Summary
Presentiamo il processo di isolamento, propagazione e caratterizzazione dei batteri che degradano gli idrocarburi dagli habitat acquatici. Il protocollo delinea l'isolamento batterico, l'identificazione con il metodo 16S rRNA e il test del loro potenziale di degradazione degli idrocarburi. Questo articolo aiuterebbe i ricercatori a caratterizzare la biodiversità microbica nei campioni ambientali e in particolare a selezionare i microbi con potenziale di biorisanamento.
Abstract
Gli inquinanti idrocarburici sono recalcitranti alla degradazione e il loro accumulo nell'ambiente è tossico per tutte le forme di vita. I batteri codificano numerosi enzimi catalitici e sono naturalmente in grado di metabolizzare gli idrocarburi. Gli scienziati sfruttano la biodiversità negli ecosistemi acquatici per isolare i batteri con potenziale di biodegradazione e biorisanamento. Tali isolati dall'ambiente forniscono un ricco insieme di percorsi metabolici ed enzimi, che possono essere ulteriormente utilizzati per aumentare il processo di degradazione su scala industriale. In questo articolo, delineiamo il processo generale di isolamento, propagazione e identificazione delle specie batteriche dagli habitat acquatici e analizziamo la loro capacità di utilizzare gli idrocarburi come unica fonte di carbonio in vitro utilizzando tecniche semplici. Il presente protocollo descrive l'isolamento di varie specie batteriche e la loro successiva identificazione utilizzando l'analisi dell'rRNA 16S. Il protocollo presenta anche misure per caratterizzare il potenziale di degradazione degli idrocarburi degli isolati batterici. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che cercano di isolare le specie batteriche dagli habitat ambientali per le loro applicazioni biotecnologiche.
Introduction
Gli idrocarburi (HC) sono ampiamente utilizzati sia come combustibili che in applicazioni chimiche. Gli idrocarburi aromatici come benzene, toluene e xilene sono ampiamente utilizzati come solventi1. Alcheni come etilene e propilene fungono da precursori nella sintesi di polimeri di polietilene e polipropilene, rispettivamente. Polimerizzazione di un altro idrocarburo, lo stirene forma polistirene. Le attività antropiche introducono idrocarburi nell'ambiente durante la loro produzione e trasporto. La contaminazione da idrocarburi del suolo e dell'acqua è fonte di gravi preoccupazioni per l'ambiente e la salute umana. I microbi svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'ecosistema regolando i cicli biogeochimici e utilizzando una vasta gamma di substrati, che includono anche inquinanti e xenobiotici, convertendoli in carbonio e fonte di energia. Questo processo di disintossicazione dei contaminanti ambientali da parte di microrganismi è noto come biorisanamento 3,4,5,6,7.
I microrganismi con la capacità di degradare gli idrocarburi si trovano negli habitat acquatici e del suolo 8,9,10. Sono stati identificati molti batteri con il potenziale di degradare alcani e HC aromatici, come Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter e Oleibacter11. Lo sviluppo di approcci tecnologicamente avanzati indipendenti dalla coltura ha contribuito alla scoperta di nuove comunità microbiche che degradano l'HC12. Il materiale genomico isolato direttamente dai campioni sorgente viene amplificato e sequenziato con metodi ad alta produttività come il sequenziamento di nuova generazione (NGS), seguito dall'analisi eliminando la necessità di coltivare microrganismi. I metodi NGS, come l'analisi del metagenoma, sono costosi e presentano inconvenienti legati al processo di amplificazione13. Le tecniche di coltivazione come la coltura dell'arricchimento selettivo14 che mirano all'isolamento dei microbi che degradano gli idrocarburi sono ancora utili in quanto consentono ai ricercatori di sondare e manipolare le vie metaboliche negli isolati batterici.
L'isolamento del DNA genomico e il successivo sequenziamento del materiale genomico rivelano informazioni preziose su qualsiasi organismo. Il sequenziamento dell'intero genoma aiuta nell'identificazione di geni che codificano per la resistenza agli antibiotici, potenziali bersagli farmacologici, fattori di virulenza, trasportatori, enzimi che metabolizzano gli xenobiotici, ecc15,16,17. Il sequenziamento del gene codificante 16SrRNA ha dimostrato di essere una tecnica robusta per identificare la filogenesi batterica. La conservazione della sequenza e della funzione genica nel corso degli anni lo rende uno strumento affidabile per identificare batteri sconosciuti e confrontare un isolato con le specie più vicine. Inoltre, la lunghezza di questo gene è ottimale per l'analisi bioinformatica18. Tutte queste caratteristiche, insieme alla facilità di amplificazione genica utilizzando primer universali e al miglioramento della tecnologia di sequenziamento genico, lo rendono un gold standard per l'identificazione dei microbi.
Qui, descriviamo una procedura per recuperare microrganismi coltivabili con potenziale di degradazione dell'HC da campioni ambientali. Il metodo descritto di seguito delinea la raccolta e l'identificazione dei batteri che degradano l'HC ed è diviso in cinque sezioni: (1) raccolta di batteri da campioni d'acqua, (2) isolamento di colture pure, (3) esplorazione della capacità di degradazione dell'HC di isolati batterici (4) isolamento del DNA genomico e (5) identificazione basata sul sequenziamento del gene rRNA 16S e analisi BLAST. Questa procedura può essere adattata per isolare batteri per molte diverse applicazioni biotecnologiche.
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Protocol
1. Raccolta, elaborazione e analisi dei campioni
NOTA: Qui presentiamo un protocollo per isolare i batteri dagli habitat acquatici. Alcuni degli isolati possono essere patogeni, quindi indossare guanti e disinfettare l'area di lavoro prima e dopo l'uso.
- Raccogliere 500 ml di campione d'acqua in cinque bottiglie di vetro sterili da diversi siti del corpo idrico. Misurare il pH e la temperatura di ciascun campione utilizzando rispettivamente un pHmetro e un termometro.
NOTA: Il protocollo non è specifico del sito e può essere facilmente adattato per isolare gli organismi anche dai corpi idrici contaminati da idrocarburi. - Filtrare il campione in un lotto di fogli filtranti da 100 mL a 0,22 μm di pori di dimensioni ridotte, in condizioni asettiche.
NOTA: il diametro della carta da filtro non deve superare il diametro della piastra di Petri. Ad esempio, la carta da filtro non superiore a 85 mm di diametro è ottimale per una capsula di Petri da 100-120 mm. - Conservare la carta da filtro su diverse piastre di supporti nutritivi (PYE 19, R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M63 21 e M2G22). I diversi tipi di terreni di crescita consentono la selezione e l'arricchimento di diversi microrganismi. Le composizioni di vari terreni di crescita sono elencate nella Tabella 1. Utilizzare una carta per ogni piastra multimediale e staccare dopo 2 ore con una pinza sterile.
- Diluire in serie i campioni di acqua non filtrata (106 diluizione) in acqua sterile bidistillata aggiungendo 100 μL del campione d'acqua raccolto in 900 μL di acqua sterile. Ciò si traduce in una diluizione 1:10. Da questo campione, prelevare 100 μL e aggiungere 900 μL di acqua sterile per ottenere una diluizione 1:100. Ripetere la diluizione fino a quando la piega di diluizione è 1:1.000.000. Miscelare mediante pipettaggio. Il volume finale di ogni diluizione sarà di 1 ml.
- Distribuire singolarmente 100 μL del campione di acqua diluita su tutte le piastre di terreno di crescita menzionate nella fase 3 in triplice copia.
- Incubare le piastre a 30 °C per 24-48 ore a seconda della crescita delle colonie.
NOTA: La maggior parte degli isolati ambientali cresce ad una temperatura ottimale di 30 °C. Se si isolano i campioni da un ambiente con temperature estreme, incubare le piastre alla stessa temperatura di quella del sito di raccolta. - Quindi, scegliere le colonie usando uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta ed eseguire la striatura del quadrante per ottenere colonie isolate.
- Incubare i piatti durante la notte. Il giorno successivo, esamina le colonie in base alle loro caratteristiche morfologiche come colore, consistenza, forma, dimensione, margine, elevazione, ecc. Restreak le colonie per ottenere colture pure.
- Eseguire la colorazione di ogni coltura pura23 e procedere con la preparazione del brodo di glicerolo.
- Per preparare le scorte di glicerolo, inoculare una singola colonia in 3 ml di terreno di coltura appropriato e incubare a 30 °C. Dalla coltura notturna, prendere 700 μL e aggiungere 300 μL di glicerolo al 100% (sterilizzato in autoclave) nei crioviali24. Congelare i flaconcini a -80 °C per una conservazione a lungo termine.
2. Degradazione degli idrocarburi
NOTA: L'esempio seguente serve a schermare gli isolati che possono degradare lo stirene. Si tratta di una leggera modifica del metodo adattato in una precedente relazione25. Seguire i passaggi in condizioni asettiche.
- Da un piatto appena striato, prelevare una colonia e inoculare 5 ml di brodo di soia triptico (TSB)/brodo nutriente (NB). Coltivare la coltura durante la notte a 30 °C agitando a 200 giri/min fino a quando l'assorbanza raggiunge ~2.
NOTA: Oltre a TSB / NB, è possibile scegliere qualsiasi mezzo di crescita in cui i batteri raggiungano un'alta densità cellulare. - Il giorno successivo, pellettare le cellule a 2862 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Lavare il pellet due volte con 2 mL di soluzione salina autoclavata (0,9% NaCl) e centrifugare a 2862 x g per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: La soluzione salina è isotonica e, quindi, mantiene la pressione osmotica all'interno delle cellule batteriche. - Risospendere il pellet in 2 ml di mezzo basale liquido privo di carbonio (LCFBM). Misurare l'assorbanza (OD600).
- Prendere due palloni sterili di Erlenmeyer con capacità di controllo di 150 ml e il gruppo sperimentale. Etichettali come A e B.
- Nel gruppo non inoculato/di controllo, (pallone A), aggiungere 40 mL di LCFBM e stirene (5 mM).
- Nel matraccio B, aggiungere 35 mL di LCFBM e stirene (regolare la concentrazione finale di stirene a 5 mM). Aggiungere la sospensione cellulare con un OD finale600 di cellule ≈ 0,1 e comporre il volume rimanente con LCFBM fino a 40 ml. Incubare i matraccio a 30 °C agitando a 200 giri/min per 30 giorni.
NOTA: Gli idrocarburi in eccesso possono essere tossici per i microbi, quindi, iniziare con bassa concentrazione e aumentarla gradualmente. - Ripetere quanto sopra per ogni ceppo aggiuntivo che deve essere valutato per la degradazione degli idrocarburi.
- Misurare l'OD600 di ciascun matraccio ogni 5 giorni e tracciare una curva di crescita. Aumentare l'incubazione fino a 45 giorni se i batteri possono utilizzare lo stirene. Un aumento di OD600 indica che il batterio può metabolizzare lo stirene.
3. Screening della degradazione del catecolo da parte di isolati batterici
NOTA: La degradazione di idrocarburi aromatici come stirene, benzene, xilene, naftalene, fenoli, ecc. produce catecoli come intermedi di reazione. I catecoli sono ulteriormente metabolizzati dai batteri con l'aiuto degli enzimi catecolo 1,2-diossigenasi e catecolo 2,3-diossigenasi attraverso le vie orto- e meta-scissione, rispettivamente26. Questi enzimi sono anche coinvolti nella degradazione di altri idrocarburi come il clorobenzene27. Il protocollo menzionato di seguito utilizza il lisato di cellule intere per il saggio enzimatico catecolo 2, 3-diossigenasi28. Lo stesso metodo di lisi può essere utilizzato per schermare l'attività della catecolo 1, 2-diossigenasi. Tuttavia, la composizione della miscela di reazione varierà. Entrambi gli enzimi sono inducibili in natura e possono essere indotti dall'aggiunta di fenolo ai mezzi di crescita.
- Con l'aiuto di un ciclo sterile, inoculare la colonia batterica da una piastra appena striata in sali minerali (MSM) integrati con 1-4 mM di fenolo. Incubare la coltura a 30 °C e 200 giri/min. Raccogliere la coltura a 4 °C quando OD 600 raggiunge tra 1,4-1,6 (cioè in fase esponenziale avanzata) centrifugando a4500 x g per 20 minuti.
- Lavare il pellet cellulare con tampone fosfato (0,5 M, pH 7,5).
- Risospendere le cellule nel tampone fosfato sopra menzionato e regolare l'OD600 finale ≈ 1.0.
- Lisare le cellule mediante sonicazione pulsata per 1,5 minuti, la durata di ciascun impulso è di 15 s. Dopo questo passaggio, la sospensione deve essere chiara o meno torbida. In caso contrario, aumentare il numero di impulsi e verificare se la sospensione è libera. Dopo ogni impulso, conservare il campione sul ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine.
- Rimuovere i detriti cellulari e le cellule ininterrotte mediante centrifugazione a 9.000 x g per 30 minuti, mantenendo la temperatura fredda (4 °C).
- Pipettare con attenzione il surnatante chiaro. Questa frazione ha l'estratto grezzo per il saggio enzimatico.
- Determinare la concentrazione proteica dell'estratto grezzo con il metodo di Bradford o Lowry29,30.
- Per determinare l'attività della catecolo 2,3-diossigenasi, misurare la formazione del prodotto finale di reazione (semialdeide 2-idrossimuconica) mediante uno spettrofotometro.
- Preparare la miscela di reazione aggiungendo 20 μL di catecolo (50 mM), 960 μL di tampone fosfato (50 mM, pH 7,5) e 20 μL di estratto grezzo.
- Per il controllo negativo, sostituire l'estratto grezzo con tampone fosfato e regolare il volume finale a 1 ml.
- Incubare la miscela di reazione per 30 minuti. A intervalli di tempo impostati, misurare l'assorbanza a 375 nm. Un aumento dell'assorbanza indica la formazione del prodotto finale di reazione, semialdeide dell'acido 2-idrossimuconico (2-HMS). Eseguire l'esperimento in triplice copia.
NOTA: Catechol è sensibile alla luce e all'ossigeno. Conservare la miscela di reazione al buio e chiudere ermeticamente i tubi per evitare la naturale degradazione del catecolo.
4. Isolamento genomico del DNA della coltura pura
NOTA: Questo è il protocollo generale per l'isolamento del DNA genomico. La colorazione di Gram è stata eseguita durante la fase di raccolta, elaborazione e analisi del campione. A causa della variazione dello spessore della parete cellulare dei batteri gram-positivi e gram-negativi, il metodo di lisi cellulare viene modificato di conseguenza. Indossare guanti durante l'isolamento e disinfettare il banco di lavoro con etanolo al 70% per evitare che le nucleasi degradino il DNA. Alcune delle sostanze chimiche menzionate di seguito possono causare gravi ustioni sulla pelle e deve essere presa la dovuta attenzione durante la loro manipolazione.
- Isolamento del DNA genomico da batteri Gram-negativi31.
- Scegli una singola colonia e inocula in un terreno di crescita fresco in provette sterili.
- Posizionare i tubi in uno scuotitore incubatore a 200 giri / min e lasciare che i batteri crescano durante la notte a 30 ° C.
- Il giorno successivo, pellet 1,5 ml di coltura coltivata durante la notte a 12.400 x g per 3 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di tampone di lisi (40 mM di Tris-acetato, pH 7,8, 20 mM di acetato di sodio, 1 mM EDTA, 1% SDS).
- Aggiungere 66 μL di soluzione di NaCl (5 M) e mescolare bene.
- Pellettare la miscela risultante a 12.400 x g per 10 minuti (4 °C).
- Pipettare il surnatante trasparente in una provetta di microcentrifuga fresca e aggiungere un volume uguale di cloroformio.
- Capovolgere la soluzione più volte fino a quando non si osserva una soluzione lattiginosa.
- Ruotare a 12.400 x g per 3 minuti e trasferire il surnatante in un flaconcino pulito.
- Aggiungere 1 ml di etanolo ghiacciato al 100%; mescolare per inversione fino a quando i filamenti bianchi di DNA precipitano.
- Centrifugare il DNA precipitato a 2.200 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Lavare il pellet di DNA con 1 mL di etanolo al 70% e lasciare asciugare il pellet di DNA per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Una volta essiccato, risospendere il pellet in 100 μL di tampone 1x Tris-EDTA(TE) e conservare il DNA a -20 °C.
- Misurare la concentrazione (A260/280) utilizzando lo spettrofotometro ed eseguire il DNA su gel di agarosio (1%) per valutare la qualità del DNA24.
- Isolamento del DNA genomico dal ceppo gram-positivo32
- Scegli una singola colonia e inocula in terreno di crescita fresco in provette sterili.
- Posizionare i tubi in uno scuotitore incubatore a 200 giri / min e consentire ai batteri di crescere durante la notte ad una temperatura di crescita adeguata.
- Il giorno successivo, prendere 1,5 ml della coltura coltivata e centrifugare a 8.600 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le celle nel buffer TE.
- Regolare l'OD600 = 1,0 con tampone TE e trasferire 740 μL della sospensione cellulare in un tubo di microfuge pulito.
- Aggiungere 20 μL di lisozima (100 mg/mL di brodo) e mescolare bene mediante pipettaggio. Incubare a 37 °C per 30 minuti (in bagno asciutto).
- Aggiungere 40 μL di SDS al 10% e mescolare bene.
- Aggiungere 8 μL di proteinasi K (10 mg/ml). Mescolare bene e incubare a 56 °C per 1-3 ore (in bagno asciutto). La sospensione dovrebbe diventare chiara ora con una maggiore viscosità, segnando un'efficiente lisi cellulare.
NOTA: La sospensione può essere lasciata durante la notte se le cellule non sono lisate correttamente. - Preriscaldare la miscela CTAB/NaCl a 65 °C (in bagno asciutto) e aggiungere 100 μL di questa miscela alla sospensione cellulare. Mescolare bene.
- Incubare a 65 °C per 10 minuti (in bagno asciutto).
- Aggiungere 500 μL di cloroformio:alcool isoamilico (24:1) e mescolare bene. Centrifugare a 16.900 x g per 10 minuti a 25 °C.
- Trasferire la fase acquosa in una provetta di microcentrifuga fresca evitando la fase organica (fase viscosa sul fondo).
- Aggiungere con cautela 500 μL di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1) e mescolare bene. Centrifugare a 16.900 x g per 10 minuti a 25 °C.
- Prendere la fase acquosa in una provetta di microcentrifuga fresca. Aggiungere 500 μL di cloroformio:alcool isoamilico (24:1) e mescolare bene.
- Trasferire la fase acquosa e aggiungere 0,6 volume di isopropanolo (prerefrigerato a -20 °C).
- I filamenti di DNA precipitati devono essere visibili sotto forma filiforme. Incubare a -20 °C per 2 ore fino a tutta la notte.
- Centrifugare a 16.900 x g per 15 minuti a 4 °C per pellettare il DNA.
- Decantare accuratamente l'isopropanolo e lavare il pellet con 1 mL di etanolo freddo al 70% (prerefrigerato a -20 °C) per rimuovere eventuali impurità.
- Centrifugare a 16.900 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente per 20 minuti o mantenere il tubo a 37 °C. Assicurarsi che il pellet non sia troppo essiccato.
- Risospendere in 100 μL di tampone 1x TE e conservare il DNA a -20 °C.
NOTA: Se il pellet diventa troppo secco ed è difficile da risospendere, incubare la provetta della microcentrifuga con pellet di DNA e acqua priva di nucleasi a 37 °C per 15-20 minuti e risospendere nuovamente mediante pipettaggio. - Misurare la concentrazione (A260/280) utilizzando uno spettrofotometro dopo aver effettuato la diluizione 1:100 in tampone 1x TE ed eseguire il DNA su gel di agarosio (1%) per valutare la qualità del DNA24.
5. Sequenziamento dell'rRNA 16S
NOTA: Il protocollo descritto di seguito è per l'amplificazione e il sequenziamento dell'rRNA 16S per l'identificazione batterica. Le informazioni derivate dalla sequenza di rRNA 16S vengono utilizzate per l'identificazione di un organismo sconosciuto e per trovare la correlazione tra diversi organismi.
- Per identificare i ceppi, amplificare il DNA isolato dalle colture batteriche pure mediante PCR con primer universali mirati alla sequenza di rRNA 16S per i batteri: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') e 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- Preparare la miscela PCR (reazioni da 25 μL) su ghiaccio con 18 μL di acqua autoclavata/priva di nucleasi, 2,5 μL di tampone 10x, 0,5 μL di primer sia diretti che inversi (100 μM stock), 2 μL della miscela dNTPs (100 μM stock), 1 μL di DNA template (2-15 ng/μL) e 1 U di Taq Polimerasi.
- Utilizzare le seguenti condizioni cicliche per l'amplificazione del gene 16S rRNA: Denaturazione iniziale a 94 °C per 10 min, (denaturazione finale a 94 °C per 40 s, ricottura primer a 56 °C per 1 min, estensione a 74 °C per 2 min) x 30 cicli, estensione finale a 74 °C per 10 min.
- Al termine del ciclo, mescolare 5 μL di campione e 1 μL di colorante caricante DNA 5x. Eseguire su gel di agarosio all'1% per verificare l'amplificazione. Conservare i prodotti PCR a 4 °C per un breve periodo o congelarli a -20°C fino a nuovo utilizzo.
- Per il sequenziamento del gene 16S rRNA, impostare la stessa reazione di cui sopra per un volume maggiore (100 μL).
- Purificare gli ampliconi per il sequenziamento Sanger24,34 utilizzando il kit di purificazione del prodotto PCR o mescolare l'intero campione con colorante caricante DNA e caricare su un gel di agarosio per eseguire il metodo di estrazione del gel.
- Una volta terminata la sequenziazione, convertire il file dei risultati in formato FASTA e verificare la somiglianza della sequenza con lo strumento di ricerca di allineamento locale di base (BLAST) su NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.
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Representative Results
Lo schema che delinea l'intera procedura per l'isolamento e lo screening dei batteri dagli habitat acquatici e la loro successiva identificazione mediante analisi dell'rRNA 16S è rappresentato nella Figura 1. I campioni d'acqua provenienti da una zona umida a Dadri, in India, sono stati raccolti in bottiglie di vetro sterili e immediatamente portati in laboratorio per l'elaborazione. I campioni sono stati fatti passare attraverso fogli filtranti con una dimensione dei pori di 0,22 μm e le carte da filtro sono state tenute a contatto con diverse piastre di supporto. Dopo 2 ore, la carta da filtro è stata rimossa e le piastre sono state incubate durante la notte a 30 °C per la formazione di colonie (Figura 2). Il giorno successivo, le singole colonie batteriche sono state selezionate e striate su piastre di media freschi (Figura 2). La coltura pura generata è stata memorizzata e successivamente utilizzata per ulteriori analisi. Utilizzando questo metodo, siamo stati in grado di creare una libreria di oltre 100 isolati batterici unici. Abbiamo mirato a identificare isolati batterici che possono utilizzare idrocarburi, in particolare stirene, che è il componente principale della plastica monouso. I batteri isolati sono stati coltivati individualmente nei rispettivi mezzi con l'aggiunta di stirene liquido come unica fonte di carbonio (Figura 3). Abbiamo potuto identificare quattro isolati che utilizzano lo stirene come unica fonte di carbonio. Due degli isolati sono stati ampiamente caratterizzati ulteriormente per la degradazione dello stirene25.
Gli isolati batterici sono stati quindi testati per la presenza di vie enzimatiche per la degradazione del metabolismo degli idrocarburi. Il metabolismo degli idrocarburi in alcuni batteri provoca la produzione di catecoli come intermedi, che sono ulteriormente degradati dalle vie di orto-scissione e meta-scissione. Gli enzimi catecolo-1,2-diossigenasi e catecolo 2,3-diossigenasi sono responsabili della reazione di scissione dell'anello36. I batteri ambientali che possiedono questi enzimi hanno dimostrato di metabolizzare diversi composti aromatici. Pertanto, è stato eseguito un test di degradazione del catecolo per valutare il potenziale di degradazione HC degli isolati batterici (Figura 4). Un saggio rappresentativo per uno degli isolati è mostrato nella Figura 4.
Per identificare gli isolati batterici, è stato eseguito il sequenziamento dell'rRNA 16S. È stata eseguita una colorazione preliminare di grammo per caratterizzare i batteri, che aiuta a identificare e risolvere i passaggi successivi. I batteri Gram-positivi sono solitamente recalcitranti ai tamponi di lisi cellulare che portano a una bassa resa del DNA genomico37. Pertanto, i risultati ottenuti dalla colorazione di Gram38 prima dell'isolamento del DNA genomico aiuterebbero nella scelta del protocollo per l'isolamento del DNA genomico. Dopo l'isolamento del DNA, l'integrità del DNA genomico è stata confermata visualizzando un piccolo campione di DNA su gel di agarosio (Figura 5A) e quantificata con il metodo di assorbanza UV utilizzando uno spettrofotometro. Il gene dell'rRNA 16S è stato amplificato utilizzando la sequenza di primer universali (Figura 5B). Mentre 500 bp sono essenziali per il sequenziamento, i risultati ideali si ottengono con 1.300-1.500 bp39. Per ottenere il grado di parentela tra ceppi isolati, è stato costruito un albero filogenetico utilizzando il software phylogeny.fr40 (Figura 6).
Figura 1: Flusso di lavoro schematico dello studio Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini di colonie batteriche da campioni d'acqua. Il campione d'acqua raccolto è stato fatto passare attraverso carta da filtro da 0,22 μm. Le carte da filtro sono state conservate su diverse piastre di supporto. Le placche sono state incubate per 24-48 ore fino a quando non sono state osservate colonie isolate. Le singole colonie sono state poi striate su piatti freschi per puro isolamento della coltura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi della degradazione microbica dello stirene e del potenziale di degradazione degli idrocarburi di screening dei batteri. Le cellule sono state coltivate in LCFBM integrato con 5 mM di stirene come unica fonte di carbonio per 40 giorni a 30 °C e 200 giri/min. OD600 è stato misurato ogni 5 giorni. Il pallone di controllo aveva solo LCFBM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Rappresentazione del saggio enzimatico della catecolo 2,3-diossigenasi per monitorare la degradazione del catecolo. (A) Il catecolo substrato incolore viene convertito in un prodotto di colore giallo per azione della catecolo 2,3-diossigenasi. La miscela di reazione contiene catecolo, tampone fosfato e lisato di cellule grezze. La formazione del prodotto viene rilevata misurando l'assorbanza a 375 nm. (B) Grafico rappresentativo del saggio enzimatico catecolo 2,3-diossigenasi con lisato a cellule intere. La miscela di reazione nel controllo negativo ha tampone e substrato catecolico senza lisato cellulare. L'assorbanza è stata misurata a 375 nm ad un intervallo di 10 minuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Isolamento genomico del DNA e PCR con rRNA 16S. (A) Elettroforesi su gel di DNA genomico isolato. Lane M: marcatore dimensionale del DNA, corsia 1-2: DNA genomico. (B) Verifica dell'amplificazione del gene 16S rRNA mediante elettroforesi su gel all'1%. I gel sono stati visualizzati mediante colorazione con bromuro di etidio; Lane M: marcatore dimensionale del DNA (1 kb), corsia 1-4: prodotti PCR amplificati da ceppi diversi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Analisi dei risultati del sequenziamento del gene rRNA 16S. Costruzione rappresentativa di dendrogrammi utilizzando il programma phylogeny.fr per rappresentare la correlazione tra i ceppi di Exiguobacterium isolati da una zona umida (evidenziati nel riquadro rosso) con il noto Exiguobacterium sp. Le sequenze di rRNA 16S di Exiguobacterium sp. noto sono state ottenute da NCBI. Questa cifra è stata presa da un precedente articolo (Chauhan et.al.) senza alcuna modifica25. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Estratto di lievito di peptone (PYE) | |
| Peptone | 2g |
| Estratto di lievito | 1g |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| 1M CaCl2 | 1 ml |
| Acqua distillata | Fino a 1000 ml |
| Sterilizzare in autoclave a 121°C e 15 PSI per 15 min. | |
| Ragionatore 2A (R2A) | |
| Idrolizzato acido di caseina | 0,5 g |
| Estratto di lievito | 0,5 g |
| Proteasi peptone | 0,5 g |
| Destrosio | 0,5 g |
| Amido solubile | 0,5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| Acqua distillata | Fino a 1000 ml |
| Sterilizzare in autoclave a 121°C e 15 PSI per 15 min. | |
| M2G | |
| 10X M2 sali (1L) - | |
| Na2HPO4 | 17,4 g |
| KH2PO4 | 10,6 g |
| NH4Cl | 5,0 g |
| Autoclave 10X M2 sali a 121 °C e 15 PSI per 15 min. | |
| 10X sali M2 | 100 ml |
| 50mM MgCl2 | 10 ml |
| 30% glucosio (p/v) | 10 ml |
| 1 mM FeSO4 in 0,8 mM EDTA, pH 6,8 | 10 ml |
| 50 mM CaCl2 | 10 ml |
| Acqua distillata | Fino a 1000 ml |
| Filtrare sterilizzare. | |
| Brodo di lisogenia (LB) | |
| Idrolizzato enzimatico di caseina | 10 g |
| Estratto di lievito | 5 g |
| NaCl | 10 g |
| Acqua distillata | Fino a 1000 ml |
| Sterilizzare in autoclave a 121°C e 15 PSI per 15 min. | |
| Brodo nutriente (NB) | |
| Peptone | 15 g |
| Estratto di lievito | 3 g |
| NaCl | 6 g |
| Glucosio | 1 g |
| Acqua distillata | Fino a 1000 ml |
| Sterilizzare in autoclave a 121°C e 15 PSI per 15 min. | |
| Brodo di soia triptico (TSB) | |
| Digerire pancreatico della caseina | 17,0 g |
| Digesto papaico di farina di soia | 3 g |
| NaCl | 5 g |
| K2HPO4 | 2,5 g |
| Destrosio | 2,5 g |
| Acqua distillata | Fino a 1000 ml |
| Sterilizzare in autoclave a 121°C e 15 PSI per 15 min. | |
| M63 · | |
| NH4Cl | 2g |
| KH2PO4 | 13,6 g |
| FeSO4.7H 2O | 0,5 mg |
| 20% glicerolo | 10 ml |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| Acqua distillata | Fino a 1000 ml |
| Supporti minimali M9 | |
| 5X sali M9 | |
| Na 2HPO4.7H 20 | 12,8 g |
| KH2PO4 | 3 g |
| NH4Cl | 1 g |
| NaCl | 0,5 g |
| Acqua distillata | Fino a 200 ml |
| Autoclave 5X M9 sali a 121°C e 15 PSI per 15 min. | |
| 1X supporti M9 | |
| 5X sali M9 | 20 ml |
| 20% glucosio | 2 ml |
| 1M MgSO4 | 200 μl |
| 1M CaCl2 | 10 μl |
| Acqua autoclavata | Fino a 100 ml |
| NOTA – Per la preparazione di terreni solidi, utilizzare 1,5% Bacto Agar (15 g / L) |
Tabella 1.
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Discussion
È ben noto che solo circa l'1% dei batteri sulla Terra può essere facilmente coltivato in laboratorio6. Anche tra i batteri coltivabili, molti rimangono non caratterizzati. I miglioramenti nei metodi molecolari hanno dato una nuova dimensione all'analisi e alla valutazione delle comunità batteriche. Tuttavia, tali tecniche hanno dei limiti, ma non rendono superflue le analisi colturali. Le tecniche di coltura pura per isolare le singole specie batteriche rimangono il meccanismo primario per la caratterizzazione delle proprietà fisiologiche. Il suolo e gli habitat acquatici ospitano molti batteri con nuovi enzimi e percorsi, che possono essere sfruttati per usi biotecnologici. Questo studio descrive un metodo semplice ed economico per l'isolamento e la caratterizzazione dei batteri da campioni ecologici.
Diversi batteri hanno esigenze nutrizionali diverse, quindi sono stati utilizzati vari mezzi di crescita per aumentare la probabilità di isolare diverse specie batteriche. Uno dei principali limiti di questo metodo è che i microbi con requisiti di crescita fastidiosi possono essere esclusi. Inoltre, l'obiettivo principale di questo passaggio è massimizzare il numero di specie batteriche ottenute dal campione. Il numero di specie batteriche nella libreria di campioni migliorerebbe le possibilità di isolare microbi con potenziale di biorisanamento. Anche se abbiamo variato solo i mezzi di crescita, la variazione della temperatura di crescita e della concentrazione di ossigeno può anche aumentare le possibilità di espandere ulteriormente la libreria di campioni con specie uniche41,42.
Un passo critico del protocollo è quello di verificare l'utilizzo del substrato da testare (stirene nel nostro caso). È importante progettare l'esperimento per tale indagine con cura per evitare risultati falsi negativi. A seconda delle caratteristiche di crescita, il microbo potrebbe non adattarsi immediatamente all'utilizzo del substrato sottoposto a test e potrebbe richiedere un processo di arricchimento. Nel nostro caso, la crescita batterica è lenta nel mezzo LCFBM utilizzato per testare l'utilizzo di idrocarburi come unica fonte di carbonio25. Per aggirare questo problema, le colture iniziali possono essere avviate aggiungendo (1% v / v) TSB o NB al mezzo LCFBM per supportare la crescita batterica. L'identificazione del microbo coltivato viene effettuata attraverso il sequenziamento dell'rRNA 16S43. Questo metodo offre un metodo robusto ed economico per l'identificazione microbica. Tuttavia, il sequenziamento 16S può fornire solo un'identificazione tassonomica di livello superiore. Per l'identificazione a livello di specie specifica, devono essere utilizzati altri primer specifici della famiglia combinati con vari test biochimici44,45.
Il saggio enzimatico con lisato di cellule intere richiede l'utilizzo di un metodo di lisi cellulare efficiente. La lisi delle cellule batteriche si ottiene solitamente eseguendo la sonicazione. Tuttavia, un metodo di congelamento-scongelamento è un metodo alternativo per la lisi cellulare delicata, che si ritiene impedisca la denaturazione delle proteine. La procedura consiste nel congelare rapidamente le cellule a -80 °C e nello scongelamento a 4 °C in modo sequenziale46. L'aggiunta di detergenti delicati come NP-40 o Triton-X-100 aiuta anche nella lisi cellulare e non denatura le proteine, a causa della loro natura non ionica47. Tuttavia, i batteri con pareti cellulari spesse come i cianobatteri48 potrebbero non beneficiare del metodo di lisi cellulare delicata che utilizza detergenti49 e, pertanto, il metodo di lisi per il saggio enzimatico deve essere scelto di conseguenza.
Concentrandosi sulla popolazione batterica coltivabile da campioni ambientali, i ricercatori possono eseguire rapidamente molti esperimenti diversi. I metodi qui descritti non richiedono l'uso di strumenti molto sofisticati e possono essere facilmente eseguiti in una configurazione di laboratorio standard. Poiché vengono utilizzati idrocarburi e sostanze chimiche pericolose, il laboratorio deve essere dotato di una corretta manipolazione e smaltimento secondo le procedure operative standard. L'approccio qui descritto può essere facilmente adattato per studiare una varietà di specie batteriche per numerose applicazioni biotecnologiche.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Karthik Krishnan e i membri del laboratorio RP per i loro utili commenti e suggerimenti. DS è supportato da SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. Il laboratorio RP è supportato da una sovvenzione CSIR-EMR e da fondi di start-up della Shiv Nadar University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B.
- R, C.
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R.
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
