Summary
We presenteren het proces van het isoleren, verspreiden en karakteriseren van koolwaterstofafbrekende bacteriën uit aquatische habitats. Het protocol schetst bacteriële isolatie, identificatie door de 16S-rRNA-methode en het testen van hun koolwaterstofafbrekend potentieel. Dit artikel zou onderzoekers helpen bij het karakteriseren van microbiële biodiversiteit in milieumonsters, en specifiek screenen op microben met bioremediatiepotentieel.
Abstract
Koolwaterstofverontreinigende stoffen zijn recalcitrant voor afbraak en hun accumulatie in het milieu is giftig voor alle levensvormen. Bacteriën coderen voor tal van katalytische enzymen en zijn van nature in staat om koolwaterstoffen te metaboliseren. Wetenschappers benutten biodiversiteit in aquatische ecosystemen om bacteriën te isoleren met biologisch afbreekbaar en bioremediatiepotentieel. Dergelijke isolaten uit de omgeving bieden een rijke reeks metabole routes en enzymen, die verder kunnen worden gebruikt om het afbraakproces op industriële schaal op te schalen. In dit artikel schetsen we het algemene proces van isolatie, verspreiding en identificatie van bacteriesoorten uit aquatische habitats en screenen we hun vermogen om koolwaterstoffen te gebruiken als de enige koolstofbron in vitro met behulp van eenvoudige technieken. Het huidige protocol beschrijft de isolatie van verschillende bacteriesoorten en hun daaropvolgende identificatie met behulp van de 16S-rRNA-analyse. Het protocol presenteert ook stappen voor het karakteriseren van het koolwaterstofafbrekend vermogen van bacteriële isolaten. Dit protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die proberen bacteriesoorten te isoleren uit milieuhabitats voor hun biotechnologische toepassingen.
Introduction
Koolwaterstoffen (HC) worden op grote schaal gebruikt, zowel als brandstof als in chemische toepassingen. Aromatische koolwaterstoffen zoals benzeen, tolueen en xyleen worden veel gebruikt als oplosmiddelen1. Alkenen zoals ethyleen en propyleen dienen als voorlopers bij de synthese van respectievelijk polyethyleen- en polypropyleenpolymeren. Polymerisatie van een andere koolwaterstof, styreen vormt polystyreen. Antropogene activiteiten introduceren koolwaterstoffen in het milieu tijdens hun productie en transport. Koolwaterstofverontreiniging van bodem en water heeft ernstige zorgen voor het milieu en de menselijke gezondheid. Microben spelen een belangrijke rol bij het in stand houden van het ecosysteem door de biogeochemische cycli te reguleren en een breed scala aan substraten te gebruiken, waaronder verontreinigende stoffen en xenobiotica, en deze om te zetten in koolstof en energiebron. Dit proces van ontgifting van milieuverontreinigende stoffen door micro-organismen staat bekend als bioremediatie 3,4,5,6,7.
Micro-organismen met het vermogen om koolwaterstoffen af te breken worden aangetroffen in aquatische en bodemhabitats 8,9,10. Veel bacteriën met het potentieel om alkanen en aromatische HC's af te breken zijn geïdentificeerd, zoals Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter en Oleibacter11. De ontwikkeling van technologisch geavanceerde cultuuronafhankelijke benaderingen heeft geholpen bij het ontdekken van nieuwe HC-degraderende microbiële gemeenschappen12. Genomisch materiaal dat direct uit bronmonsters wordt geïsoleerd, wordt versterkt en gesequenced door methoden met een hoge doorvoer, zoals Next Generation Sequencing (NGS), gevolgd door analyse, waardoor het niet nodig is om micro-organismen te kweken. NGS-methoden, zoals metagenoomanalyse, zijn duur en hebben nadelen die verband houden met het amplificatieproces13. Teelttechnieken zoals selectieve verrijkingscultuur14 die gericht zijn op isolatie van koolwaterstofafbrekende microben zijn nog steeds nuttig omdat ze onderzoekers in staat stellen metabole routes in bacteriële isolaten te onderzoeken en te manipuleren.
Genomische DNA-isolatie en daaropvolgende sequencing van het genomische materiaal onthult waardevolle informatie over elk organisme. Whole-genome sequencing helpt bij de identificatie van genen die coderen voor antibioticaresistentie, potentiële medicijndoelen, virulentiefactoren, transporters, xenobiotisch-metaboliserende enzymen, enz.15,16,17. Sequencing van het 16SrRNA-coderende gen is bewezen een robuuste techniek te zijn om bacteriële fylogenie te identificeren. Behoud van de gensequentie en -functie door de jaren heen maakt het een betrouwbaar hulpmiddel voor het identificeren van onbekende bacteriën en het vergelijken van een isolaat met de dichtstbijzijnde soort. Bovendien is de lengte van dit gen optimaal voor bioinformatica-analyse18. Al deze functies, samen met het gemak van genamplificatie met behulp van universele primers en verbetering van gensequencingtechnologie, maken het een gouden standaard voor de identificatie van microben.
Hier beschrijven we een procedure om cultiveerbare micro-organismen met HC-afbrekend potentieel terug te winnen uit milieumonsters. De hieronder beschreven methode schetst de verzameling en identificatie van HC-afbrekende bacteriën en is verdeeld in vijf secties: (1) verzameling van bacteriën uit watermonsters, (2) isolatie van zuivere culturen, (3) onderzoek naar HC-afbrekend vermogen van bacteriële isolaten (4) genomische DNA-isolatie en (5) identificatie op basis van 16S rRNA-gensequencing en BLAST-analyse. Deze procedure kan worden aangepast om bacteriën te isoleren voor veel verschillende biotechnologische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monsterverzameling, -verwerking en -analyse
OPMERKING: Hier presenteren we een protocol om bacteriën te isoleren uit aquatische habitats. Sommige van de isolaten kunnen pathogeen zijn, draag daarom handschoenen en desinfecteer het werkgebied voor en na gebruik.
- Verzamel 500 ml watermonster in vijf steriele glazen flessen van verschillende plaatsen in het waterlichaam. Meet de pH en temperatuur van elk monster met respectievelijk een pH-meter en thermometer.
OPMERKING: Het protocol is niet locatiespecifiek en kan gemakkelijk worden aangepast om organismen ook te isoleren van met koolwaterstof verontreinigde waterlichamen. - Filtreer het monster in een batch van 100 ml door filtervellen met een poriegrootte van 0,22 μm, in aseptische omstandigheden.
OPMERKING: De diameter van het filtreerpapier mag niet groter zijn dan de diameter van de petrischaal. Filterpapier met een diameter van niet meer dan 85 mm is bijvoorbeeld optimaal voor een petrischaal van 100-120 mm. - Bewaar het filterpapier over verschillende voedingsmediaplaten (PYE 19, R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M63 21 en M2G22). De verschillende soorten groeimedia maken de selectie en verrijking van verschillende micro-organismen mogelijk. Samenstellingen van verschillende groeimedia zijn vermeld in tabel 1. Gebruik één papier voor elke mediaplaat en verwijder na 2 uur met een steriele tang.
- Verdun de ongefilterde watermonsters (106 verdunning) serieel in steriel dubbel gedestilleerd water door toevoeging van 100 μL van het verzamelde watermonster in 900 μL steriel water. Dit resulteert in een verdunning van 1:10. Neem uit dit monster 100 μL en voeg 900 μL steriel water toe om 1:100 verdunning te verkrijgen. Herhaal de verdunning totdat de verdunningsplooi 1:1.000.000 is. Meng door pipetteren. Het uiteindelijke volume van elke verdunning is 1 ml.
- Verdeel 100 μL van het verdunde watermonster afzonderlijk over alle groeimediaplaten die in stap 3 in drievoud worden genoemd.
- Incubeer de platen bij 30 °C gedurende 24 tot 48 uur, afhankelijk van de groei van de kolonies.
OPMERKING: De meeste omgevingsisolaten groeien bij een optimale temperatuur van 30 °C. Als u de monsters isoleert van een omgeving met extreme temperaturen, incubeer de platen dan bij dezelfde temperatuur als die van de verzamelplaats. - Kies vervolgens de kolonies met behulp van een steriele tandenstoker of pipetpunt en voer kwadrantstrepen uit om geïsoleerde kolonies te krijgen.
- Incubeer de platen een nacht. Screen de volgende dag de kolonies op basis van hun morfologische kenmerken zoals kleur, textuur, vorm, grootte, marge, hoogte, enz. Restreak de kolonies om zuivere culturen te verkrijgen.
- Voer gramkleuring uit van elke zuivere cultuur23 en ga verder met de bereiding van de glycerolbouillon.
- Om de glycerolvoorraden te bereiden, ent u een enkele kolonie in 3 ml geschikte groeimedia en incubeert u bij 30 °C. Neem uit de nachtkweek 700 μL en voeg 300 μL 100% glycerol (gesteriliseerd door autoclaveren) toe aan cryovialen24. Vries de injectieflacons in bij -80 °C voor langdurige opslag.
2. Afbraak van koolwaterstoffen
OPMERKING: Het onderstaande voorbeeld is om de isolaten te screenen die styreen kunnen afbreken. Het is een kleine wijziging van de methode die in een eerder verslag is aangepast25. Volg de stappen onder aseptische omstandigheden.
- Kies van een vers gestreept bord een kolonie en ent in 5 ml tryptische sojabouillon (TSB) / voedingsbouillon (NB). Laat de cultuur een nacht groeien bij 30 °C met schudden bij 200 tpm totdat de absorptie ~ 2 bereikt.
OPMERKING: Anders dan TSB / NB, kan elk groeimedium worden gekozen waarin de bacteriën een hoge celdichtheid bereiken. - Pellet de cellen de volgende dag gedurende 5 minuten bij 4 °C op 2862 x g en gooi het supernatant weg.
- Was de pellet tweemaal met 2 ml geautoclaveerde zoutoplossing (0,9% NaCl) en draai op 2862 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Zoutoplossing is isotoon en handhaaft dus de osmotische druk in bacteriële cellen. - Resuspendeer de pellet in 2 ml vloeibaar koolstofvrij basaal medium (LCFBM). Meet de absorptie (OD600).
- Neem twee steriele Erlenmeyers met een capaciteit van 150 ml voor controle en de experimentele groep. Label ze als A en B.
- Voeg in de niet-geënte /controlegroep (kolf A) 40 ml LCFBM en styreen (5 mM) toe.
- Voeg in kolf B 35 ml LCFBM en styreen toe (pas de eindconcentratie styreen aan tot 5 mM). Voeg de celsuspensie toe met een laatste OD600 cellen ≈ 0,1 en vul het resterende volume aan met LCFBM tot 40 ml. Incubeer de kolven bij 30 °C met schudden bij 200 tpm gedurende 30 dagen.
OPMERKING: Koolwaterstoffen in overmaat kunnen giftig zijn voor de microben, begin daarom met een lage concentratie en verhoog deze geleidelijk. - Herhaal het bovenstaande voor elke extra stam die moet worden beoordeeld op afbraak van koolwaterstoffen.
- Meet om de 5 dagen de OD600 van elke kolf en zet een groeicurve uit. Verhoog de incubatie tot 45 dagen als de bacteriën styreen kunnen gebruiken. Een toename van OD600 geeft aan dat de bacterie styreen kan metaboliseren.
3. Screening van catecholafbraak door bacteriële isolaten
OPMERKING: De afbraak van aromatische koolwaterstoffen zoals styreen, benzeen, xyleen, naftaleen, fenolen, enz. produceert catechols als reactietussenproducten. De catechols worden verder gemetaboliseerd door bacteriën met behulp van catechol 1,2-dioxygenase en catechol 2,3-dioxygenase enzymen via de ortho- en meta-splitsingsroutes, respectievelijk26. Deze enzymen zijn ook betrokken bij de afbraak van andere koolwaterstoffen zoals chloorbenzeen27. Het onderstaande protocol gebruikt helecellysaatlysaat voor catechol 2, 3-dioxygenase enzymtest28. Dezelfde lysismethode kan worden gebruikt om de activiteit van catechol 1, 2-dioxygenase te screenen. De samenstelling van het reactiemengsel zal echter variëren. Beide enzymen zijn induceerbaar van aard en kunnen worden geïnduceerd door de toevoeging van fenol aan de groeimedia.
- Met behulp van een steriele lus, ent u de bacteriekolonie van een vers gestreepte plaat in minerale zouten medium (MSM) aangevuld met 1-4 mM fenol. Incubeer de cultuur bij 30 °C en 200 tpm. Oogst de cultuur bij 4 °C wanneer OD 600 tussen 1,4-1,6 (d.w.z. in de late exponentiële fase) bereikt door gedurende20 minuten met 4500 x g te draaien.
- Was de celpellet met fosfaatbuffer (0,5 M, pH 7,5).
- Resuspendeer de cellen in de bovengenoemde fosfaatbuffer en pas de uiteindelijke OD600 ≈ 1.0 aan.
- Lyseer de cellen door gepulseerde ultrasoonapparaat gedurende 1,5 min, waarbij de duur van elke puls 15 s is. Na deze stap moet de ophanging helder of minder troebel zijn. Zo niet, verhoog dan het aantal pulsen en controleer of de suspensie duidelijk is. Bewaar het monster na elke puls op ijs om eiwitafbraak te voorkomen.
- Verwijder de celresten en ongebroken cellen door centrifugeren bij 9.000 x g gedurende 30 minuten, waarbij de koude temperatuur (4 °C) wordt gehandhaafd.
- Pipetteer het heldere supernatant voorzichtig. Deze fractie heeft het ruwe extract voor enzymtest.
- Bepaal de eiwitconcentratie van ruw extract met Bradford of Lowry's methode29,30.
- Om de activiteit van catechol 2,3-dioxygenase te bepalen, meet u de vorming van het reactie-eindproduct (2-hydroxymuconisch semialdehyde) met een spectrofotometer.
- Bereid het reactiemengsel door toevoeging van 20 μL catechol (50 mM), 960 μL fosfaatbuffer (50 mM, pH 7,5) en 20 μL van het ruwe extract.
- Vervang voor de negatieve controle het ruwe extract door fosfaatbuffer en stel het uiteindelijke volume in op 1 ml.
- Incubeer het reactiemengsel gedurende 30 minuten. Meet op gezette tijdsintervallen de absorptie bij 375 nm. Een toename van de absorptie duidt op de vorming van het reactie-eindproduct, 2-hydroxymuconic acid semialdehyde (2-HMS). Voer het experiment uit in drievoud.
OPMERKING: Catechol is licht- en zuurstofgevoelig. Bewaar het reactiemengsel in het donker en sluit de buisjes goed af om de natuurlijke afbraak van catechol te voorkomen.
4. Genomische DNA-isolatie van de zuivere cultuur
OPMERKING: Dit is het algemene protocol voor de isolatie van genomisch DNA. Gramkleuring werd uitgevoerd tijdens de monsterverzameling, verwerking en analysestap. Vanwege de variatie in celwanddikte van grampositieve en gramnegatieve bacteriën wordt de cellysemethode dienovereenkomstig aangepast. Draag handschoenen tijdens het isoleren en desinfecteer de werkbank met 70% ethanol om te voorkomen dat de nucleasen DNA afbreken. Sommige van de onderstaande chemicaliën kunnen ernstige brandwonden op de huid veroorzaken en de juiste zorg moet worden genomen tijdens het hanteren ervan.
- Isolatie van genomisch DNA van Gram-negatieve bacteriën31.
- Kies een enkele kolonie en ent in een vers groeimedium in steriele reageerbuizen.
- Plaats de buizen in een incubator shaker bij 200 rpm en laat de bacteriën een nacht groeien bij 30 °C.
- Pellet de volgende dag 1,5 ml 's nachts gekweekte cultuur op 12.400 x g gedurende 3 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in 200 μL lysisbuffer (40 mM Tris-acetaat, pH 7,8, 20 mM natriumacetaat, 1 mM EDTA, 1% SDS).
- Voeg 66 μL NaCl-oplossing (5 M) toe en meng goed.
- Pellet het resulterende mengsel op 12.400 x g gedurende 10 minuten (4 °C).
- Pipetteer het heldere supernatant in een verse microcentrifugebuis en voeg een gelijk volume chloroform toe.
- Keer de oplossing meerdere keren om totdat een melkachtige oplossing wordt waargenomen.
- Draai gedurende 3 minuten op 12.400 x g en breng het supernatant over in een schone injectieflacon.
- Voeg 1 ml ijskoude 100% ethanol toe; meng door inversie totdat witte strengen DNA neerslaan.
- Centrifugeer het neergeslagen DNA bij 2.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Was de DNA-pellet met 1 ml 70% ethanol en laat de DNA-pellet 5 minuten drogen bij kamertemperatuur.
- Eenmaal gedroogd, resuspensie de pellet in 100 μL van 1x Tris-EDTA(TE) buffer, en bewaar het DNA bij -20 °C.
- Meet de concentratie (A260/280) met behulp van een spectrofotometer en voer het DNA uit op agarosegel (1%) om de kwaliteit van DNA24 te beoordelen.
- Isolatie van genomisch DNA uit grampositieve stam32
- Kies een enkele kolonie en ent in vers groeimedium in steriele reageerbuizen.
- Plaats de buizen in een incubator shaker bij 200 rpm en laat de bacteriën een nacht groeien bij een geschikte groeitemperatuur.
- Neem de volgende dag 1,5 ml van de gekweekte cultuur en centrifugeer gedurende 5 minuten op 8.600 x g .
- Verwijder het supernatant en suspensie de cellen in de TE-buffer.
- Stel de OD600 = 1,0 met TE-buffer in en breng 740 μL van de celsuspensie over naar een schone microfugebuis.
- Voeg 20 μL lysozym (100 mg/ml bouillon) toe en meng goed door pipetteren. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten (in een droogbad).
- Voeg 40 μL 10% SDS toe en meng goed.
- Voeg 8 μL proteïnase K (10 mg/ml) toe. Meng goed en incubeer bij 56 °C gedurende 1-3 uur (in een droog bad). De suspensie moet nu duidelijk worden met verhoogde viscositeit, waardoor efficiënte cellyse wordt gemarkeerd.
OPMERKING: De suspensie kan 's nachts worden achtergelaten als de cellen niet goed zijn gelyseerd. - Verwarm het CTAB/NaCl-mengsel voor op 65 °C (in een droogbad) en voeg 100 μL van dit mengsel toe aan de celsuspensie. Meng goed.
- Incubeer bij 65 °C gedurende 10 minuten (in een droogbad).
- Voeg 500 μL chloroform:isoamylalcohol (24:1) toe en meng goed. Draai op 16.900 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C.
- Breng de waterige fase over in een verse microcentrifugebuis en vermijd de organische fase (viskeuze fase aan de onderkant).
- Voeg voorzichtig 500 μL fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) toe en meng goed. Draai op 16.900 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C.
- Neem de waterige fase in een verse microcentrifugebuis. Voeg 500 μL chloroform:isoamylalcohol (24:1) toe en meng goed.
- Breng de waterige fase over en voeg 0,6 volume isopropanol toe (voorgekoeld bij -20 °C).
- De neergeslagen DNA-strengen moeten zichtbaar zijn in de draadachtige vorm. Incubeer bij -20 °C gedurende 2 uur tot een nacht.
- Centrifugeer bij 16.900 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om het DNA te pelleteren.
- Decanteer de isopropanol voorzichtig en was de pellet met 1 ml koude 70% ethanol (voorgekoeld bij -20 °C) om eventuele onzuiverheden te verwijderen.
- Centrifugeer bij 16.900 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Laat de pellet 20 minuten drogen bij kamertemperatuur of houd de buis op 37 °C. Zorg ervoor dat de pellet niet te droog is.
- Resuspendie in 100 μL 1x TE-buffer en bewaar het DNA bij -20 °C.
OPMERKING: Als de pellet overgedroogd raakt en moeilijk te resuspenderen is, incubeer dan de microcentrifugebuis met DNA-pellet en nucleasevrij water bij 37 °C gedurende 15-20 minuten en resuspensie opnieuw door pipetteren. - Meet de concentratie (A260/280) met behulp van een spectrofotometer na het maken van 1:100 verdunning in 1x TE-buffer en voer het DNA uit op agarosegel (1%) om de kwaliteit van DNA24 te beoordelen.
5. 16S rRNA sequencing
OPMERKING: Het onderstaande protocol is voor amplificatie en sequencing van 16S rRNA voor bacteriële identificatie. Informatie afgeleid van de 16S-rRNA-sequentie wordt gebruikt voor de identificatie van een onbekend organisme en om de verwantschap tussen verschillende organismen te vinden.
- Om de stammen te identificeren, versterkt u het DNA geïsoleerd uit de zuivere bacterieculturen door PCR met universele primers gericht op 16S rRNA-sequentie voor bacteriën: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') en 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- Bereid het PCR-mengsel (25 μL-reacties) op ijs met 18 μL geautoclaveerd/nucleasevrij water, 2,5 μL 10x buffer, 0,5 μL zowel voorwaartse als omgekeerde primers (100 μM bouillon), 2 μL van het dNTPs-mengsel (100 μM stock), 1 μL DNA-sjabloon (2-15 ng/μL) en 1 U Taq Polymerase.
- Gebruik de volgende cyclusomstandigheden voor 16S rRNA-genamplificatie: Initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 10 min, (laatste denaturatie bij 94 °C gedurende 40 s, primergloeien bij 56 °C gedurende 1 min, extensie bij 74 °C gedurende 2 minuten) x 30 cycli, laatste verlenging bij 74 °C gedurende 10 minuten.
- Nadat de cyclus is afgelopen, mengt u 5 μL monster en 1 μL 5x DNA-ladingskleurstof. Gebruik 1% agarose-gel om de versterking te verifiëren. Bewaar de PCR-producten bij 4 °C voor de korte termijn of vries ze in bij -20 °C tot verder gebruik.
- Voor 16S rRNA-gensequencing, stel dezelfde reactie in als hierboven vermeld voor een hoger volume (100 μL).
- Zuiver de amplicons voor Sanger sequencing24,34 met behulp van PCR product zuiveringskit of meng het hele monster met DNA loading kleurstof en laad op een agarose gel om gel extractie methode uit te voeren.
- Zodra de volgorde is voltooid, converteert u het resultatenbestand in FASTA-indeling en controleert u de gelijkenis van de reeks met de basiszoekfunctie voor lokale uitlijning (BLAST) op NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het schema dat de volledige procedure schetst voor isolatie en screening van bacteriën uit aquatische habitats en hun daaropvolgende identificatie door 16S-rRNA-analyse is weergegeven in figuur 1. Watermonsters uit een wetland in Dadri, India werden verzameld in steriele glazen flessen en onmiddellijk naar het laboratorium gebracht voor verwerking. De monsters werden door filtervellen met een poriegrootte van 0,22 μm geleid en het filterpapier werd in contact gehouden met verschillende mediaplaten. Na 2 uur werd filterpapier verwijderd en werden de platen 's nachts bij 30 °C geïncubeerd voor kolonievorming (figuur 2). De volgende dag werden individuele bacteriekolonies geselecteerd en gestreept op verse mediaplaten (figuur 2). De gegenereerde zuivere cultuur werd opgeslagen en vervolgens gebruikt voor verdere analyse. Met behulp van deze methode konden we een bibliotheek van meer dan 100 unieke bacteriële isolaten creëren. We wilden bacteriële isolaten identificeren die koolwaterstoffen kunnen gebruiken, met name styreen, dat de primaire component is van plastic voor eenmalig gebruik. De geïsoleerde bacteriën werden individueel gekweekt in de respectieve media met de toevoeging van vloeibaar styreen als enige bron van koolstof (figuur 3). We konden vier isolaten identificeren die styreen gebruiken als enige bron van koolstof. Twee van de isolaten werden uitgebreid verder gekarakteriseerd voor styreenafbraak25.
De bacteriële isolaten werden vervolgens getest op de aanwezigheid van enzymatische routes voor de afbraak van het koolwaterstofmetabolisme. Koolwaterstofmetabolisme in sommige bacteriën resulteert in de productie van catechols als tussenproducten, die verder worden afgebroken door ortho-splitsing en meta-splitsingsroutes. Catechol 1,2-dioxygenase en catechol 2,3-dioxygenase-enzymen zijn verantwoordelijk voor ring-splitsingsreactie36. Van omgevingsbacteriën die deze enzymen bezitten, is aangetoond dat ze verschillende aromatische verbindingen metaboliseren. Zo werd een catecholafbraaktest uitgevoerd om het HC-afbrekende potentieel van bacteriële isolaten te beoordelen (figuur 4). Een representatieve test voor een van de isolaten is weergegeven in figuur 4.
Om de bacteriële isolaten te identificeren, werd 16S rRNA-sequencing uitgevoerd. Een voorlopige gramkleuring werd uitgevoerd om de bacteriën te karakteriseren, wat helpt bij het identificeren en oplossen van volgende stappen. Grampositieve bacteriën zijn meestal recalcitrant voor cellysebuffers, wat leidt tot een lage genomische DNA-opbrengst37. De resultaten verkregen van gramkleuring38 vóór genomische DNA-isolatie zouden dus helpen bij het kiezen van het protocol voor genomische DNA-isolatie. Na DNA-isolatie werd de integriteit van genomisch DNA bevestigd door een klein DNA-monster op agarosegel te visualiseren (figuur 5A) en gekwantificeerd met behulp van een UV-absorptiemethode met behulp van een spectrofotometer. Het 16S-rRNA-gen werd versterkt met behulp van universele primers-sequentie (figuur 5B). Hoewel 500 bp essentieel is voor sequencing, worden ideale resultaten verkregen met 1.300-1.500 bp39. Om de mate van verwantschap tussen geïsoleerde stammen te verkrijgen, werd een fylogenetische boom geconstrueerd met behulp van de phylogeny.fr software40 (figuur 6).
Figuur 1: Schematische workflow van het onderzoek Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbeeldingen van bacteriekolonies uit watermonsters. Het verzamelde watermonster werd door 0,22 μm filterpapier geleid. Het filterpapier werd over verschillende mediaplaten bewaard. De platen werden gedurende 24-48 uur geïncubeerd totdat geïsoleerde kolonies werden waargenomen. De enkele kolonies werden vervolgens op verse platen gestreept voor pure cultuurisolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van microbiële afbraak van styreen en screening van koolwaterstofafbraakpotentieel van bacteriën. De cellen werden gekweekt in LCFBM aangevuld met 5 mM styreen als enige koolstofbron gedurende 40 dagen bij 30 °C en 200 tpm. OD600 werd elke 5 dagen gemeten. De regelkolf had alleen LCFBM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatie van Catechol 2,3-dioxygenase enzymtest om de afbraak van catechol te monitoren. (A) Het kleurloze substraat catechol wordt door de werking van catechol 2,3-dioxygenase omgezet in een geelkleurig product. Het reactiemengsel bevat catechol, fosfaatbuffer en ruwcellysaat. De vorming van het product wordt gedetecteerd door de absorptie bij 375 nm te meten. (B) Representatieve grafiek van catechol-2,3-dioxygenase-enzymtest met hele-cellysaat. Het reactiemengsel in negatieve controle heeft buffer- en catecholsubstraat zonder cellysaat. De absorptie werd gemeten bij 375 nm met een interval van 10 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Genomische DNA-isolatie en 16S rRNA PCR. (A) Gel-elektroforese van geïsoleerd genomisch DNA. Lane M: DNA size marker, Lane 1-2: Genomic DNA. (B) Verificatie van 16S rRNA gen amplificatie door 1% gel elektroforese. Gels werden gevisualiseerd door kleuring met ethidiumbromide; Lane M: DNA-groottemarker (1 kb), Lane 1-4: Versterkte PCR-producten van verschillende stammen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Analyse van de 16S rRNA gen sequencing resultaten. Representatieve dendrogramconstructie met behulp van het phylogeny.fr-programma om de verwantschap weer te geven tussen Exiguobacterium-stammen geïsoleerd uit een wetland (gemarkeerd in rood vak) met de bekende Exiguobacterium sp. De 16S rRNA-sequenties van bekende Exiguobacterium sp. werden verkregen van NCBI. Dit cijfer is overgenomen uit een eerder artikel (Chauhan et.al.) zonder enige wijziging25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Pepton gist extract (PYE) | |
| Pepton | 2g |
| Gist extract | 1g |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| 1M CaCl2 | 1 ml |
| Gedestilleerd water | Tot 1000 ml |
| Steriliseren door autoclaveren bij 121°C en 15 PSI gedurende 15 min. | |
| Reasoner's 2A (R2A) | |
| Caseïnezuurhydrolysaat | 0,5 g |
| Gist extract | 0,5 g |
| Protease pepton | 0,5 g |
| Dextrose | 0,5 g |
| Oplosbaar zetmeel | 0,5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| Gedestilleerd water | Tot 1000 ml |
| Steriliseren door autoclaveren bij 121°C en 15 PSI gedurende 15 min. | |
| M2G | |
| 10X M2 zouten (1L) - | |
| Na2HPO4 | 17.4 gr |
| KH2PO4 | 10.6 gr |
| NH4cl | 5.0 gr |
| Autoclaaf 10X M2 zouten bij 121 °C en 15 PSI gedurende 15 min. | |
| 10X M2 zouten | 100 ml |
| 50mM MgCl2 | 10 ml |
| 30% glucose (g/v) | 10 ml |
| 1 mM FeSO4 in 0,8 mM EDTA, pH 6,8 | 10 ml |
| CaCl2 m² 50 m² | 10 ml |
| Gedestilleerd water | Tot 1000 ml |
| Filter steriliseren. | |
| Lysogenie Bouillon (LB) | |
| Caseïne enzymhydrolysaat | 10 gr |
| Gist extract | 5 gr |
| NaCl | 10 gr |
| Gedestilleerd water | Tot 1000 ml |
| Steriliseren door autoclaveren bij 121°C en 15 PSI gedurende 15 min. | |
| Voedingsbouillon (NB) | |
| Pepton | 15 gr |
| Gist extract | 3 gr |
| NaCl | 6 gr |
| Glucose | 1 g |
| Gedestilleerd water | Tot 1000 ml |
| Steriliseren door autoclaveren bij 121°C en 15 PSI gedurende 15 min. | |
| Tryptische sojabouillon (TSB) | |
| Pancreasvertering van caseïne | 17.0 gr |
| Papaïsche vertering van sojameel | 3 gr |
| NaCl | 5 gr |
| K2HPO4 | 2,5 g |
| Dextrose | 2,5 g |
| Gedestilleerd water | Tot 1000 ml |
| Steriliseren door autoclaveren bij 121°C en 15 PSI gedurende 15 min. | |
| M63 | |
| NH4cl | 2g |
| KH2PO4 | 13.6 gr |
| FeSO4,7H 2O | 0,5 mg |
| 20% glycerol | 10 ml |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| Gedestilleerd water | Tot 1000 ml |
| M9 minimale media | |
| 5X M9 zouten | |
| Na2 HPO4,7H 20 | 12.8 gr |
| KH2PO4 | 3 gr |
| NH4cl | 1 g |
| NaCl | 0,5 g |
| Gedestilleerd water | Tot 200 ml |
| Autoclaaf 5X M9 zouten bij 121°C en 15 PSI gedurende 15 min. | |
| 1x M9-media | |
| 5X M9 zouten | 20 ml |
| 20% glucose | 2 ml |
| 1M MgSO4 | 200 μl |
| 1M CaCl2 | 10 μl |
| Geautoclaveerd water | Tot 100 ml |
| OPMERKING – Gebruik voor de bereiding van vaste media 1,5% Bacto Agar (15 g/L) |
Tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is algemeen bekend dat slechts ongeveer 1% van de bacteriën op aarde gemakkelijk in het laboratorium kan worden gekweekt6. Zelfs onder de kweekbare bacteriën blijven velen onkarakteriseerd. Verbeteringen in moleculaire methoden hebben een nieuwe dimensie gegeven aan de analyse en evaluatie van bacteriële gemeenschappen. Dergelijke technieken hebben echter wel beperkingen, maar ze maken de cultuuranalyses niet overbodig. Zuivere kweektechnieken om individuele bacteriesoorten te isoleren blijven het primaire mechanisme voor de karakterisering van fysiologische eigenschappen. Bodem- en aquatische habitats herbergen veel bacteriën met nieuwe enzymen en paden, die kunnen worden gebruikt voor biotechnologische toepassingen. Deze studie beschrijft een eenvoudige en goedkope methode voor de isolatie en karakterisering van bacteriën uit ecologische monsters.
Verschillende bacteriën hebben verschillende voedingsbehoeften, vandaar dat verschillende groeimedia werden gebruikt om de kans op het isoleren van verschillende bacteriesoorten te vergroten. Een belangrijke beperking van deze methode is dat microben met kieskeurige groeivereisten kunnen worden uitgesloten. Het belangrijkste doel van deze stap is ook om het aantal bacteriesoorten dat uit het monster wordt verkregen te maximaliseren. Het aantal bacteriesoorten in de monsterbibliotheek zou de kans op het isoleren van microben met bioremediatiepotentieel verbeteren. Hoewel we alleen groeimedia varieerden, kunnen variërende groeitemperatuur en zuurstofconcentratie ook de kans vergroten om de monsterbibliotheek verder uit te breiden met unieke soorten41,42.
Een cruciale stap van het protocol is het controleren van het gebruik van het te testen substraat (styreen in ons geval). Het is belangrijk om het experiment voor dergelijk onderzoek zorgvuldig te ontwerpen om vals-negatieve resultaten te voorkomen. Afhankelijk van de groeikenmerken past de microbe zich mogelijk niet onmiddellijk aan het gebruik van het geteste substraat aan en kan een verrijkingsproces nodig zijn. In ons geval is de bacteriegroei traag in het LCFBM-medium dat wordt gebruikt om het gebruik van koolwaterstof als enige koolstofbron te testen25. Om dit probleem te omzeilen, kunnen initiële culturen worden gestart door (1% v / v) TSB of NB toe te voegen aan het LCFBM-medium om de bacteriegroei te ondersteunen. Identificatie van de gekweekte microbe wordt bereikt door middel van 16S rRNA-sequencing43. Deze methode biedt een robuuste en kosteneffectieve methode voor microbiële identificatie. 16S-sequencing kan echter alleen taxonomische identificatie op een hoger niveau bieden. Voor identificatie op soortspecifiek soortniveau moeten andere familiespecifieke primers worden gebruikt in combinatie met verschillende biochemische tests44,45.
Enzymtest met whole-cell lysaat vereist het gebruik van een efficiënte cellysemethode. Bacteriële cellyse wordt meestal bereikt door ultrasoonapparaat uit te voeren. Een vries-dooimethode is echter een alternatieve methode voor zachte cellysis, waarvan wordt aangenomen dat deze denaturatie van eiwitten voorkomt. De procedure bestaat uit het snel invriezen van de cellen bij -80 °C en het achtereenvolgens ontdooien bij 4 °C46. De toevoeging van milde detergentia zoals NP-40 of Triton-X-100 helpt ook bij cellysis en denatureert de eiwitten niet, vanwege hun niet-ionische aard47. Bacteriën met dikke celwanden zoals cyanobacteriën48 hebben echter mogelijk geen baat bij de zachte cellysemethode met reinigingsmiddelen49 en daarom moet de lysismethode voor enzymbepaling dienovereenkomstig worden gekozen.
Door zich te richten op de kweekbare bacteriepopulatie uit omgevingsmonsters, kunnen onderzoekers snel veel verschillende experimenten uitvoeren. De hier beschreven methoden vereisen geen gebruik van zeer geavanceerde instrumenten en kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd in een standaard laboratoriumopstelling. Aangezien koolwaterstoffen en gevaarlijke chemische stoffen worden gebruikt, moet het laboratorium worden uitgerust met de juiste behandeling en verwijdering volgens de standaard operationele procedures. De hier beschreven aanpak kan eenvoudig worden aangepast om een verscheidenheid aan bacteriesoorten te bestuderen voor tal van biotechnologische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Karthik Krishnan en leden van het RP-lab voor hun nuttige opmerkingen en suggesties. DS wordt ondersteund door SNU-Doctoral fellowship en Earthwatch Institute India Fellowship. RP lab wordt ondersteund door een CSIR-EMR-beurs en start-upfondsen van Shiv Nadar University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B.
- R, C.
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R.
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
