, potenciais alvos de drogas, fatores de virulência, transportadores, enzimas metabolizadoras de xenobióticos, etc15,16,17. O sequenciamento do gene codificador do 16SrRNA provou ser uma técnica robusta para identificar a filogenia bacteriana. A conservação da sequência e função do gene ao longo dos anos o torna uma ferramenta confiável para identificar bactérias desconhecidas e comparar um isolado com a espécie mais próxima. Além disso, o comprimento desse gene é ótimo para análise de bioinformática18. Todas essas características, juntamente com a facilidade de amplificação de genes usando primers universais e o aprimoramento na tecnologia de sequenciamento gênico, fazem dele um padrão ouro para a identificação de micróbios.
Neste trabalho, descrevemos um procedimento para recuperação de microrganismos cultiváveis com potencial degradador de HC a partir de amostras ambientais. O método descrito a seguir descreve a coleta e identificação de bactérias degradadoras de HC e é dividido em cinco seções: (1) coleta de bactérias de amostras de água, (2) isolamento de culturas puras, (3) exploração da capacidade degradadora de HC de isolados bacterianos, (4) isolamento de DNA genômico e (5) identificação baseada em sequenciamento do gene 16S rRNA e análise BLAST. Este procedimento pode ser adaptado para isolar bactérias para as mais diversas aplicações biotecnológicas.
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Protocol
1. Coleta, processamento e análise de amostras
NOTA: Aqui, apresentamos um protocolo para isolar bactérias de habitats aquáticos. Alguns dos isolados podem ser patogênicos, portanto, usar luvas e desinfetar a área de trabalho antes e após o uso.
- Coletar 500 mL de amostra de água em cinco garrafas de vidro estéreis de diferentes locais do corpo hídrico. Medir o pH e a temperatura de cada amostra usando um medidor de pH e termômetro, respectivamente.
NOTA: O protocolo não é específico do local e pode ser facilmente adaptado para isolar organismos de corpos d'água contaminados com hidrocarbonetos também. - Filtrar a amostra num lote de 100 ml através de folhas filtrantes de 0,22 μm de poros, em condições assépticas.
NOTA: O diâmetro do papel de filtro não deve exceder o diâmetro da placa de Petri. Por exemplo, papel de filtro não superior a 85 mm de diâmetro é ideal para uma placa de Petri de 100-120 mm. - Manter os papéis de filtro sobre diferentes placas de meios nutritivos (PYE19, R2A20, M9, LB, NB, TSB, M6321 e M2G22). Os diferentes tipos de meios de crescimento permitem a seleção e o enriquecimento de diferentes microrganismos. As composições dos diversos meios de crescimento estão listadas na Tabela 1. Use um papel para cada placa de mídia e descasque após 2 h usando pinças estéreis.
- Diluir em série as amostras de água não filtrada (106 diluição) em água bidestilada estéril, adicionando 100 μL da amostra de água recolhida em 900 μL de água estéril. Isso resulta em uma diluição de 1:10. Desta amostra, retirar 100 μL e adicionar 900 μL de água estéril para obter uma diluição de 1:100. Repita a diluição até que a dobra de diluição seja de 1:1.000.000. Misture por pipetagem. O volume final de cada diluição será de 1 mL.
- Espalhe 100 μL da amostra de água diluída individualmente em todas as placas de meios de crescimento mencionadas na etapa 3 em triplicatas.
- Incubar as placas a 30 °C durante 24 a 48 horas, dependendo do crescimento das colónias.
NOTA: A maioria dos isolados ambientais cresce a uma temperatura ótima de 30 °C. Se isolar as amostras de um ambiente com temperaturas extremas, incubar as placas à mesma temperatura do local de coleta. - Em seguida, escolha as colônias usando um palito estéril ou ponta de pipeta e execute a estria do quadrante para obter colônias isoladas.
- Incube as placas durante a noite. No dia seguinte, faça uma triagem das colônias com base em suas características morfológicas, como cor, textura, forma, tamanho, margem, elevação, etc. Restreak as colônias para obter culturas puras.
- Realizar coloração de grama de cada cultura pura23 e proceder com o preparo do estoque de glicerol.
- Para preparar os estoques de glicerol, inocular uma única colônia em 3 mL de meio de cultura apropriado e incubar a 30 °C. A partir da cultura noturna, tomar 700 μL e adicionar 300 μL de glicerol a 100% (esterilizado por autoclavagem) em criofrascos24. Congelar os frascos para injetáveis a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
2. Degradação dos hidrocarbonetos
NOTA: O exemplo abaixo é para filtrar os isolados que podem degradar o estireno. Trata-se de uma ligeira modificação do método adaptado em relatório anterior25. Siga os passos em condições assépticas.
- De um prato recém-listrado, colher uma colônia e inocular em 5 mL de caldo de soja Tryptic (TSB)/Caldo nutriente (NB). Cultivar a cultura durante a noite a 30 °C com agitação a 200 rpm até que a absorbância atinja ~2.
NOTA: Com exceção do TSB/NB, qualquer meio de crescimento pode ser escolhido no qual as bactérias atinjam alta densidade celular. - No dia seguinte, pastilha as células a 2862 x g por 5 min a 4 °C e descarte o sobrenadante.
- Lavar o pellet duas vezes com 2 mL de solução salina autoclavada (NaCl 0,9%) e girar a 2862 x g por 5 min a 4 °C.
OBS: O soro fisiológico é isotônico e, portanto, mantém a pressão osmótica no interior das células bacterianas. - Ressuspender o pellet em 2 mL de meio basal líquido livre de carbono (MBCFCL). Medir a absorbância (OD600).
- Levar dois frascos Erlenmeyer estéreis com capacidade de 150 mL para controle e grupo experimental. Rotule-os como A e B.
- No grupo não inoculado/controle (frasco A), adicionar 40 mL de MBCFC e estireno (5 mM).
- No balão B, adicionar 35 mL de LCFBM e estireno (ajustar a concentração final de estireno para 5 mM). Adicionar a suspensão celular com um OD final de600 células ≈ 0,1 e completar o volume restante com LCFBM até 40 mL. Incubar os frascos a 30 °C com agitação a 200 rpm durante 30 dias.
NOTA: Hidrocarbonetos em excesso podem ser tóxicos para os micróbios, portanto, comece com baixa concentração e aumente-a gradualmente. - Repita o acima para cada cepa adicional que deve ser avaliada quanto à degradação de hidrocarbonetos.
- Medir o OD600 de cada frasco a cada 5 dias e traçar uma curva de crescimento. Aumente a incubação até 45 dias se as bactérias puderem utilizar estireno. Um aumento no OD600 indica que a bactéria pode metabolizar estireno.
3. Triagem da degradação de catecol por isolados bacterianos
NOTA: A degradação de hidrocarbonetos aromáticos como estireno, benzeno, xileno, naftaleno, fenóis, etc. produzem catecóis como intermediários de reação. Os catecóis são posteriormente metabolizados por bactérias com a ajuda das enzimas catecol 1,2-dioxigenase e catecol 2,3-dioxigenase através das vias de ortoclivagem e metaclivagem, respectivamente26. Essas enzimas também estão envolvidas na degradação de outros hidrocarbonetos, como o clorobenzeno27. O protocolo citado abaixo utiliza o lisado de células inteiras para o ensaio da enzima catecol 2, 3-dioxigenase28. O mesmo método de lise pode ser usado para rastrear a atividade da catecol 1, 2-dioxigenase. No entanto, a composição da mistura de reação irá variar. Ambas as enzimas são induzíveis na natureza e podem ser induzidas pela adição de fenol aos meios de crescimento.
- Com a ajuda de uma alça estéril, inocular a colônia bacteriana de uma placa recém-riscada em meio de sais minerais (MSM) suplementado com fenol 1-4 mM. Incubar a cultura a 30 °C e 200 rpm. Colher a cultura a 4 °C quando OD600 atingir entre 1,4-1,6 (ou seja, em fase exponencial tardia) girando a 4500 x g por 20 min.
- Lavar o pellet celular com tampão fosfato (0,5 M, pH 7,5).
- Ressuspender as células no tampão fosfato acima mencionado e ajustar o OD600 final ≈ 1.0.
- Lisar as células por sonicação pulsada por 1,5 min, sendo a duração de cada pulso de 15 s. Após essa etapa, a suspensão deve estar clara ou menos turva. Caso contrário, aumente o número de pulsos e verifique se a suspensão está limpa. Após cada pulso, mantenha a amostra no gelo para evitar a degradação da proteína.
- Remover os restos celulares e as células intactas por centrifugação a 9.000 x g por 30 min, mantendo a temperatura fria (4 °C).
- Pipetar cuidadosamente o sobrenadante transparente. Esta fração tem o extrato bruto para ensaio enzimático.
- Determinar a concentração proteica do extrato bruto pelo método de Bradford ou Lowry29,30.
- Para determinar a atividade da catecol 2,3-dioxigenase, medir a formação do produto final da reação (2-hidroximucônico semialdeído) por um espectrofotômetro.
- Preparar a mistura de reacção adicionando 20 μL de catecol (50 mM), 960 μL de tampão fosfato (50 mM, pH 7,5) e 20 μL do extracto bruto.
- Para o controle negativo, substituir o extrato bruto por tampão fosfato e ajustar o volume final para 1 mL.
- Incubar a mistura de reação por 30 min. Em intervalos de tempo definidos, medir a absorbância a 375 nm. Um aumento na absorbância indica a formação do produto final da reação, o ácido 2-hidroximucônico semialdeído (2-HMS). Realizar o experimento em triplicatas.
NOTA: O catecol é sensível à luz e ao oxigênio. Conservar a mistura de reacção no escuro e fechar bem os tubos para evitar a degradação natural do catecol.
4. Isolamento do DNA genômico da cultura pura
NOTA: Este é o protocolo geral para o isolamento de DNA genômico. A coloração de Gram foi realizada durante a etapa de coleta, processamento e análise das amostras. Devido à variação na espessura da parede celular de bactérias gram-positivas e gram-negativas, o método de lise celular é modificado de acordo. Use luvas ao isolar e desinfete a bancada com etanol 70% para evitar que as nucleases degradem o DNA. Alguns dos produtos químicos mencionados abaixo podem causar queimaduras graves na pele e o cuidado adequado deve ser tomado ao manuseá-los.
- Isolamento de DNA genômico de bactérias Gram-negativas31.
- Escolher uma única colônia e inocular em um meio de crescimento fresco em tubos de ensaio estéreis.
- Coloque os tubos num agitador de incubadora a 200 rpm e deixe que as bactérias cresçam durante a noite a 30 °C.
- No dia seguinte, pellet 1,5 mL de cultura cultivada durante a noite a 12.400 x g por 3 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 μL de tampão de lise (40 mM Tris-acetato, pH 7,8, 20 mM acetato de sódio, 1 mM EDTA, 1% SDS).
- Adicionar 66 μL de solução de NaCl (5 M) e misturar bem.
- Pellet da mistura resultante a 12.400 x g durante 10 min (4 °C).
- Pipetar o sobrenadante límpido num tubo de microcentrífuga fresco e adicionar um volume igual de clorofórmio.
- Inverter a misturar a solução várias vezes até observar uma solução leitosa.
- Gire a 12.400 x g durante 3 minutos e transfira o sobrenadante para um frasco para injetáveis limpo.
- Adicionar 1 mL de etanol 100% gelado; misturar por inversão até que as fitas brancas de DNA se precipitem.
- Centrifugar o ADN precipitado a 2.200 x g durante 10 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
- Lavar o pellet de DNA com 1 mL de etanol 70% e deixar o pellet de DNA secar por 5 min à temperatura ambiente.
- Depois de seco, ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão 1x Tris-EDTA(TE) e armazene o DNA a -20 °C.
- Medir a concentração (A260/280) usando espectrofotômetro e executar o DNA em gel de agarose (1%) para avaliar a qualidade do DNA24.
- Isolamento de DNA genômico de cepa gram-positiva32
- Escolher uma única colônia e inocular em meio de crescimento fresco em tubos de ensaio estéreis.
- Coloque os tubos em um agitador de incubadora a 200 rpm e deixe as bactérias crescerem durante a noite a uma temperatura de crescimento adequada.
- No dia seguinte, tomar 1,5 mL da cultura cultivada e centrifugar a 8.600 x g por 5 min.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda as células no tampão TE.
- Ajustar o OD600 = 1,0 com tampão TE e transferir 740 μL da suspensão celular para um tubo de microfuga limpo.
- Adicionar 20 μL de lisozima (caldo de 100 mg/mL) e misturar bem por pipetagem. Incubar a 37 °C durante 30 minutos (em banho seco).
- Adicione 40 μL de 10% de SDS e misture bem.
- Adicionar 8 μL de Proteinase K (10 mg/mL). Misture bem e incube a 56 °C por 1-3 h (em banho seco). A suspensão deve ficar clara agora com o aumento da viscosidade, marcando a lise celular eficiente.
NOTA: A suspensão pode ser deixada durante a noite se as células não forem lisadas corretamente. - Pré-aqueça a mistura CTAB/NaCl a 65 °C (em banho seco) e adicione 100 μL desta mistura à suspensão celular. Misture bem.
- Incubar a 65 °C durante 10 minutos (em banho seco).
- Adicione 500 μL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e misture bem. Gire a 16.900 x g por 10 min a 25 °C.
- Transfira a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga fresco evitando a fase orgânica (fase viscosa no fundo).
- Adicione cuidadosamente 500 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e misture bem. Gire a 16.900 x g por 10 min a 25 °C.
- Tome a fase aquosa em um tubo de microcentrífuga fresco. Adicione 500 μL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e misture bem.
- Transferir a fase aquosa e adicionar 0,6 volume de isopropanol (pré-resfriado a -20 °C).
- As fitas de ADN precipitadas devem ser visíveis na forma de rosca. Incubar a -20 °C durante 2 h durante a noite.
- Centrifugar a 16.900 x g por 15 min a 4 °C para pellet o DNA.
- Decantar cuidadosamente o isopropanol e lavar o pellet com 1 mL de etanol 70% frio (pré-resfriado a -20 °C) para remover quaisquer impurezas.
- Centrifugar a 16.900 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
- Deixe o pellet secar à temperatura ambiente durante 20 min ou mantenha o tubo a 37 °C. Certifique-se de que o pellet não está excessivamente seco.
- Ressuspender em 100 μL de tampão 1x TE e armazenar o DNA a -20 °C.
NOTA: Se o pellet ficar excessivamente seco e for difícil de ressuspender, incube o tubo de microcentrífuga com pellet de DNA e água livre de nuclease a 37 °C por 15-20 min e ressuspenda novamente por pipetagem. - Medir a concentração (A260/280) em espectrofotômetro após diluição de 1:100 em tampão TE 1x e executar o DNA em gel de agarose (1%) para avaliar a qualidade do DNA24.
5. Sequenciamento do 16S rRNA
NOTA: O protocolo descrito abaixo é para amplificação e sequenciamento do 16S rRNA para identificação bacteriana. Informações derivadas da sequência 16S rRNA são usadas para a identificação de um organismo desconhecido e para encontrar a relação entre diferentes organismos.
- Para identificar as cepas, amplificar o DNA isolado das culturas bacterianas puras por PCR com primers universais direcionados à sequência 16S rRNA para bactérias: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') e 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- Preparar a mistura de PCR (reações de 25 μL) em gelo com 18 μL de água autoclavada/livre de nuclease, 2,5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de primers forward e reverse (100 μM stock), 2 μL da mistura dNTPs (100 μM stock), 1 μL de DNA template (2-15 ng/μL) e 1 U de Taq Polymerase.
- Use as seguintes condições de ciclagem para amplificação do gene 16S rRNA: Desnaturação inicial a 94 °C por 10 min (desnaturação final a 94 °C por 40 s, recozimento do primer a 56 °C por 1 min, extensão a 74 °C por 2 min) x 30 ciclos, extensão final a 74 °C por 10 min.
- Após o término do ciclo, misturar 5 μL de amostra e 1 μL de corante de carga de DNA 5x. Executar em gel de agarose a 1% para verificar a amplificação. Conservar os produtos de PCR a 4 °C a curto prazo ou congelá-los a -20 °C até nova utilização.
- Para o sequenciamento do gene 16S rRNA, configurar a mesma reação mencionada acima para maior volume (100 μL).
- Purificar os amplicons para sequenciamento de Sanger24,34 usando o kit de purificação do produto PCR ou misturar toda a amostra com corante de carga de DNA e carregar em um gel de agarose para executar o método de extração em gel.
- Feito o sequenciamento, converta o arquivo de resultados no formato FASTA e verifique a similaridade da sequência com a ferramenta básica de busca de alinhamento local (BLAST) no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.
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Representative Results
O esquema delineando todo o procedimento de isolamento e triagem de bactérias de habitats aquáticos e sua posterior identificação pela análise do 16S rRNA está representado na Figura 1. Amostras de água de uma área úmida em Dadri, Índia, foram coletadas em garrafas de vidro estéreis e imediatamente levadas ao laboratório para processamento. As amostras foram passadas através de folhas filtrantes com poros de 0,22 μm, e os papéis de filtro foram mantidos em contato com diferentes placas de meio. Após 2 h, os papéis de filtro foram removidos e as placas foram incubadas durante a noite a 30 °C para a formação de colônias (Figura 2). No dia seguinte, colônias bacterianas individuais foram selecionadas e semeadas em placas de meio fresco (Figura 2). A cultura pura gerada foi armazenada e posteriormente utilizada para posterior análise. Usando este método, conseguimos criar uma biblioteca de mais de 100 isolados bacterianos únicos. Nosso objetivo foi identificar isolados bacterianos que podem utilizar hidrocarbonetos, especialmente estireno, que é o principal componente do plástico de uso único. As bactérias isoladas foram cultivadas individualmente nos respectivos meios, com a adição de estireno líquido como única fonte de carbono (Figura 3). Foi possível identificar quatro isolados que utilizam estireno como única fonte de carbono. Dois dos isolados foram extensivamente caracterizados quanto à degradação do estireno25.
Os isolados bacterianos foram então testados quanto à presença de vias enzimáticas para a degradação do metabolismo de hidrocarbonetos. O metabolismo de hidrocarbonetos em algumas bactérias resulta na produção de catecóis como intermediários, que são posteriormente degradados pelas vias de ortoclivagem e metaclivagem. As enzimas catecol 1,2-dioxigenase e catecol 2,3-dioxigenase são responsáveis pela reação de clivagem do anel36. Bactérias ambientais que possuem essas enzimas têm sido mostradas para metabolizar vários compostos aromáticos. Assim, um ensaio de degradação de catecol foi realizado para avaliar o potencial degradador de HC dos isolados bacterianos (Figura 4). Um ensaio representativo para um dos isolados é mostrado na Figura 4.
Para identificar os isolados bacterianos, foi realizado o sequenciamento do 16S rRNA. Uma coloração preliminar de Gram foi realizada para caracterizar as bactérias, o que ajuda a identificar e solucionar as etapas subsequentes. Bactérias gram-positivas são geralmente recalcitrantes a tampões de lise celular, levando a baixo rendimento de DNA genômico37. Assim, os resultados obtidos da coloração de gram38 antes do isolamento do DNA genômico auxiliariam na escolha do protocolo de isolamento do DNA genômico. Após o isolamento do DNA, a integridade do DNA genômico foi confirmada pela visualização de uma pequena amostra de DNA em gel de agarose (Figura 5A) e quantificada pelo método de absorbância UV usando um espectrofotômetro. O gene 16S rRNA foi amplificado usando a sequência universal de primers (Figura 5B). Enquanto 500 pb são essenciais para o sequenciamento, resultados ideais são obtidos com 1.300-1.500 pb39. Para obter o grau de parentesco entre as cepas isoladas, uma árvore filogenética foi construída utilizando o software phylogeny.fr40 (Figura 6).
Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático do estudo Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de colônias bacterianas de amostras de água. A amostra de água coletada foi passada através de papel filtro de 0,22 μm. Os papéis-filtro foram mantidos sobre diferentes placas de meios. As placas foram incubadas por 24-48 h até que colônias isoladas fossem observadas. As colônias individuais foram então semeadas em placas frescas para puro isolamento da cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos da degradação microbiana do estireno e do potencial de degradação de hidrocarbonetos das bactérias. As células foram cultivadas em LCFBM suplementado com estireno 5 mM como única fonte de carbono por 40 dias a 30 °C e 200 rpm. OD600 foi medido a cada 5 dias. O frasco controle continha apenas MCFCL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representação do ensaio da enzima 2,3-dioxigenase catecol para monitorar a degradação do catecol. (A) O substrato incolor catecol é convertido em um produto de cor amarela pela ação da catecol 2,3-dioxigenase. A mistura de reação contém catecol, tampão fosfato e lisado celular bruto. A formação do produto é detectada medindo a absorbância a 375 nm. (B) Gráfico representativo do ensaio da enzima catecol 2,3-dioxigenase com lisado de células inteiras. A mistura reacional em controle negativo possui substrato tampão e catecol sem lisado celular. A absorbância foi medida a 375 nm em um intervalo de 10 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Isolamento do DNA genômico e PCR do 16S rRNA. (A) Eletroforese em gel de DNA genômico isolado. Faixa M: Marcador de tamanho de DNA, Faixa 1-2: DNA genômico. (B) Verificação da amplificação do gene 16S rRNA por eletroforese em gel a 1%. Os géis foram visualizados pela coloração com brometo de etídio; Faixa M: Marcador de tamanho de DNA (1 kb), Faixa 1-4: Produtos de PCR amplificados de diferentes cepas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise dos resultados do sequenciamento do gene 16S rRNA. Construção de dendrograma representativo utilizando o programa phylogeny.fr para descrever a relação entre cepas de Exiguobacterium isoladas de uma área úmida (destacadas em caixa vermelha) com o conhecido Exiguobacterium sp. As sequências de RNAr 16S de Exiguobacterium sp conhecidas foram obtidas do NCBI. Este número foi retirado de um artigo anterior (Chauhan et.al.) sem qualquer modificação25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Extrato de levedura de peptona (PYE) | |
| Peptona | 2g |
| Extrato de levedura | 1g |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| 1M CaCl2 | 1 ml |
| Água destilada | Até 1000 ml |
| Esterilizar em autoclave a 121°C e 15 PSI por 15 min. | |
| Raciocinador 2A (R2A) | |
| Hidrolisado ácido de caseína | 0,5 gr |
| Extrato de levedura | 0,5 gr |
| Peptona protease | 0,5 gr |
| Dextrose | 0,5g |
| Amido solúvel | 0,5 gr |
| K2HPO4 | 0,5 gr |
| Água destilada | Até 1000 ml |
| Esterilizar em autoclave a 121°C e 15 PSI por 15 min. | |
| M2G | |
| Sais 10X M2 (1L) - | |
| Na2HPO4 | 17,4 gr |
| KH2PO4 | 10,6 gr |
| NH4Cl | 5,0 gr |
| Autoclave 10X M2 sais a 121 °C e 15 PSI por 15 min. | |
| Sais 10X M2 | 100 ml |
| 50mM MgCl2 | 10 ml |
| 30% de glicose (p/v) | 10 ml |
| 1 mM FeSO4 em 0,8 mM EDTA, pH 6,8 | 10 ml |
| CaCl2 de 50 mM | 10 ml |
| Água destilada | Até 1000 ml |
| Filtro esterilizar. | |
| Caldo de Lisogenia (LB) | |
| Hidrolisado enzimático de caseína | 10 gr |
| Extrato de levedura | 5 gr |
| NaCl | 10 gr |
| Água destilada | Até 1000 ml |
| Esterilizar em autoclave a 121°C e 15 PSI por 15 min. | |
| Caldo Nutriente (NB) | |
| Peptona | 15 gr |
| Extrato de levedura | 3 g |
| NaCl | 6 g |
| Glicose | 1 gr |
| Água destilada | Até 1000 ml |
| Esterilizar em autoclave a 121°C e 15 PSI por 15 min. | |
| Caldo de Soja Tríptico (TSB) | |
| Digestão pancreática da caseína | 17.0 gr |
| Digesto papal do farelo de soja | 3 g |
| NaCl | 5 gr |
| K2HPO4 | 2,5 gr |
| Dextrose | 2,5 gr |
| Água destilada | Até 1000 ml |
| Esterilizar em autoclave a 121°C e 15 PSI por 15 min. | |
| M63 | |
| NH4Cl | 2g |
| KH2PO4 | 13,6 gr |
| FeSO4.7H 2O | 0,5 mg |
| 20% glicerol | 10 ml |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| Água destilada | Até 1000 ml |
| Mídia mínima M9 | |
| Sais 5X M9 | |
| Na2 HPO4.7H 20 | 12,8 gr |
| KH2PO4 | 3 g |
| NH4Cl | 1 gr |
| NaCl | 0,5 gr |
| Água destilada | Até 200 ml |
| Autoclave 5X M9 sais a 121°C e 15 PSI por 15 min. | |
| 1X mídia M9 | |
| Sais 5X M9 | 20 ml |
| 20% de glicose | 2 ml |
| 1M MgSO4 | 200 μl |
| 1M CaCl2 | 10 μl |
| Água autoclavada | Até 100 ml |
| NOTA – Para o preparo de meios sólidos, utilizar Ágar Bacto 1,5% (15 g/L) |
Tabela 1.
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Discussion
Está bem estabelecido que apenas aproximadamente 1% das bactérias na Terra pode ser facilmente cultivada em laboratório6. Mesmo entre as bactérias cultiváveis, muitas permanecem descaracterizadas. Melhorias nos métodos moleculares deram uma nova dimensão à análise e avaliação das comunidades bacterianas. No entanto, tais técnicas apresentam limitações, mas não tornam redundantes as análises de cultura. Técnicas de cultivo puro para isolar espécies bacterianas individuais permanecem como o principal mecanismo para a caracterização de propriedades fisiológicas. O solo e os habitats aquáticos abrigam muitas bactérias com novas enzimas e vias, que podem ser aproveitadas para usos biotecnológicos. Este estudo descreve um método simples e de baixo custo para o isolamento e caracterização de bactérias a partir de amostras ecológicas.
Diferentes bactérias apresentam diferentes exigências nutricionais, por isso vários meios de crescimento foram utilizados para aumentar a probabilidade de isolar diversas espécies bacterianas. Uma das principais limitações deste método é que micróbios com necessidades de crescimento fastidiosas podem ser excluídos. Além disso, o principal objetivo desta etapa é maximizar o número de espécies bacterianas obtidas da amostra. O número de espécies bacterianas na biblioteca de amostras aumentaria as chances de isolar micróbios com potencial de biorremediação. Embora tenhamos apenas meios de crescimento variados, a variação da temperatura de crescimento e da concentração de oxigênio também pode aumentar as chances de expandir ainda mais a biblioteca de amostras com espécies únicas41,42.
Uma etapa crítica do protocolo é verificar a utilização do substrato a ser testado (estireno em nosso caso). É importante planejar o experimento para tal investigação com cuidado para evitar resultados falso-negativos. Dependendo das características de crescimento, o micróbio pode não se adaptar imediatamente à utilização do substrato a ser testado e pode exigir um processo de enriquecimento. Em nosso caso, o crescimento bacteriano é lento no meio de MCFCCL utilizado para testar a utilização de hidrocarbonetos como única fonte de carbono25. Para contornar esse problema, culturas iniciais podem ser iniciadas adicionando (1% v/v) TSB ou NB ao meio LCFBM para apoiar o crescimento bacteriano. A identificação do micróbio cultivado é realizada através do sequenciamento do RNAr 16S43. Este método oferece um método robusto e econômico para identificação microbiana. No entanto, o sequenciamento do 16S só pode fornecer identificação taxonômica de nível superior. Para a identificação em nível de espécie específica, outros primers específicos da família devem ser usados combinados com vários testes bioquímicos44,45.
O ensaio enzimático com lisado de células inteiras requer o uso de um método eficiente de lise celular. A lise celular bacteriana é geralmente conseguida através da realização de sonicação. No entanto, um método de congelamento-descongelamento é um método alternativo para lise celular suave, que se acredita para evitar a desnaturação da proteína. O procedimento consiste em congelar rapidamente as células a -80 °C e descongelar a 4 °C de forma sequencial46. A adição de detergentes suaves como NP-40 ou Triton-X-100 também auxilia na lise celular e não desnatura as proteínas, devido à sua natureza não iônica47. No entanto, bactérias com paredes celulares espessas, como cianobactérias48 , podem não se beneficiar do método de lise celular suave usando detergentes49 e, portanto, o método de lise para ensaio enzimático deve ser escolhido de acordo.
Ao se concentrar na população bacteriana cultivável a partir de amostras ambientais, os pesquisadores podem rapidamente realizar muitos experimentos diferentes. Os métodos aqui descritos não requerem o uso de instrumentos muito sofisticados e podem ser facilmente executados em uma configuração de laboratório padrão. Uma vez que são utilizados hidrocarbonetos e produtos químicos perigosos, o laboratório deve estar equipado com manuseamento e eliminação adequados de acordo com os procedimentos operacionais padrão. A abordagem aqui descrita pode ser facilmente adaptada para estudar uma variedade de espécies bacterianas para inúmeras aplicações biotecnológicas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Karthik Krishnan e aos membros do laboratório RP por seus comentários e sugestões úteis. O DS é apoiado pela SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. O laboratório RP é apoiado por uma bolsa CSIR-EMR e fundos de start-up da Universidade Shiv Nadar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
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