Summary
Vi presenterer prosessen med å isolere, forplante og karakterisere hydrokarbonnedbrytende bakterier fra akvatiske habitater. Protokollen skisserer bakteriell isolasjon, identifisering ved 16S rRNA-metoden og testing av deres hydrokarbonnedbrytende potensial. Denne artikkelen vil hjelpe forskere med å karakterisere mikrobiell biologisk mangfold i miljøprøver, og spesielt skjerme for mikrober med bioremedieringspotensial.
Abstract
Hydrokarbonforurensende stoffer er gjenstridige mot nedbrytning, og deres akkumulering i miljøet er giftig for alle livsformer. Bakterier koder for mange katalytiske enzymer og er naturlig i stand til å metabolisere hydrokarboner. Forskere utnytter biologisk mangfold i akvatiske økosystemer for å isolere bakterier med biologisk nedbrytning og bioremedieringspotensial. Slike isolater fra miljøet gir et rikt sett med metabolske veier og enzymer, som videre kan utnyttes for å skalere opp nedbrytningsprosessen i industriell skala. I denne artikkelen skisserer vi den generelle prosessen med isolasjon, forplantning og identifisering av bakteriearter fra akvatiske habitater og skjermer deres evne til å utnytte hydrokarboner som eneste karbonkilde in vitro ved hjelp av enkle teknikker. Den nåværende protokollen beskriver isoleringen av forskjellige bakteriearter og deres påfølgende identifisering ved hjelp av 16S rRNA-analysen. Protokollen presenterer også trinn for å karakterisere hydrokarbonnedbrytningspotensialet til bakterieisolater. Denne protokollen vil være nyttig for forskere som prøver å isolere bakteriearter fra miljøhabitater for deres bioteknologiske applikasjoner.
Introduction
Hydrokarboner (HC) er mye brukt både som drivstoff og i kjemiske applikasjoner. Aromatiske hydrokarboner som benzen, toluen og xylen brukes mye som løsningsmidler1. Alkener som etylen og propylen tjener som forløpere i syntesen av henholdsvis polyetylen- og polypropylenpolymerer. Polymerisering av et annet hydrokarbon, styren danner polystyren. Antropogene aktiviteter introduserer hydrokarboner i miljøet under produksjon og transport. Hydrokarbonforurensning av jord og vann har alvorlige bekymringer for miljøet og menneskers helse. Mikrober spiller en viktig rolle i å opprettholde økosystemet ved å regulere de biogeokjemiske syklusene og utnytte et bredt spekter av substrater, som også inkluderer forurensninger og xenobiotika, og konverterer dem til karbon og energikilde. Denne prosessen med avgiftning av miljøforurensninger av mikroorganismer er kjent som bioremediering 3,4,5,6,7.
Mikroorganismer med evne til å nedbryte hydrokarboner finnes i vann- og jordhabitater 8,9,10. Mange bakterier med potensial til å nedbryte alkaner og aromatiske HCer har blitt identifisert, for eksempel Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter og Oleibacter11. Utviklingen av teknologisk avanserte kulturuavhengige tilnærminger har bidratt til å oppdage nye HC-nedbrytende mikrobielle samfunn12. Genomisk materiale direkte isolert fra kildeprøver forsterkes og sekvenseres ved hjelp av metoder med høy gjennomstrømning som Next Generation Sequencing (NGS) etterfulgt av analyse som eliminerer behovet for å dyrke mikroorganismer. NGS-metoder, som metagenomanalyse, er dyre og lider av ulemper knyttet til amplifikasjonsprosessen13. Dyrkingsteknikker som selektiv anrikningskultur14 som retter seg mot isolering av hydrokarbonnedbrytende mikrober, er fortsatt nyttige da de tillater forskere å undersøke og manipulere metabolske veier i bakterielle isolater.
Genomisk DNA-isolering og påfølgende sekvensering av genomisk materiale avslører verdifull informasjon om enhver organisme. Helgenomsekvensering hjelper til med identifisering av gener som koder for antibiotikaresistens, potensielle legemiddelmål, virulensfaktorer, transportører, xenobiotika-metaboliserende enzymer, etc15,16,17. Sekvensering av 16SrRNA-kodende gen har vist seg å være en robust teknikk for å identifisere bakteriell fylogeni. Bevaring av gensekvensen og funksjonen gjennom årene gjør det til et pålitelig verktøy for å identifisere ukjente bakterier og sammenligne et isolat med de nærmeste artene. I tillegg er lengden på dette genet optimal for bioinformatikkanalyse18. Alle disse funksjonene sammen med den enkle genforsterkningen ved hjelp av universelle primere og forbedring i gensekvenseringsteknologi gjør det til en gullstandard for identifisering av mikrober.
Her beskriver vi en prosedyre for å gjenvinne dyrkede mikroorganismer med HC-nedbrytende potensial fra miljøprøver. Metoden beskrevet nedenfor skisserer innsamling og identifisering av HC-nedbrytende bakterier og er delt inn i fem seksjoner: (1) innsamling av bakterier fra vannprøver, (2) isolering av rene kulturer, (3) undersøkelse av HC-nedbrytende evne til bakterielle isolater, (4) genomisk DNA-isolasjon, og (5) identifikasjon basert på 16S rRNA-gensekvensering og BLAST-analyse. Denne prosedyren kan tilpasses for å isolere bakterier for mange forskjellige bioteknologiske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøveinnsamling, behandling og analyse
MERK: Her presenterer vi en protokoll for å isolere bakterier fra vannlevende habitater. Noen av isolatene kan være sykdomsfremkallende, bruk derfor hansker og desinfiser arbeidsområdet før og etter bruk.
- Samle 500 ml vannprøve i fem sterile glassflasker fra forskjellige steder i vannkroppen. Mål pH og temperatur for hver prøve ved hjelp av henholdsvis en pH-måler og et termometer.
MERK: Protokollen er ikke stedsspesifikk og kan enkelt tilpasses for å isolere organismer fra hydrokarbonforurensede vannforekomster også. - Filtrer prøven i et parti på 100 ml til og med 0,22 μm filterark i porestørrelse, under aseptiske forhold.
NOTAT: Diameteren på filterpapiret bør ikke overstige petriskåldiameteren. For eksempel er filterpapir som ikke overstiger 85 mm diameter optimalt for en 100-120 mm petriskål. - Oppbevar filterpapirene over forskjellige næringsmedieplater (PYE19, R2A 20, M9, LB, NB, TSB, M6321 og M2G22). De forskjellige typer vekstmedier tillater valg og anrikning av forskjellige mikroorganismer. Sammensetninger av ulike vekstmedier er listet opp i tabell 1. Bruk ett papir til hver medieplate og riv av etter 2 timer med steril tang.
- Fortynn de ufiltrerte vannprøvene (10,6 fortynning) serielt i sterilt dobbeltdestillert vann ved å tilsette 100 μL av den oppsamlede vannprøven i 900 μL sterilt vann. Dette resulterer i en fortynning på 1:10. Ta 100 μL fra denne prøven og tilsett 900 μL sterilt vann for å oppnå 1:100 fortynning. Gjenta fortynningen til fortynningsfolden er 1:1 000 000. Bland ved pipettering. Det endelige volumet av hver fortynning vil være 1 ml.
- Fordel 100 mikrol av den fortynnede vannprøven individuelt på alle vekstmedieplater nevnt i trinn 3 i triplikater.
- Inkuber platene ved 30 °C i 24 til 48 timer, avhengig av veksten av kolonier.
MERK: De fleste miljøisolatene vokser ved en optimal temperatur på 30 °C. Hvis du isolerer prøvene fra et miljø med ekstreme temperaturer, inkuberer du platene ved samme temperatur som på oppsamlingsstedet. - Deretter velger du koloniene ved hjelp av en steril tannpirker eller pipettespiss og utfører kvadrantstreker for å få isolerte kolonier.
- Inkuber platene over natten. Neste dag, skjerm koloniene basert på deres morfologiske egenskaper som farge, tekstur, form, størrelse, margin, høyde, etc. Restreak koloniene for å få rene kulturer.
- Utfør gramfarging av hver ren kultur23 og fortsett med glyserollagerpreparat.
- For å forberede glyserollagrene, inokuler en enkelt koloni i 3 ml passende vekstmedier og inkuber ved 30 °C. Fra nattens kultur, ta 700 μL og tilsett 300 μL 100% glyserol (sterilisert ved autoklavering) i kryovialer24. Hetteglassene fryses ved -80 °C for langtidsoppbevaring.
2. Nedbrytning av hydrokarboner
MERK: Eksemplet nedenfor er å screene isolatene som kan nedbryte styren. Det er en liten modifikasjon av metoden tilpasset i en tidligere rapport25. Følg trinnene under aseptiske forhold.
- Fra en nystripet tallerken, velg en koloni og inokuler i 5 ml tryptisk soyabuljong (TSB) / næringsbuljong (NB). Dyrk kulturen over natten ved 30 ° C med risting ved 200 o / min til absorbansen når ~ 2.
MERK: Bortsett fra TSB / NB, kan ethvert vekstmedium velges der bakteriene når høy celletetthet. - Neste dag, pellet cellene ved 2862 x g i 5 minutter ved 4 ° C og kast supernatanten.
- Vask pelleten to ganger med 2 ml autoklavert saltvann (0,9 % NaCl) og sentrifugerer ved 2862 x g i 5 minutter ved 4 °C.
MERK: Saltvann er isotonisk, og dermed opprettholder det osmotiske trykket inne i bakterieceller. - Resuspender pelleten i 2 ml flytende karbonfritt basalmedium (LCFBM). Mål absorbansen (OD600).
- Ta to sterile Erlenmeyer-kolber med 150 ml kapasitet for kontroll og eksperimentgruppen. Merk dem som A og B.
- I gruppen som ikke er inokulert/kontroll, (kolbe A), tilsett 40 ml LCFBM og styren (5 mM).
- I kolbe B, tilsett 35 ml LCFBM og styren (juster den endelige konsentrasjonen av styren til 5 mM). Legg til cellesuspensjonen med en endelig OD600 av celler ≈ 0,1 og utgjør gjenværende volum med LCFBM opp til 40 ml. Inkuber kolbene ved 30 °C med risting ved 200 o / min i 30 dager.
MERK: Hydrokarboner i overskudd kan være giftige for mikrober, derfor starter med lav konsentrasjon og øker den gradvis. - Gjenta ovenstående for hver ekstra belastning som må evalueres for hydrokarbonnedbrytning.
- Mål OD600 av hver kolbe hver 5. dag og plott en vekstkurve. Øk inkubasjonen opptil 45 dager hvis bakteriene kan utnytte styren. En økning i OD600 indikerer at bakterien kan metabolisere styren.
3. Screening av katekolnedbrytning med bakterieisolater
MERK: Nedbrytningen av aromatiske hydrokarboner som styren, benzen, xylen, naftalen, fenoler, etc. produserer katekoler som reaksjonsmellomprodukter. Katekolene metaboliseres videre av bakterier ved hjelp av catechol 1,2-dioxygenase og catechol 2,3-dioxygenase enzymer gjennom henholdsvis orto- og metaspaltningsveiene26. Disse enzymene er også involvert i nedbrytningen av andre hydrokarboner som klorbenzen27. Protokollen nevnt nedenfor bruker helcellelysat for katekol 2, 3-dioksygenase enzymanalyse28. Den samme lysismetoden kan brukes til å skjerme aktiviteten til katekol 1, 2-dioksygenase. Imidlertid vil sammensetningen av reaksjonsblandingen variere. Begge enzymene er induserbare i naturen og kan induseres ved tilsetning av fenol til vekstmediet.
- Ved hjelp av en steril sløyfe, inokuler bakteriekolonien fra en nystripet plate til mineralsaltmedium (MSM) supplert med 1-4 mM fenol. Inkuber kulturen ved 30 °C og 200 o / min. Høst kulturen ved 4 °C når OD 600 når mellom 1,4-1,6 (dvs. i sen eksponentiell fase) ved å spinne ved4500 x g i 20 minutter.
- Vask cellepelleten med fosfatbuffer (0,5 M, pH 7,5).
- Resuspender cellene i ovennevnte fosfatbuffer og juster den endelige OD600 ≈ 1.0.
- Lyse cellene ved pulserende sonikering i 1,5 min, varigheten av hver puls er 15 s. Etter dette trinnet må suspensjonen være klar eller mindre uklar. Hvis ikke, øk antall pulser og kontroller om suspensjonen er klar. Etter hver puls, hold prøven på is for å unngå nedbrytning av protein.
- Fjern cellerester og ubrutte celler ved sentrifugering ved 9000 x g i 30 minutter, og oppretthold den kalde temperaturen (4 ° C).
- Pipetter den klare supernatanten forsiktig. Denne fraksjonen har råekstraktet for enzymanalyse.
- Bestem proteinkonsentrasjonen av råekstrakt ved enten Bradford eller Lowrys metode29,30.
- For å bestemme aktiviteten til katekol 2,3-dioksygenase, måles dannelsen av reaksjonens sluttprodukt (2-hydroksymukonisk semialdehyd) med et spektrofotometer.
- Forbered reaksjonsblandingen ved å tilsette 20 μL katekol (50 mM), 960 μL fosfatbuffer (50 mM, pH 7,5) og 20 μL av råekstraktet.
- For negativ kontroll, erstatt råekstraktet med fosfatbuffer og juster det endelige volumet til 1 ml.
- Inkuber reaksjonsblandingen i 30 minutter. Ved innstilte tidsintervaller måles absorbansen ved 375 nm. En økning i absorbans indikerer dannelsen av reaksjonens sluttprodukt, 2-hydroksymukonsyre semialdehyd (2-HMS). Utfør eksperimentet i triplikater.
MERK: Catechol er lysfølsom og oksygenfølsom. Oppbevar reaksjonsblandingen i mørkt og lukk rørene tett for å forhindre naturlig nedbrytning av catechol.
4. Genomisk DNA-isolasjon av den rene kulturen
MERK: Dette er den generelle protokollen for isolering av genomisk DNA. Gramfarging ble utført under prøveinnsamlings-, prosesserings- og analysetrinnet. På grunn av variasjonen i celleveggtykkelsen av gram-positive og gram-negative bakterier, modifiseres cellelysemetoden tilsvarende. Bruk hansker mens du isolerer og desinfiser arbeidsbenken med 70% etanol for å unngå at nukleasene nedbryter DNA. Noen av kjemikaliene nevnt nedenfor kan forårsake alvorlige forbrenninger på huden, og det må tas riktig forsiktighet mens du håndterer dem.
- Isolering av genomisk DNA fra gramnegative bakterier31.
- Velg en enkelt koloni og inokuler i et friskt vekstmedium i sterile reagensrør.
- Plasser rørene i en inkubatorshaker ved 200 o / min og la bakteriene vokse over natten ved 30 ° C.
- Neste dag, pellet 1,5 ml over natten dyrket kultur på 12,400 x g i 3 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 200 μL lysisbuffer (40 mM Tris-acetat, pH 7,8, 20 mM natriumacetat, 1 mM EDTA, 1% SDS).
- Tilsett 66 μL NaCl-oppløsning (5 M) og bland godt.
- Pellet den resulterende blandingen ved 12 400 x g i 10 minutter (4 °C).
- Pipetter den klare supernatanten i et nytt mikrosentrifugerør og tilsett et likt volum kloroform.
- Inverter, bland løsningen flere ganger til en melkeaktig løsning er observert.
- Sentrifugerer 12 400 x g i 3 minutter og overfør supernatanten til et rent hetteglass.
- Tilsett 1 ml iskald 100% etanol; bland ved inversjon til hvite DNA-tråder faller ut.
- Sentrifuger det utfelte DNA-et ved 2 200 x g i 10 minutter ved 4 °C og kast supernatanten.
- Vask DNA-pelleten med 1 ml 70% etanol og la DNA-pelleten tørke i 5 minutter ved romtemperatur.
- Når den er tørket, resuspenderes pelleten i 100 μL 1x Tris-EDTA (TE) buffer, og lagrer DNA ved -20 °C.
- Mål konsentrasjonen (A260/280) ved hjelp av spektrofotometer og kjør DNA på agarosegel (1%) for å vurdere kvaliteten på DNA24.
- Isolering av genomisk DNA fra gram-positiv stamme32
- Velg en enkelt koloni og inokuler i friskt vekstmedium i sterile reagensrør.
- Plasser rørene i en inkubatorshaker ved 200 o / min og la bakteriene vokse over natten ved en passende veksttemperatur.
- Neste dag, ta 1,5 ml av den dyrkede kulturen og sentrifugen ved 8,600 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i TE-bufferen.
- Juster OD600 = 1,0 med TE-buffer og overfør 740 μL av cellesuspensjonen til et rent mikrofugerør.
- Tilsett 20 mikrol lysozym (100 mg/ml stam) og bland godt ved pipettering. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter (i tørt bad).
- Tilsett 40 μL 10% SDS og bland godt.
- Tilsett 8 μL proteinase K (10 mg/ml). Bland godt og inkuber ved 56 °C i 1-3 timer (i tørt bad). Suspensjonen skal bli klar nå med økt viskositet, noe som markerer effektiv cellelyse.
MERK: Suspensjonen kan stå over natten hvis cellene ikke lyseres riktig. - Forvarm CTAB/NaCl-blandingen ved 65 °C (i et tørt bad) og tilsett 100 μL av denne blandingen til cellesuspensjonen. Bland godt.
- Inkuber ved 65 °C i 10 minutter (i tørt bad).
- Tilsett 500 μL kloroform:isoamylalkohol (24: 1) og bland godt. Spinn ved 16 900 x g i 10 minutter ved 25 °C.
- Overfør den vandige fasen til et nytt mikrosentrifugerør for å unngå den organiske fasen (viskøs fase nederst).
- Tilsett forsiktig 500 μL fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1) og bland godt. Spinn ved 16 900 x g i 10 minutter ved 25 °C.
- Ta den vandige fasen i et nytt mikrosentrifugerør. Tilsett 500 μL kloroform:isoamylalkohol (24: 1) og bland godt.
- Overfør den vandige fasen og tilsett 0,6 volum isopropanol (forkjølt ved -20 °C).
- De utfelte DNA-trådene må være synlige i trådform. Inkuber ved -20 °C i 2 timer til over natten.
- Sentrifuge ved 16 900 x g i 15 minutter ved 4 °C for å pelletere DNA.
- Dekanter isopropanolen forsiktig og vask pelleten med 1 ml kald 70 % etanol (forkjølt ved -20 °C) for å fjerne urenheter.
- Sentrifuge ved 16 900 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- La pelleten tørke ved romtemperatur i 20 minutter eller hold slangen ved 37 °C. Forsikre deg om at pelleten ikke er overtørket.
- Resuspender i 100 μL 1x TE-buffer og lagre DNA ved -20 °C.
MERK: Hvis pelleten blir overtørket og vanskelig å resuspendere, inkuber mikrosentrifugerøret med DNA-pellet og nukleasefritt vann ved 37 °C i 15-20 minutter og resuspender igjen ved pipettering. - Mål konsentrasjonen (A260/280) ved hjelp av et spektrofotometer etter å ha gjort 1:100 fortynning i 1x TE-buffer og kjør DNA på agarosegel (1%) for å vurdere kvaliteten på DNA24.
5. 16S rRNA-sekvensering
MERK: Protokollen som er skissert nedenfor er for amplifisering og sekvensering av 16S rRNA for bakteriell identifikasjon. Informasjon avledet fra 16S rRNA-sekvensen brukes til identifisering av en ukjent organisme og for å finne forholdet mellom forskjellige organismer.
- For å identifisere stammene, forsterk DNA isolert fra de rene bakteriekulturer ved PCR med universelle primere rettet mot 16S rRNA-sekvens for bakterier: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') og 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- Forbered PCR-blandingen (25 μL-reaksjoner) på is med 18 μL autoklavert/nukleasefritt vann, 2,5 μL 10x buffer, 0,5 μL av både forover- og reversprimere (100 μM-stam), 2 μL av dNTP-blandingen (100 μM-stam), 1 μL DNA-mal (2-15 ng / μL) og 1 U Taq-polymerase.
- Bruk følgende syklusbetingelser for 16S rRNA-genamplifisering: Initial denaturering ved 94 °C i 10 minutter, (endelig denaturering ved 94 °C i 40 s, primerglødning ved 56 °C i 1 min, forlengelse ved 74 °C i 2 minutter) x 30 sykluser, endelig forlengelse ved 74 °C i 10 minutter.
- Etter at syklusen er avsluttet, bland 5 μL prøve og 1 μL 5x DNA-lastefargestoff. Kjør på 1% agarosegel for å verifisere forsterkningen. Oppbevar PCR-produktene ved 4 °C på kort sikt eller frys dem ved -20 °C til videre bruk.
- For 16S rRNA-gensekvensering, sett opp samme reaksjon som nevnt ovenfor for høyere volum (100 μL).
- Rens amplicons for Sanger-sekvensering24,34 ved hjelp av PCR-produktrensingssett eller bland hele prøven med DNA-lastefargestoff og last på en agarosegel for å utføre gelekstraksjonsmetode.
- Når sekvenseringen er ferdig, konverterer du resultatfilen i FASTA-format og kontrollerer sekvenslikheten med det grunnleggende lokale justeringssøkeverktøyet (BLAST) på NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skjematiske beskrivelsen av hele prosedyren for isolering og screening av bakterier fra vannlevende habitater og deres påfølgende identifisering ved 16S rRNA-analyse er representert i figur 1. Vannprøver fra et våtmarksområde i Dadri, India ble samlet i sterile glassflasker og umiddelbart tatt til laboratoriet for behandling. Prøvene ble sendt gjennom filterark med 0,22 μm porestørrelse, og filterpapirene ble holdt i kontakt med forskjellige medieplater. Etter 2 timer ble filterpapir fjernet, og platene ble inkubert over natten ved 30 °C for kolonidannelse (figur 2). Dagen etter ble enkelte bakteriekolonier selektert og stripet på ferske medieplater (figur 2). Den rene kulturen som ble generert, ble lagret og deretter brukt til videre analyse. Ved hjelp av denne metoden var vi i stand til å lage et bibliotek med mer enn 100 unike bakterieisolater. Vi hadde som mål å identifisere bakterieisolater som kan utnytte hydrokarboner, spesielt styren, som er den primære komponenten i engangsplast. De isolerte bakteriene ble individuelt dyrket i respektive medier med tilsetning av flytende styren som eneste karbonkilde (figur 3). Vi kunne identifisere fire isolater som bruker styren som eneste karbonkilde. To av isolatene ble omfattende karakterisert videre for styrennedbrytning25.
Bakterieisolatene ble deretter testet for tilstedeværelse av enzymatiske veier for nedbrytning av hydrokarbonmetabolisme. Hydrokarbonmetabolisme i noen bakterier resulterer i produksjon av katekoler som mellomprodukter, som nedbrytes ytterligere av orto-spaltning og meta-spaltningsveier. Katekol 1,2- dioksygenase og katekol 2,3-dioksygenase enzymer er ansvarlige for ringspaltningsreaksjon36. Miljøbakterier som har disse enzymene har vist seg å metabolisere flere aromatiske forbindelser. Dermed ble det utført en katekol-nedbrytningsanalyse for å vurdere HC-nedbrytningspotensialet til bakterieisolater (figur 4). Representativ analyse for ett av isolatene er vist i figur 4.
For å identifisere bakterieisolatene ble 16S rRNA-sekvensering utført. En foreløpig gramfarging ble utført for å karakterisere bakteriene, noe som hjelper til med å identifisere og feilsøke påfølgende trinn. Gram-positive bakterier er vanligvis gjenstridige mot cellelysebuffere som fører til lavt genomisk DNA-utbytte37. Dermed vil resultatene oppnådd fra gramfarging38 før genomisk DNA-isolasjon bidra til å velge protokollen for genomisk DNA-isolasjon. Etter DNA-isolering ble integriteten til genomisk DNA bekreftet ved å visualisere en liten prøve av DNA på agarosegel (figur 5A) og kvantifisert ved UV-absorbansmetode ved hjelp av et spektrofotometer. 16S rRNA-genet ble amplifisert ved hjelp av universell primersekvens (figur 5B). Mens 500 bp er avgjørende for sekvensering, oppnås ideelle resultater med 1,300-1,500 bp39. For å oppnå graden av slektskap mellom isolerte stammer ble et fylogenetisk tre konstruert ved hjelp av phylogeny.fr programvare40 (figur 6).
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt for studien Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilder av bakteriekolonier fra vannprøver. Den oppsamlede vannprøven ble ført gjennom 0,22 μm filterpapir. Filterpapirene ble oppbevart over forskjellige medieplater. Platene ble inkubert i 24-48 timer til isolerte kolonier ble observert. Enkeltkoloniene ble deretter stripet på ferske tallerkener for ren kulturisolasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater av mikrobiell nedbrytning av styren og screening hydrokarbonnedbrytningspotensial av bakterier. Cellene ble dyrket i LCFBM supplert med 5 mM styren som eneste karbonkilde i 40 dager ved 30 °C og 200 rpm. OD600 ble målt hver 5. Kontrollkolben hadde bare LCFBM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representasjon av Catechol 2,3-dioxygenase enzymanalyse for å overvåke nedbrytningen av katekol. (A) Det fargeløse substratet catechol omdannes til et gulfarget produkt ved virkningen av katekol 2,3-dioksygenase. Reaksjonsblandingen inneholder katekol, fosfatbuffer og råcellelysat. Dannelsen av produktet detekteres ved å måle absorbans ved 375 nm. (B) Representativ graf av katekol 2,3-dioksygenase enzymanalyse med helcellelysat. Reaksjonsblandingen i negativ kontroll har buffer og katekolsubstrat uten cellelysat. Absorbans ble målt til 375 nm med et intervall på 10 min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Genomisk DNA-isolasjon og 16S rRNA PCR. (A) Gelelektroforese av isolert genomisk DNA. Lane M: DNA-størrelsesmarkør, Lane 1-2: Genomisk DNA. (B) Verifisering av 16S rRNA-genamplifisering ved 1% gelelektroforese. Geler ble visualisert ved farging med ethidiumbromid; Lane M: DNA-størrelsesmarkør (1 kb), Lane 1-4: Forsterkede PCR-produkter fra forskjellige stammer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Analyse av 16S rRNA-gensekvenseringsresultatene. Representativ dendrogramkonstruksjon ved hjelp av phylogeny.fr programmet for å skildre slektskapet mellom Exiguobacterium-stammer isolert fra et våtmark (uthevet i rød boks) med den kjente Exiguobacterium sp. 16S rRNA-sekvensene av kjente Exiguobacterium sp. ble hentet fra NCBI. Dette tallet er hentet fra en tidligere artikkel (Chauhan et.al.) uten noen endring25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Peptone gjærekstrakt (PYE) | |
| Peptone | 2g |
| Gjærekstrakt | 1g |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| 1M CaCl2 | 1 ml |
| Destillert vann | Opptil 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| Resonnementets 2A (R2A) | |
| Kaseinsyrehydrolysat | 0,5 g |
| Gjærekstrakt | 0,5 g |
| Protease pepton | 0,5 g |
| Druesukker | 0,5 g |
| Stivelse, løselig | 0,5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| Destillert vann | Opptil 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| M2G | |
| 10X M2 salter (1L) - | |
| Na2HPO4 | 17,4 g |
| KH2PO4 | 10,6 g |
| NH4Cl | 5,0 g |
| Autoklav 10X M2 salter ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| 10X M2 salter | 100 ml |
| 50 mM MgCl2 | 10 ml |
| 30 % glukose (w/v) | 10 ml |
| 1 mM FeSO4 i 0,8 mM EDTA, pH 6,8 | 10 ml |
| 50 mM CaCl2 | 10 ml |
| Destillert vann | Opptil 1000 ml |
| Filter sterilisere. | |
| Lysogeny buljong (LB) | |
| Kasein enzymhydrolysat | 10 g |
| Gjærekstrakt | 5 g |
| NaCl | 10 g |
| Destillert vann | Opptil 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| Næringsbuljong (NB) | |
| Peptone | 15 g |
| Gjærekstrakt | 3 g |
| NaCl | 6 g |
| Glukose | 1 g |
| Destillert vann | Opptil 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| Tryptisk soyabuljong (TSB) | |
| Bukspyttkjertel fordøyelse av kasein | 17,0 g |
| Papaic digest av soyabønne måltid | 3 g |
| NaCl | 5 g |
| K2HPO4 | 2,5 g |
| Druesukker | 2,5 g |
| Destillert vann | Opptil 1000 ml |
| Steriliser ved autoklavering ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| M63 | |
| NH4Cl | 2g |
| KH2PO4 | 13,6 g |
| FeSO4.7H 2O | 0,5 mg |
| 20% glyserol | 10 ml |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| Destillert vann | Opptil 1000 ml |
| M9 minimalt medium | |
| 5X M9 salter | |
| Na 2HPO4.7H 20 | 12,8 g |
| KH2PO4 | 3 g |
| NH4Cl | 1 g |
| NaCl | 0,5 g |
| Destillert vann | Opptil 200 ml |
| Autoklav 5X M9 salter ved 121 °C og 15 PSI i 15 minutter. | |
| 1X M9-medier | |
| 5X M9 salter | 20 ml |
| 20% glukose | 2 ml |
| 1M MgSO4 | 200 μl |
| 1M CaCl2 | 10 μl |
| Autoklavert vann | Opptil 100 ml |
| MERK - For solid media forberedelse, bruk 1,5% Bacto Agar (15 g / L) |
Tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er velkjent at bare ca. 1 % av bakteriene på jorden lett kan dyrkes i laboratoriet6. Selv blant de dyrkede bakteriene forblir mange ukarakteriserte. Forbedringer i molekylære metoder har gitt en ny dimensjon til analyse og evaluering av bakteriesamfunn. Slike teknikker har imidlertid begrensninger, men de gjør ikke kulturanalysene overflødige. Rene kulturteknikker for å isolere individuelle bakteriearter forblir den primære mekanismen for karakterisering av fysiologiske egenskaper. Jord og akvatiske habitater har mange bakterier med nye enzymer og veier, som kan utnyttes for bioteknologiske bruksområder. Denne studien beskriver en enkel og rimelig metode for isolering og karakterisering av bakterier fra økologiske prøver.
Ulike bakterier har forskjellige ernæringsmessige behov, derfor ble ulike vekstmedier brukt for å øke sannsynligheten for å isolere forskjellige bakteriearter. En stor begrensning ved denne metoden er at mikrober med kresne vekstbehov kan bli ekskludert. Hovedmålet med dette trinnet er også å maksimere antall bakteriearter oppnådd fra prøven. Antall bakteriearter i prøvebiblioteket vil øke sjansene for å isolere mikrober med bioremedieringspotensial. Selv om vi bare varierte vekstmedier, kan varierende veksttemperatur og oksygenkonsentrasjon også øke sjansene for å utvide prøvebiblioteket ytterligere med unike arter41,42.
Et kritisk trinn i protokollen er å kontrollere utnyttelsen av underlaget som testes (styren i vårt tilfelle). Det er viktig å designe eksperimentet for slik undersøkelse med forsiktighet for å unngå falske negative resultater. Avhengig av vekstegenskaper, kan mikroben ikke umiddelbart tilpasse seg til å utnytte substratet som testes, og kan kreve en anrikningsprosess. I vårt tilfelle er bakterieveksten langsom i LCFBM-mediet som brukes til å teste utnyttelsen av hydrokarbon som eneste karbonkilde25. For å omgå dette problemet kan innledende kulturer startes ved å legge til (1% v/v) TSB eller NB til LCFBM-mediet for å støtte bakterievekst. Identifisering av den dyrkede mikroben oppnås gjennom 16S rRNA-sekvensering43. Denne metoden gir en robust og kostnadseffektiv metode for mikrobiell identifikasjon. 16S-sekvensering kan imidlertid bare gi taksonomisk identifikasjon på høyere nivå. For spesifikk identifikasjon på artsnivå må andre familiespesifikke primere brukes kombinert med ulike biokjemiske tester44,45.
Enzymanalyse med helcellelysat krever bruk av en effektiv cellelysemetode. Bakteriell cellelyse oppnås vanligvis ved å utføre sonikering. Imidlertid er en fryse-tine-metode en alternativ metode for mild cellelyse, som antas å forhindre denaturering av protein. Prosedyren består i å fryse cellene raskt ved -80 °C og tine ved 4 °C sekvensielt46. Tilsetningen av milde vaskemidler som NP-40 eller Triton-X-100 hjelper også i cellelyse og denaturerer ikke proteinene på grunn av deres ikke-ioniske natur47. Imidlertid kan bakterier med tykke cellevegger som cyanobakterier48 ikke dra nytte av den milde cellelysemetoden ved bruk av vaskemidler49 , og dermed må lysismetoden for enzymanalyse velges deretter.
Ved å fokusere på den dyrkede bakteriepopulasjonen fra miljøprøver, kan forskerne raskt utføre mange forskjellige eksperimenter. Metodene beskrevet her krever ikke bruk av svært sofistikerte instrumenter og kan enkelt utføres i et standard laboratorieoppsett. Siden hydrokarboner og farlige kjemikalier brukes, skal laboratoriet være utstyrt med forsvarlig håndtering og avhending i henhold til standard driftsprosedyrer. Tilnærmingen beskrevet her kan enkelt tilpasses for å studere en rekke bakteriearter for mange bioteknologiske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Karthik Krishnan og medlemmer av RP-laboratoriet for nyttige kommentarer og forslag. DS er støttet av SNU-Doctoral fellowship og Earthwatch Institute India Fellowship. RP-lab støttes av et CSIR-EMR-stipend og oppstartsmidler fra Shiv Nadar University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B.
- R, C.
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R.
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
