Summary
Hidrokarbon bozunan bakterileri sucul habitatlardan izole etme, çoğaltma ve karakterize etme sürecini sunuyoruz. Protokol, bakteri izolasyonunu, 16S rRNA yöntemiyle tanımlamayı ve hidrokarbon bozunma potansiyellerinin test edilmesini ana hatlarıyla belirtir. Bu makale, araştırmacıların çevresel örneklerde mikrobiyal biyoçeşitliliği karakterize etmelerine ve özellikle biyoremediasyon potansiyeli olan mikropları taramalarına yardımcı olacaktır.
Abstract
Hidrokarbon kirleticiler bozunmaya karşı inatçıdır ve çevrede birikmeleri tüm yaşam formları için toksiktir. Bakteriler çok sayıda katalitik enzimi kodlar ve doğal olarak hidrokarbonları metabolize edebilirler. Bilim adamları, biyolojik bozunma ve biyoremediasyon potansiyeli olan bakterileri izole etmek için su ekosistemlerindeki biyolojik çeşitlilikten yararlanır. Çevreden gelen bu tür izolatlar, bozunma sürecini endüstriyel ölçekte büyütmek için daha fazla kullanılabilecek zengin bir metabolik yol ve enzim seti sağlar. Bu makalede, bakteri türlerinin sucul habitatlardan izolasyonu, çoğaltılması ve tanımlanması ile ilgili genel süreci özetliyoruz ve basit teknikler kullanarak in vitro olarak hidrokarbonları tek karbon kaynağı olarak kullanma yeteneklerini inceliyoruz. Mevcut protokol, çeşitli bakteri türlerinin izolasyonunu ve daha sonra 16S rRNA analizi kullanılarak tanımlanmasını açıklamaktadır. Protokol ayrıca bakteri izolatlarının hidrokarbon bozunma potansiyelini karakterize etmek için adımlar sunar. Bu protokol, biyoteknolojik uygulamaları için bakteri türlerini çevresel habitatlardan izole etmeye çalışan araştırmacılar için faydalı olacaktır.
Introduction
Hidrokarbonlar (HC) hem yakıt olarak hem de kimyasal uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Benzen, toluen ve ksilen gibi aromatik hidrokarbonlar çözücü olarak yaygın olarak kullanılmaktadır1. Etilen ve propilen gibi alkenler, sırasıyla polietilen ve polipropilen polimerlerin sentezinde öncü olarak görev yapar. Başka bir hidrokarbonun polimerizasyonu olan stiren, polistiren oluşturur. Antropojenik faaliyetler, üretimleri ve nakliyeleri sırasında hidrokarbonları çevreye sokar. Toprağın ve suyun hidrokarbon kirliliği, çevre ve insan sağlığı için ciddi endişelere sahiptir. Mikroplar, biyojeokimyasal döngüleri düzenleyerek ve kirleticiler ve ksenobiyotikler de dahil olmak üzere çok çeşitli substratlar kullanarak, bunları karbon ve enerji kaynağına dönüştürerek ekosistemin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Çevresel kirleticilerin mikroorganizmalar tarafından detoksifikasyon süreci, biyoremediasyon 3,4,5,6,7 olarak bilinir.
Hidrokarbonları parçalama kabiliyetine sahip mikroorganizmalar su ve toprak habitatlarında bulunur8,9,10. Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter ve Oleibacter11 gibi alkanları ve aromatik HC'leri parçalama potansiyeline sahip birçok bakteri tanımlanmıştır. Teknolojik olarak gelişmiş kültürden bağımsız yaklaşımların geliştirilmesi, yeni HC parçalayıcı mikrobiyal toplulukların keşfedilmesine yardımcı olmuştur12. Kaynak örneklerden doğrudan izole edilen genomik materyal, Yeni Nesil Dizileme (NGS) gibi yüksek verimli yöntemlerle amplifiye edilir ve dizilenir, ardından analiz yapılır, bu da mikroorganizmaların yetiştirilmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. Metagenom analizi gibi NGS yöntemleri pahalıdır ve amplifikasyon süreciyle ilgili dezavantajlardan muzdariptir13. Hidrokarbon parçalayıcı mikropların izolasyonunu hedefleyen seçici zenginleştirme kültürü14 gibi yetiştirme teknikleri, araştırmacıların bakteri izolatlarındaki metabolik yolları araştırmasına ve manipüle etmesine izin verdiği için hala yararlıdır.
Genomik DNA izolasyonu ve ardından genomik materyalin dizilimi, herhangi bir organizma hakkında değerli bilgiler ortaya çıkarır. Tüm genom dizilimi, antibiyotik direncini, potansiyel ilaç hedeflerini, virülans faktörlerini, taşıyıcıları, ksenobiyotik-metabolize edici enzimleri vb. kodlayan genlerin tanımlanmasına yardımcı olur15,16,17. 16SrRNA kodlayan genin diziliminin, bakteriyel filogeni tanımlamak için sağlam bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Gen dizisinin ve işlevinin yıllar boyunca korunması, onu bilinmeyen bakterileri tanımlamak ve bir izolatı en yakın türlerle karşılaştırmak için güvenilir bir araç haline getirir. Ek olarak, bu genin uzunluğu biyoinformatik analiz için optimumdur18. Tüm bu özellikler, evrensel primerler kullanılarak gen amplifikasyonunun kolaylığı ve gen dizileme teknolojisindeki gelişme ile birlikte, onu mikropların tanımlanması için altın bir standart haline getirmektedir.
Burada, çevresel örneklerden HC parçalama potansiyeline sahip ekilebilir mikroorganizmaları geri kazanmak için bir prosedür açıklıyoruz. Aşağıda açıklanan yöntem, HC parçalayıcı bakterilerin toplanmasını ve tanımlanmasını ana hatlarıyla belirtir ve beş bölüme ayrılmıştır: (1) su örneklerinden bakteri toplanması, (2) saf kültürlerin izolasyonu, (3) bakteri izolatlarının HC parçalama kapasitesinin araştırılması, (4) genomik DNA izolasyonu ve (5) 16S rRNA gen dizilimi ve BLAST analizine dayalı tanımlama. Bu prosedür, birçok farklı biyoteknolojik uygulama için bakterileri izole etmek üzere uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Numune toplama, işleme ve analiz
NOT: Burada, bakterileri sucul habitatlardan izole etmek için bir protokol sunuyoruz. İzolatların bazıları patojenik olabilir, bu nedenle eldiven giyin ve kullanımdan önce ve sonra çalışma alanını dezenfekte edin.
- Su kütlesinin farklı bölgelerinden beş steril cam şişede 500 mL su numunesi toplayın. Sırasıyla bir pH metre ve termometre kullanarak her numunenin pH'ını ve sıcaklığını ölçün.
NOT: Protokol bölgeye özgü değildir ve organizmaları hidrokarbonla kirlenmiş su kütlelerinden izole etmek için kolayca uyarlanabilir. - Numuneyi aseptik koşullarda 100 mL'lik bir parti halinde 0,22 μm gözenek boyutlu filtre tabakaları halinde filtreleyin.
NOT: Filtre kağıdının çapı Petri kabı çapını geçmemelidir. Örneğin, 85 mm'yi aşmayan filtre kağıdı, 100-120 mm'lik bir Petri kabı için idealdir. - Filtre kağıtlarını farklı besin malzemesi plakaları (PYE 19, R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M63 21 ve M2G22) üzerinde tutun. Farklı büyüme ortamı türleri, farklı mikroorganizmaların seçilmesine ve zenginleştirilmesine izin verir. Çeşitli büyüme ortamlarının bileşimleri Tablo 1'de listelenmiştir. Her ortam plakası için bir kağıt kullanın ve steril forseps kullanarak 2 saat sonra soyun.
- Toplanan su numunesinden 100 μL steril suya 900 μL ekleyerek filtrelenmemiş su numunelerini (106 seyreltme) steril çift damıtılmış suda seri olarak seyreltin. Bu, 1:10 seyreltme ile sonuçlanır. Bu numuneden 100 μL alın ve 1:100 seyreltme elde etmek için 900 μL steril su ekleyin. Seyreltme kıvrımı 1:1.000.000 olana kadar seyreltmeyi tekrarlayın. Pipetleme ile karıştırın. Her seyreltmenin son hacmi 1 mL olacaktır.
- 100 μL seyreltilmiş su numunesini, 3. adımda belirtilen tüm büyüme ortamı plakalarına ayrı ayrı üçlü kopyalar halinde yayın.
- Kolonilerin büyümesine bağlı olarak plakaları 30 °C'de 24 ila 48 saat inkübe edin.
NOT: Çevresel izolatların çoğu, 30 °C'lik optimum sıcaklıkta büyür. Numuneleri aşırı sıcaklıklara sahip bir ortamdan izole ediyorsanız, plakaları toplama alanınınkiyle aynı sıcaklıkta inkübe edin. - Ardından, steril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak kolonileri seçin ve izole koloniler elde etmek için kadran çizgisi yapın.
- Plakaları gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kolonileri renk, doku, şekil, boyut, kenar boşluğu, yükseklik vb. gibi morfolojik özelliklerine göre eleyin. Saf kültürler elde etmek için kolonileri yeniden canlandırın.
- Her saf kültürün23 gram boyamasını gerçekleştirin ve gliserol stok hazırlığına devam edin.
- Gliserol stoklarını hazırlamak için, tek bir koloniyi 3 mL uygun büyüme ortamında aşılayın ve 30 °C'de inkübe edin. Gece kültüründen 700 μL alın ve kriyoviyallere 300 μL% 100 gliserol (otoklavlama ile sterilize edilmiş) ekleyin24. Uzun süreli saklama için şişeleri -80 °C'de dondurun.
2. Hidrokarbonların bozunması
NOT: Aşağıdaki örnek, stireni bozabilecek izolatları taramak içindir. Bu, önceki bir raporda uyarlanan yöntemin küçük bir değişikliğidir25. Aseptik koşullar altında adımları izleyin.
- Taze çizgili bir tabaktan bir koloni seçin ve 5 mL Triptik soya suyu (TSB)/Besin suyu (NB) ile aşılayın. Kültürü gece boyunca 30 °C'de 200 rpm'de eziyet ~2'ye ulaşana kadar çalkalayarak büyütün.
NOT: TSB/NB dışında, bakterilerin yüksek hücre yoğunluğuna ulaştığı herhangi bir büyüme ortamı seçilebilir. - Ertesi gün, hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2862 x g'de pelet haline getirin ve süpernatanı atın.
- Peleti 2 mL otoklavlanmış salin (%0.9 NaCl) ile iki kez yıkayın ve 2862 x g'de 4 °C'de 5 dakika döndürün.
NOT: Salin izotoniktir ve bu nedenle bakteri hücrelerinin içindeki ozmotik basıncı korur. - Peletin 2 mL sıvı karbonsuz bazal ortamda (LCFBM) yeniden süspanse edilmesi. Absorbansı ölçün (OD600).
- Kontrol ve deney grubu için 150 mL kapasiteli iki steril Erlenmeyer şişesi alın. Bunları A ve B olarak etiketleyin.
- Aşılanmamış / kontrol grubunda (şişe A), 40 mL LCFBM ve stiren (5 mM) ekleyin.
- B şişesine 35 mL LCFBM ve stiren ekleyin (son stiren konsantrasyonunu 5 mM'ye ayarlayın). Hücre süspansiyonunu 0.1'≈ son bir OD 600 hücre ile ekleyin ve kalan hacmi40 mL'ye kadar LCFBM ile tamamlayın. Şişeleri 30 gün boyunca 200 rpm'de çalkalayarak 30 °C'de inkübe edin.
NOT: Fazla hidrokarbonlar mikroplar için toksik olabilir, bu nedenle düşük konsantrasyonla başlayın ve yavaş yavaş artırın. - Hidrokarbon bozunması için değerlendirilmesi gereken her ek suş için yukarıdakileri tekrarlayın.
- Her şişenin OD600'ünü her 5 günde bir ölçün ve bir büyüme eğrisi çizin. Bakteriler stiren kullanabiliyorsa inkübasyonu 45 güne kadar artırın. OD600'deki bir artış, bakterinin stireni metabolize edebileceğini gösterir.
3. Bakteriyel izolatlar tarafından katekol bozunmasının taranması
NOT: Stiren, benzen, ksilen, naftalin, fenoller vb. gibi aromatik hidrokarbonların bozunması, reaksiyon ara maddeleri olarak katekoller üretir. Katekoller, katekol 1,2-dioksijenaz ve katekol 2,3-dioksijenaz enzimleri yardımıyla bakteriler tarafından sırasıyla orto- ve meta-bölünme yolları yoluyla metabolize edilir26. Bu enzimler ayrıca klorobenzen27 gibi diğer hidrokarbonların bozunmasında da rol oynar. Aşağıda belirtilen protokol, katekol 2, 3-dioksijenaz enzim testi28 için tam hücre lizatı kullanır. Aynı lizis yöntemi, katekol 1, 2-dioksijenazın aktivitesini taramak için kullanılabilir. Bununla birlikte, reaksiyon karışımının bileşimi değişecektir. Her iki enzim de doğada indüklenebilir ve büyüme ortamına fenol ilavesiyle indüklenebilir.
- Steril bir halka yardımıyla, bakteri kolonisini taze çizgili bir plakadan 1-4 mM fenol ile desteklenmiş mineral tuzlar ortamına (MSM) aşılayın. Kültürü 30 °C ve 200 rpm'de inkübe edin. OD600 1.4-1.6 arasına ulaştığında (yani geç üstel fazda) 4500 x g'da 20 dakika döndürerek kültürü 4 °C'de hasat edin.
- Hücre peletini fosfat tamponu (0,5 M, pH 7,5) ile yıkayın.
- Yukarıda belirtilen fosfat tamponundaki hücreleri yeniden süspanse edin ve son OD600'ü 1.0≈ ayarlayın.
- Hücreleri 1.5 dakika boyunca darbeli sonikasyon ile parçalayın, her darbenin süresi 15 saniyedir. Bu adımdan sonra, süspansiyon berrak veya daha az bulanık olmalıdır. Değilse, darbe sayısını artırın ve süspansiyonun temiz olup olmadığını kontrol edin. Her darbeden sonra, protein bozulmasını önlemek için numuneyi buz üzerinde tutun.
- Soğuk sıcaklığı (4 °C) koruyarak 30 dakika boyunca 9.000 x g'da santrifüjleme yaparak hücre kalıntılarını ve kırılmamış hücreleri çıkarın.
- Berrak süpernatanı dikkatlice pipetleyin. Bu fraksiyon, enzim tahlili için ham ekstrakta sahiptir.
- Ham ekstraktın protein konsantrasyonunu Bradford veya Lowry'nin yöntemi29,30 ile belirleyin.
- Katekol 2,3-dioksijenazın aktivitesini belirlemek için, reaksiyon son ürününün (2-hidroksimukonik semialdehit) oluşumunu bir spektrofotometre ile ölçün.
- 20 μL katekol (50 mM), 960 μL fosfat tamponu (50 mM, pH 7.5) ve 20 μL ham ekstrakt ekleyerek reaksiyon karışımını hazırlayın.
- Negatif kontrol için, ham ekstraktı fosfat tamponu ile değiştirin ve son hacmi 1 mL'ye ayarlayın.
- Reaksiyon karışımını 30 dakika inkübe edin. Ayarlanan zaman aralıklarında, absorbansı 375 nm'de ölçün. Absorbanstaki bir artış, reaksiyon son ürününün, 2-hidroksimukonik asit semialdehitin (2-HMS) oluşumunu gösterir. Denemeyi üç kopya halinde gerçekleştirin.
NOT: Catechol ışığa ve oksijene duyarlıdır. Reaksiyon karışımını karanlıkta saklayın ve katekolün doğal bozulmasını önlemek için tüpleri sıkıca kapatın.
4. Saf kültürün genomik DNA izolasyonu
NOT: Bu, genomik DNA'nın izolasyonu için genel protokoldür. Numune toplama, işleme ve analiz aşamasında gram boyama yapıldı. Gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerin hücre duvarı kalınlığındaki değişiklik nedeniyle, hücre lizis yöntemi buna göre değiştirilir. İzole ederken eldiven giyin ve nükleazların DNA'yı bozmasını önlemek için tezgahı %70 etanol ile dezenfekte edin. Aşağıda belirtilen kimyasallardan bazıları ciltte ciddi yanıklara neden olabilir ve bunlarla uğraşırken uygun özen gösterilmelidir.
- Gram-negatif bakterilerden genomik DNA'nın izolasyonu31.
- Tek bir koloni seçin ve steril test tüplerinde taze bir büyüme ortamında aşılayın.
- Tüpleri 200 rpm'de bir inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin ve bakterilerin gece boyunca 30 °C'de büyümesine izin verin.
- Ertesi gün, 3 dakika boyunca 12.400 x g'da 1.5 mL gece boyunca yetiştirilen kültürü peletleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve peleti 200 μL lizis tamponunda (40 mM Tris-asetat, pH 7.8, 20 mM sodyum asetat, 1 mM EDTA,% 1 SDS) yeniden süspanse edin.
- 66 μL NaCl çözeltisi (5 M) ekleyin ve iyice karıştırın.
- Elde edilen karışımı 12.400 x g'da 10 dakika (4 °C) peletleyin.
- Berrak süpernatanı taze bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve eşit hacimde kloroform ekleyin.
- Sütlü bir çözelti gözlenene kadar çözeltiyi birkaç kez ters çevirin.
- 3 dakika boyunca 12.400 x g'da döndürün ve süpernatanı temiz bir şişeye aktarın.
- 1 mL buz gibi %100 etanol ekleyin; DNA'nın beyaz iplikleri çökelinceye kadar ters çevirerek karıştırın.
- Çökeltilmiş DNA'yı 2.200 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- DNA peletini 1 mL %70 etanol ile yıkayın ve DNA peletini oda sıcaklığında 5 dakika kurumaya bırakın.
- Kuruduktan sonra, peleti 100 μL 1x Tris-EDTA(TE) tamponunda yeniden süspanse edin ve DNA'yı -20 °C'de saklayın.
- Spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu (A260/280) ölçün ve DNA24'ün kalitesini değerlendirmek için DNA'yı agaroz jel (%1) üzerinde çalıştırın.
- Genomik DNA'nın gram-pozitif suştan izolasyonu32
- Tek bir koloni seçin ve steril test tüplerinde taze büyüme ortamında aşılayın.
- Tüpleri 200 rpm'de bir inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin ve bakterilerin gece boyunca uygun bir büyüme sıcaklığında büyümesine izin verin.
- Ertesi gün, yetiştirilen kültürden 1.5 mL alın ve 5 dakika boyunca 8.600 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve hücreleri TE tamponunda yeniden süspanse edin.
- OD600 = 1.0'ı TE tamponu ile ayarlayın ve 740 μL hücre süspansiyonunu temiz bir mikrofüj tüpüne aktarın.
- 20 μL lizozim (100 mg/mL stok) ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin (kuru banyoda).
- 40 μL% 10 SDS ekleyin ve iyice karıştırın.
- 8 μL Proteinaz K (10 mg/mL) ekleyin. İyice karıştırın ve 56 °C'de 1-3 saat (kuru banyoda) inkübe edin. Süspansiyon, artan viskozite ile şimdi netleşmeli ve verimli hücre lizizini işaretlemelidir.
NOT: Hücreler düzgün bir şekilde parçalanmazsa süspansiyon gece boyunca bırakılabilir. - CTAB/NaCl karışımını 65 °C'de (kuru banyoda) önceden ısıtın ve bu karışımdan 100 μL'yi hücre süspansiyonuna ekleyin. İyice karıştırın.
- 65 °C'de 10 dakika inkübe edin (kuru banyoda).
- 500 μL kloroform: izoamil alkol (24: 1) ekleyin ve iyice karıştırın. 25 °C'de 10 dakika boyunca 16.900 x g'da döndürün.
- Sulu fazı, organik fazdan (altta viskoz faz) kaçınarak taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Dikkatlice 500 μL fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) ekleyin ve iyice karıştırın. 25 °C'de 10 dakika boyunca 16.900 x g'da döndürün.
- Sulu fazı taze bir mikrosantrifüj tüpüne alın. 500 μL kloroform: izoamil alkol (24: 1) ekleyin ve iyice karıştırın.
- Sulu fazı aktarın ve 0.6 hacim izopropanol ekleyin (-20 °C'de önceden soğutulmuş).
- Çökelmiş DNA zincirleri iplik benzeri formda görünür olmalıdır. -20 °C'de 2 saat ila gece boyunca inkübe edin.
- DNA'yı peletlemek için 16.900 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- İzopropanolü dikkatlice boşaltın ve safsızlıkları gidermek için peleti 1 mL soğuk %70 etanol (-20 °C'de önceden soğutulmuş) ile yıkayın.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 16.900 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Peletin oda sıcaklığında 20 dakika kurumasını bekleyin veya tüpü 37 °C'de tutun. Peletin fazla kurutulmadığından emin olun.
- 100 μL 1x TE tamponunda yeniden süspanse edin ve DNA'yı -20 °C'de saklayın.
NOT: Pelet aşırı kurursa ve yeniden süspanse edilmesi zorsa, mikrosantrifüj tüpünü DNA peleti ve nükleaz içermeyen su ile 37 °C'de 15-20 dakika inkübe edin ve pipetleme ile tekrar süspanse edin. - 1x TE tamponunda 1:100 seyreltme yaptıktan sonra bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu (A260/280) ölçün ve DNA24'ün kalitesini değerlendirmek için DNA'yı agaroz jel (%1) üzerinde çalıştırın.
5. 16S rRNA dizilimi
NOT: Aşağıda özetlenen protokol, bakteri tanımlaması için 16S rRNA'nın amplifikasyonu ve dizilimi içindir. 16S rRNA dizisinden elde edilen bilgiler, bilinmeyen bir organizmanın tanımlanması ve farklı organizmalar arasındaki ilişkinin bulunması için kullanılır.
- Suşları tanımlamak için, saf bakteri kültürlerinden izole edilen DNA'yı, bakteriler için 16S rRNA dizisini hedefleyen evrensel primerlerle PCR ile çoğaltın: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') ve 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- PCR karışımını (25 μL reaksiyonlar) 18 μL otoklavlanmış/nükleaz içermeyen su, 2.5 μL 10x tampon, 0.5 μL hem ileri hem de geri primer (100 μM stok), 2 μL dNTP karışımı (100 μM stok), 1 μL DNA şablonu (2-15 ng/μL) ve 1 U Taq Polimeraz.
- 16S rRNA gen amplifikasyonu için aşağıdaki döngü koşullarını kullanın: 94 °C'de 10 dakika ilk denatürasyon, (94 °C'de 40 saniye boyunca son denatürasyon, 56 °C'de 1 dakika primer tavlama, 74 °C'de 2 dakika uzatma) x 30 döngü, 74 °C'de 10 dakika boyunca son uzatma.
- Döngü sona erdikten sonra, 5 μL numune ve 1 μL 5x DNA yükleme boyasını karıştırın. Amplifikasyonu doğrulamak için% 1 agaroz jel üzerinde çalıştırın. PCR ürünlerini kısa süreli olarak 4 °C'de saklayın veya daha sonra kullanana kadar -20°C'de dondurun.
- 16S rRNA gen dizilimi için, daha yüksek hacim (100 μL) için yukarıda bahsedilenle aynı reaksiyonu ayarlayın.
- PCR ürün saflaştırma kitini kullanarak Sanger dizilimi24,34 için amplikonları saflaştırın veya tüm numuneyi DNA yükleme boyası ile karıştırın ve jel ekstraksiyon yöntemini gerçekleştirmek için bir agaroz jeli üzerine yükleyin.
- Sıralama tamamlandıktan sonra, sonuç dosyasını FASTA formatına dönüştürün ve NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35'teki temel yerel hizalama arama aracı (BLAST) ile dizi benzerliğini kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bakterilerin sucul habitatlardan izolasyonu ve taranması ve daha sonra 16S rRNA analizi ile tanımlanması için tüm prosedürün ana hatlarını çizen şema Şekil 1'de gösterilmektedir. Hindistan'ın Dadri kentindeki bir sulak alandan alınan su örnekleri steril cam şişelerde toplandı ve hemen işlenmek üzere laboratuvara götürüldü. Numuneler 0.22 μm gözenek büyüklüğüne sahip filtre tabakalarından geçirildi ve filtre kağıtları farklı medya plakaları ile temas halinde tutuldu. 2 saat sonra, filtre kağıtları çıkarıldı ve plakalar koloni oluşumu için gece boyunca 30 ° C'de inkübe edildi (Şekil 2). Ertesi gün, tek tek bakteri kolonileri seçildi ve taze ortam plakalarına çizildi (Şekil 2). Üretilen saf kültür depolandı ve daha sonra daha fazla analiz için kullanıldı. Bu yöntemi kullanarak, 100'den fazla benzersiz bakteri izolatından oluşan bir kütüphane oluşturabildik. Hidrokarbonları, özellikle de tek kullanımlık plastiğin birincil bileşeni olan stireni kullanabilen bakteri izolatlarını tanımlamayı amaçladık. İzole edilen bakteriler, tek karbon kaynağı olarak sıvı stiren ilavesiyle ilgili ortamda ayrı ayrı büyütüldü (Şekil 3). Stireni tek karbon kaynağı olarak kullanan dört izolat tanımlayabiliriz. İzolatlardan ikisi, stiren bozunması için kapsamlı bir şekilde karakterize edildi25.
Bakteriyel izolatlar daha sonra hidrokarbon metabolizmasının bozunması için enzimatik yolların varlığı açısından test edildi. Bazı bakterilerde hidrokarbon metabolizması, orto-bölünme ve meta-bölünme yolları ile daha da bozulan ara ürünler olarak katekollerin üretilmesine neden olur. Katekol 1,2-dioksijenaz ve katekol 2,3-dioksijenaz enzimleri, halka-bölünme reaksiyonundansorumludur 36. Bu enzimlere sahip olan çevresel bakterilerin çeşitli aromatik bileşikleri metabolize ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, bakteriyel izolatların HC bozunma potansiyelini değerlendirmek için bir katekol bozunma testi yapıldı (Şekil 4). İzolatlardan biri için temsili bir tahlil Şekil 4'te gösterilmiştir.
Bakteri izolatlarını tanımlamak için 16S rRNA dizilemesi yapıldı. Bakterileri karakterize etmek için sonraki adımların tanımlanmasına ve giderilmesine yardımcı olan bir ön gram boyama yapıldı. Gram-pozitif bakteriler genellikle düşük genomik DNA verimine yol açan hücre lizis tamponlarına karşı inatçıdır37. Bu nedenle, genomik DNA izolasyonundan önce gram boyama38'den elde edilen sonuçlar, genomik DNA izolasyonu için protokolün seçilmesine yardımcı olacaktır. DNA izolasyonundan sonra, genomik DNA'nın bütünlüğü, agaroz jel üzerinde küçük bir DNA örneği görüntülenerek doğrulandı (Şekil 5A) ve bir spektrofotometre kullanılarak UV absorbans yöntemi ile ölçüldü. 16S rRNA geni, üniversal primer dizisi kullanılarak amplifiye edildi (Şekil 5B). Dizileme için 500 bp olmazsa olmazken, 1.300-1.500 bp ile ideal sonuçlar elde edilir39. İzole edilmiş suşlar arasındaki akrabalık derecesini elde etmek için, phylogeny.fr yazılımı40 kullanılarak bir filogenetik ağaç oluşturulmuştur (Şekil 6).
Şekil 1: Çalışmanın şematik iş akışı Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Su örneklerinden bakteri kolonilerinin görüntüleri. Toplanan su numunesi 0.22 μm filtre kağıdından geçirilmiştir. Filtre kağıtları farklı medya plakaları üzerinde tutuldu. Plakalar, izole koloniler gözlenene kadar 24-48 saat inkübe edildi. Tek koloniler daha sonra saf kültür izolasyonu için taze plakalara çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Stirenin mikrobiyal bozunmasının temsili sonuçları ve bakterilerin hidrokarbon bozunma potansiyelinin taranması. Hücreler, 30 °C ve 200 rpm'de 40 gün boyunca tek karbon kaynağı olarak 5 mM stiren ile desteklenmiş LCFBM'de büyütüldü. OD600 her 5 günde bir ölçüldü. Kontrol şişesinde sadece LCFBM vardı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Katekol 2,3-dioksijenaz enzim testinin temsili, katekolün bozunmasını izlemek için. (A) Renksiz substrat katekol, katekol 2,3-dioksijenazın etkisiyle sarı renkli bir ürüne dönüştürülür. Reaksiyon karışımı katekol, fosfat tamponu ve ham hücre lizatı içerir. Ürünün oluşumu 375 nm'de absorbans ölçülerek tespit edilir. (B) Tam hücre lizatı ile katekol 2,3-dioksijenaz enzim testinin temsili grafiği. Negatif kontroldeki reaksiyon karışımı, hücre lizatı içermeyen tampon ve katekol substratına sahiptir. Absorbans, 10 dakikalık bir aralıkla 375 nm'de ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Genomik DNA izolasyonu ve 16S rRNA PCR. (A) İzole genomik DNA'nın jel elektroforezi. Şerit M: DNA boyutu işaretleyicisi, Şerit 1-2: Genomik DNA. (B) %1 jel elektroforezi ile 16S rRNA gen amplifikasyonunun doğrulanması. Jeller, etidyum bromür ile boyanarak görselleştirildi; Şerit M: DNA boyutu işaretleyici (1 kb), Şerit 1-4: Farklı suşlardan amplifiye edilmiş PCR ürünleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 16S rRNA gen dizileme sonuçlarının analizi. Bir sulak alandan (kırmızı kutuda vurgulanmıştır) izole edilen Exiguobacterium suşları ile bilinen Exiguobacterium sp. arasındaki ilişkiyi göstermek için phylogeny.fr programı kullanan temsili dendrogram yapımı. Bilinen Exiguobacterium sp.'nin 16S rRNA dizileri NCBI'den elde edildi. Bu rakam daha önceki bir makaleden (Chauhan et.al.) herhangi bir değişiklik yapılmadan alınmıştır25. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Pepton Maya Özü (PYE) | |
| Pepton | 2g |
| Maya özü | 1g |
| 1 milyon MgSO4 | 1 ml |
| 1M CaCl2 | 1 ml |
| Damıtılmış su | 1000 ml'ye kadar |
| 121°C ve 15 PSI'da 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin. | |
| Reasoner'ın 2A'sı (R2A) | |
| Kazein asit hidrolizatı | 0,5 gr |
| Maya özü | 0,5 gr |
| Proteaz pepton | 0,5 gr |
| Dekstroz | 0,5 gr |
| Nişasta, çözünür | 0,5 gr |
| K2HPO4 | 0,5 gr |
| Damıtılmış su | 1000 ml'ye kadar |
| 121°C ve 15 PSI'da 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin. | |
| M2G (M2G) | |
| 10X M2 tuzları (1L) - | |
| Na2HPO4 | 17.4 gr |
| KH2PO4 | 10.6 gr |
| NH4Cl | 5.0 gr |
| 10X M2 tuzlarını 121 °C ve 15 PSI'da 15 dakika otoklavlayın. | |
| 10X M2 tuzları | 100 ml |
| 50mM MgCl2 | 10 ml |
| %30 glikoz (a/h) | 10 ml |
| 0,8 mM EDTA'da 1 mM FeSO4 , pH 6,8 | 10 ml |
| 50 mM CaCl2 | 10 ml |
| Damıtılmış su | 1000 ml'ye kadar |
| Filtre sterilize eder. | |
| Lizojen Et Suyu (LB) | |
| Kazein enzimik hidrolizat | 10 gr |
| Maya özü | 5 gr |
| NaCl (Sıvı Değeri) | 10 gr |
| Damıtılmış su | 1000 ml'ye kadar |
| 121°C ve 15 PSI'da 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin. | |
| Besin Suyu (NB) | |
| Pepton | 15 gr |
| Maya özü | 3 gr |
| NaCl (Sıvı Değeri) | 6 gr |
| Glikoz | 1 gr |
| Damıtılmış su | 1000 ml'ye kadar |
| 121°C ve 15 PSI'da 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin. | |
| Triptik Soya Suyu (TSB) | |
| Kazeinin pankreas sindirimi | 17.0 gr |
| Soya küspesinin papalık sindirimi | 3 gr |
| NaCl (Sıvı Değeri) | 5 gr |
| K2HPO4 | 2.5 gr |
| Dekstroz | 2.5 gr |
| Damıtılmış su | 1000 ml'ye kadar |
| 121°C ve 15 PSI'da 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin. | |
| M63 Serisi | |
| NH4Cl | 2g |
| KH2PO4 | 13.6 gr |
| FeSO4.7H 2O | 0.5 mg |
| % 20 gliserol | 10 ml |
| 1 milyon MgSO4 | 1 ml |
| Damıtılmış su | 1000 ml'ye kadar |
| M9 minimum baskı malzemesi | |
| 5X M9 tuzları | |
| Na 2HPO4.7H 20 | 12.8 gr |
| KH2PO4 | 3 gr |
| NH4Cl | 1 gr |
| NaCl (Sıvı Değeri) | 0,5 gr |
| Damıtılmış su | 200 ml'ye kadar |
| 5X M9 tuzlarını 121°C'de ve 15 PSI'da 15 dakika otoklavlayın. | |
| 1X M9 ortam | |
| 5X M9 tuzları | 20 ml |
| % 20 glikoz | 2 ml |
| 1 milyon MgSO4 | 200 μl |
| 1M CaCl2 | 10 μl |
| Otoklavlanmış su | 100 ml'ye kadar |
| NOT – Katı ortam hazırlığı için %1.5 Bacto Agar (15 g/L) kullanın |
Tablo 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dünyadaki bakterilerin sadece yaklaşık% 1'inin laboratuvarda kolayca yetiştirilebileceği iyi bilinmektedir6. Ekilebilir bakteriler arasında bile, çoğu karakterize edilmeden kalır. Moleküler yöntemlerdeki gelişmeler, bakteri topluluklarının analiz ve değerlendirmesine yeni bir boyut kazandırmıştır. Bununla birlikte, bu tür tekniklerin sınırlamaları vardır, ancak kültür analizlerini gereksiz kılmaz. Bireysel bakteri türlerini izole etmek için saf kültür teknikleri, fizyolojik özelliklerin karakterizasyonu için birincil mekanizma olmaya devam etmektedir. Toprak ve su habitatları, biyoteknolojik kullanımlar için kullanılabilecek yeni enzimlere ve yollara sahip birçok bakteriyi barındırır. Bu çalışma, ekolojik örneklerden bakterilerin izolasyonu ve karakterizasyonu için basit ve ucuz bir yöntemi açıklamaktadır.
Farklı bakterilerin farklı beslenme gereksinimleri vardır, bu nedenle çeşitli bakteri türlerini izole etme olasılığını artırmak için çeşitli büyüme ortamları kullanılmıştır. Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, titiz büyüme gereksinimleri olan mikropların dışlanabilmesidir. Ayrıca, bu adımın temel amacı, numuneden elde edilen bakteri türlerinin sayısını en üst düzeye çıkarmaktır. Örnek kütüphanesindeki bakteri türlerinin sayısı, biyoremediasyon potansiyeli olan mikropları izole etme şansını artıracaktır. Sadece çeşitli büyüme ortamlarına rağmen, değişen büyüme sıcaklığı ve oksijen konsantrasyonu, benzersiz türlerle örnek kütüphanesini daha da genişletme şansını da artırabilir41,42.
Protokolün kritik bir adımı, test edilen substratın (bizim durumumuzda stiren) kullanımını kontrol etmektir. Yanlış negatif sonuçlardan kaçınmak için bu tür bir araştırma için deneyi dikkatli bir şekilde tasarlamak önemlidir. Büyüme özelliklerine bağlı olarak, mikrop test edilen substratın kullanımına hemen uyum sağlayamayabilir ve bir zenginleştirme işlemi gerektirebilir. Bizim durumumuzda, hidrokarbonun tek karbon kaynağı olarak kullanımını test etmek için kullanılan LCFBM ortamında bakteri üremesi yavaştır25. Bu sorunu aşmak için, bakteri üremesini desteklemek için LCFBM ortamına (%1 v/h) TSB veya NB eklenerek ilk kültürler başlatılabilir. Ekili mikrobun tanımlanması 16S rRNA dizilimi43 ile gerçekleştirilir. Bu yöntem, mikrobiyal tanımlama için sağlam ve uygun maliyetli bir yöntem sunar. Bununla birlikte, 16S dizilimi yalnızca daha yüksek düzeyde taksonomik tanımlama sağlayabilir. Spesifik tür düzeyinde tanımlama için, çeşitli biyokimyasal testlerle birlikte diğer aileye özgü primerler kullanılmalıdır44,45.
Tam hücre lizatı ile enzim tahlili, verimli bir hücre lizis yönteminin kullanılmasını gerektirir. Bakteriyel hücre lizisi genellikle sonikasyon yapılarak elde edilir. Bununla birlikte, donma-çözülme yöntemi, proteinin denatürasyonunu önlediğine inanılan nazik hücre lizizi için alternatif bir yöntemdir. Prosedür, hücrelerin -80 °C'de hızlı bir şekilde dondurulması ve 4 °C'de sırayla çözülmesinden oluşur46. NP-40 veya Triton-X-100 gibi hafif deterjanların eklenmesi de hücre lizizine yardımcı olur ve iyonik olmayan yapıları nedeniyle proteinleri denatüre etmez47. Bununla birlikte, siyanobakteriler48 gibi kalın hücre duvarlarına sahip bakteriler, deterjanlar49 kullanan nazik hücre lizis yönteminden fayda görmeyebilir ve bu nedenle enzim tahlili için lizis yöntemi buna göre seçilmelidir.
Araştırmacılar, çevresel örneklerden ekilebilir bakteri popülasyonuna odaklanarak birçok farklı deneyi hızlı bir şekilde gerçekleştirebilirler. Burada açıklanan yöntemler çok karmaşık aletlerin kullanılmasını gerektirmez ve standart bir laboratuvar kurulumunda kolayca gerçekleştirilebilir. Hidrokarbonlar ve tehlikeli kimyasallar kullanıldığından, laboratuvar standart çalışma prosedürlerine göre uygun şekilde elleçleme ve bertaraf etme ile donatılmalıdır. Burada açıklanan yaklaşım, çok sayıda biyoteknolojik uygulama için çeşitli bakteri türlerini incelemek üzere kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Dr. Karthik Krishnan'a ve RP laboratuvarı üyelerine yararlı yorumları ve önerileri için teşekkür ederiz. DS, SNU-Doktora bursu ve Earthwatch Enstitüsü Hindistan Bursu tarafından desteklenmektedir. RP laboratuvarı, Shiv Nadar Üniversitesi'nden bir CSIR-EMR hibesi ve başlangıç fonları ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B.
- R, C.
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R.
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
