Summary
Vi præsenterer processen med at isolere, formere og karakterisere kulbrintenedbrydende bakterier fra akvatiske levesteder. Protokollen skitserer bakteriel isolering, identifikation ved 16S rRNA-metoden og test af deres carbonhydridnedbrydende potentiale. Denne artikel vil hjælpe forskere med at karakterisere mikrobiel biodiversitet i miljøprøver og specifikt screene for mikrober med bioremedieringspotentiale.
Abstract
Forurenende kulbrinter er genstridige over for nedbrydning, og deres ophobning i miljøet er giftig for alle livsformer. Bakterier koder for adskillige katalytiske enzymer og er naturligt i stand til at metabolisere kulbrinter. Forskere udnytter biodiversiteten i akvatiske økosystemer til at isolere bakterier med bionedbrydning og bioremedieringspotentiale. Sådanne isolater fra miljøet giver et rigt sæt metaboliske veje og enzymer, som yderligere kan udnyttes til at opskalere nedbrydningsprocessen i industriel skala. I denne artikel skitserer vi den generelle proces med isolering, formering og identifikation af bakteriearter fra akvatiske levesteder og screener deres evne til at udnytte kulbrinter som den eneste kulstofkilde in vitro ved hjælp af enkle teknikker. Denne protokol beskriver isoleringen af forskellige bakteriearter og deres efterfølgende identifikation ved hjælp af 16S rRNA-analysen. Protokollen præsenterer også trin til karakterisering af kulbrintenedbrydningspotentialet for bakterielle isolater. Denne protokol vil være nyttig for forskere, der forsøger at isolere bakteriearter fra miljømæssige levesteder til deres bioteknologiske anvendelser.
Introduction
Kulbrinter (HC) anvendes i vid udstrækning både som brændstoffer og i kemiske applikationer. Aromatiske kulbrinter såsom benzen, toluen og xylen anvendes i vid udstrækning som opløsningsmidler1. Alkener, såsom ethylen og propylen, tjener som forstadier i syntesen af henholdsvis polyethylen- og polypropylenpolymerer. Polymerisation af et andet carbonhydrid, styren danner polystyren. Antropogene aktiviteter introducerer kulbrinter i miljøet under deres produktion og transport. Kulbrinteforurening af jord og vand giver anledning til alvorlig bekymring for miljøet og menneskers sundhed. Mikrober spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af økosystemet ved at regulere de biogeokemiske cyklusser og udnytte en bred vifte af substrater, som også omfatter forurenende stoffer og xenobiotika, og omdanne dem til kulstof og energikilde. Denne proces med afgiftning af miljøforurenende stoffer af mikroorganismer er kendt som bioremediering 3,4,5,6,7.
Mikroorganismer med evne til at nedbryde kulbrinter findes i vand- og jordhabitater 8,9,10. Mange bakterier med potentiale til at nedbryde alkaner og aromatiske HC'er er blevet identificeret, såsom Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter og Oleibacter11. Udviklingen af teknologisk avancerede kulturuafhængige tilgange har bidraget til at opdage nye HC-nedbrydende mikrobielle samfund12. Genomisk materiale, der er direkte isoleret fra kildeprøver, amplificeres og sekventeres ved hjælp af metoder med høj kapacitet såsom Next Generation Sequencing (NGS) efterfulgt af analyse, hvilket eliminerer behovet for at dyrke mikroorganismer. NGS-metoder, såsom metagenomanalyse, er dyre og lider af ulemper relateret til amplifikationsprocessen13. Dyrkningsteknikker såsom selektiv berigelseskultur14, der sigter mod isolering af carbonhydridnedbrydende mikrober, er stadig nyttige, da de giver forskere mulighed for at undersøge og manipulere metaboliske veje i bakterieisolater.
Genomisk DNA-isolering og efterfølgende sekventering af det genomiske materiale afslører værdifuld information om enhver organisme. Helgenomsekventering hjælper med at identificere gener, der koder for antibiotikaresistens, potentielle lægemiddelmål, virulensfaktorer, transportører, xenobiotisk metaboliserende enzymer osv.15,16,17. Sekventering af 16SrRNA-kodende gen har vist sig at være en robust teknik til at identificere bakteriel fylogeni. Bevarelse af gensekvensen og funktionen gennem årene gør det til et pålideligt værktøj til at identificere ukendte bakterier og sammenligne et isolat med de nærmeste arter. Desuden er længden af dette gen optimal til bioinformatikanalyse18. Alle disse funktioner sammen med den lette genamplifikation ved hjælp af universelle primere og forbedring af gensekventeringsteknologi gør det til en guldstandard til identifikation af mikrober.
Her beskriver vi en procedure til genvinding af dyrkbare mikroorganismer med HC-nedbrydende potentiale fra miljøprøver. Metoden beskrevet nedenfor skitserer indsamling og identifikation af HC-nedbrydende bakterier og er opdelt i fem sektioner: (1) indsamling af bakterier fra vandprøver, (2) isolering af rene kulturer, (3) undersøgelse af HC-nedbrydende evne af bakterielle isolater, (4) genomisk DNA-isolering og (5) identifikation baseret på 16S rRNA-gensekventering og BLAST-analyse. Denne procedure kan tilpasses til at isolere bakterier til mange forskellige bioteknologiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Indsamling, behandling og analyse af prøver
BEMÆRK: Her præsenterer vi en protokol til isolering af bakterier fra akvatiske levesteder. Nogle af isolaterne kan være patogene, brug derfor handsker og desinficer arbejdsområdet før og efter brug.
- Saml 500 ml vandprøve i fem sterile glasflasker fra forskellige steder i vandområdet. Mål pH og temperaturen i hver prøve ved hjælp af henholdsvis et pH-meter og termometer.
BEMÆRK: Protokollen er ikke stedspecifik og kan let tilpasses til også at isolere organismer fra kulbrinteforurenede vandområder. - Prøven filtreres i et parti på 100 ml til og med 0,22 μm-porestørrelse filterark under aseptiske forhold.
BEMÆRK: Filterpapirets diameter må ikke overstige petriskålens diameter. For eksempel er filterpapir med en diameter på højst 85 mm optimalt til en 100-120 mm petriskål. - Opbevar filterpapiret over forskellige næringsmedieplader (PYE19,R2A 20, M9, LB, NB, TSB, M6321 og M2G22). De forskellige typer vækstmedier tillader udvælgelse og berigelse af forskellige mikroorganismer. Sammensætninger af forskellige vækstmedier er anført i tabel 1. Brug et papir til hver medieplade og skræl af efter 2 timer med sterile pincet.
- De ufiltrerede vandprøver (10,6 fortynding) fortyndes serielt i sterilt dobbeltdestilleret vand ved tilsætning af 100 μL af den opsamlede vandprøve i 900 μL sterilt vand. Dette resulterer i en 1:10 fortynding. Fra denne prøve udtages 100 μL og tilsættes 900 μL sterilt vand for at opnå 1:100 fortynding. Fortyndingen gentages, indtil fortyndingsfolden er 1:1.000.000. Bland ved pipettering. Det endelige volumen af hver fortynding vil være 1 ml.
- 100 μL af den fortyndede vandprøve fordeles enkeltvis på alle vækstmedieplader, der er nævnt i trin 3, i tre eksemplarer.
- Pladerne inkuberes ved 30 °C i 24 til 48 timer afhængigt af koloniernes vækst.
BEMÆRK: De fleste miljøisolater vokser ved en optimal temperatur på 30 °C. Hvis prøverne isoleres fra et miljø med ekstreme temperaturer, inkuberes pladerne ved samme temperatur som indsamlingsstedets. - Vælg derefter kolonierne ved hjælp af en steril tandstikker eller pipettespids og udfør kvadrantstriber for at få isolerede kolonier.
- Inkuber pladerne natten over. Næste dag screenes kolonierne baseret på deres morfologiske egenskaber såsom farve, tekstur, form, størrelse, margen, højde osv. Restreak kolonierne for at opnå rene kulturer.
- Udfør gramfarvning af hver ren kultur23 og fortsæt med glycerollagerpræparation.
- Til fremstilling af glycerolstammerne podes en enkelt koloni i 3 ml passende vækstmedium og inkuberes ved 30 °C. Fra natkulturen tages 700 μL og tilsættes 300 μL 100% glycerol (steriliseret ved autoklavering) i kryoialer24. Hætteglassene fryses ved -80 °C til langtidsopbevaring.
2. Nedbrydning af kulbrinter
BEMÆRK: Eksemplet nedenfor er at screene de isolater, der kan nedbryde styren. Det er en mindre ændring af den metode, der blev tilpasset i en tidligere rapport25. Følg trinnene under aseptiske forhold.
- Fra en friskstribet plade skal du vælge en koloni og inokulere i 5 ml tryptisk sojabuljong (TSB) / næringsbouillon (NB). Kulturen dyrkes natten over ved 30 °C under omrystning ved 200 omdr./min., indtil absorbansen når ~2.
BEMÆRK: Bortset fra TSB / NB kan ethvert vækstmedium vælges, hvor bakterierne når høj celletæthed. - Næste dag pelleteres cellerne ved 2862 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Pellet vaskes to gange med 2 ml autoklaveret saltvand (0,9% NaCl) og centrifugeres ved 2862 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Saltvand er isotonisk og opretholder således det osmotiske tryk inde i bakterieceller. - Resuspender pellet i 2 ml flydende kulstoffrit basalmedium (LCFBM). Absorbansen måles (OD600).
- Tag to sterile Erlenmeyerkolber med 150 ml kapacitet til kontrol og forsøgsgruppen. Mærk dem som A og B.
- I den ikke-inokulerede /kontrolgruppe (kolbe A) tilsættes 40 ml LCFBM og styren (5 mM).
- I kolbe B tilsættes 35 ml LCFBM og styren (den endelige koncentration af styren justeres til 5 mM). Cellesuspensionen tilsættes med en endelig OD600 celler ≈ 0,1, og det resterende volumen fyldes op med LCFBM op til 40 ml. Kolberne inkuberes ved 30 °C under omrystning ved 200 o/min i 30 dage.
BEMÆRK: Overskydende kulbrinter kan være giftige for mikroberne, start derfor med lav koncentration og øg den gradvist. - Ovenstående gentages for hver yderligere stamme, der skal evalueres for nedbrydning af carbonhydrider.
- OD600 for hver kolbe måles hver 5. dag, og der tegnes en vækstkurve. Forøg inkubationen op til 45 dage, hvis bakterierne kan udnytte styren. En stigning i OD600 indikerer, at bakterien kan metabolisere styren.
3. Screening af katekolnedbrydning ved bakterieisolater
BEMÆRK: Nedbrydningen af aromatiske carbonhydrider, såsom styren, benzen, xylen, naphthalen, phenoler osv. producerer catechols som reaktionsmellemprodukter. Catechols metaboliseres yderligere af bakterier ved hjælp af catechol 1,2-dioxygenase og catechol 2,3-dioxygenase enzymer gennem henholdsvis ortho- og meta-spaltningsvejene26. Disse enzymer er også involveret i nedbrydningen af andre carbonhydrider, såsom chlorbenzen27. Protokollen nævnt nedenfor bruger helcellelysat til catechol 2, 3-dioxygenase enzymassay28. Den samme lysismetode kan bruges til at screene aktiviteten af catechol 1, 2-dioxygenase. Imidlertid vil sammensætningen af reaktionsblandingen variere. Begge enzymer er inducerbare i naturen og kan induceres ved tilsætning af phenol til vækstmediet.
- Ved hjælp af en steril sløjfe podes bakteriekolonien fra en friskstribet plade i mineralsaltmedium (MSM) suppleret med 1-4 mM phenol. Kulturen inkuberes ved 30 °C og 200 omdr./min. Høst kulturen ved 4 °C, når OD 600 når mellem 1,4-1,6 (dvs. i sen eksponentiel fase) ved at dreje ved4500 x g i 20 min.
- Vask cellepillen med fosfatbuffer (0,5 M, pH 7,5).
- Resuspender cellerne i ovennævnte fosfatbuffer og juster den endelige OD600 ≈ 1,0.
- Lys cellerne ved pulserende sonikering i 1,5 min, varigheden af hver puls er 15 s. Efter dette trin skal suspensionen være klar eller mindre grumset. Hvis ikke, øg antallet af impulser og kontroller, om suspensionen er klar. Efter hver puls skal prøven opbevares på is for at undgå proteinnedbrydning.
- Cellerester og ubrudte celler fjernes ved centrifugering ved 9.000 x g i 30 minutter, idet den kolde temperatur opretholdes (4 °C).
- Den klare supernatant pipetteres forsigtigt. Denne fraktion har råekstraktet til enzymanalyse.
- Bestem proteinkoncentrationen af råekstrakt ved enten Bradford eller Lowrys metode29,30.
- For at bestemme aktiviteten af catechol-2,3-dioxygenase måles dannelsen af reaktionsslutproduktet (2-hydroxymukonisk semialdehyd) med et spektrofotometer.
- Reaktionsblandingen fremstilles ved tilsætning af 20 μL catechol (50 mM), 960 μL phosphatbuffer (50 mM, pH 7,5) og 20 μL råekstrakt.
- Til den negative kontrol erstattes råekstraktet med fosfatbuffer, og det endelige volumen justeres til 1 ml.
- Inkuber reaktionsblandingen i 30 min. Med bestemte tidsintervaller måles absorbansen ved 375 nm. En stigning i absorbansen indikerer dannelsen af reaktionsslutproduktet, 2-hydroxymukonsyresemialdehyd (2-HMS). Udfør eksperimentet i tre eksemplarer.
BEMÆRK: Katekol er lysfølsom og iltfølsom. Opbevar reaktionsblandingen i mørke og luk rørene tæt for at forhindre den naturlige nedbrydning af catechol.
4. Genomisk DNA-isolering af den rene kultur
BEMÆRK: Dette er den generelle protokol til isolering af genomisk DNA. Gramfarvning blev udført under prøveindsamling, behandling og analysetrin. På grund af variationen i cellevægtykkelsen af gram-positive og gram-negative bakterier ændres cellelysemetoden i overensstemmelse hermed. Brug handsker, mens du isolerer og desinficerer arbejdsbordet med 70% ethanol for at undgå, at nukleaserne nedbryder DNA. Nogle af de kemikalier, der er nævnt nedenfor, kan forårsage alvorlige forbrændinger på huden, og der skal udvises passende omhu under håndtering af dem.
- Isolering af genomisk DNA fra gramnegative bakterier31.
- Vælg en enkelt koloni og pod i et frisk vækstmedium i sterile reagensglas.
- Anbring rørene i en inkubatorryster ved 200 omdr./min., og lad bakterierne vokse natten over ved 30 °C.
- Den næste dag pellets 1,5 ml dyrket kultur natten over ved 12.400 x g i 3 min.
- Supernatanten fjernes og pellet resuspenderes i 200 μl lysisbuffer (40 mM Tris-acetat, pH 7,8, 20 mM natriumacetat, 1 mM EDTA, 1% SDS).
- Der tilsættes 66 μL NaCl-opløsning (5 M) og blandes godt.
- Pellet den resulterende blanding ved 12.400 x g i 10 min (4 °C).
- Den klare supernatant pipetteres i et frisk mikrocentrifugeglas, og der tilsættes en tilsvarende mængde chloroform.
- Vend opløsningen flere gange, indtil der observeres en mælkeagtig opløsning.
- Centrifuger ved 12.400 x g i 3 minutter og overfør supernatanten til et rent hætteglas.
- Tilsæt 1 ml iskold 100% ethanol; blandes ved inversion, indtil hvide DNA-strenge udfældes.
- Det udfældede DNA centrifugeres ved 2,200 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Vask DNA-pillen med 1 ml 70% ethanol og lad DNA-pillen tørre i 5 min ved stuetemperatur.
- Når pellet er tørret, resuspenderes pellet i 100 μL 1x Tris-EDTA(TE)-buffer, og DNA'et opbevares ved -20 °C.
- Mål koncentrationen (A260/280) ved hjælp af spektrofotometer og kør DNA'et på agarosegel (1%) for at vurdere kvaliteten af DNA24.
- Dyrkning af genomisk DNA fra grampositiv stamme32
- Vælg en enkelt koloni og pod i frisk vækstmedium i sterile reagensglas.
- Placer rørene i en inkubatorryster ved 200 o / min, og lad bakterierne vokse natten over ved en passende væksttemperatur.
- Næste dag skal du tage 1,5 ml af den dyrkede kultur og centrifugere ved 8.600 x g i 5 minutter.
- Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i TE-bufferen.
- OD600 = 1,0 justeres med TE-buffer, og 740 μL af cellesuspensionen overføres til et rent mikrofugerør.
- Der tilsættes 20 μL lysozym (100 mg/ml stam) og blandes grundigt ved pipettering. Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter (i tørt bad).
- Tilsæt 40 μL 10% SDS og bland godt.
- Der tilsættes 8 μL proteinase K (10 mg/ml). Bland godt og inkuber ved 56 °C i 1-3 timer (i et tørt bad). Suspensionen skal blive klar nu med øget viskositet, hvilket markerer effektiv cellelyse.
BEMÆRK: Suspensionen kan efterlades natten over, hvis cellerne ikke lyseres korrekt. - CTAB/NaCl-blandingen forvarmes ved 65 °C (i et tørt bad), og der tilsættes 100 μL af denne blanding til cellesuspensionen. Bland godt.
- Der inkuberes ved 65 °C i 10 minutter (i tørt bad).
- Tilsæt 500 μL chloroform:isoamylalkohol (24:1) og bland godt. Spin ved 16.900 x g i 10 minutter ved 25 °C.
- Den vandige fase overføres til et frisk mikrocentrifugerør, hvorved den organiske fase undgås (tyktflydende fase i bunden).
- Tilsæt forsigtigt 500 μL phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1) og bland godt. Spin ved 16.900 x g i 10 minutter ved 25 °C.
- Den vandige fase tages i et frisk mikrocentrifugerør. Tilsæt 500 μL chloroform:isoamylalkohol (24:1) og bland godt.
- Den vandige fase overføres, og der tilsættes 0,6 volumenisopropanol (forkølet ved -20 °C).
- De udfældede DNA-strenge skal være synlige i den trådlignende form. Der inkuberes ved -20 °C i 2 timer til natten over.
- Der centrifugeres ved 16.900 x g i 15 minutter ved 4 °C for at pelletere DNA'et.
- Isopropanol dekanteres omhyggeligt, og pelleten vaskes med 1 ml kold 70% ethanol (forkølet ved -20 °C) for at fjerne urenheder.
- Der centrifugeres ved 16.900 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres.
- Lad pillen tørre ved stuetemperatur i 20 minutter eller opbevar røret ved 37 °C. Sørg for, at pelleten ikke er overtørret.
- Resuspender i 100 μL 1x TE-buffer og opbevar DNA'et ved -20 °C.
BEMÆRK: Hvis pelleten bliver overtørret og er vanskelig at resuspendere, inkuberes mikrocentrifugerøret med DNA-pellet og nukleasefrit vand ved 37 °C i 15-20 minutter og resuspenderes igen ved pipettering. - Mål koncentrationen (A260/280) ved hjælp af et spektrofotometer efter 1:100 fortynding i 1x TE-buffer, og kør DNA'et på agarosegel (1%) for at vurdere kvaliteten af DNA24.
5. 16S rRNA-sekventering
BEMÆRK: Protokollen skitseret nedenfor er til amplifikation og sekventering af 16S rRNA til bakteriel identifikation. Information afledt af 16S rRNA-sekvensen bruges til identifikation af en ukendt organisme og til at finde slægtskabet mellem forskellige organismer.
- For at identificere stammerne amplificeres DNA'et isoleret fra de rene bakteriekulturer ved PCR med universelle primere rettet mod 16S rRNA-sekvens for bakterier: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') og 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- Forbered PCR-blandingen (25 μL reaktioner) på is med 18 μL autoklaveret/nukleasefrit vand, 2,5 μL 10x buffer, 0,5 μL både fremadgående og omvendte primere (100 μM lager), 2 μL af dNTP-blandingen (100 μM lager), 1 μL DNA-skabelon (2-15 ng/μL) og 1 U Taq Polymerase.
- Brug følgende cykelbetingelser for 16S rRNA-genamplifikation: Initial denaturering ved 94 °C i 10 minutter (endelig denaturering ved 94 °C i 40 s, grundglødning ved 56 °C i 1 min, forlængelse ved 74 °C i 2 min) x 30 cyklusser, endelig forlængelse ved 74 °C i 10 minutter.
- Når cyklussen er afsluttet, blandes 5 μL prøve og 1 μL 5x DNA-påfyldningsfarvestof. Kør på 1% agarosegel for at verificere amplifikationen. Opbevar PCR-produkterne ved 4 °C på kort sigt eller frys dem ved -20 °C indtil yderligere brug.
- Til 16S rRNA-gensekventering indstilles den samme reaktion som nævnt ovenfor for højere volumen (100 μL).
- Rens amplikonerne til Sanger-sekventering24,34 ved hjælp af PCR-produktrensningssæt, eller bland hele prøven med DNA-påfyldningsfarvestof og læg på en agarosegel for at udføre gelekstraktionsmetode.
- Når sekvenseringen er udført, skal du konvertere resultatfilen i FASTA-format og kontrollere sekvensligheden med det grundlæggende lokale justeringssøgeværktøj (BLAST) på NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skematiske oversigt over hele proceduren for isolering og screening af bakterier fra akvatiske levesteder og deres efterfølgende identifikation ved 16S rRNA-analyse er vist i figur 1. Vandprøver fra et vådområde i Dadri, Indien, blev indsamlet i sterile glasflasker og straks taget til laboratoriet til behandling. Prøverne blev ført gennem filterark med en porestørrelse på 0,22 μm, og filterpapiret blev holdt i kontakt med forskellige medieplader. Efter 2 timer blev filtrerpapiret fjernet, og pladerne blev inkuberet natten over ved 30 °C til kolonidannelse (figur 2). Den næste dag blev individuelle bakteriekolonier udvalgt og stribet på friske medieplader (figur 2). Den genererede rene kultur blev opbevaret og efterfølgende brugt til yderligere analyse. Ved hjælp af denne metode var vi i stand til at oprette et bibliotek med mere end 100 unikke bakterieisolater. Vores mål var at identificere bakterieisolater, der kan udnytte kulbrinter, især styren, som er den primære komponent i engangsplast. De isolerede bakterier blev dyrket individuelt i respektive medier med tilsætning af flydende styren som eneste kilde til kulstof (figur 3). Vi kunne identificere fire isolater, der udnytter styren som eneste kilde til kulstof. To af isolaterne blev yderligere karakteriseret i udstrakt grad for styrennedbrydning25.
Bakterieisolaterne blev derefter testet for tilstedeværelsen af enzymatiske veje til nedbrydning af kulbrintemetabolismen. Kulbrintemetabolisme i nogle bakterier resulterer i produktion af catechols som mellemprodukter, som yderligere nedbrydes af ortho-spaltning og meta-spaltningsveje. Catechol 1,2- dioxygenase og catechol 2,3-dioxygenase enzymer er ansvarlige for ringspaltningsreaktion36. Miljøbakterier, der besidder disse enzymer, har vist sig at metabolisere flere aromatiske forbindelser. Således blev der udført et catecholnedbrydningsassay for at vurdere HC-nedbrydningspotentialet for bakterieisolater (figur 4). Figur 4 viser et repræsentativt assay for et af isolaterne.
For at identificere bakterieisolaterne blev 16S rRNA-sekventering udført. En foreløbig gramfarvning blev udført for at karakterisere bakterierne, hvilket hjælper med at identificere og fejlfinde efterfølgende trin. Grampositive bakterier er normalt genstridige over for cellelysebuffere, hvilket fører til lavt genomisk DNA-udbytte37. Således ville resultaterne opnået fra gramfarvning38 før genomisk DNA-isolering hjælpe med at vælge protokollen for genomisk DNA-isolering. Efter DNA-isolering blev integriteten af genomisk DNA bekræftet ved visualisering af en lille prøve af DNA på agarosegel (figur 5A) og kvantificeret ved UV-absorbansmetode ved anvendelse af et spektrofotometer. 16S rRNA-genet blev amplificeret ved hjælp af universel primersekvens (figur 5B). Mens 500 bp er afgørende for sekventering, opnås ideelle resultater med 1.300-1.500 bp39. For at opnå graden af slægtskab mellem isolerede stammer blev et fylogenetisk træ konstrueret ved hjælp af phylogeny.fr-softwaren40 (figur 6).
Figur 1: Skematisk arbejdsgang for undersøgelsen Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billeder af bakteriekolonier fra vandprøver. Den opsamlede vandprøve blev ført gennem 0,22 μm filterpapir. Filterpapiret blev opbevaret over forskellige medieplader. Pladerne blev inkuberet i 24-48 timer, indtil isolerede kolonier blev observeret. De enkelte kolonier blev derefter stribet på friske plader for ren kulturisolering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative resultater af mikrobiel nedbrydning af styren og screening af bakteriers nedbrydningspotentiale for carbonhydrid. Cellerne blev dyrket i LCFBM suppleret med 5 mM styren som eneste kulstofkilde i 40 dage ved 30 °C og 200 omdr./min. OD600 blev målt hver 5. dag. Kontrolkolben havde kun LCFBM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentation af Catechol 2,3-dioxygenaseenzymassay til overvågning af nedbrydningen af catechol. (A) Det farveløse substrat catechol omdannes til et gulfarvet produkt ved virkningen af catechol 2,3-dioxygenase. Reaktionsblandingen indeholder catechol, fosfatbuffer og råcellelysat. Dannelsen af produktet detekteres ved måling af absorbans ved 375 nm. B) Repræsentativ graf over catechol 2,3-dioxygenaseenzymassay med helcellelysat. Reaktionsblandingen i negativ kontrol har buffer og catecholsubstrat uden cellelysat. Absorbansen blev målt ved 375 nm med et interval på 10 min. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Genomisk DNA-isolering og 16S rRNA PCR. A) Gelelektroforese af isoleret genomisk DNA. Bane M: DNA-størrelsesmarkør, bane 1-2: genomisk DNA. (B) Verifikation af 16S rRNA-genamplifikation ved 1% gelelektroforese. Geler blev visualiseret ved farvning med ethidiumbromid; Bane M: DNA-størrelsesmarkør (1 kb), bane 1-4: Amplificerede PCR-produkter fra forskellige stammer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Analyse af resultaterne af 16S rRNA-gensekventering. Repræsentativ dendrogramkonstruktion ved hjælp af phylogeny.fr-programmet til at skildre slægtskabet mellem Exiguobacterium-stammer isoleret fra et vådområde (fremhævet i rød boks) med den kendte Exiguobacterium sp. 16S rRNA-sekvenserne af kendt Exiguobacterium sp. blev opnået fra NCBI. Dette tal er taget fra et tidligere papir (Chauhan et.al.) uden ændringer25. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Udtræk af peptongær (PYE) | |
| Pepton | 2g |
| Gærekstrakt | 1g |
| 1MMgSO4 | 1 ml |
| 1M CaCl2 | 1 ml |
| Destilleret vand | Op til 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| Ræsonnementets 2A (R2A) | |
| Kaseinsyrehydrolysat | 0,5 g |
| Gærekstrakt | 0,5 g |
| Protease pepton | 0,5 g |
| Dextrose | 0,5 g |
| Opløselig stivelse | 0,5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| Destilleret vand | Op til 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| M2G | |
| 10X M2 salte (1L) - | |
| Na2HPO4 | 17,4 g |
| KH2PO4 | 10,6 g |
| NH:4Cl | 5,0 g |
| Autoklave 10X M2 salte ved 121 °C og 15 PSI i 15 min. | |
| 10X M2 salte | 100 ml |
| 50mM MgCl2 | 10 ml |
| 30% glucose (w / v) | 10 ml |
| 1 mMFeSO4 i 0,8 mM EDTA, pH 6,8 | 10 ml |
| 50 mM CaCl2 | 10 ml |
| Destilleret vand | Op til 1000 ml |
| Filtrer sterilisere. | |
| Lysogeni bouillon (LB) | |
| Kasein enzymhydrolysat | 10 g |
| Gærekstrakt | 5 g |
| NaCl | 10 g |
| Destilleret vand | Op til 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| Næringsstof bouillon (NB) | |
| Pepton | 15 g |
| Gærekstrakt | 3 g |
| NaCl | 6 g |
| Glukose | 1 g |
| Destilleret vand | Op til 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| Tryptisk soja bouillon (TSB) | |
| Pancreas fordøjelse af kasein | 17,0 g |
| Papaisk fordøjelse af sojabønnemel | 3 g |
| NaCl | 5 g |
| K2HPO4 | 2,5 g |
| Dextrose | 2,5 g |
| Destilleret vand | Op til 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| M63 | |
| NH:4Cl | 2g |
| KH2PO4 | 13,6 g |
| FeSO4.7H 2O | 0,5 mg |
| 20% glycerol | 10 ml |
| 1MMgSO4 | 1 ml |
| Destilleret vand | Op til 1000 ml |
| M9 minimale medier | |
| 5X M9 salte | |
| Na 2HPO4.7H 20 | 12,8 g |
| KH2PO4 | 3 g |
| NH:4Cl | 1 g |
| NaCl | 0,5 g |
| Destilleret vand | Op til 200 ml |
| Autoklave 5X M9 salte ved 121°C og 15 PSI i 15 min. | |
| 1X M9-medier | |
| 5X M9 salte | 20 ml |
| 20% glukose | 2 ml |
| 1MMgSO4 | 200 μl |
| 1M CaCl2 | 10 μl |
| Autoklaveret vand | Op til 100 ml |
| BEMÆRK - Til forberedelse af faste medier skal du bruge 1,5% Bacto Agar (15 g / L) |
Tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er velkendt, at kun ca. 1% af bakterierne på Jorden let kan dyrkes i laboratoriet6. Selv blandt de dyrkbare bakterier forbliver mange ukarakteriserede. Forbedringer i molekylære metoder har givet en ny dimension til analyse og evaluering af bakteriesamfund. Sådanne teknikker har dog begrænsninger, men de gør ikke kulturanalyserne overflødige. Rene kulturteknikker til isolering af individuelle bakteriearter forbliver den primære mekanisme til karakterisering af fysiologiske egenskaber. Jord- og vandlevende levesteder huser mange bakterier med nye enzymer og veje, som kan udnyttes til bioteknologiske anvendelser. Denne undersøgelse beskriver en enkel og billig metode til isolering og karakterisering af bakterier fra økologiske prøver.
Forskellige bakterier har forskellige ernæringsmæssige behov, derfor blev forskellige vækstmedier brugt til at øge sandsynligheden for at isolere forskellige bakteriearter. En væsentlig begrænsning ved denne metode er, at mikrober med hurtige vækstkrav kan blive udelukket. Hovedmålet med dette trin er også at maksimere antallet af bakteriearter opnået fra prøven. Antallet af bakteriearter i prøvebiblioteket ville forbedre chancerne for at isolere mikrober med bioremedieringspotentiale. Selvom vi kun varierede vækstmedier, kan varierende væksttemperatur og iltkoncentration også øge chancerne for yderligere at udvide prøvebiblioteket med unikke arter41,42.
Et kritisk trin i protokollen er at kontrollere udnyttelsen af substratet, der testes (styren i vores tilfælde). Det er vigtigt at designe eksperimentet til en sådan undersøgelse med omhu for at undgå falsk-negative resultater. Afhængigt af vækstegenskaber tilpasser mikroben sig muligvis ikke straks til at udnytte substratet, der testes, og kan kræve en berigelsesproces. I vores tilfælde er bakterievæksten langsom i LCFBM-mediet, der bruges til at teste udnyttelsen af kulbrinte som den eneste kulstofkilde25. For at omgå dette problem kan indledende kulturer startes ved at tilføje (1% v / v) TSB eller NB til LCFBM-mediet for at understøtte bakterievækst. Identifikation af den dyrkede mikrobe opnås gennem 16S rRNA-sekventering43. Denne metode tilbyder en robust og omkostningseffektiv metode til mikrobiel identifikation. 16S-sekventering kan dog kun give taksonomisk identifikation på højere niveau. Til identifikation på artsniveau skal der anvendes andre familiespecifikke primere kombineret med forskellige biokemiske test44,45.
Enzymanalyse med helcellelysat kræver anvendelse af en effektiv cellelysemetode. Bakteriel cellelyse opnås normalt ved at udføre sonikering. Imidlertid er en fryse-optøningsmetode en alternativ metode til skånsom cellelyse, som menes at forhindre denaturering af protein. Fremgangsmåden består i hurtigt at fryse cellerne ved -80 °C og optø ved 4 °C sekventielt46. Tilsætningen af milde rengøringsmidler som NP-40 eller Triton-X-100 hjælper også med cellelyse og denaturerer ikke proteinerne på grund af deres ikke-ioniske natur47. Imidlertid kan bakterier med tykke cellevægge, såsom cyanobakterier48 , muligvis ikke drage fordel af den skånsomme cellelysemetode ved hjælp af vaskemidler49 , og lysismetoden til enzymanalyse skal derfor vælges i overensstemmelse hermed.
Ved at fokusere på den dyrkbare bakteriepopulation fra miljøprøver kan forskerne hurtigt udføre mange forskellige eksperimenter. De metoder, der beskrives her, kræver ikke brug af meget sofistikerede instrumenter og kan let udføres i en standard laboratorieopsætning. Da der anvendes kulbrinter og farlige kemikalier, skal laboratoriet udstyres med korrekt håndtering og bortskaffelse i henhold til standarddriftsprocedurer. Den her beskrevne tilgang kan let tilpasses til at studere en række bakteriearter til adskillige bioteknologiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Karthik Krishnan og medlemmer af RP-laboratoriet for deres nyttige kommentarer og forslag. DS er støttet af SNU-Doctoral fellowship og Earthwatch Institute India Fellowship. RP lab er støttet af et CSIR-EMR-tilskud og opstartsmidler fra Shiv Nadar University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B.
- R, C.
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R.
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
