Summary
Detta protokoll beskriver de mikrofabrikationstekniker som krävs för att bygga en lab-on-a-chip, mikrofluidisk elektroporationsanordning. Den experimentella installationen utför kontrollerade transfektioner på encellsnivå i ett kontinuerligt flöde och kan utökas till högre genomströmningar med populationsbaserad kontroll. En analys tillhandahålls som visar förmågan att elektriskt övervaka graden av cellmembranpermeabilisering i realtid.
Abstract
Nuvarande terapeutiska innovationer, såsom CAR-T-cellterapi, är starkt beroende av virusmedierad genleverans. Även om den är effektiv åtföljs denna teknik av höga tillverkningskostnader, vilket har medfört ett intresse för att använda alternativa metoder för genleverans. Elektroporering är ett elektrofysiskt, icke-viralt tillvägagångssätt för intracellulär leverans av gener och andra exogena material. Vid applicering av ett elektriskt fält tillåter cellmembranet tillfälligt molekylär leverans in i cellen. Typiskt utförs elektroporering på makroskalan för att bearbeta ett stort antal celler. Detta tillvägagångssätt kräver dock omfattande empirisk protokollutveckling, vilket är kostsamt när man arbetar med primära och svårtransfekta celltyper. Lång protokollutveckling, i kombination med kravet på stora spänningar för att uppnå tillräckliga elektriska fältstyrkor för att permeabilisera cellerna, har lett till utvecklingen av elektroporeringsanordningar i mikroskala. Dessa mikroelektroporeringsanordningar tillverkas med vanliga mikrofabrikationstekniker och möjliggör större experimentell kontroll med potential att upprätthålla hög genomströmningskapacitet. Detta arbete bygger på en mikrofluidisk-elektroporeringsteknik som kan detektera nivån av cellmembranpermeabilisering på en encellsnivå under kontinuerligt flöde. Denna teknik var dock begränsad till 4 celler som bearbetades per sekund, och därför föreslås och presenteras ett nytt tillvägagångssätt för att öka systemets genomströmning här. Denna nya teknik, betecknad som cellpopulationsbaserad återkopplingskontroll, tar hänsyn till cellpermeabiliseringssvaret på en mängd olika elektroporationspulserande förhållanden och bestämmer de bäst lämpade elektroporationspulsförhållandena för celltypen som testas. Ett högre genomströmningsläge används sedan, där denna "optimala" puls appliceras på cellsuspensionen under transport. Stegen för att tillverka enheten, ställa in och köra mikrofluidiska experiment och analysera resultaten presenteras i detalj. Slutligen demonstreras denna mikroelektroporeringsteknik genom att leverera en DNA-plasmid som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP) till HEK293-celler.
Introduction
Nuvarande terapeutiska innovationer inom biomedicinsk forskning, såsom CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T-cell) cellterapi och genetisk redigering med CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, förlitar sig starkt på förmågan att leverera exogent material både framgångsrikt och effektivt till det intracellulära utrymmet1. I CAR-T-terapi använder guldstandarden för att utföra genleveranssteget i cellterapitillverkning virala vektorer2. Även om virusmedierad genleverans är en effektiv leveransmodalitet, har den också flera nackdelar. Dessa inkluderar tillverkningskostnader, cytotoxicitet, immunogenicitet, mutagenes / tumorigenespotential och storleksbegränsningar för genen (erna) som ska levereras3. Dessa begränsningar har lett till forskning och utveckling av alternativ, icke-viral leveransteknik.
Elektroporering, ett alternativ till virusmedierad genleverans, förlitar sig på tillämpningen av en optimal elektrisk pulsvågform för att utföra DNA-, RNA- och proteintransfektioner av celler. Efter appliceringen av ett externt elektriskt fält äventyras cellmembranet kort, vilket gör cellen mottaglig för intracellulär leverans av annars ogenomträngliga exogena material4. Jämfört med virusmedierad leverans är elektroporering fördelaktigt eftersom det i allmänhet är säkert, enkelt att använda och har låga driftskostnader. Elektroporering kan leverera både liten och stor molekylär last och kan vara effektiv vid transfektering av celler oavsett härstamning5. För att uppnå önskvärda resultat efter elektroporering, dvs. god livskraft och god elektrotransfektionseffektivitet, måste en mängd olika experimentella parametrar samoptimeras. Dessa inkluderar celltyp6, celltäthet, molekylkoncentration7, elektroporationsbuffertegenskaper (t.ex. molekylär sammansättning, konduktivitet och osmolaritet)8, elektrodstorlek / geometri9 och elektrisk pulsvågform (form, polaritet, antal pulser)10 (se figur 1 för en illustration). Även om var och en av dessa parametrar kan ha en signifikant effekt på resultaten av elektroporationsexperiment, har pulsvågform studerats särskilt i detalj, eftersom den elektriska energin hos den applicerade pulsen (erna) är roten till den inneboende avvägningen mellan den resulterande cellviabiliteten och elektrotransfektionseffektiviteten8.
Typiskt utförs elektroporationsexperiment på makroskalan, där celler suspenderas i 100-tals mikroliter buffert mellan en uppsättning stora parallellplattelektroder i en elektroporationskuvett. Elektroderna tillverkas vanligtvis av aluminium med ett elektrodavstånd på 1-4 mm. När cellerna har laddats manuellt via pipett är kyvetten elektriskt ansluten till en skrymmande, elektrisk pulsgenerator där användaren kan ställa in och tillämpa pulsvågformsparametrarna för att elektropolera cellsuspensionen. Även om makroskala eller bulkelektroporering kan bearbeta celldensiteter > 106 celler / ml, kan den här funktionen vara slösaktig när du optimerar inställningarna för elektrisk pulsvågform. Detta är särskilt oroande vid elektroporering av primära celltyper där cellpopulationsnumren kan begränsas. Dessutom, på grund av det stora avståndet mellan elektroderna, måste pulsgeneratorn kunna leverera stora spänningar för att uppnå elektriska fältstyrkor >1kV / cm11. Dessa höga spänningar orsakar resistiv effektavledning genom elektrolytbufferten vilket resulterar i Joule-uppvärmning, vilket kan vara skadligt för den resulterande cellviabiliteten12. Slutligen kommer utförande av elektroporering på en tät suspension av celler konsekvent att belastas med en medfödd variation i den resulterande elektrotransfektionseffektiviteten och cellviabiliteten. Varje cell i suspension kan uppleva en annan elektrisk fältstyrka på grund av de omgivande cellerna. Beroende på om den upplevda elektriska fältstyrkan antingen ökas eller minskas kan den resulterande cellviabiliteten eller elektrotransfektionseffektiviteten var och en påverkas negativt11. Dessa nackdelar med elektroporering i makroskala har lett till strävan efter och utveckling av alternativ teknik som fungerar på mikroskala och möjliggör bättre kontroll på encellsnivå.
Området BioMEMS, eller biomedicinska mikroelektromekaniska system, härrör från de tekniska framsteg som gjorts inom mikroelektronikindustrin. Specifikt att använda mikrofabrikationsprocesser för att utveckla mikroenheter för att främja biomedicinsk forskning. Dessa framsteg inkluderar utvecklingen av mikroelektrodmatriser för in vivo elektrisk övervakning 13, kapacitiva mikroelektroder för in situ-elektroporation14, miniatyriserade organ-on-a-chip-enheter 15, mikrofluidisk patientnära diagnostik 16, biosensorer 17 och läkemedelsleveranssystem 18, inklusive nano- och mikroelektroporationsanordningar 19,20,21 . På grund av förmågan att designa och tillverka enheter i samma storleksskala som biologiska celler är nano- och mikroelektroporationsteknik fördelaktig jämfört med deras makroskala motsvarighet22,23. Dessa elektroporationsanordningar eliminerar kravet på högspänningspulsapplikationer, eftersom elektroduppsättningar med avstånd på 10s till 100-tals mikrometer vanligtvis är integrerade. Denna funktion minskar drastiskt strömmen genom elektrolyten, vilket i sin tur minskar ackumuleringen av giftiga elektrolysprodukter och effekterna av Joule-uppvärmning i dessa system. Kanalerna i mikroskala säkerställer också att ett mycket mer enhetligt elektriskt fält appliceras tillförlitligt på cellerna under pulsapplikation, vilket resulterar i mer konsekventa resultat24. Dessutom är det också vanligt att mikroelektroporeringsanordningar integreras i en mikrofluidisk plattform som lämpar sig för framtida integration i en helautomatisk teknik, en mycket önskvärd kapacitet inom cellterapitillverkning25. Slutligen möjliggör elektroporering i mikroskala elektrisk förhör av elektroporationshändelser. Till exempel kan graden av cellmembranpermeabilisering övervakas i realtid vid en enda cellnivå26,27. Syftet med denna metod är att beskriva mikrofabrikation, systemdrift och analys av en mikrofluidisk, encellig mikroelektroporationsanordning som kan mäta graden av cellmembranpermeabilisering för optimering av elektroporationsprotokoll, men ändå öka genomströmningen jämfört med den tidigare state-of-the-art.
Att utföra elektroporering på encellsnivå är inte längre en ny teknik, som det först demonstrerades av Rubinsky et al. 2001 med utvecklingen av en statisk cellelektroporationsteknik28. Deras mikroenhet var innovativ eftersom de var de första som demonstrerade förmågan att elektriskt övervaka händelsen av elektroporation. Detta har ytterligare lett till utvecklingen av statiska, encelliga elektroporationstekniker som kan elektriskt detektera graden av cellmembranpermeabilisering på ett parallelliserat sätt för att öka enheternas genomströmning. Men även med parallellisering och batchbearbetning saknar dessa enheter allvarligt det totala antalet celler de kan bearbeta per tidsenhet29,30. Denna begränsning har lett till utvecklingen av genomströmningsanordningar som kan utföra mikroelektroporering på encellsnivå vid mycket större genomströmningar31. Denna enhetsövergång, från statisk till genomströmningsmiljö, begränsar förmågan att elektriskt övervaka graden av cellmembranpermeabilisering efter appliceringen av elektroporationspulsen. Metoden som beskrivs i detta arbete överbryggar klyftan mellan dessa två tekniker, en mikroelektroporeringsteknik som kan elektriskt detektera, pulsera och övervaka graden av cellmembranpermeabilisering av enskilda celler, på ett kontinuerligt flöde, seriellt sätt.
Denna teknik beskrevs nyligen i Zheng et al. I det arbetet introducerades funktionerna i denna teknik med slutförandet av en parametrisk studie, där både amplituden och varaktigheten av elektroporationspulsen varierade, och den efterföljande elektriska signalen, som indikerar cellmembranpermeabilisering, undersöktes32. Resultaten visade att en ökning av intensiteten hos elektroporationspulsen (dvs. ökning av applicerat elektriskt fält eller ökning av pulsvaraktigheten) orsakade en ökning av den uppmätta cellmembranpermeabiliseringen. För att ytterligare validera systemet tillsattes en gemensam fluorescerande indikator för framgångsrik elektroporering, propidiumjodid33, till cellsuspensionen och en fluorescensbild fångades omedelbart efter appliceringen av den elektriska pulsen. Den optiska signalen, dvs fluorescensintensiteten hos propidiumjodid inuti cellen, var starkt korrelerad med den elektriska mätningen av graden av cellmembranpermeabilisering, vilket verifierade tillförlitligheten hos denna elektriska mätning. Detta arbete övervägde emellertid endast leveransen av den lilla molekylen propidiumjodid, som har liten eller ingen översättningsbar betydelse.
I detta arbete introduceras en ny tillämpning av denna teknik för att förbättra systemets genomströmning samtidigt som man levererar en biologiskt aktiv plasmid-DNA (pDNA) -vektor och bedömer elektrotransfektionseffektiviteten hos celler som replateras och odlas efter elektroporering. Även om det tidigare arbetet överträffar befintliga mikroelektroporeringstekniker som kan mäta händelsen av elektroporering elektriskt, kräver enhetens nuvarande tillstånd fortfarande långa celltransittider mellan elektroduppsättningen (~ 250 ms) för att utföra celldetektering, pulsapplikation och cellmembranpermeabiliseringsmätning. Med en enda kanal begränsar detta dataflödet till 4 celler/s. För att bekämpa denna begränsning introduceras ett nytt koncept för cellpopulationsbaserad återkopplingsstyrd elektroporering för att utföra pDNA-elektrotransfektion. Genom att använda en hypofysiologisk konduktivitetselektroporationsbuffert möjliggör detta system elektrisk förhör av enskilda celler över en mängd elektroporationspulsapplikationer. Baserat på det elektriska svaret bestäms sedan en "optimal" elektroporationspuls. Ett "högkapacitetsläge" implementeras sedan där cellmembranets permeabiliseringsbestämning upphävs, flödeshastigheten ökas och elektroporationspulsens arbetscykel matchas med celltransittiden för att säkerställa en puls per cell i transit mellan elektroderna. Detta arbete kommer att ge omfattande detaljer om mikrofabrikationsstegen för tillverkning av mikroenheten, materialet / utrustningen och deras inställning som krävs för att utföra experimentet och driften / analysen av enheten och dess elektrotransfektionseffektivitet (eTE).
Figur 1: Experimentella faktorer som påverkar elektroporationsresultaten. (Vänster) Cellsuspension-Viktiga faktorer att tänka på innan elektroporationen börjar inkluderar: Nyttolast (i detta fall pDNA), koncentration, celltäthet och elektroporationsbuffertegenskaper. Elektroporationsbuffertegenskaper att tänka på är konduktivitet, osmolaritet och den exakta molekylära sammansättningen som bidrar till dessa värden. (Mitten) Pulsapplikation - Den exakta pulstypen (fyrkantig våg kontra exponentiellt sönderfall) och pulsvågform (enkelpuls kontra pulståg) måste optimeras för att maximera både den resulterande cellviabiliteten och elektrotransfektionseffektiviteten. Vanliga pulståg som implementeras i elektroporationsprocesser består vanligtvis av en serie högspänningspulser (HV) eller serier av pulser som roterar mellan HV och lågspänningspuls (LV). (Höger) Cell recovery-Down-stream bearbetningssteg, i synnerhet återhämtningscellodlingsmediet som celler överförs till, bör optimeras. Ej presenterad (längst till vänster) kan ytterligare uppströms cellbearbetningssteg implementeras för övergripande optimering av elektroporeringsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användare bör granska alla säkerhetsdatablad för material och förnödenheter som används i detta protokoll. Lämplig personlig skyddsutrustning ska bäras vid varje steg och steril teknik ska användas under experiment. Avsnitt 1-7 diskuterar enhetstillverkningen.
1. Enhetstillverkning - Maskdesign
OBS: Se figur 2 för en illustration av mikrofabrikationsprocessen. Mikrofabrikationsstegen ska utföras i renrumsmiljö. Ytterligare personlig skyddsutrustning är nödvändig (hårnät, ansiktshårnät, mask, renrumsdräkt, skoskydd).
- Installera en CAD-programvara som du väljer, designa en 2-dimensionell "mask" av både mikrofluidikkanalen och elektroderna och spara designen i önskat filformat (dvs. .dxf, .dwg).
OBS: Se kompletterande figur 1 för ett exempel på ett 2-dimensionellt maskschema. - Skicka till valfri leverantör för utskrift. Se till att designens dimensioner ligger inom leverantörens upplösningsförmåga.
2. Enhetstillverkning - Fotolitografi
OBS: De tillhandahållna mikrofabriceringsrecepten är antagna från fotoresisternas tillverkares rekommendationer och bör endast användas som utgångspunkt34. Exakta värden för bakningstider, exponeringstider etc. måste optimeras för varje tillverkningsprotokoll. Det rekommenderas att använda wafer pincett för hantering av både kiselskivor och glasskivor.
- Mikrofluidisk kanaltillverkning
- Rengöring av kiselskiva och sodakalkglasskiva: Följ stegen 2.1.2-2.1.3 för att utföra rengöring av kiselskiva och 1 "× 3" sodakalkglasskiva (båda kallade" substrat ").
- Sänk ner substraten i ett acetonbad, ett isopropanolbad (IPA) och ett avjoniserat vattenbad i 10 minuter vardera. Utför denna 3-stegs tvätt seriellt vid rumstemperatur.
- Ta bort och torka ytan med en trycksatt kväve eller filtrerad luftgaskälla. Placera underlaget i en ugn på 150 °C i minst 30 minuter för att möjliggöra avdunstning av återstående fukt.
- SU-8-fotolitografi på kiselskiva: Utför fotolitografi på kiselskivan genom att följa stegen 2.1.5-2.1.14.
OBS: För att uppnå en mikrofluidisk kanalhöjd på 20 μm användes SU-8 2000-seriens negativa fotoresist. Exakta snurrhastigheter varierar beroende på formuleringen av SU-8 (dvs. 2010, 2015, etc.); Följande villkor är dock för SU-8 2010 formulering35. - Ta ut kiselskivan ur ugnen på 150 °C och låt den svalna till rumstemperatur (RT).
- Fäst skivan i chucken på wafer spin coater med hjälp av spinnbeläggningens vakuumsystem. Programmera spinnaren. Steg 1 - 500 rpm i 10 s vid en acceleration av 100 rpm / s, Steg 2 - 1000 rpm i 30 s vid en acceleration av 300 rpm / s.
- Dispensera 4 ml SU-8 2010 fotoresist på mitten av kiselskivan. Kör programmet. När systemet stannar, stäng av vakuumet.
- Överför den SU-8-belagda kiselskivan med pincett på en värmeplatta vid 95 °C i 4-5 minuter för mjuk bakning. Ta sedan bort skivan från kokplattan och låt den svalna till RT.
OBS: Följ rätt startprocedur för den laboratoriespecifika fotolitografiska maskjusteraren. - Säkra fotomasken med 2D-mikrofluidiska kanaldesigner på maskhållaren. Sätt i kiselskivan, med SU-8-beläggningen uppåt, på skivchucken.
- Ställ in exponeringsinställningarna för 150 mJ/cm2 och kör maskinen.
VARNING: Titta inte direkt på UV-ljuskällan för att undvika potentiella ögonskador. - Placera den SU-8-belagda kiselskivan på en kokplatta vid 95 ° C i 4-5 minuter för bakning efter exponering.
- Sänk ner kiselskivan i SU-8-utvecklarlösningen (se materialtabell) i 3-4 minuter. Applicera mild agitation. Ta bort skivan från lösningen och skölj ytan med IPA.
- Torka ytan med en trycksatt kväve eller filtrerad luftgaskälla. Inspektera funktionerna under ett mikroskop med hjälp av ett UV-filter och se till att inga uppenbara defekter i de mikrofluidiska kanalerna.
- Placera kiselskivan i en ugn på 150 °C i minst 30 minuter för en hård bakning.
- Låt svalna till RT och använd stylusprofilometri för att mäta den exakta höjden och lutningen på kanalens sidoväggar.
- Fotolitografi på glasskivor
OBS: Hexametyldisilazan (HMDS) används som adhesionspromotor för S1818 positiv fotoresist36.- Ta ut glasskivan från ugnen på 150 °C och låt den svalna till RT.
- Fäst glasskivan i spinnarens chuck med vakuum och programmera spinnaren. Steg 1 - 500 rpm i 10 s vid en acceleration av 100 rpm / s. Steg 2 - 3000 rpm för 30 satt en acceleration på 300 rpm/s.
- Fördela 3-4 droppar HMDS över ytan på glasskivan. Kör programmet.
OBS: För att uppnå en ytbeläggning på ~ 3 μm bör S1800 positiv fotoresistserie användas. Exakta spinnhastigheter varierar beroende på formuleringen; Rekommendationerna nedan gäller för S1818 formulering34. - Fördela 1 ml fotoresist på ytan av glasskivan. Se till att det täcker ytan.
- Kör programmet. När systemet har stannat, stäng av vakuumet och ta bort glasskivan.
- Placera den S1818-belagda glasskivan på en kokplatta vid 120 °C i 4 minuter för en mjuk bakning. Ta bort och låt komma till RT.
- Säkra fotomasken med 2D-elektroddesignerna på maskhållaren.
- Sätt i och rikta in glasskivan, med S1818-beläggningen uppåt, på waferchucken. Ställ in exponeringsinställningarna för 250 mJ/cm2 och kör maskinen.
OBS: Olika kontaktjusteringsmodeller kan vara mer eller mindre tillmötesgående för icke-cirkulära substrat med varierande tjocklek. - Sänk ner glasskivan i MF-319 utvecklarlösning i 2 minuter. Applicera mild agitation. Skölj ytan på glasskivan med avjoniserat vatten.
- Torka ytan med en trycksatt kväve- eller filtrerad luftgaskälla och observera funktionerna under ett mikroskop med hjälp av ett UV-filter. Se till att det inte finns några uppenbara defekter i de litografiska mönstren.
- Placera glasskivan i ugnen på 150 °C, så att underlagets yta av intresse är vänd uppåt, i minst 30 minuter för en hård bakning. Ta ut ur ugnen och håll den skyddad mot ljus.
3. Tillverkning av apparater: Fluorvätesyra (HF) etsning
VARNING: Detta steg innebär hantering och bortskaffande av fluorvätesyra (HF), vilket kan orsaka djupa, smärtsamma kemiska brännskador. Ytterligare personlig skyddsutrustning ska användas för att skydda hanteraren (ansiktsskydd, kemiskt resistenta handskar i armbågslängd, kemiskt resistent förkläde med ärmar). Kalciumglukonatsyraneutralisator och hudgel bör hållas i närheten av labbbänken. Detta steg bör inte utföras ensamt. HF ska aldrig förvaras i eller dispenseras i glasbehållare eftersom behållaren etsas av syran.
OBS: HF etsar enhetligt det exponerade glaset (dvs. elektroddesignen) för att bilda ett urtag i glaset, vilket möjliggör bättre kantupplösning av elektrodmönstret efter metallavsättning (avsnitt 4).
- Sänk ner glasskivan i 10:1 buffrad HF-lösning i 1 min i en behållare av polytetrafluoretylen. Överför och tvätta glasskivorna i avjoniserat vatten. Upprepa tvättsteget 3 gånger.
- Torka ytan med en trycksatt kväve eller filtrerad luftgaskälla. Placera glasunderlag i en ugn på 65 °C över natten för att avlägsna eventuell kvarvarande fukt. Täck underlagen från ljus.
4. Enhetstillverkning: Fysisk ångavsättning
OBS: Detta steg involverar metallavsättningen på glasskivans underlag för att definiera elektrodmönstren. Vanliga metallelektroder är krom / guld och titan / platina. Guld och platina fäster inte vid glassubstratet, så ett frövidhäftningsskikt av krom respektive titan krävs för att främja vidhäftning37.
- Följ det renrumsspecifika protokollet för att använda det interna PVD-systemet. Detta arbete använder ett DC-förstoftningssystem och sputter med 100 SCCM argongas vid ett tryck på ~ 8 mTorr och 200 W effekt.
- Spruta titan i 8 min med en hastighet av ~100 Å/min. Spruta platina i 10 min med en hastighet av ~200 Å/min. Ta bort underlagen från PVD-kammaren.
5. Enhetstillverkning: Photoresist lyftning
OBS: Detta steg innebär att man löser upp fotoresistskiktet i ett acetonbad och lämnar de vidhäftade platinaelektroderna mönstrade på glasskivorna.
- Sänk ner de metallbelagda glasskivorna i ett acetonbad i ~10 min.
- Sonicate badet för att införa agitation för att bryta upp den osammanhängande metallfilmen. Använd en acetonindränkt torkduk för att ta bort eventuella rester om det behövs.
- När all fotoresist/metall har tagits bort, tvätta elektrodmönstren med avjoniserat vatten och placera dem i en ugn på 65 °C över natten för att avlägsna eventuell kvarvarande ytfuktighet.
- Använd stylusprofilometri för att mäta profilen för de mönstrade elektroderna.
6. Enhetstillverkning: Mjuk litografi
OBS: Detta steg innebär replikformning av mikrofluidikkanalen på SU-8-huvudavlastningsstrukturen med hjälp av en elastomer, polydimetylsiloxan (PDMS).
- Silanisering av kiselskiva
OBS: Detta är ett valfritt steg; Det kommer dock att öka livslängden för SU-8-lättnadsstrukturen som tillverkades i underavsnitt 2.1. Detta steg bör utföras i en kemisk rökhuv.- Fäst skivan i botten av en petriskål och lägg petriskålen i en exsickator.
- Omge kiselskivans omkrets med ca 50 μl triklor(1H,1H,2H,2H-perfluoroktyl) silan. Anslut vakuum (vakuumpump eller husvakuumledning) och kör i 20 minuter.
- PDMS replika gjutning
- I en engångsbehållare (t.ex. vägbåt, plastkopp), blanda PDMS elastomerbas till härdare i ett viktförhållande på 10: 1 ovanpå en elektronisk balans. Häll PDMS-lösningen över kiselskivan och placera blandningen under vakuum för att ta bort alla luftbubblor.
- Härda vid 65 °C i minst 4 timmar så att PDMS stelnar. Skär ut det gjutna PDMS med spetsen på ett rakblad och skala från kiselskivan.
- Använd en vässad biopsistans och ta bort PDMS från enhetens inlopp / uttag. För denna anordning användes 0,75 mm och 3 mm biopsistansar för inloppen respektive utloppen.
OBS: Biopsistansen som används bör ha en något mindre diameter än den yttre diametern på den sammankopplade slangen för att säkerställa en tät tätning av slangar i behållarna.
- Ultraljudsbehandling rengöring av PDMS
- Sänk ner PDMS-enheterna i IPA och placera dem i en sonicator i 30-45 minuter för att ta bort eventuellt PDMS-skräp från inloppet / uttagen. PDMS kan svälla i IPA-lösningen.
- Skölj med avjoniserat vatten och placera i en 65 °C ugn över natten så att PDMS kan svälla tillbaka till normal storlek.
OBS: Eventuellt kvarvarande skräp kan täppa till enheten under experiment. Stora bitar av skräp kan tas bort från PDMS-ytan med hjälp av en bit scotch tejp före ultraljudsbehandling.
7. Enhetstillverkning: PDMS-bindning / trådfäste
OBS: Detta steg innebär att behandla ytan på PDMS och glassubstratet med en syreplasma för att bilda en irreversibel bindning mellan PDMS och glas38. Receptet som tillhandahålls kan behöva anpassas till det exakta systemet som används i laboratoriet.
- Klipp enheterna i storlek och se till att PDMS-enhetens yta är ren. Om du inte rengör igen följer du stegen i avsnitt 6.3.
- Programmera plasmageneratorn. Ställ in effekten på 70 W, tid till 35 s, tryck till 325 mTorr, flödeshastighet för syrgas till 60 SCCM. Placera PDMS och elektrodglasskiva i systemet med funktionerna uppåt och kör programmet.
- Ta bort enheterna och justera snabbt kanalfunktionerna till elektroderna med hjälp av ett stereoskop. Applicera tryck ordentligt från mitten av PDMS mot sidorna för att ta bort oönskade luftbubblor vid bindningsgränssnittet.
- Placera på en varm plats vid 95 ° C i minst 2 minuter för att slutföra bindningsproceduren och låt enheten svalna vid RT.
- Skär 2 stycken 22-G solid tråd vid ~ 6 " längder och remsa isolatorn från båda ändarna.
- Bind ledningarna till elektrodkuddar med silverledande epoxi. Placera färdiga enheter i en ugn på 65 °C över natten.
Figur 2: Tillverkning av mikroenheter. (A) Mikrofluidisk kanaltillverkning - viktiga steg: rengöring av kiselskivor (steg 2.1.1-2.1.3), fotoresistbeläggning och mjukbakning (steg 2.1.7-2.1.8), UV-exponering (steg 2.1.10), utveckling (steg 2.1.12) och PDMS-hällning (underavsnitt 6.2). (B) Elektrodtillverkningsnyckelsteg: Rengöring av glasskiva (steg 2.1.1-2.1.3), HMDS-beläggning och fotoresistbeläggning (steg 2.2.3-2.2.4), UV-exponering (steg 2.2.8), utveckling (steg 2.2.9), HF-etsning (avsnitt 3), fysisk ångdeposition (avsnitt 4) och fotoresistlyftning (avsnitt 5). (C) Enhetens slutförande-nyckelsteg: Inlopps-/utloppsåtkomst och ultraljudsbehandling (steg 6.2.3 och avsnitt 6.3), PDMS-bindning och trådfäste (avsnitt 7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
8. Cellodling och skörd
OBS: Standardprocedurer för cellodling och steril hantering bör användas. Följ celltypsspecifikt protokoll för cellodling.
- Cellodling
- Cellpassage: Odla och passera cellerna enligt steg 8.1.2-8.1.5.
- Odla HEK293-celler i komplett DMEM-lösning (88% DMEM, 10% värmeinaktiverat fosterserum från nötkreatur, 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin) i en T25-kolv i en inkubator vid 37 ° C, 95% O2, 5% CO2. Passageceller enligt schema när man når ~ 80% sammanflöde.
- Aspirera mediet med antingen pipett eller vakuumsystem och inkubera cellerna i 0,25% trypsin-EDTA (2 ml-T25-kolv) i 2 minuter vid 37 °C. Neutralisera trypsin med dubbelt så stor volym kulturmedia.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera HEK293-celler vid 770 x g i 2 minuter. Aspirera supernatanten med antingen en pipett eller vakuumsystem
- Återsuspendera HEK293-celler i 1 ml förvärmd DMEM.
- Cellplätering: Plåta cellerna enligt steg 8.1.7-8.1.8
- Platta cellerna med en utspädning på 10:1 till 20:1 i en T25-kolv (5 ml DMEM) för att fortsätta odlingen.
- Plåta cellerna med en utspädning på 5:1 till 20:1 i en 6-brunnsplatta (2 ml DMEM per brunn) som ska skördas för elektroporationsexperiment.
OBS: HEK293-celler pläterade 24 timmar före elektroporationsexperiment för att uppnå ~ 70% sammanflöde vid cellskörd (underavsnitt 8.3). Ett inkonsekvent skördeschema kan leda till variationer i elektroporationsresultat.
- Elektroporering buffert
- Förbered elektroporeringsbuffert
OBS: Se Sherba et al. för detaljer om elektroporationsbuffertberedningen8. Buffertkompositionen var 285 mM sackaros, 0,7 mM MgCl2, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7,4; osmolalitet: 310 mOsm, konduktivitet: 500 μS/cm). Elektroporeringsbuffert ska formuleras på ett sterilt sätt och förvaras vid 4 °C under en hållbarhetstid på ~1 månad. Elektroporationsbuffertformuleringen bör optimeras per celltyp.
- Förbered elektroporeringsbuffert
- Cellskörd och pDNA-tillsats
- Följ samma steg som cellpassage (8.1.2-8.1.4).
- Tvätta cellerna i steril 1x PBS, överföringscellsuspension i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera cellerna vid 770 x g i 2 minuter.
- Tvätta HEK293 cellpellets i elektroporeringsbufferten och centrifugera vid 770 x g i 2 min. Återsuspendera cellerna i elektroporationsbufferten vid ~ 5 miljoner celler / ml.
OBS: Celldensiteten bör optimeras per celltyp. - Tillsätt pDNA-kodning för grönt fluorescerande protein (GFP) till en slutlig koncentration på 20 μg/ml. Blanda försiktigt pDNA/cellsuspensionen och överför suspensionen till en 1 cc spruta för experiment.
9. Hårdvara / experimentell installation
OBS: Innan du skördar celler för experiment, se till att den experimentella installationen är klar för att minimera den tid som cellerna är upphängda i elektroporationsbufferten. Slå på elektronik 20-30 min före experiment för att värma upp. Se figur 3 för ett schema över den experimentella installationen för driften av encellsdetekteringsmodulen.
OBS: En specialbyggd PA90 Op-Amp-krets utvecklades för att rymma både den känslighet som krävs för detektering av encellsnivå med hjälp av inlåsningsförstärkaren och de höga spänningar som krävs för att applicera tillräckligt starka elektroporationspulser. Se PA90-databladet för specifikationer om rekommenderade kretsar39.
- Initiera inlåsningsförstärkaren med aktuella förförstärkarinställningar och ställ in via algoritmen. Se Zheng et al. för detaljer om inlåsningsinställningarna32.
- Strömförsörjning, funktionsgenerator och förstärkare
- Strömförsörjning 1: Ställ in på -15 V för att driva kretsens negativa ände.
- Strömförsörjning 2 (funktionsgenerator): Ställ in på utgången av DC-signalen och ställ in amplituden på 2 V. Anslut till 50x förstärkaringång.
- Program Electroporation Pulse Generator för fyrkantsvågen: Ställ in önskad pulsbredd (arbetscykel) och önskad pulsamplitud (volt).
- Ställ in utgången i utlösningsläge (1 puls). Anslut utgången till ingången på 50x-förstärkaren.
OBS: Kom ihåg 50x förstärkningen när du programmerar pulsamplituden. Dvs för att uppnå en elektrisk fältstyrka på 1 kV/cm krävs totalt 30 V, 30 V/300 μm (avstånd mellan elektroder), därför bör funktionsgeneratorns utgång ställas in på 30/50 eller 600 mV. - Kontrollera utgångarna från 50x-förstärkaren med hjälp av ett oscilloskop. Utgång 1-100 V från strömförsörjning 2 (9.2.2). Utgång 2-variabel amplitud för elektroporationspulsen (9.2.4).
- Anslut en 10x sond till en oscilloskopkanal och till den färdiga mikroenheten (enhet som testas, DUT) i steg 7.6 där elektroporationspulsen ska appliceras. Övervaka systemet under experimentering för att säkerställa att pulser tillämpas.
- Se till att inlåsnings-USB är ansluten och registrerad. Dubbelkolla alla inlåsningsinställningar i algoritmkoden (viktigast av allt, inlåsningsutgångsfrekvens).
- Mikroskop/CCD-kamera
- Placera mikroenheten på mikroskopets scen via en glidhållare. Slå på CCD-kameran och sätt mikrofluidikkanalen i fokus. Använd ett 4x- eller 10x-mål.
Bild 3: Experimentell installation schematisk -Encellsidentifiering. Op-förstärkaren med hög effekt (PA-90) möjliggör superposition av högspänningselektroporationspulsen på den inlåsta utsignalen som krävs för encellsdetektering. Denna excitationssignal passerar genom mikroelektroporeringsanordningen (Device Under Test, DUT) där strömmen sedan förstärks av den aktuella förförstärkaren och matas in i algoritmen. Systemet övervakar kontinuerligt för celldetekteringshändelsen. Vid cellinträde genereras en digital signal av inlåsningsförstärkaren för att utlösa appliceringen av elektroporationspulsen på cellen /cellerna under transport. Legend: PA-90 (högeffektsförstärkare), DUT (enhet under test), DIO (digital ingång / utgång), FG-EP (funktionsgenerator / elektroporationspuls), 50X (50X förstärkare), PS-V- (strömförsörjning / negativ spänning för PA 90), FG-V + (funktionsgenerator, positiv spänning för PA 90). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
10. Experimentell drift
- Mikrofluidisk kanal priming
- Ta bort alla luftbubblor från den cellbelastade sprutan. Fäst en 30 G nål på den cellbelastade sprutan.
- Använd pincett och skjut tygonslangen ner längs nålens längd. Förfyll utloppsbehållaren med återvinningsmedia (samma som steg 8.1.2 utan antibiotika), ~ 40-50 μL.
- Använd tummen och tryck försiktigt på kolven så att vätskan långsamt når slangledningens ände.
- Fäst sprutan i sprutpumpen. Slå på sprutpumpen och se till att den är inställd på framåtriktad perfusion.
- Programmera pumpen för rätt diameter på sprutan för att säkerställa att flödeshastigheterna är korrekta. Se pumpmanualen för detaljer om sprutdiametrar.
OBS: För att förhindra att celler sätter sig i sprutan, säkra sprutpumpen på ett klämstativ så att den kan arbeta vertikalt med sprutänden nedåt. - Ställ in sprutpumpens flödeshastighet, ~ 10-20 μL / min, och låt pumpen gå tills vätskan når slangledningens ände. Säkra slangen till mikrofluidikanordningen.
- Sänk sprutpumpens flödeshastighet, ~ 5-10 μL / min, och låt pumpen gå tills all luft släpps ut från mikrofluidikanordningen och celler passerar till enhetens utlopp.
- Ta bort cellerna från utloppet via pipettaspiration. Fyll på utloppsbehållaren med återvinningsmedia (samma som steg 8.1.2 utan antibiotika), ~ 40-50 μL.
- Encells elektroporationscellmembranpermeabiliseringskartläggning
OBS: Se figur 4 och figur 5 för en bättre förståelse av de elektriska data som indikerar cellmembranpermeabilisering respektive cellmembranets permeabiliseringskartläggning.- Ställ in sprutpumpens flödeshastighet på ~ 0,1-0,3 μl / min för att säkerställa ett flöde av enstaka celler genom elektroduppsättningen. Celltransittiden mellan elektroderna bör vara ~ 250 ms.
- Starta datorprogrammet genom att klicka på Kör. Se till att systemet sparar elektriska data.
- Se till att systemet på ett tillförlitligt sätt upptäcker celler för att utlösa de datorstyrda pulsapplikationerna. Justera detekteringströskeln i enlighet med detta.
- Ställ in pulsparametrarna för den ursprungliga, lägsta elektriska energielektroporationspulsen. Se tabell 1 för elektroporationspulserande parametrar i denna studie.
- Slå på utgångskanalen för elektroporationspulsgeneratorn (steg 9.2.3.).
- Följ ett förutbestämt antal celldetektions-/pulsapplikationer (n = 100). I slutet av varje testat tillstånd, aspirera celler från mikroenhetsutloppet och fyll på utloppet med återställningsmedia.
- Iterera till nästa elektroporationspulstillstånd. Upprepa tills alla elektroporationspulsförhållanden har testats.
- Bestäm graden av cellmembranpermeabilisering för varje testad pulsapplikation. (Validering efter processen beskrivs i avsnitt 11.1). Generera cellmembranets permeabiliseringskarta (figur 5).
- Bestäm elektroporationspulsparametrarna för populationsbaserad återkoppling med hög genomströmning.
- Stäng av sprutpumpen, ta bort celler från utloppsbehållaren och fyll på utloppet med återvinningsmedia.
- Populationsbaserad återkopplingsstyrd elektroporering med hög genomströmning
OBS: Se figur 6 för ett schema som illustrerar den populationsbaserade feedbackprocessen.- Ställ in sprutpumpens flödeshastighet på ~ 1-3 μl / min för att säkerställa ett flöde av enstaka celler genom elektroduppsättningen. Celltransittiden mellan elektroderna bör vara ~ 25 ms.
- Ställ in pulsamplituden på det "optimerade" tillståndet (10.2.9), stäng av avtryckarläget och ställ in pulsbredden så att den matchar celltransittiden.
- Ställ in arbetscykeln så att puls PÅ tid matchar det "optimerade" tillståndet. Se tabell 1.
- Ställ in utgångskanalfunktionsgeneratorn på ON, slå på sprutpumpen och låt systemet gå tills önskat antal celler har elektroporerats.
- När du är klar stänger du av både sprutpumpen och funktionsgeneratorn.
- Överför cellerna från utloppsbehållaren till cellodlingskolven/plattan av lämplig storlek fylld med förvärmda återvinningsmedier och överför odlingskolv/platta till inkubatorn.
11. Analys
- Detektion av membranpermeabilisering på encellsnivå
OBS: För att säkerställa att den "optimala" pulsen användes under modulen med hög genomströmning bör en analys efter experimentet utföras för att verifiera de elektriska data som exporteras från underavsnitt 10.2. Se figur 4 för en grafisk representation av den elektriska signalen som är representativ för membranpermeabilisering på grund av elektroporering.- Ladda data i en analysprogramvara (MATLAB, Python, etc.). Generera ett diagram över Ström kontra Tid för varje pulserande tillstånd.
- Bestäm manuellt graden av cellmembranpermeabilisering (Δ IP/ΔIC). Se figur 4. Generera cellmembranpermeabiliseringskartan (Δ IP / ΔIC kontra elektrisk energi, figur 5) över alla testade pulsförhållanden. Kontrollera "optimalt" pulserande tillstånd.
- elektrotransfektionseffektivitet (eTE)
- Efter inkubationsperioden på 24 timmar, avlägsna de elektroporerade cellerna från inkubatorn.
- Utför en levande cellfläck. Späd DRAQ5 1:1000 till en slutlig koncentration på 5 μM i cellodlingskärlet. Blanda försiktigt cellerna/färgningslösningen och inkubera vid 37 °C i 5–30 minuter.
OBS: En annan fläck kan implementeras i detta steg. Se till att de fluorescerande egenskaperna inte överlappar den fluorescerande markören som indikerar framgångsrik elektrotransfektion (dvs. GFP är i den gröna våglängden och DRAQ5 är den långt röda). - Slå på ett epifluorescerande mikroskop, lampa och kameror (se Materialförteckning).
- Ta bort cellerna från inkubatorn och sätt dem i fokus på mikroskopet.
- Ta en faskontrastbild (ljusfält) av det markerade fältet.
- Ta epifluorescerande bilder av samma fält med FITC-filter (GFP) och DRAQ5-filter (Far-Red). Analysera bilduppsättningarna manuellt eller via en algoritm.
OBS: Se figur 7 för representativa bilder. - Räkna det totala antalet GFP-positiva celler i alla bilder. Räkna det totala antalet DRAQ5-färgade celler i alla bilder. Beräkna eTE (förhållandet mellan GFP-positiva celler och DRAQ5-färgade celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 belyser driftsprinciperna bakom detekteringen av membranpermeabilisering på encellsnivå för en enda pulsamplitud. Efter initieringen av elektroporationsexperimentet bestämmer celldetekteringsalgoritmen en optimal tröskel för celldetektering via en punkt-för-punkt, lutningsbaserad detektionsmetod. Systemet övervakar sedan kontinuerligt (1) för en signifikant negativ förändring i den uppmätta elektriska strömmen, vilket indikerar att en cell kommer in. Detta beror på det biologiska cellmembranets isolerande natur, så att när cellen passerar genom elektroduppsättningen sker en momentan ökning av impedansen, vilket resulterar i en kraftig minskning av den uppmätta strömmen, vilket möjliggör konsekvent celldetektering (2), vilket i slutändan utlöser omkopplaren till den datorstyrda pulsapplikationen (4). Den isolerade cellen förskjuter en volym elektrolyt mellan elektroderna, vilket resulterar i ett strömfall som är proportionellt mot cellens storlek. Denna förändring i ström betecknas som ΔIC (3). Omedelbart efter ΔIC-beräkning administreras den förutbestämda, elektriska pulsen (4) till cellen under transport. Denna momentana tillströmning av energi introducerar en kort avkänningsartefakt i systemet (grå låda). Vid återlåsning på signalen, dvs. växling tillbaka till cellövervakning, (5) är det uppenbart att elektroporationspulsen permeabiliserade cellmembranet när storleken på strömförändringen på grund av cellens närvaro mellan elektroduppsättningen sjunker vid utgången (6). Skillnaden i de två strömdropparna på grund av cellens impedansstorlek före / efter elektroporationspulsapplikationen kallas permeabiliseringsströmmen och betecknas som ΔIP. När cellen lämnar volymen mellan elektroderna stabiliseras baslinjen och systemet återgår till celldetekteringsläge (1). Efter att ett förutbestämt antal celler har elektroporerats testas den näst högsta energielektroporationspulsen (se tabell 1 för pulsinställningar). För varje testad elektroporationspuls bestäms en genomsnittlig "grad av membranpermeabilisering". Detta värde beräknas som Δ IP/ΔIC. När varje förutbestämd elektroporationspuls har testats plottas Δ IP/ΔIC mot den applicerade elektriska energitätheten (σ x E 2 x t), där σ är lösningens konduktivitet (S / cm), E är den elektriska fältstyrkan ( kV / cm) och t är pulsvaraktigheten (ms). Se figur 5 för cellmembranpermeabiliseringskartan för HEK293-celler som används i det här exemplet.
Tabell 1: Parametrar för elektroporationspuls. För denna studie valdes elektroporationspulser så att laddningsflödet (σ×E×t) förblir konstant, där σ är lösningens konduktivitet (S / cm), E är den elektriska fältstyrkan (kV / cm) och t är pulsvaraktigheten (ms). Resultatet är ett spektrum av den applicerade pulselektriska energin. Exempel på den erforderliga arbetscykeln (d.c.) för att uppnå de angivna pulsparametrarna tillhandahålls för både en ökning på 5× och 10× i den initiala (encellsdetektion) flödeshastigheten. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Figur 4: Permeabilisering av encellsmembran - Algoritmoperation. (Överst) Elektrisk inspelning av en serie encellsdetekteringar / pulsapplikationer (indikeras av de skarpa spikarna i ström). (Nederst) Systemdrift för detektering och pulsering av en enda cell. (1) Systemet känner kontinuerligt av för en förändring i strömmen via en punkt-för-punkt-lutningsberäkning. (2) En kraftig minskning av lutningen detekteras, vilket indikerar att en cell kommer in mellan elektroderna och utlöser den datorstyrda pulsapplikationen. (3) Ett strömfall (ΔIC) bestäms och är proportionellt mot cellens storlek. (4) Elektroporationspulsen appliceras på cellen under transport, vilket orsakar en avkänningsartefakt i den elektriska signalen (grå låda). (5) Inlåsningsförstärkaren växlar tillbaka till cellövervakning när den låses in i cellen under transport. (6) Cellen lämnar elektroduppsättningen och orsakar en annan, mindre magnitudspik i ström (Δ IC > (I 6 - I5)). Skillnaden i impedansmätningarna beror på porbildning genom det isolerade cellmembranet. Denna förändring i ström kallas permeabiliseringsströmmen (ΔIP). Graden av cellmembranpermeabilisering beräknas (Δ IP/ΔIC). Baslinjen stabiliseras och systemet återgår till detekteringsläge (1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En distinkt korrelation observeras mellan den applicerade elektriska energin och graden av cellmembranpermeabilisering (figur 5), med förekomsten av en övergångsregion där en väsentlig ökning av graden av cellmembranpermeabilisering sker. För detta ändamål väljs en puls med elektrisk energi som överträffar denna övergångsregion för högkapacitetsfasen i mikroelektroporationsprocessen (figur 6). I detta experiment bestämdes pulsen 1,8 kV/cm: 670 μs som "optimal". Som beskrivits i detalj i avsnitt 10.3 i protokollet ökas systemets flödeshastighet och funktionsgeneratorn ställs in för att kontinuerligt mata ut en puls med en inställd puls och arbetscykel (se tabell 1 för pulsinställningar för 1,5 μl / min och 3,0 μL / min flödeshastigheter) för att säkerställa att 1 puls appliceras på varje cell under transport. I denna studie ökades flödeshastigheten med 5x, så pulsbredden sattes till 50 ms (matchande celltransittiden) vid en arbetscykel (dc) på 2,7%.
Figur 5: HEK293 cellmembranpermeabiliseringskartläggning -Δ Ip / ΔIc kontra elektrisk energi. De elektriska data (Δ IP / ΔIC) representeras som medelvärdet ± SEM. Pulserande förhållanden (vänster till höger) - 0,4 kV / cm: 3 ms, 0,8 kV / cm: 1,5 ms, 1,0 kV / cm: 1,2 ms, 1,2 kV / cm: 1 ms, 1,8 kV / cm: 0,67 ms, 2,4 kV / cm: 0,5 ms. En tydlig korrelation observeras mellan graden av cellmembranpermeabilisering och den elektriska energitätheten hos den applicerade pulsen. För denna experimentrunda valdes det pulserande tillståndet 1,8 kV/cm: 0,67 ms som den "optimala" elektroporationspulsen för högkapacitetsmodulen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Cellpopulationsbaserat återkopplingsstyrt elektroporationsprocessarbetsflöde. Till att börja med programmeras en initial flödeshastighet (Q0) för att möjliggöra elektrisk förhör på encellsnivå. Ett programmerbart antal celler pulseras vid varje förutbestämd elektroporationspulseringsförhållanden (E 0 / t0 till E N / tN), med den applicerade elektriska energin som ökar med varje iteration av elektroporationspulsapplikationer. Efter slutförandet av den högsta elektriska energipulsen som ingår i studien, E N/tN, plottas cellmembranets permeabiliseringskurva och den optimala elektroporationspulsen bestäms för cellpopulationen som testas. Systemet fortsätter till högkapacitetsläge, där flödeshastigheten ökas tillQ-genomströmning och de hastighetsbegränsande encellsförhörsstegen utelämnas. Det optimala pulståget kommer kontinuerligt att appliceras E opt / t opt vid d.c.opt så att varje cell i transit kommer att få en enda elektroporationspuls baserat på celltransittiden och pulsbreddscykeln (DC). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter 24 timmars återhämtning efter elektroporering avbildades cellerna för att bestämma elektrotransfektionseffektiviteten (eTE). Som beskrivs i underavsnitt 11.2 i protokollet bestämdes eTE som det totala antalet celler som uttrycker GFP normaliserat till det totala antalet celler färgade med DRAQ5. eTE för 1,8 kV / cm: 670 μs puls bestämdes till ~ 70% (figur 7A). För att belysa systemets betydelse för att exakt kartlägga graden av cellmembranpermeabilisering och välja en tillräckligt hög elektroporationspulsenergi vid övergång till högkapacitetsläget, undersöktes också pulstillståndet 0,4 kV/cm: 3 ms i termer av eTE (figur 7B). I detta fall var den resulterande eTE vid 24 timmar mindre än 5%.
Figur 7: elektrotransfektionseffektivitet-GFP-uttryck vid 24 timmar. HEK293-celler inkuberades vid 37 °C i 24 timmar efter mikroelektroporationsexperiment. Alla celler färgades med DRAQ5 (röd), och elektrotransfektionseffektiviteten (eTE) bestämdes baserat på förhållandet mellan celler som uttrycker GFP (grönt) och det totala cellantalet (rött). Cellviabilitet bedömdes inte som ett utfallsmått i denna studie. (A) Representativ, staplad 4× fluorescensbild av HEK293-celler som framgångsrikt transfekteras via en 1,8 kV / cm: 670 μs puls som visar eTE på cirka 70%. (B) Representativ, staplad 4× fluorescensbild av HEK293-celler som utan framgång transfekteras via en 0,4 kV / cm: 3 ms puls som visar eTE << 5%. Skalstreck: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: 2-dimensionellt CAD-schema. Mikroelektroporeringsanordningen består av en rak, 100 μm bred mikrokanal med ett inlopp med en diameter på 1 mm och ett utlopp med en diameter på 3 mm. Varje elektrodspår är 100 μm brett och elektroduppsättningen omfattar elektroporationsområdet för anordningen, som är 300 μm lång. Mikrokanalens 3-dimensionella höjd styrs av fotoresistens tjocklek. I detta arbete var enhetens höjd 20 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteras inom detta protokoll fokuserar främst på mikrofabrikation av en mikrofluidisk anordning som sedan integreras i en specialiserad elektroporationsexperimentell installation. Termen "recept", som ofta används när man beskriver detaljerna i mikrofabrikationsprocessen, antyder vikten av att följa / optimera varje steg för att framgångsrikt tillverka en fungerande enhet. Vissa kritiska steg i processen, när de inte optimeras, såsom UV-exponeringstid / energi, PVD-sputtringshastigheter / varaktigheter och syreplasmageneratorinställningar, kan dock vara problematiska för både tillverkningsprocessen och det framgångsrika genomförandet av elektroporationsexperimenten. Felsökning av tillverkningsprocessen görs främst via försök och fel eller en mer kontrollerad Design of Experiments experimentell design. Dessutom finns det alternativa mikrofabrikationstekniker, såsom Deep Reactive Ion Etching (DRIE), som kan ersättas för att utföra de olika stegen i protokollet (dvs. med hjälp av en DRIE-etsad gjutningsstruktur för att utföra den mjuka litografiprocessen). Dessutom kan optimering av recept och design / tillverkning av enheter vara tidskrävande för nybörjare på fältet. Men när mikrofabrikationsprocessen väl har utvecklats framgångsrikt har ingenjören / forskaren friheten att designa en enhet som är lämplig för deras specifika behov.
För detta ändamål utvecklades enheten som beskrivs i detta protokoll för att utöka vårt tidigare arbete32. Detta medförde användning av den elektriska detektionen av encellsmembranpermeabilisering men på ett sätt med högre genomströmning. Den experimentella installationen som beskrivs inom kräver behovet av specialutrustning, dvs. inlåsningsförstärkare, som kan vara ovanlig för standardforskningslaboratoriet och därmed begränsa den potentiella uppsökande och anpassningsförmågan hos denna teknik. En mikrofluidisk elektroporationsanordning med "bara ben" kan dock implementeras enligt detta protokoll, vilket endast kräver en funktionsgenerator och eventuellt en spänningsförstärkare för att generera elektroporationspulserna.
Ändå skiljer sig denna mikroelektroporationsplattform från andra encellselektroporationstekniker. Förmågan att både elektriskt detektera och optimera elektroporationsparametrar på en encellssuspension i en kontinuerlig flödesmiljö är verkligen innovativ. Framtida arbete innebär att optimera de andra viktiga experimentella parametrarna relaterade till framgångsrika elektroporationsresultat (se figur 1) för att ytterligare förbättra plattformens övergripande effektivitet. Ytterligare viabilitets- och metaboliska analyser kommer att utvecklas och implementeras för att bedöma eventuella negativa nedströmseffekter associerade med mikroelektroporeringsplattformen. Dessutom kan den mikrofluidiska designen fortsätta att förbättras för att uppnå högre cellulär genomströmning, vilket har visats av andra grupper40. Efter att ha tagit itu med dessa problem har denna teknik potential att antas i tillverkningsprocessen för cellterapi för att utföra genleverans och / eller genredigering, eftersom denna metod är mycket mottaglig för både en sluten och automatiserad process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna ekonomiskt stöd från National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) och US Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) för att finansiera doktorand JJS på stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
| 24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
| 33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
| 4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
| AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
| Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
| CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
| CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
| Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
| Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
| Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
| Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
| DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
| E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
| Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
| EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
| FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
| Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
| Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
| HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
| HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
| IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
| L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
| MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
| Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
| Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
| Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
| National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
| Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
| PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
| Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
| Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
| PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
| PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
| PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
| SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
| SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
| SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
| Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
| Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
References
- Gao, Q. Q., et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).
- Aijaz, A., et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).
- Milone, M. C., O'Doherty, U.
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A.
- Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).
- Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. Gene electrotransfer: A mechanistic perspective. Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).
- Clauss, J., et al. Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors. Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).
- Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Scientific Reports. 10 (1), 3053 (2020).
- Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. A microfluidic electroporation device for cell lysis. Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).
- Kar, S., et al. Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects. Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).
- Shi, J. F., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
- Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells. Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).
- Wei, W. J., et al. An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo. Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).
- Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Wu, Q. R., et al. Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects. Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).
- Pandey, C. M., et al.
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
- Nuxoll, E.
- Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode. Scientific Reports. 5, (2015).
- Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).
- Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G.
- Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).
- Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation. Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).
- Hsi, P., et al. Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing. Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).
- Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control. Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).
- Ye, Y. F., et al. Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip. 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).
- Huang, Y., Rubinsky, B. Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization. Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).
- Guo, X. L., Zhu, R. Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array. Scientific Reports. 6, (2016).
- Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Wang, H. Y., Lu, C. Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply. Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).
- Zheng, M. D., et al. Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation. Technology. 5 (1), 31-41 (2017).
- Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. In vitro electroporation detection methods - An overview. Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).
- MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf (2021).
- SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf (2001).
- Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf (2021).
- Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , Elsevier. 91-94 (2006).
- Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules. Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).
- PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf (2021).
- Lissandrello, C. A., et al. High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing. Scientific Reports. 10 (1), 18045 (2020).
