Summary
Denne protokol beskriver de mikrofabrikationsteknikker, der kræves for at opbygge en lab-on-a-chip, mikrofluidisk elektroporationsenhed. Den eksperimentelle opsætning udfører kontrollerede transfektioner på enkeltcelleniveau i et kontinuerligt flow og kan udvides til højere gennemløb med populationsbaseret kontrol. Der leveres en analyse, der viser evnen til elektrisk at overvåge graden af cellemembranpermeabilisering i realtid.
Abstract
Nuværende terapeutiske innovationer, såsom CAR-T-celleterapi, er stærkt afhængige af viral-medieret genlevering. Selvom den er effektiv, ledsages denne teknik af høje produktionsomkostninger, hvilket har skabt interesse for at bruge alternative metoder til genlevering. Elektroporation er en elektrofysisk, ikke-viral tilgang til intracellulær levering af gener og andre eksogene materialer. Ved påføring af et elektrisk felt tillader cellemembranen midlertidigt molekylær levering ind i cellen. Typisk udføres elektroporation på makroskalaen for at behandle et stort antal celler. Denne tilgang kræver imidlertid omfattende empirisk protokoludvikling, hvilket er dyrt, når man arbejder med primære og vanskelige at transficere celletyper. Langvarig protokoludvikling kombineret med kravet om store spændinger for at opnå tilstrækkelige elektriske feltstyrker til at gennemtrænge cellerne har ført til udviklingen af elektroporationsanordninger i mikroskala. Disse mikroelektroporationsanordninger fremstilles ved hjælp af almindelige mikrofabrikationsteknikker og giver mulighed for større eksperimentel kontrol med potentiale til at opretholde høje gennemstrømningsfunktioner. Dette arbejde bygger på en mikrofluidisk elektroporationsteknologi, der er i stand til at detektere niveauet af cellemembranpermeabilisering på et enkeltcelleniveau under kontinuerlig strømning. Denne teknologi var imidlertid begrænset til 4 celler behandlet i sekundet, og derfor foreslås og præsenteres en ny tilgang til at øge systemets gennemstrømning her. Denne nye teknik, betegnet som cellepopulationsbaseret feedbackkontrol, overvejer cellepermeabiliseringsresponsen på en række elektroporationspulserende forhold og bestemmer de bedst egnede elektroporationspulsbetingelser for celletypen under test. Der anvendes derefter en højere gennemstrømningstilstand, hvor denne 'optimale' puls påføres cellesuspensionen under transit. Trinene til fremstilling af enheden, opsætning og kørsel af mikrofluidiske eksperimenter og analyse af resultaterne præsenteres detaljeret. Endelig demonstreres denne mikroelektroporationsteknologi ved at levere et DNA-plasmid, der koder for grønt fluorescerende protein (GFP) i HEK293-celler.
Introduction
Nuværende terapeutiske innovationer inden for biomedicinsk forskning, såsom CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T-celle) celleterapi og genetisk redigering ved hjælp af CRISPR (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagne DNA-sekvenser) / Cas9, er stærkt afhængige af evnen til at levere eksogent materiale både med succes og effektivt ind i det intracellulære rum1. I CAR-T-terapi er guldstandarden til at udføre genleveringstrinnet i fremstilling af celleterapi ved hjælp af virale vektorer2. Selvom viral-medieret genlevering er en effektiv leveringsmodalitet, har den også flere ulemper. Disse omfatter produktionsomkostninger, cytotoksicitet, immunogenicitet, mutagenese / tumorigenesepotentiale og størrelsesbegrænsninger på det eller de gener, der skal leveres3. Disse begrænsninger har ført til forskning og udvikling af alternative, ikke-virale leveringsteknologier.
Elektroporation, et alternativ til viral-medieret genlevering, er afhængig af anvendelsen af en optimal elektrisk pulsbølgeform til at udføre DNA-, RNA- og proteintransfektioner af celler. Efter påføring af et eksternt elektrisk felt kompromitteres cellemembranen kortvarigt, hvilket gør cellen modtagelig for intracellulær levering af ellers uigennemtrængelige eksogene materialer4. Sammenlignet med viral-medieret levering er elektroporation fordelagtig, da den generelt er sikker, nem at betjene og har lave driftsomkostninger. Elektroporation kan levere både lille og stor molekylær last og kan være effektiv til at transficere celler uanset afstamning5. For at opnå ønskelige resultater efter elektroporation, dvs. god levedygtighed og god elektrotransfektionseffektivitet, skal en række eksperimentelle parametre samoptimeres. Disse omfatter celletype6, celletæthed, molekylekoncentration7, elektroporationsbufferegenskaber (f.eks. molekylær sammensætning, ledningsevne og osmolaritet)8, elektrodestørrelse/geometri9 og elektrisk pulsbølgeform (form, polaritet, antal impulser)10 (se figur 1 for en illustration). Selvom hver af disse parametre kan have en signifikant effekt på resultaterne af elektroporationseksperimenter, er pulsbølgeform især blevet undersøgt i detaljer, da den elektriske energi i den eller de anvendte impulser er roden til den iboende afvejning mellem den resulterende cellelevedygtighed og elektrotransfektionseffektivitet8.
Typisk udføres elektroporationseksperimenter på makroskalaen, hvor celler suspenderes i 100'erne mikroliter buffer mellem et sæt store parallelpladeelektroder i en elektroporationskuvette. Elektroderne fremstilles almindeligvis af aluminium med en elektrodeafstand på 1-4 mm. Når cellerne er manuelt indlæst via pipette, er kuvetten elektrisk forbundet til en omfangsrig, elektrisk pulsgenerator, hvor brugeren kan indstille og anvende pulsbølgeformparametrene til at elektropolere cellesuspensionen. Selvom makroskala eller bulkelektroporation kan behandle celletætheder >106 celler / ml, kan denne funktion være spildt, når du optimerer indstillingerne for elektrisk pulsbølgeform. Dette er især bekymrende ved elektropering af primære celletyper, hvor cellepopulationstallene kan begrænses. På grund af den store afstand mellem elektroderne skal pulsgeneratoren desuden være i stand til at levere store spændinger for at opnå elektriske feltstyrker >1kV / cm11. Disse høje spændinger forårsager resistiv effektafledning gennem elektrolytbufferen, hvilket resulterer i Joule-opvarmning, hvilket kan være skadeligt for den resulterende cellelevedygtighed12. Endelig vil udførelse af elektroporation på en tæt suspension af celler konsekvent blive belastet med en medfødt variabilitet i den resulterende elektrotransfektionseffektivitet og cellelevedygtighed. Hver celle i suspension kunne opleve en anden elektrisk feltstyrke på grund af de omgivende celler. Afhængigt af om den erfarne elektriske feltstyrke enten øges eller formindskes, kan den resulterende cellelevedygtighed eller elektrotransfektionseffektivitet hver især blive negativt påvirket11. Disse ulemper ved elektroporation i makroskala har ført til forfølgelse og udvikling af alternative teknologier, der opererer på mikroskala og giver mulighed for bedre kontrol på enkeltcelleniveau.
Området BioMEMS eller biomedicinske mikroelektromekaniske systemer stammer fra de teknologiske fremskridt, der er gjort i mikroelektronikindustrien. Specifikt ved hjælp af mikrofabrikationsprocesser til udvikling af mikroenheder til fremme af biomedicinsk forskning. Disse fremskridt omfatter udvikling af mikroelektrodearrays til in vivo elektrisk overvågning 13, kapacitive mikroelektroder til in situ-elektroporation14, miniaturiserede organ-on-a-chip-enheder 15, mikrofluidisk point-of-care-diagnostik 16, biosensorer 17 og lægemiddelafgivelsessystemer 18, herunder nano- og mikroelektroporationsenheder 19,20,21 . På grund af evnen til at designe og fremstille enheder i samme størrelsesskala som biologiske celler er nano- og mikroelektroporationsteknologier fordelagtige sammenlignet med deres makroskala modstykke22,23. Disse elektroporationsenheder eliminerer kravet om højspændingspulsapplikationer, da elektrodesæt med afstande fra 10'erne til 100'erne mikrometer typisk er integreret. Denne funktion reducerer strømmen drastisk gennem elektrolytten, hvilket igen reducerer akkumuleringen af giftige elektrolyseprodukter og virkningerne af Joule-opvarmning i disse systemer. Mikroskalakanalerne sikrer også, at et meget mere ensartet elektrisk felt pålideligt påføres cellerne under pulspåføring, hvilket resulterer i mere ensartede resultater24. Derudover er det også almindeligt, at mikroelektroporationsanordninger integreres i en mikrofluidisk platform, der egner sig til fremtidig integration i en fuldautomatisk teknologi, en meget ønskelig kapacitet inden for fremstilling af celleterapi25. Endelig giver mikroskala elektroporation mulighed for elektrisk forhør af elektroporationshændelser. For eksempel kan graden af cellemembranpermeabilisering overvåges i realtid på et enkelt celleniveau26,27. Formålet med denne metode er at beskrive mikrofabrikation, systemdrift og analyse af en mikrofluid, enkeltcellet mikroelektroporationsenhed, der er i stand til at måle graden af cellemembranpermeabilisering til optimering af elektroporationsprotokoller, men alligevel øge gennemstrømningen i forhold til den tidligere state-of-the-art.
Udførelse af elektroporation på enkeltcelleniveau er ikke længere en ny teknik, som det først blev demonstreret af Rubinsky et al. i 2001 med udviklingen af en statisk celleelektroporationsteknologi28. Deres mikroenhed var innovativ, da de var de første til at demonstrere evnen til elektrisk at overvåge elektroporationsbegivenheden. Dette har yderligere ført til udviklingen af statiske, enkeltcellede elektroporationsteknologier, der er i stand til elektrisk at detektere graden af cellemembranpermeabilisering på en paralleliseret måde for at øge enhedernes gennemstrømning. Men selv med parallelisering og batchbehandling mangler disse enheder alvorligt det samlede antal celler, de kan behandle pr. Tidsenhed29,30. Denne begrænsning har ført til udviklingen af gennemstrømningsenheder, der er i stand til at udføre mikroelektroporation på enkeltcelleniveau ved meget større gennemstrømninger31. Denne enhedsovergang fra statisk til gennemstrømningsmiljø begrænser evnen til elektrisk overvågning af graden af cellemembranpermeabilisering efter påføring af elektroporationspulsen. Metoden beskrevet i dette arbejde bygger bro mellem disse to teknologier, en mikroelektroporationsteknologi, der er i stand til elektrisk at detektere, pulsere og overvåge graden af cellemembranpermeabilisering af individuelle celler på en kontinuerlig flow, seriel måde.
Denne teknologi blev for nylig beskrevet i Zheng et al. I dette arbejde blev kapaciteten af denne teknologi introduceret med afslutningen af en parametrisk undersøgelse, hvor både amplituden og varigheden af elektroporationspulsen blev varieret, og det efterfølgende elektriske signal, der tyder på cellemembranpermeabilisering, blev undersøgt32. Resultaterne viste, at en stigning i intensiteten af elektroporationspulsen (dvs. stigning i påført elektrisk felt eller stigning i pulsvarighed) forårsagede en stigning i den målte cellemembranpermeabilisering. For yderligere at validere systemet blev en fælles fluorescerende indikator for vellykket elektroporation, propidiumiodid33, tilsat cellesuspensionen, og et fluorescensbillede blev taget umiddelbart efter påføringen af den elektriske puls. Det optiske signal, dvs. fluorescensintensiteten af propidiumiodid inde i cellen, var stærkt korreleret med den elektriske måling af graden af cellemembranpermeabilisering, hvilket verificerede pålideligheden af denne elektriske måling. Dette arbejde overvejede imidlertid kun levering af det lille molekyle propidiumiodid, som har ringe eller ingen oversættelig betydning.
I dette arbejde introduceres en ny anvendelse af denne teknologi for at forbedre systemets gennemstrømning, samtidig med at der leveres en biologisk aktiv plasmid-DNA (pDNA) vektor og vurderer elektrotransfektionseffektiviteten af celler, der replateres og dyrkes efter elektroporation. Selvom det tidligere arbejde overgår eksisterende mikroelektroporationsteknologier, der er i stand til elektrisk at måle elektroporationsbegivenheden, kræver enhedens aktuelle tilstand stadig lange celletransittider mellem elektrodesættet (~ 250 ms) for at udføre celledetektion, pulsapplikation og måling af cellemembranpermeabilisering. Med en enkelt kanal begrænser dette gennemstrømningen til 4 celler/s. For at bekæmpe denne begrænsning introduceres et nyt koncept for cellepopulationsbaseret feedback-kontrolleret elektroporation for at udføre pDNA-elektrotransfektion. Ved at bruge en hypofysiologisk ledningsevne elektroporationsbuffer giver dette system mulighed for elektrisk forhør af enkeltceller på tværs af en lang række elektroporationspulsapplikationer. Baseret på det elektriske respons bestemmes derefter en 'optimal' elektroporationspuls. En 'high-throughput' -tilstand implementeres derefter, hvor cellemembranpermeabiliseringsbestemmelsen ophæves, strømningshastigheden øges, og elektroporationspulsens driftscyklus matches med celletransittiden for at sikre en puls pr. celle i transit mellem elektroderne. Dette arbejde vil give omfattende detaljer om mikrofabrikationstrinnene til fremstilling af mikroenheden, materialet / udstyret og deres opsætning, der kræves for at udføre eksperimenteringen, og driften / analysen af enheden og dens elektrotransfektionseffektivitet (eTE).
Figur 1: Eksperimentelle faktorer, der påvirker elektroporationsresultater. (Venstre) Cellesuspension-Vigtige faktorer, der skal overvejes inden elektroporationens begyndelse, omfatter: Nyttelast (i dette tilfælde pDNA), koncentration, celletæthed og elektroporationsbufferegenskaber. Elektroporationsbufferegenskaber, der skal overvejes, er ledningsevne, osmolaritet og den nøjagtige molekylære sammensætning, der bidrager til disse værdier. (Midten) Pulsapplikation-Den nøjagtige pulstype (kvadratbølge vs. eksponentielt henfald) og pulsbølgeform (enkelt puls vs. pulstog) skal optimeres for at maksimere både den resulterende cellelevedygtighed og elektrotransfektionseffektivitet. Almindelige pulstog implementeret i elektroporationsprocesser består typisk af en række højspændingsimpulser (HV) eller serier af impulser, der roterer mellem HV og lavspændings (LV) pulsstørrelser. (Højre) Cell Recovery-Down-stream behandlingstrin, især gendannelsescellekulturmediet, som celler overføres til, bør optimeres. Ikke fremhævet (yderst til venstre), yderligere opstrøms cellebehandlingstrin kan implementeres til samlet optimering af elektroporationsprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Brugere bør gennemgå alle MSDS for de materialer og forsyninger, der anvendes i denne protokol. Der skal bæres passende personlige værnemidler på hvert trin, og steril teknik skal anvendes under forsøg. Afsnit 1-7 diskuterer enhedens fabrikation.
1. Enhedsfremstilling - Maskedesign
BEMÆRK: Se figur 2 for en illustration af mikrofabrikationsprocessen. Mikrofabrikationstrinnene skal udføres i et renrumsmiljø. Yderligere PPE er nødvendig (hårnet, ansigtshårnet, maske, renrumsdragt, skoovertræk).
- Installer en CAD-software efter eget valg, design en 2-dimensionel 'maske' af både den mikrofluidiske kanal og elektroder, og gem designet i det ønskede filformat (dvs. .dxf, .dwg).
BEMÆRK: Se supplerende figur 1 for et eksempel på en 2-dimensionel maskeskematisk. - Send til en leverandør efter eget valg for at blive udskrevet. Sørg for, at dimensionerne af designene er inden for leverandørens opløsningsfunktioner.
2. Enhedsfabrikation- Fotolitografi
BEMÆRK: De medfølgende mikrofabrikationsopskrifter er vedtaget fra fotoresistens producentens anbefalinger og bør kun bruges som udgangspunkt34. Nøjagtige værdier for bagetider, eksponeringstider osv. skal optimeres for hver fabrikationsprotokol. Det anbefales at bruge waferpincet til håndtering af både siliciumskiver og glasrutschebaner.
- Fremstilling af mikrofluidiske kanaler
- Siliciumskive og sodakalkglasglasrensning: Følg trin 2.1.2-2.1.3 for at udføre siliciumskive og 1" × 3" sodakalkglasglasrensning (begge benævnt 'substrat').
- Nedsænk substraterne i et acetonebad, et isopropanol (IPA) bad og et deioniseret vandbad i 10 minutter hver. Udfør denne 3-trins vask serielt ved stuetemperatur.
- Fjern og tør overfladen ved hjælp af en nitrogen- eller filtreret luftgaskilde under tryk. Anbring substraterne i en 150 °C ovn i mindst 30 minutter for at tillade fordampning af den resterende fugt.
- SU-8 fotolitografi på siliciumskive: Udfør fotolitografi på siliciumskiven ved at følge trin 2.1.5-2.1.14.
BEMÆRK: For at opnå en mikrofluidisk kanalhøjde på 20 μm blev SU-8 2000-serien negativ fotoresist brugt. Nøjagtige spin-satser vil variere afhængigt af formuleringen af SU-8 (dvs. 2010, 2015 osv.); Følgende betingelser gælder dog for SU-8 2010 formulering35. - Siliciumskiven tages ud af ovnen ved 150 °C, og den afkøles til stuetemperatur (RT).
- Fastgør waferen til chucken på wafer spin coater ved hjælp af spin coaterens vakuumsystem. Programmer spinneren. Trin 1 - 500 o / min i 10 s ved en acceleration på 100 o / min / s, trin 2 - 1000 o / min i 30 s ved en acceleration på 300 o / min / s.
- Dispenser 4 ml SU-8 2010 fotoresist på midten af siliciumskiven. Kør programmet. Når systemet går i stå, skal du slukke for vakuumet.
- Brug pincet til at overføre SU-8-belagt siliciumskive på en kogeplade ved 95 °C i 4-5 minutter til blød bagning. Fjern derefter waferen fra kogepladen, og lad den køle af til RT.
BEMÆRK: Følg den korrekte opstartsprocedure for den laboratoriespecifikke fotolitografiske maskejustering. - Fastgør fotomasken med 2D-mikrofluidkanaldesignet på maskeholderen. Indsæt siliciumskiven med SU-8-belægningen opad på waferpatronen.
- Indstil eksponeringsindstillingerne til 150 mJ/cm2 , og kør maskinen.
FORSIGTIG: Se ikke direkte på UV-lyskilden for at undgå potentiel øjenskade. - Placer den SU-8 belagte siliciumskive på en kogeplade ved 95 °C i 4-5 minutter til bagning efter eksponering.
- Nedsænk siliciumskiven i SU-8-udviklerløsningen (se Materialetabel) i 3-4 min. Påfør blid agitation. Fjern waferen fra opløsningen og skyl overfladen med IPA.
- Tør overfladen ved hjælp af en nitrogenkilde under tryk eller filtreret luftgaskilde. Undersøg funktionerne under et mikroskop ved hjælp af et UV-filter, og sørg for ingen åbenlyse defekter i de mikrofluidiske kanaler.
- Anbring siliciumskiven i en 150 °C ovn i mindst 30 minutter til hård bagning.
- Lad det køle ned til RT og brug stylusprofilometri til at måle den nøjagtige højde og hældning af kanalens sidevægge.
- Fotolitografi på glasrutschebaner
BEMÆRK: Hexamethyldisilazan (HMDS) bruges som vedhæftningspromotor til S1818 positiv fotoresist36.- Fjern glasglasset fra ovnen på 150 °C, og lad det køle af til RT.
- Fastgør glasglideren til spinnerens borepatron ved hjælp af vakuum, og programmer spinneren. Trin 1 - 500 o / min i 10 s ved en acceleration på 100 o / min. Trin 2 - 3000 o / min for 30 sad en acceleration på 300 o / min.
- Dispenser 3-4 dråber HMDS over overfladen af glasrutsjebanen. Kør programmet.
BEMÆRK: For at opnå en overfladebelægning på ~ 3 μm skal S1800 positive fotoresist-serier anvendes. Nøjagtige spinhastigheder varierer afhængigt af formuleringen; nedenstående anbefalinger er til S1818-formuleringen34. - Dispenser 1 ml fotoresist på overfladen af glasrutsjebanen. Sørg nok til at dække overfladearealet.
- Kør programmet. Når systemet går i stå, skal du slukke for vakuumet og fjerne glasbeholderen.
- Placer det S1818-belagte glasglas på en kogeplade ved 120 °C i 4 minutter for en blød bagning. Fjern og lad komme til RT.
- Fastgør fotomasken med 2D-elektrodedesignet på maskeholderen.
- Indsæt og juster glasbeholderen med S1818-belægningen opad på waferpatronen. Indstil eksponeringsindstillingerne til 250 mJ/cm2 , og kør maskinen.
BEMÆRK: Forskellige kontaktjusteringsmodeller kan være mere eller mindre imødekommende over for ikke-cirkulære underlag med varierende tykkelse. - Nedsænk glasrutsjebanen i MF-319 udviklerløsning i 2 min. Påfør blid agitation. Skyl overfladen af glasglasset med deioniseret vand.
- Tør overfladen ved hjælp af en nitrogen- eller filtreret luftgaskilde under tryk, og observer funktionerne under et mikroskop ved hjælp af et UV-filter. Sørg for, at der ikke er åbenlyse fejl i de litografiske mønstre.
- Anbring glasglas i ovnen ved 150 °C, og sørg for, at underlagsoverfladen af interesse vender opad i mindst 30 minutter for en hård bagning. Fjern fra ovnen og hold dig beskyttet mod lys.
3. Enhedsfabrikation: Flussyre (HF) ætsning
FORSIGTIG: Dette trin involverer håndtering og bortskaffelse af flussyre (HF), som kan forårsage dybe, smertefulde kemiske forbrændinger. Yderligere PPE skal bruges til at beskytte håndtereren (ansigtsskærm, albuelange kemisk resistente handsker, kemisk resistent forklæde med ærmer). Calciumgluconatsyreneutralisator og hudgel bør opbevares i nærheden af laboratoriebænken. Dette trin bør ikke udføres alene. HF bør aldrig opbevares i eller udleveres i glasbeholdere, da beholderen ætses af syren.
BEMÆRK: HF ætser ensartet det udsatte glas (dvs. elektrodedesignet) for at danne en fordybning i glasset, hvilket giver mulighed for bedre kantopløsning af elektrodemønsteret efter metalaflejring (afsnit 4).
- Nedsænk glasglasset i 10:1 bufferet HF-opløsning i 1 minut i en polytetrafluorethylenbeholder. Overfør og vask glasrutsjebanerne i deioniseret vand. Gentag vasketrinnet 3 gange.
- Tør overfladen ved hjælp af en nitrogenkilde under tryk eller filtreret luftgaskilde. Anbring glasunderlag i en 65 °C ovn natten over for at fjerne eventuel resterende fugt. Dæk substraterne fra lys.
4. Enhedsfabrikation: Fysisk dampaflejring
BEMÆRK: Dette trin involverer metalaflejring på glasglideunderlagene for at definere elektrodemønstrene. Almindeligt anvendte metalelektroder er krom / guld og titanium / platin. Guld og platin klæber ikke til glassubstratet, så et frøvedhæftningslag af henholdsvis krom eller titanium er påkrævet for at fremme vedhæftning37.
- Følg den renrumsspecifikke protokol for at betjene det interne PVD-system. Dette arbejde bruger et DC-forstøvningssystem og sputter med 100 SCCM Argon-gas ved et tryk på ~ 8 mTorr og 200 W effekt.
- Sputter titanium i 8 min med en hastighed på ~100 Å/min. Sputter platin i 10 min med en hastighed på ~200 Å/min. Fjern substraterne fra PVD-kammeret.
5. Enhedsfremstilling: Photoresist lift-off
BEMÆRK: Dette trin involverer opløsning af fotoresistlaget i et acetonebad, hvilket efterlader de klæbede platinelektroder mønstret på glasdiasene.
- Nedsænk de metalbelagte glasglider i et acetonebad i ~ 10 min.
- Sonicer badet for at introducere agitation for at bryde den uklæbede metalfilm op. Brug en acetone-gennemblødt klud til at fjerne eventuelle rester, hvis det er nødvendigt.
- Når al fotoresist/metal er fjernet, vaskes elektrodemønstrene med deioniseret vand, og dem anbringes i en 65 °C ovn natten over for at fjerne eventuel resterende overfladefugtighed.
- Brug stylusprofilometri til at måle profilen af de mønstrede elektroder.
6. Enhedsfremstilling: Blødt litografi
BEMÆRK: Dette trin involverer replikastøbning af den mikrofluidiske kanal på SU-8-masteraflastningsstrukturen ved hjælp af en elastomer, polydimethylsiloxan (PDMS).
- Silicium wafer silanisering
BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin; Det vil dog øge levetiden for SU-8-hjælpestrukturen, der blev fremstillet i afsnit 2.1. Dette trin skal udføres i en kemisk røghætte.- Fastgør waferen til bunden af en petriskål, og læg petriskålen i en tørremaskine.
- Omgiv siliciumskivens omkreds med ca. 50 μL trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan. Tilslut vakuum (vakuumpumpe eller husvakuumledning) og kør i 20 min.
- PDMS replika støbning
- I en engangsbeholder (f.eks. vejebåd, plastikkop) blandes PDMS elastomerbase til hærder ved et vægtforhold på 10: 1 oven på en elektronisk vægt. Hæld PDMS-opløsningen over siliciumskiven, og anbring blandingen under et vakuum for at fjerne alle luftbobler.
- Hærd ved 65 °C i mindst 4 timer, så PDMS kan størkne. Brug spidsen af et barberblad til at skære det støbte PDMS ud og skrælle fra siliciumskiven.
- Brug en skærpet biopsistans til at fjerne PDMS fra enhedens indløb / udløb. Til denne enhed blev der anvendt 0,75 mm og 3 mm biopsistanser til henholdsvis indløbene og udløbene.
BEMÆRK: Den anvendte biopsistans skal have en lidt mindre diameter end den ydre diameter af forbindelsesslangen for at sikre en tæt forsegling af slanger i reservoirerne.
- Sonikering rengøring af PDMS
- Nedsænk PDMS-enhederne i IPA, og placer dem i en sonikator i 30-45 minutter for at fjerne PDMS-snavs fra indløbet / udløbene. PDMS kan svulme op i IPA-opløsningen.
- Skyl med deioniseret vand og læg dem i en ovn på 65 °C natten over, så PDMS kan svulme op igen til den normale størrelse.
BEMÆRK: Eventuelle rester kan tilstoppe enheden under eksperimentering. Store stykker snavs kan fjernes fra PDMS-overfladen ved hjælp af et stykke scotch tape inden sonikering.
7. Enhedsfabrikation: PDMS-limning / trådfastgørelse
BEMÆRK: Dette trin indebærer behandling af overfladen af PDMS og glassubstratet med et iltplasma for at danne en irreversibel binding mellem PDMS og glas38. Den leverede opskrift skal muligvis tilpasses det nøjagtige system, der anvendes i laboratoriet.
- Skær enhederne i størrelse, og sørg for, at overfladen på PDMS-enheden er ren. Hvis du ikke genindretter, skal du følge trinnene i underafsnit 6.3.
- Programmer plasmageneratoren. Indstil effekt til 70 W, Tid til 35 s, Tryk til 325 mTorr, Strømningshastighed for iltgas til 60 SCCM. Placer PDMS og elektrodeglasglid ind i systemet med funktionerne opad, og kør programmet.
- Fjern enhederne, og juster hurtigt kanalfunktionerne til elektroderne ved hjælp af et stereoskop. Påfør tryk fra midten af PDMS mod siderne for at fjerne uønskede luftbobler ved limningsgrænsefladen.
- Anbring på et varmt sted ved 95 °C i mindst 2 minutter for at afslutte limningsproceduren, og lad enheden køle af ved RT.
- Skær 2 stykker 22-G massiv tråd i ~ 6 "længder og strip isolatoren fra begge ender.
- Lim ledningerne til elektrodepuder ved hjælp af sølvledende epoxy. Anbring færdige enheder i en 65 °C ovn natten over.
Figur 2: Fremstilling af mikroenheder. (A) Mikrofluidisk kanalfabrikation-nøgletrin: Rengøring af siliciumskive (trin 2.1.1-2.1.3), fotoresistbelægning og blød bagning (trin 2.1.7-2.1.8), UV-eksponering (trin 2.1.10), udvikling (trin 2.1.12) og PDMS-hældning (underafsnit 6.2). (B) Elektrodefabrikationsnøgletrin: Glasglasglasrensning (trin 2.1.1-2.1.3), HMDS-belægning og fotoresistbelægning (trin 2.2.3-2.2.4), UV-eksponering (trin 2.2.8), udvikling (trin 2.2.9), HF-ætsning (afsnit 3), fysisk dampaflejring (afsnit 4) og fotoresistlift-off (afsnit 5). (C) Enhedens afsluttende nøgletrin: Indløbs-/udløbsadgang og sonikering (trin 6.2.3 og afsnit 6.3), PDMS-limning og ledningsfastgørelse (afsnit 7). Klik her for at se en større version af denne figur.
8. Cellekultur og høst
BEMÆRK: Standard cellekultur og sterile håndteringsprocedurer bør anvendes. Følg celletypespecifik protokol for cellekultur.
- Cellekultur
- Cellepassage: Dyrkning og passage af cellerne efter trin 8.1.2-8.1.5.
- Kultur HEK293-celler i komplet DMEM-opløsning (88% DMEM, 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin) i en T25-kolbe i en inkubator ved 37 °C, 95% O2, 5% CO2. Passageceller efter planen, når de når ~ 80% sammenløb.
- Opstil mediet ved hjælp af enten et pipette- eller vakuumsystem, og inkuber cellerne i 0,25% trypsin-EDTA (2 ml-T25-kolbe) i 2 minutter ved 37 °C. Neutraliser trypsin med dobbelt så meget kulturmedier.
- Cellesuspensionen overføres til et 15 ml konisk rør og centrifugerer HEK293-celler ved 770 x g i 2 min. Aspirer supernatanten ved hjælp af enten et pipette- eller vakuumsystem
- Resuspend HEK293-celler i 1 ml forvarmet DMEM.
- Celleplettering: Plade cellerne ved at følge trin 8.1.7-8.1.8
- Pallerp cellerne ved en fortynding på 10: 1 til 20: 1 i en T25-kolbe (5 ml DMEM) for at fortsætte kulturen.
- Pladerne plades ved en fortynding på 5:1 til 20:1 i en 6-brønds plade (2 ml DMEM pr. brønd), der skal høstes til elektroporationsforsøg.
BEMÆRK: HEK293-celler belagt 24 timer før elektroporationsforsøg for at opnå ~ 70% sammenløb ved cellehøst (underafsnit 8.3). En inkonsekvent høstplan kan føre til variation i elektroporationsresultater.
- Elektroporationsbuffer
- Forbered elektroporationsbuffer
BEMÆRK: Se Sherba et al. for detaljer om elektroporationsbufferpræparatet8. Buffersammensætningen var 285 mM saccharose, 0,7 mM MgCl2, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7,4; osmolalitet: 310 mOsm, ledningsevne: 500 μS/cm). Elektroporationsbuffer skal formuleres sterilt og opbevares ved 4 °C i en holdbarhed på ~1 måned. Elektroporationsbufferformulering bør optimeres pr. Celletype.
- Forbered elektroporationsbuffer
- Cellehøst og pDNA-tilsætning
- Følg de samme trin som cellepassage (8.1.2-8.1.4).
- Cellerne vaskes i steril 1x PBS, overførselscellesuspension i et 15 ml konisk rør og centrifugeceller ved 770 x g i 2 min.
- Der vaskes HEK293 cellepellet i elektroporationsbufferen og centrifugeres ved 770 x g i 2 min. Resuspender cellerne i elektroporationsbufferen ved ~ 5 millioner celler / ml.
BEMÆRK: Celletætheden skal optimeres pr. celletype. - Der tilsættes pDNA-kodning for grønt fluorescerende protein (GFP) til en slutkoncentration på 20 μg/ml. Bland forsigtigt pDNA / cellesuspensionen og overfør suspensionen til en 1 cc sprøjte til eksperimentering.
9. Hardware/eksperimentel opsætning
BEMÆRK: Før du høster celler til eksperimentering, skal du sikre dig, at den eksperimentelle opsætning er afsluttet for at minimere den tid, cellerne er suspenderet i elektroporationsbufferen. Tænd elektronik 20-30 minutter før eksperimenter for at varme op. Se figur 3 for et skema over den eksperimentelle opsætning til driften af enkeltcelledetekteringsmodulet.
BEMÆRK: Et specialbygget PA90 Op-Amp-kredsløb blev udviklet til at imødekomme både den følsomhed, der kræves til detektion af enkeltcelleniveau ved hjælp af låseforstærkeren og de høje spændinger, der kræves for at anvende tilstrækkeligt stærke elektroporationsimpulser. Se PA90-databladet for specifikationer for anbefalede kredsløb39.
- Initialiser låseforstærkeren med aktuelle forforstærkerindstillinger og indstil via algoritmen. Se Zheng et al. for detaljer om lock-in-indstillingerne32.
- Strømforsyninger, funktionsgenerator og forstærker
- Strømforsyning 1: Indstil til -15 V for at drive den negative ende af kredsløbet.
- Strømforsyning 2 (funktionsgenerator): Indstil til at udsende DC-signal, og indstil amplituden til 2 V. Tilslut til 50x forstærkerindgang.
- Program Electroporation Pulse Generator til den firkantede bølge: Indstil den ønskede pulsbredde (driftscyklus) og ønsket pulsamplitude (volt).
- Indstil output til triggertilstand (1 puls). Tilslut udgangen til indgangen på 50x forstærkeren.
BEMÆRK: Husk 50x forstærkningen ved programmering af pulsamplituden. Dvs. for at opnå en elektrisk feltstyrke på 1 kV / cm kræves i alt 30 V, 30 V / 300 μm (afstand mellem elektroder), derfor skal funktionsgeneratorudgangen indstilles til 30/50 eller 600 mV. - Kontroller udgangene fra 50x forstærkeren ved hjælp af et oscilloskop. Udgang 1-100 V fra strømforsyning 2 (9.2.2). Udgang 2-Variabel amplitude for elektroporationspulsen (9.2.4).
- Tilslut en 10x sonde til en oscilloskopkanal og til den færdige mikroenhed (enhed under test, DUT) i trin 7.6, hvor elektroporationspulsen skal påføres. Overvåg systemet under eksperimentering for at sikre, at pulser påføres.
- Sørg for, at lock-in USB er tilsluttet og registreret. Dobbelttjek alle låseindstillinger i algoritmekoden (vigtigst af alt, fastlåsningsoutputfrekvens).
- Mikroskop/CCD-kamera
- Placer mikroenheden på mikroskopets trin via en glideholder. Tænd for CCD-kameraet, og bring den mikrofluidiske kanal i fokus. Brug et 4x eller 10x mål.
Figur 3: Eksperimentel opsætning skematisk-Enkelt celledetektion. Højeffekt-op-ampen (PA-90) giver mulighed for superpositionering af højspændingselektroporationspulsen på det fastlåsende Output AC-signal, der kræves til enkeltcelledetektionen. Dette excitationssignal passerer gennem mikroelektroporationsenheden (Device Under Test, DUT), hvor strømmen derefter forstærkes af den aktuelle forforstærker og føres ind i algoritmen. Systemet overvåger løbende for celledetekteringshændelsen. Ved celleindgang genereres et digitalt signal af låseforstærkeren for at udløse anvendelsen af elektroporationspulsen på cellen (e) i transit. Forklaring: PA-90 (høj effekt op forstærker), DUT (enhed under test), DIO (digital indgang / udgang), FG-EP (funktionsgenerator / elektroporationspuls), 50X (50X forstærker), PS-V- (strømforsyning / negativ spænding til PA 90), FG-V + (funktionsgenerator, positiv spænding til PA 90). Klik her for at se en større version af denne figur.
10. Eksperimentel operation
- Mikrofluidisk kanal priming
- Fjern alle luftbobler fra den cellebelastede sprøjte. Fastgør en 30 G nål til den cellebelastede sprøjte.
- Brug pincet til at skubbe tygonslanger ned langs nålen. Forfyld udløbsbeholderen med genvindingsmedier (samme som trin 8.1.2 uden antibiotika), ~ 40-50 μL.
- Brug tommelfingeren til forsigtigt at lægge pres på stemplet, så væsken langsomt når enden af slangelinjen.
- Fastgør sprøjten til sprøjtepumpen. Tænd for sprøjtepumpen, og sørg for, at den er indstillet til fremadgående perfusion.
- Programmer pumpen til sprøjtens korrekte diameter for at sikre, at strømningshastighederne er nøjagtige. Se pumpemanualen for specifikationer på sprøjtediametre.
BEMÆRK: For at forhindre celler i at sætte sig i sprøjten skal du fastgøre sprøjtepumpen på et klemmestativ, så den kan fungere lodret med sprøjteenden nedad. - Indstil sprøjtepumpens strømningshastighed, ~ 10-20 μL / min, og lad pumpen køre, indtil væsken når enden af slangeledningen. Fastgør slanger til den mikrofluidiske enhed.
- Sænk sprøjtepumpens strømningshastighed, ~ 5-10 μL / min, og lad pumpen køre, indtil al luft udvises fra den mikrofluidiske enhed, og celler krydser til enhedens udløb.
- Fjern cellerne fra udløbet via pipetteaspiration. Fyld udløbsbeholderen igen med genvindingsmedier (samme som trin 8.1.2 uden antibiotika), ~ 40-50 μL.
- Kortlægning af enkeltcellet elektroporationscellemembranpermeabilisering
BEMÆRK: Se figur 4 og figur 5 for en bedre forståelse af de elektriske data, der indikerer henholdsvis cellemembranpermeabilisering og kortlægning af cellemembranpermeabilisering.- Indstil sprøjtepumpens strømningshastighed til ~0,1-0,3 μL/min for at sikre en strøm af enkeltceller gennem elektrodesættet. Celletransittiden mellem elektroderne skal være ~ 250 ms.
- Start computerprogrammet ved at klikke på Kør. Sørg for, at systemet gemmer de elektriske data.
- Sørg for, at systemet pålideligt registrerer celler for at udløse de computerstyrede pulsapplikationer. Juster detektionstærsklen i overensstemmelse hermed.
- Indstil pulsparametrene for den indledende, laveste elektriske energielektroporationspuls. Se tabel 1 for elektroporationspulserende parametre i denne undersøgelse.
- Tænd for udgangskanalen for elektroporationspulsgeneratoren (trin 9.2.3.).
- Følg et forudbestemt antal celledetekterings-/pulsapplikationer (n = 100). Ved afslutningen af hver testet tilstand skal du aspirere celler fra mikroenhedens udløb og genopfylde stikkontakten med genoprettelsesmedier.
- Gentag til den næste elektroporationspulstilstand. Gentag, indtil alle elektroporationspulsforhold er testet.
- Bestem graden af cellemembranpermeabilisering for hver testet pulsapplikation. (Validering efter processen er beskrevet i afsnit 11.1). Generer kortet over cellemembranpermeabilisering (figur 5).
- Bestem elektroporationspulsparametrene for befolkningsbaseret feedback med høj kapacitet.
- Sluk for sprøjtepumpen, fjern celler fra udløbsbeholderen, og genopfyld udløbet med genvindingsmedier.
- Befolkningsbaseret feedback-kontrolleret elektroporation-høj gennemstrømning
BEMÆRK: Se figur 6 for et skema, der illustrerer den befolkningsbaserede feedbackproces.- Indstil sprøjtepumpens strømningshastighed til ~ 1-3 μL / min for at sikre en strøm af enkeltceller gennem elektrodesættet. Celletransittiden mellem elektroderne skal være ~ 25 ms.
- Indstil pulsamplituden til den 'optimerede' tilstand (10.2.9), sluk for udløsertilstand, og indstil pulsbredden, så den passer til celletransittiden.
- Indstil driftscyklussen således, at puls ON-tid matcher den 'optimerede' tilstand. Der henvises til tabel 1.
- Indstil outputkanalfunktionsgeneratoren til ON, tænd sprøjtepumpen, og lad systemet køre, indtil det ønskede antal celler er blevet elektroporeret.
- Når du er færdig, skal du slukke for både sprøjtepumpen og funktionsgeneratoren.
- Overfør cellerne fra udløbsbeholderen til den passende størrelse cellekulturkolbe/plade fyldt med forvarmede genvindingsmedier, og overfør kulturkolbe/-plade til inkubatoren.
11. Bedømmelse
- Detektion af membranpermeabilisering på enkeltcelleniveau
BEMÆRK: For at sikre, at den "optimale" puls blev brugt under modulet med høj kapacitet, skal der udføres en analyse efter eksperimentet for at verificere de elektriske data, der eksporteres fra underafsnit 10.2. Se figur 4 for en grafisk repræsentation af det elektriske signal, der er repræsentativt for membranpermeabilisering på grund af elektroporation.- Indlæs data i en analysesoftware (MATLAB, Python osv.). Generer et plot af Aktuel versus Tid for hver pulserende tilstand.
- Bestem manuelt graden af cellemembranpermeabilisering (Δ IP / ΔIC). Se figur 4. Generer kortet over cellemembranpermeabilisering (Δ IP / ΔIC versus elektrisk energi, figur 5) over alle testede pulsforhold. Bekræft 'optimal' pulserende tilstand.
- elektro-transfektion effektivitet (eTE)
- Efter inkubationsperioden på 24 timer fjernes de elektroporerede celler fra inkubatoren.
- Udfør en levende celleplet. Fortynd DRAQ5 1:1000 til en endelig koncentration på 5 μM i cellekulturbeholderen. Bland forsigtigt cellerne/farvningsopløsningen og inkuber ved 37 °C i 5-30 min.
BEMÆRK: En anden plet kan implementeres i dette trin. Sørg for, at de fluorescerende egenskaber ikke overlapper med den fluorescerende markør, der indikerer vellykket elektrotransfektion (dvs. GFP er i den grønne bølgelængde og DRAQ5 er den fjernrøde). - Tænd et epifluorescerende mikroskop, lampe og kameraer (se Materialetabel).
- Fjern cellerne fra inkubatoren og bring dem i fokus på mikroskopet.
- Tag et fasekontrastbillede (brightfield) af det valgte felt.
- Tag epifluorescerende billeder af det samme felt ved hjælp af filtrene FITC (GFP) og Far-Red (DRAQ5). Analyser billedsættene manuelt eller via en algoritme.
BEMÆRK: Se figur 7 for repræsentative billeder. - Tæl det samlede antal GFP-positive celler i alle billederne. Tæl det samlede antal DRAQ5-farvede celler i alle billederne. Beregn eTE (forholdet mellem GFP-positive celler og DRAQ5-farvede celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 fremhæver driftsprincipperne bag membranpermeabiliseringsdetektering på enkeltcelleniveau for en enkelt pulsamplitude. Efter initieringen af elektroporationseksperimentet bestemmer celledetekteringsalgoritmen en optimal tærskel for celledetektion via en punkt-for-punkt, hældningsbaseret detektionsmetode. Systemet overvåger derefter kontinuerligt (1) for en signifikant negativ ændring i den målte elektriske strøm, hvilket er tegn på indgangen til en celle. Dette skyldes den biologiske cellemembrans isolerende karakter, således at når cellen krydser gennem elektrodesættet, er der en øjeblikkelig stigning i impedans, hvilket resulterer i et kraftigt fald i den målte strøm, hvilket muliggør ensartet celledetektion (2), som i sidste ende udløser skiftet til den computerstyrede pulsapplikation (4). Den isolerede celle fortrænger et volumen elektrolyt mellem elektroderne, hvilket resulterer i et fald i strøm, der er proportional med cellens størrelse. Denne ændring i strømmen betegnes som ΔIC (3). Umiddelbart efter ΔIC-beregning administreres den forudbestemte, elektriske puls (4) til cellen i transit. Denne øjeblikkelige tilstrømning af energi introducerer en kort sansende artefakt i systemet (grå boks). Ved genlåsning på signalet, dvs. skift tilbage til celleovervågning (5) er det tydeligt, at elektroporationspulsen gennemtrængte cellemembranen, da størrelsen af strømændringen på grund af cellens tilstedeværelse mellem elektrodesættet falder ved udgang (6). Forskellen i de to dråber i strøm på grund af cellens impedansstørrelse før / post elektroporationspulsapplikation kaldes permeabiliseringsstrømmen og betegnes som ΔIP. Når cellen forlader volumenet mellem elektroderne, stabiliseres basislinjen, og systemet vender tilbage til celledetekteringstilstand (1). Efter at et forudbestemt antal celler er elektroporeret, testes den næsthøjeste energielektroporationspuls (se tabel 1 for pulsindstillinger). For hver testet elektroporationspuls bestemmes en gennemsnitlig 'grad af membranpermeabilisering'. Denne værdi beregnes som Δ IP/ΔIC. Når hver forudbestemt elektroporationspuls er testet, afbildes Δ IP/ΔIC mod den påførte elektriske energitæthed (σ x E 2 x t), hvor σ er opløsningens ledningsevne (S/cm), E er den elektriske feltstyrke (kV/cm), og t er pulsvarigheden (ms). Se figur 5 for kortet over cellemembranpermeabilisering for HEK293-celler, der er brugt i dette eksempel.
Tabel 1: Parametre for elektroporationspuls. Til denne undersøgelse blev elektroporationsimpulser valgt således, at ladningsfluxen (σ×E×t) forbliver konstant, hvor σ er opløsningens ledningsevne (S / cm), E er den elektriske feltstyrke (kV / cm) og t er pulsvarigheden (ms). Resultatet er et spektrum af den påførte puls elektriske energi. Eksempler på den krævede arbejdscyklus (dc) for at opnå de specificerede pulsparametre gives for både en stigning på 5× og 10× i den indledende (enkeltcelledetektion) strømningshastighed. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 4: Enkeltcellemembranpermeabilisering - Algoritmeoperation. (Til toppen) Elektrisk registrering af en række enkeltcelledetektioner / pulsapplikationer (angivet med de skarpe spidser i strøm). (Nederst) Systemdrift til påvisning og pulsering af en enkelt celle. (1) Systemet registrerer løbende en ændring i strømmen via en punkt-for-punkt hældningsberegning. (2) Der påvises et kraftigt fald i hældningen, hvilket tyder på, at en celle kommer ind mellem elektroderne, og udløser den computerstyrede pulsapplikation. (3) Et strømfald (ΔIC) bestemmes og er proportionalt med cellens størrelse. (4) Elektroporationspulsen påføres cellen i transit, hvilket forårsager en sensorartefakt i det elektriske signal (grå boks). (5) Låseforstærkeren skifter tilbage til celleovervågning, når den låses ind i cellen igen i transit. (6) Cellen forlader elektrodesættet og forårsager en anden, mindre størrelsesstigning i strøm (Δ IC > (I 6 - I5)). Forskellen i impedansmålingerne skyldes poredannelse gennem den isolerede cellemembran. Denne ændring i strøm kaldes permeabiliseringsstrømmen (ΔIP). Graden af cellemembranpermeabilisering beregnes (Δ IP / ΔIC). Basislinjen stabiliseres, og systemet vender tilbage til detektionstilstand (1). Klik her for at se en større version af denne figur.
En tydelig sammenhæng observeres mellem den påførte elektriske energi og graden af cellemembranpermeabilisering (figur 5) med eksistensen af et overgangsområde, hvor der forekommer en betydelig stigning i graden af cellemembranpermeabilisering. Til dette formål vælges en puls med elektrisk energi, der overgår denne overgangsregion, til højkapacitetsfasen af mikroelektroporationsprocessen (figur 6). I dette forsøg blev pulsen på 1,8 kV/cm: 670 μs bestemt som 'optimal'. Som beskrevet detaljeret i protokollens underafsnit 10.3 øges systemets strømningshastighed, og funktionsgeneratoren indstilles til kontinuerligt at udsende en puls med en indstillet puls og driftscyklus (se tabel 1 for pulsindstillinger for 1,5 μL/min og 3,0 μL/min strømningshastigheder) for at sikre, at der påføres 1 puls på hver celle i transit. I denne undersøgelse blev strømningshastigheden øget med 5x, således blev pulsbredden indstillet til 50 ms (svarende til celletransittiden) ved en arbejdscyklus (DC) på 2,7%.
Figur 5: HEK293 cellemembranpermeabiliseringskortlægning -Δ Ip / ΔIc versus elektrisk energi. De elektriske data (Δ IP/ ΔIC) er repræsenteret som middelværdien ± SEM. Pulsforhold (fra venstre mod højre)- 0,4 kV/cm: 3 ms, 0,8 kV/cm: 1,5 ms, 1,0 kV/cm: 1,2 ms, 1,2 kV/cm: 1 ms, 1,8 kV/cm: 0,67 ms, 2,4 kV/cm: 0,5 ms. En klar sammenhæng observeres mellem graden af cellemembranpermeabilisering og den elektriske energitæthed af den påførte puls. Til denne forsøgsrunde blev pulseringstilstanden på 1,8 kV/cm: 0,67 ms valgt som den 'optimale' elektroporationspuls til modulet med høj kapacitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Cellepopulationsbaseret feedback-styret elektroporation-proces workflow. For at starte programmeres en indledende strømningshastighed (Q0) for at muliggøre elektrisk forhør på enkeltcelleniveau. Et programmerbart antal celler pulseres ved hver forudbestemt elektroporationspulseringsbetingelser (E 0/t0 til E N/tN), hvor den påførte elektriske energi øges med hver iteration af elektroporationspulsapplikationer. Efter afslutningen af den højeste elektriske energipuls, der er inkluderet i undersøgelsen, EN / tN, afbildes cellemembranpermeabiliseringskurven, og den optimale elektroporationspuls bestemmes for den cellepopulation, der testes. Systemet fortsætter til high-throughput-tilstand, hvor strømningshastigheden øges tilQ-gennemstrømning, og de hastighedsbegrænsende enkeltcelleforhørstrin udelades. Det optimale pulstog vil kontinuerligt blive anvendt E opt / topt ved d.c.opt, således at hver celle i transit modtager en enkelt elektroporationspuls baseret på celletransittiden og pulsbreddedriftscyklussen (DC). Klik her for at se en større version af denne figur.
Efter 24 timers genopretning efter elektroporation blev cellerne afbildet for at bestemme elektrotransfektionseffektiviteten (eTE). Som beskrevet i underafsnit 11.2 i protokollen blev eTE bestemt som det samlede antal celler, der udtrykker GFP normaliseret til det samlede antal celler farvet med DRAQ5. eTE for 1,8 kV/cm: 670 μs puls blev bestemt til at være ~70% (figur 7A). For at fremhæve systemets betydning for nøjagtigt at kortlægge graden af cellemembranpermeabilisering og vælge en tilstrækkelig høj elektroporationspulsenergi ved overgang til højkapacitetstilstand, blev 0,4 kV / cm: 3 ms pulstilstand også undersøgt med hensyn til eTE (figur 7B). I dette tilfælde var den resulterende eTE efter 24 timer mindre end 5%.
Figur 7: elektrotransfektionseffektivitet-GFP-ekspression ved 24 timer. HEK293-celler blev inkuberet ved 37 °C i 24 timer efter mikroelektroporationsforsøg. Alle celler blev farvet med DRAQ5 (rød), og elektrotransfektionseffektiviteten (eTE) blev bestemt ud fra forholdet mellem celler, der udtrykker GFP (grøn) og det samlede celleantal (rødt). Cellelevedygtighed blev ikke vurderet som en resultatmåling i denne undersøgelse. (A) Repræsentativt, stablet 4× fluorescensbillede af HEK293-celler, der med succes transficeres via en 1,8 kV / cm: 670 μs puls, der viser eTE på ca. 70%. (B) Repræsentativt, stablet 4× fluorescensbillede af HEK293-celler, der uden held transficeres via en 0,4 kV/cm: 3 ms puls, der viser eTE << 5%. Skala bar: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: 2-dimensionel CAD-skematisk. Mikroelektroporationsanordningen består af en lige, 100 μm bred mikrokanal med et indløb på 1 mm i diameter og et udløb med en diameter på 3 mm. Hvert elektrodespor er 100 μm bredt, og elektrodesættet omfatter enhedens elektroporationsområde, som er 300 μm langt. Den 3-dimensionelle højde af mikrokanalen styres af tykkelsen af fotoresisten. I dette arbejde var enhedens højde 20 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden, der præsenteres inden for denne protokol, fokuserer primært på mikrofabrikation af en mikrofluidisk enhed, der derefter integreres i en specialiseret elektroporationseksperimentel opsætning. Udtrykket 'opskrift', som ofte bruges, når man beskriver detaljerne i mikrofabrikationsprocessen, antyder vigtigheden af at følge / optimere hvert trin for at kunne fremstille en fungerende enhed. Imidlertid kan visse kritiske trin i processen, når de ikke er optimeret, såsom UV-eksponeringstid / energi, PVD-forstøvningshastigheder / varigheder og iltplasmageneratorindstillinger, være problematiske for både fremstillingsprocessen såvel som den vellykkede udførelse af elektroporationseksperimenterne. Fejlfinding af fabrikationsprocessen udføres primært via forsøg og fejl eller et mere kontrolleret design af eksperimenter eksperimentelt design. Derudover er der alternative mikrofabrikationsteknikker, såsom Deep Reactive Ion Etching (DRIE), der kan erstattes for at udføre de forskellige trin i protokollen (dvs. ved hjælp af en DRIE ætset støbestruktur til at udføre den bløde litografiproces). Desuden kan optimering af opskrifter og design / fremstilling af enheder være tidskrævende for nybegyndere i marken. Men når mikrofabrikationsprocessen er blevet udviklet med succes, har ingeniøren / forskeren friheden til at designe en enhed, der passer til deres specifikke behov.
Til dette formål blev den enhed, der er beskrevet i denne protokol, udviklet til at udvide vores tidligere arbejde32. Dette indebar udnyttelse af den encellede membranpermeabilisering elektriske detektion, men på en højere gennemstrømningsmåde. Den eksperimentelle opsætning, der er beskrevet inden for, kræver behov for specialudstyr, dvs. indlåsningsforstærker, der kan være ualmindeligt for standardforskningslaboratoriet og dermed begrænse den potentielle rækkevidde og tilpasningsevne af denne teknik. Imidlertid kan en 'bare-bones' mikrofluidisk elektroporationsanordning implementeres efter denne protokol, hvilket kun kræver en funktionsgenerator og muligvis en spændingsforstærker til at generere elektroporationsimpulserne.
Ikke desto mindre adskiller denne mikroelektroporationsplatform sig fra andre enkeltcellede elektroporationsteknologier. Evnen til både elektrisk at detektere og optimere elektroporationsparametre på en enkeltcellesuspension i et kontinuerligt flowmiljø er virkelig innovativ. Fremtidigt arbejde indebærer optimering af de andre vigtige eksperimentelle parametre relateret til vellykkede elektroporationsresultater (se figur 1) for yderligere at forbedre den samlede effektivitet af denne platform. Yderligere levedygtigheds- og metaboliske assays vil blive udviklet og implementeret for at vurdere eventuelle potentielle negative nedstrømseffekter forbundet med mikroelektroporationsplatformen. Desuden kan det mikrofluidiske design fortsætte med at blive forbedret for at opnå højere cellulær gennemstrømning, som det er blevet demonstreret af andre grupper40. Efter at have behandlet disse bekymringer har denne teknologi potentialet til at blive vedtaget i fremstillingsprocessen for celleterapi for at udføre genlevering og / eller genredigering, da denne metode er meget modtagelig for både en lukket og automatiseret proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende økonomisk støtte fra National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) og US Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) til finansiering af kandidatstuderende JJS på stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
| 24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
| 33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
| 4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
| AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
| Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
| CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
| CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
| Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
| Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
| Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
| Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
| DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
| E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
| Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
| EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
| FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
| Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
| Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
| HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
| HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
| IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
| L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
| MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
| Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
| Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
| Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
| National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
| Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
| PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
| Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
| Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
| PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
| PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
| PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
| SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
| SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
| SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
| Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
| Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
References
- Gao, Q. Q., et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).
- Aijaz, A., et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).
- Milone, M. C., O'Doherty, U.
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A.
- Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).
- Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. Gene electrotransfer: A mechanistic perspective. Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).
- Clauss, J., et al. Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors. Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).
- Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Scientific Reports. 10 (1), 3053 (2020).
- Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. A microfluidic electroporation device for cell lysis. Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).
- Kar, S., et al. Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects. Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).
- Shi, J. F., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
- Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells. Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).
- Wei, W. J., et al. An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo. Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).
- Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Wu, Q. R., et al. Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects. Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).
- Pandey, C. M., et al.
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
- Nuxoll, E.
- Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode. Scientific Reports. 5, (2015).
- Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).
- Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G.
- Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).
- Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation. Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).
- Hsi, P., et al. Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing. Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).
- Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control. Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).
- Ye, Y. F., et al. Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip. 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).
- Huang, Y., Rubinsky, B. Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization. Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).
- Guo, X. L., Zhu, R. Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array. Scientific Reports. 6, (2016).
- Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Wang, H. Y., Lu, C. Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply. Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).
- Zheng, M. D., et al. Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation. Technology. 5 (1), 31-41 (2017).
- Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. In vitro electroporation detection methods - An overview. Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).
- MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf (2021).
- SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf (2001).
- Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf (2021).
- Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , Elsevier. 91-94 (2006).
- Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules. Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).
- PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf (2021).
- Lissandrello, C. A., et al. High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing. Scientific Reports. 10 (1), 18045 (2020).
