Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Hier stellen wir Protokolle zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen biologisch relevanten Derivaten mittels Chemilumineszenz-basierter Assays mit hoher Sensitivität vor.

Abstract

Die Aktivität von Stickstoffmonoxid (NO) in vivo ist das kombinierte Ergebnis seiner direkten Wirkungen, der Wirkung seiner Derivate, die durch NO-Autoxidation erzeugt werden, und der Wirkung von nitrosierten Verbindungen. Die Messung von NO-Metaboliten ist für die Untersuchung der NO-Aktivität sowohl auf Gefäßebene als auch in anderen Geweben unerlässlich, insbesondere in den experimentellen Umgebungen, in denen exogenes NO verabreicht wird. Ozonbasierte Chemilumineszenz-Assays ermöglichen präzise Messungen von NO- und NO-Metaboliten sowohl in Flüssigkeiten (einschließlich Plasma, Gewebehomogenaten, Zellkulturen) als auch in Gasgemischen (z. B. ausgeatmeter Atem). NO reagiert mit Ozon, um Stickstoffdioxid in einem angeregten Zustand zu erzeugen. Die daraus resultierende Lichtemission ermöglicht die Photodetektion und die Erzeugung eines elektrischen Signals, das den NO-Gehalt der Probe reflektiert. Aliquots aus derselben Probe können verwendet werden, um spezifische NO-Metaboliten wie Nitrat, Nitrit, S-Nitrosothiole und Eisen-Nitrosyl-Komplexe zu messen. Darüber hinaus wird NO, das von zellfreiem Hämoglobin verbraucht wird, auch mit der Chemilumineszenzanalyse quantifiziert. Eine Illustration all dieser Techniken wird zur Verfügung gestellt.

Introduction

Seit Salvador Moncada und die Nobelpreisträger Robert Furchgott, Louis Ignarro und Ferid Murad Stickstoffmonoxid (NO) als den bisher bekannten Endothel-abgeleiteten Relaxationsfaktor (EDRF) identifiziert haben, wurde die zentrale Rolle von NO in mehreren Schlüsselmechanismen etabliert, die sich über die Gefäßbiologie, die Neurowissenschaften, den Stoffwechsel und die Wirtsantwort erstrecken 1,2,3,4,5,6,7 . Die exogene Verabreichung von NO-Gas hat sich zu einer etablierten Behandlung für Ateminsuffizienz aufgrund von pulmonaler Hypertonie beim Neugeborenenentwickelt 8. Stickstoffmonoxidgas wurde auch zur Behandlung von Infektionen mit dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV), Malaria und anderen Infektionskrankheiten, Ischämie-Reperfusionsverletzungen und zur Vorbeugung akuter Nierenschäden bei Patienten, die sich einer Herzoperation unterziehen, untersucht 9,10,11,12. Der Bedarf an präzisen Messtechniken zur Beurteilung der NO-Werte, seiner Metaboliten und der seiner Zielproteine und -verbindungen ergibt sich sowohl aus mechanistischen als auch aus interventionellen Studien.

Aufgrund seiner hohen Reaktivität kann NO je nach biologischer Matrix, in der es hergestellt und/oder freigesetzt wird, unterschiedliche Reaktionen erfahren. In Abwesenheit von Hämoglobin (Hb) oder anderen Oxy-Hämoproteinen wird NO fast vollständig zu Nitrit oxidiert (NO2-).

2NEIN + O 2 → 2NR.2

NR. 2 + NR. → N2O3

N2O3 + H 2 O → NO2- + H+

NO wird zunächst mit molekularem Sauerstoff (O2) zu Stickstoffdioxid (NO2) autoxidiert und reagiert selbst mitNO2 zur Erzeugung von Distickstofftrioxid (N2O3). Ein MolekülN2O3reagiert mit Wasser (H2O) zu zwei Molekülen von NO2- und einem Proton (H+)13. Im Vollblutwerden 14,15, NO und NO 2- schnell in Nitrat (NO3-) umgewandelt, da diese Moleküle eifrig mit den oxidierten Hämgruppen von Hb [Hb-Fe2+-O2 oder Oxyhämoglobin (oxyHb)] reagieren, um NO3- zu erhalten. Diese Reaktion ist mit dem Übergang der Hämgruppe in den ferrischen Zustand [Hb-Fe 3+ oder Methämoglobin (metHb)] gekoppelt:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

Die Barriere der roten Blutkörperchen (RBC) und der unmittelbar an das Endothel angrenzende Raum sind die Hauptfaktoren, die diese Reaktion begrenzen und es einem kleinen Teil des vom Endothel freigesetzten NO ermöglichen, als EDRF16,17 zu wirken. Tatsächlich ist bekannt, dass zellfreies Hb im Kreislauf die Vasodilatation in experimentellen und klinischen Umgebungen stört17,18. Innerhalb der RBC reagiert je nach Oxygenierung undNO2-Konzentration ein Teil von NO mit Desoxyhämoglobin (Hb-Fe 2+) zu Eisen-Nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO oder HbNO):

Hb-Fe2 + + NEIN → Hb-Fe2+-NEIN

Im RBC15,17 kann NO 2- Hb-Fe 3+ bilden, indem es Hb-Fe 2+ reduziert, was zur Freisetzung von NO führt, das wiederum Hb-Fe 2+-O2 (bevorzugt) oder Hb-Fe 2+ bindet.

Die Erzeugung von NO-Derivaten sollte nicht als streng unidirektional betrachtet werden, da NO aus NO2- und NO3- in verschiedenen Geweben und durch verschiedene Enzyme (z.B. durch Darmbakterien oder in Mitochondrien, insbesondere unter hypoxischen Bedingungen) regeneriert werden kann19,20.

Eine variable Menge an produziertem (oder verabreichtem) NO führt zur nachgeschalteten Erzeugung von S-Nitrosothen, hauptsächlich durch Thiol-Transnitrosierung aus N2O3 in Gegenwart eines Nucleophils, wodurch ein NO+-Donorzwischenprodukt entsteht (Nuc-NO+-NO2-):

N 2 O3 + RS- → RS-NO + NO2-

Eine weitere Möglichkeit zur Erzeugung von S-Nitrosothiolen ist die Nitrosylierung oxidierter Thiole (KEINE Reaktion mit einem oxidierten Thiol):

RS• + NEIN → RS-NEIN

Dieser Mechanismus und die direkte Thioloxidation durch NR.2 sind möglicherweise nur unter sehr spezifischen Bedingungen möglich, die an anderer Stelle21 beschrieben werden. S-Nitrosothiole reichen von leichten Molekülen wie S-Nitrosoglutathion bis hin zu großen Thiol-haltigen Proteinen. S-Nitrosohämoglobin (S-NO-Hb) wird durch Nitrosierung einer Thiolgruppe eines konservierten Cysteinrests in der β-Kette (β93C)22 gebildet.

Die Erzeugung und der Stoffwechsel von S-Nitrosothiolen sind Teil wichtiger Regulationsmechanismen. Beispiele hierfür sind die Regulation von Glutathion, Caspasen, N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) und Ryanodinrezeptoren23,24,25,26,27,28. Nitrosiertes Albumin (S-Nitroso-Albumin), das bisher als wichtiger Vermittler der NO-Biologie in vivo galt, scheint ein NO/NO+-Transporter ohne spezifische zusätzliche biologische Aktivitätzu sein 29.

Bei der Messung der Konzentration von NO und seinen Derivaten aus einer bestimmten biologischen Probe innerhalb einer biologischen Matrix ist es wichtig, Eigenschaften wie Säuregehalt, Sauerstoffversorgung, Temperatur und das Vorhandensein von Reagenzien zu berücksichtigen. Beispiele hierfür sind verabreichte exogene NO-Donatoren und, im Rahmen einer akuten Entzündung, Wasserstoffperoxid (H2O2), das mitNO2 reagiert, was zur Erzeugung einer übernormalen Konzentration von freien Radikalen wie Peroxynitrit (ONOO-)21 führt. Neben der verwendeten Analysemethode ist die präanalytische Phase der Probenvorbereitung und -lagerung von grundlegender Bedeutung. Nachgeschaltete Reaktionen, die nicht die in vivo NO-Aktivität darstellen, sind vorherzusagen, zu berücksichtigen und zu blockieren. Ein valides Beispiel ist die Instabilität von S-NO-Hb, die eine spezielle Behandlung von Blutproben erfordert, wenn es für die Messungvorgesehen ist 22.

Chemilumineszenz-basierte Assays sind der Goldstandard für den Nachweis der NO-Spiegel und seiner Hauptmetaboliten [NO2-, NO3-, S-NO- und Eisen-Nitrosyl-Komplexe (Fe-NO)] in jeder biologischen Flüssigkeit, einschließlich Gewebehomogenaten30,31. Diese Methoden basieren auf dem Chemilumineszenzdetektor (CLD), einem Gerät, das die Reaktion von NO mit Ozon (O3) beherbergt und NO 2 in einem angeregten Zustand (NO2•) erzeugt. Die Relaxation von NO2• verursacht die Emission eines Lichtphotons, das von einem Photomultiplierrohr detektiert wird, wodurch ein elektrisches Signal erzeugt wird, das direkt proportional zum NO-Gehalt des abgetasteten Gasgemisches32 ist. Es wird ein vereinfachter Schaltplan der CLD dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Vereinfachtes Schema eines Chemilumineszenzdetektors für Stickoxidgas. Der Chemilumineszenz-basierte Nachweis von Stickstoffmonoxid (NO) ist die stöchiometrische Erzeugung eines Photons pro NO-Gasmolekül, das in den Chemilumineszenzdetektor (CLD) eingeführt wird. Die Chemilumineszenzreaktion wird in einer dafür vorgesehenen Kammer erhalten, die mit Ozon (O3) von einem internen Generator versorgt wird, der durch Verbindung mit einer externen Pumpe auf Unterdruck gehalten wird, was einen kontinuierlichen und konstanten Zufluss von Messgas ermöglicht. Die Erzeugung von O3 erfordert zweiatomigen Sauerstoff (O2), der von einem speziellenO2-Tank geliefert wird, der mit dem CLD verbunden ist (andere Hersteller bieten CLDs an, die mit Umgebungsluft betrieben werden). Innerhalb der Reaktionskammer reagiert jedes im beprobten Gas enthaltene NO-Gasmolekül mit Sauerstoff zu einem Molekül Stickstoffdioxid im aktivierten Zustand (NO2*). Durch die Rückkehr in seinen Grundzustand emittiert jedes NO2*-Molekül ein Photon, das von einer Photomultiplierröhre (PMT) neben der Reaktionskammer detektiert wird. Das PMT mit dem zugehörigen Verstärker und der zentralen Verarbeitungseinheit erzeugt ein Signal, das proportional zur Photonenzahl und der Anzahl der NO-Moleküle in der Reaktionskammer ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Der Probeneinlass des CLD kann an ein Glaswarensystem angeschlossen werden, das eine Reaktionskammer für flüssige Proben enthält. Das System wird kontinuierlich mit einem Inertgas wie Stickstoff, Helium oder Argon gespült, wodurch NO von der Reaktionskammer auf die CLD übertragen wird. Flüssigphasenproben werden durch eine spezielle Membran in den Spülbehälter injiziert.

Figure 2
Abbildung 2: Struktur eines Spülgefäßes für die chemilumineszenzbasierte Detektion von Stickoxidgas Das Spülgefäß (rechts) ermöglicht den Nachweis von Stickstoffmonoxid (NO) -Gas oder einer anderen Verbindung, die leicht in NO-Gas umgewandelt werden kann, wenn sie aus einem flüssigen Phasenreagenz freigesetzt wird. Der Inertgaseinlass ist an eine Quelle (Tank) eines Inertgases wie Argon, Xeon oder zweiatomigen Stickstoff (N2) angeschlossen. Das Nadelventil (öffnet sich nach links) dient zur Druckregelung innerhalb des Spülbehälters und kann zur Reinigung des Behälters vollständig entfernt werden. Der Injektionsanschluss ist von einer Kappe mit einem Membranseptum für die Probeninjektion bedeckt. Die Membran sollte oft ausgetauscht werden. Ein beheizter Mantel umgibt die Reaktionskammer und ist an ein Warmwasserbad angeschlossen, um denVCl 3 in HCl-Assay durchzuführen. Der Spülgefäßauslass ist mit dem Chemilumineszenzdetektor (CLD) oder mit der NaOH-Falle (erforderlich fürVCl 3 in HCl-Assays) verbunden. Um den Inhalt der Reaktionskammer abzulassen, schließen Sie zunächst die Absperrhähne am Inertgaseinlass und am Spülbehälterauslass, schließen Sie das Nadelventil, entfernen Sie die Kappe am Einspritzanschluss und öffnen Sie schließlich den Absperrhahn am Abfluss. Die NaOH-Falle (links) muss inline zwischen dem Spülgefäß und dem CLD platziert werden, wenn derVCl 3 in HCl-Assay aufgrund der Korrosivität von HCl durchgeführt wird. Die Verbindung mit dem CLD erfordert immer, dass ein Intensivfeld-Dielektrikum (IFD) zwischen dem CLD und dem Ausgang des Spülbehälters (oder der NaOH-Falle, falls verwendet) platziert wird. Der IFD-Filter entfernt luftgetragene Partikel und verhindert, dass Flüssigkeit durch das Spülgefäß gelangt. PTFE = Polytetrafluorethylen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Infolgedessen kann jede Verbindung, die durch eine spezifische und kontrollierte chemische Reaktion in NO umgewandelt werden kann, mit hoher Empfindlichkeit in jeder biologischen Flüssigkeit und jedem Gewebehomogenat24 nachgewiesen werden. Die direkte Messung von Gasphasen-NO durch Chemilumineszenz wird sowohl in experimentellen als auch in klinischen Umgebungen durchgeführt. Diese Techniken werden an anderer Stelle ausführlich beschrieben33,34,35. Die Messung von NO2-, S-Nitrosothiolen, S-nitrosierten Proteinen und Fe-NOs kann durch Zugabe von Proben in einem Reaktionsgemisch mit Triiodid (I3-) durchgeführt werden, das stöchiometrisch KEIN Gas aus all diesen Verbindungen freisetzt:

I3- → I2 + I-

2NO 2− +2I− +4H+ → 2NO + I 2 +2H 2 O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NEIN + I2

während I 3- nicht mit NO 3-15 reagiert. Präzise Messungen jeder Verbindung werden durch die Vorbehandlung von Probenaliquoten mit angesäuertem Sulfanilamid (AS) mit oder ohne Quecksilberchlorid (HgCl2) ermöglicht. Insbesondere entfernt die Vorbehandlung mit AS alle NO 2-Inhalte. Infolgedessen spiegelt der von der CLD gemessene NO-Gehalt nur die Summe der S-NO- und Fe-NOs-Konzentration wider. Die Injektion von HgCl 2 in eine Probe aliquot vor der AS-Injektion bewirkt, dass NO2- durch S-NO freigesetzt wird. Die Behandlung mit AS (die zur NO2-Entfernung führt) stellt sicher, dass der gemessene NO-Gehalt nur die Konzentration von Fe-NOs widerspiegelt. Eine Reihe von Subtraktionen zwischen den Bewertungen ermöglicht es, die genaue Konzentration der drei NO-Derivatezu berechnen 22.

Figure 3
Abbildung 3: Schritte in der Probenvorbereitung für denI3- in Essigsäure-Chemilumineszenz-Assay. Die sequentiellen Schritte zur Herstellung des I-3-in-Essigsäure-Chemilumineszenz-Assays sind dargestellt. Die Verwendung von lichtgeschützten Zentrifugenröhrchen ist erforderlich. Die Röhrchen 1, 2 und 3 werden zur Vorbereitung auf den Assay verwendet. Ein weiteres Probenaliquot (Tube 4) wird für denVCl 3 in HCl-Assay benötigt, wenn die Messung von Nitrat (NO3-) erforderlich ist. Die Schritte werden durch rot markierte Zahlen gekennzeichnet. Vorfüllen (Schritt 1) wie angegeben mit Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS) oder HgCl2 vor Zugabe des Probenvolumens. Fügen Sie das Probenvolumen (2) wie angegeben hinzu, wirbeln Sie es ein und inkubieren Sie es für 2 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Fügen Sie (3) PBS oder angesäuertes Sulfanilamid (AS) wie angegeben, Wirbel hinzu und inkubieren Sie für 3 Minuten bei RT. Führen Sie den Assay aus (4). Die durch den Assay gemessene Konzentration ist die Summe der Konzentration der Verbindungen, die unter jedem Röhrchen berichtet werden. Röhre Nummer 1 ermöglicht Messungen von Nitrit (NO2-), S-Nitrosothiolen (S-NO) und Eisen-Nitrosyl-Komplexen (Fe-NOs) als ein einziges Signal. Für die Nitratmessung (NR.3-) sind die Proben sowohl mit I 3- in Essigsäure als auch mitVCl 3 in HCl-Assays zu verwenden, und der aus Röhrchen 1 erhaltene Wert ist von dem aus Röhrchen 4 erhaltenen Wert zu subtrahieren. *empfohlene Mengen für die Hb-Analyse zur Bestimmung vonRest-NO2-, S-Nitrosohämoglobin und Eisen-Nitrosyl-Hämoglobin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Für die NO3-Messung wird Vanadium(III)-chlorid (VCl3) in Salzsäure (HCl) zur Umwandlung von NO 3- in NO im Spülgefäß verwendet, um NO3- stöchiometrisch mit der CLD zu messen:

2 NR.3-+ 3V+3 + 2H 2 O →2NO+ 3VO2+ + 4H+

Um eine ausreichend schnelle Umwandlung zu erreichen, muss die Reaktion bei 90-95 °C durchgeführt werden. Die Reduktion von NO3- auf NO 2- ist gekoppelt mit der Reduktion von NO2- auf NO durch HCl. Vanadiummetall reduziert auch S-NOs und setzt ihre NO-Einheit 22,36 frei. Die endgültige Konzentration, die CLD mitVCl 3 in HCl erhält, spiegelt die Gesamtkonzentration von NO3-, NO2 und anderen nitrosierten Verbindungen wider. Die Subtraktion des letztgenannten Wertes von der mit CLD mit I 3- ergebenden Konzentration ermöglicht die Berechnung der NO 3- Konzentration36,37 (Abbildung 3).

Im NO-Verbrauchsassay erzeugt die kontinuierliche Freisetzung von NO im Spülgefäß durch NO-Donatoren wie (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) ein stabiles Signal, das die Quantifizierung von zellfreiem oxyHb in den injizierten Proben ermöglicht. Die Menge an NO, die im Spülgefäß verbraucht wird, steht in einer stöchiometrischen Beziehung zur Menge an oxyHb in der Probe38.

Protokolle zur Messung vonNO2-,NO3-, S-Nitrosothiolen, Eisen-Nitrosyl-Komplexen und NO-Verbrauch durch zellfreies Hb in Plasmaproben sind dargestellt. Studien zu NO in der RBC-Umgebung erfordern eine spezifische Probenbehandlung, gefolgt von einer Ausschlusschromatographie, um extrem fragile S-NO-Hb und Hb-NO in Verbindung mit der Bestimmung der Hb-Gesamtkonzentration15,22 zu messen. Die Probenvorbereitung ist für die Korrektur der Messung von entscheidender Bedeutung. Die Präexistenz von NO2- inH2Ound die Freisetzung vonNO2- während des Assays können zur Messung künstlich höherer Konzentrationen von NO-Derivaten wie S-NO-Hb 14,39 führen. Wichtige Aspekte der Probenvorbereitung werden ebenfalls vorgestellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Die in diesem Protokoll angegebenen Verfahren entsprechen dem Überprüfungsausschuss des Massachusetts General Hospital. Die Blutproben, die verwendet wurden, waren während einer früheren Studie gesammelt worden und wurden für den aktuellen Zweckde-identifiziert 18.

HINWEIS: In den Anweisungen des Herstellers finden Sie spezifische Anleitungen zu optimalen Verbindungen zwischen Schläuchen und Glaswaren, die das Spülgefäß, das Waschen und die allgemeine Wartung bilden. Die Verbindungen müssen fest und sorgfältig hergestellt sein, um die Glaswaren nicht zu beschädigen. Identifizieren Sie die Komponenten des Glasspülbehälters: Gaseinlassleitung, Spülbehälter mit Heizmantel und Kondensator, Natriumhydroxid (NaOH) Gasblasenfalle, Verbindungsleitung zwischen dem Spülbehälter und dem Bubbler, Spülbehälterauslassgasleitung (zu CLD), die mit einem Intensivfeld-Dielektrikum (IFD) ausgestattet ist. Eine IFD-Filterleitung zwischen dem Spülgefäß und dem Probeneinlass des CLD muss jedes Mal vorhanden sein, wenn KEINE Metaboliten in flüssiger Form (Plasma, Zellkulturen, Gewebehomogenate) gemessen werden (alle im Protokoll vorgestellten Assays). Die Probenvorbereitung hängt von der analysierten Flüssigkeit oder dem analysierten Gewebe und von den interessanten Verbindungen ab. Wichtige Aspekte der präanalytischen Phase werden in den Abschnitten 1 und 2 behandelt. Spezifische Vorbereitungsschritte für spezifische Assays sind in den Abschnitten 3-5 enthalten. Die Abschnitte 6-8 gelten für alle Assays.

1. Herstellung spezieller Reagenzien

HINWEIS: Weitere Einzelheiten sind den früheren Veröffentlichungen15,22 zu entnehmen.

  1. Bereiten Sie 5% (290 mM) angesäuerte Sulfanilamid (AS) Lösung zur NO 2-Entfernung vor, indem Sie 500 mg Sulfanilamid in 10 ml 1N HCl auflösen. Diese Lösung ist monatelang stabil.
  2. 50 mM Quecksilberchlorid (HgCl2)-Lösung für die NO2-Freisetzung aus S-NOs herzustellen, indem67,9 mgHgCl2 in 5 ml PBS aufgelöst werden. Schützen Sie die Lagerlösung vor Licht.
  3. Herstellen einer NO2-blockierenden Lösung mit 800 mM Ferricyanid [K3Fe(CN)6] zur Oxidation von Hb zusammen mit 100 mM N-ethylmaleimid (NEM) zur Blockierung von Thiolgruppen und (OPTIONAL) 10% Nonylphenyl-Polyethylenglykollösung (Nonidet p-40) zur Auflösung von Erythrozytenmembranen.
    1. Fügen Sie K3Fe (CN) 6 zu deionisiertem und destilliertem Wasser (ddH2O, 263,5 g Pulver pro Liter) hinzu, um eine Endkonzentration von 800 mM zu erhalten.
    2. Geben Sie NEM zu der 800 mM K3Fe (CN) 6 in ddH2O-Lösung (12,5 g Pulver pro Liter bei einer Konzentration von 100 mM) und mischen Sie die Lösung, um alle Kristalle aufzulösen.
    3. Fügen Sie einen Teil von 10% NP-40 zu neun Teilen der 800 mM NEM K3Fe (CN) 6 100 mM NEM-Lösung (111 ml pro Liter) hinzu und mischen Sie gut (obligatorischer Schritt für die Vollblutanalyse).
  4. Bereiten Sie die S-NO-Hb-Stabilisierungslösung vor, die 12 mM K 3 Fe(CN)6,10 mM NEM, 100 μM Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA, für Metallchelatierung) und 1% Nonidet p-40 Reinigungsmittel aus ihren Stammlösungen enthält.
    1. Bereiten Sie eine 200 mM NEM-Lösung vor, indem Sie NEM-Kristalle zu PBS geben (25 mg/ml, z. B. 250 mg in 10 ml PBS) und mischen Sie die Lösung, bis alle Kristalle gelöst sind (am Experimenttag herzustellen).
    2. Es wird eine 800 mM K3 Fe(CN)6-Lösung durch Zugabe von K3 Fe(CN)6 zu ddH2 O (263,5mg/ml, z. B.1,32gin 5 mL ddH2O) hergestellt, um eine Endkonzentration von 800 mM zu erhalten (am Versuchstag vorzunehmen).
    3. Bereiten Sie eine 10 mM DTPA-Stammlösung vor, indem Sie 786 mg DTPA zu 200 ml ddH2O hinzufügen und den pH-Wert mit 5N NaOH auf 7,0 einstellen, um DTPA vollständig zu lösen.
    4. 5 ml 200 mM NEM-Lösung, 1,5 ml 800 mM K3Fe(CN)6-Lösung und 1 mL DTPA-Stammlösung zu 81,5 ml PBS bei 7,2 pH und schließlich 11 ml 10% NP-40 hinzufügen, um das Endvolumen auf 100 ml zu bringen.

2. Probenentnahme

HINWEIS: Weitere Informationen zur Beispielsammlung finden Sie in den zuvor veröffentlichten Werken 15,22,40.

  1. Vollblut sammeln
    1. Sammeln Sie Blut in heparinbeschichteten Röhrchen, wobei Sie venöse gegenüber arteriellen Gefäßen bevorzugen (sofern nicht ausdrücklich erforderlich) und Katheterplatzierung gegenüber Venenpunktion (wenn möglich) mit Katheter oder Nadelbohrung von mindestens 20 G oder mehr bevorzugen, um die Hämolyse zu minimieren.
    2. Sofort die NO 2-blockierende Lösung (1 Teil der Lösung zu 4 Teilen Vollblut) hinzufügen, verarbeiten (Abschnitte 3 oder 4) oder einfrieren und bei -80 °C lagern.
  2. Sammeln Sie Plasma und rote Blutkörperchen (RBCs)
    1. Sammeln Sie Blut in heparinbeschichteten Röhrchen, die venöses gegenüber arteriellem Blut bevorzugen (sofern nicht ausdrücklich erforderlich) und Nadeln von mindestens 20 g oder mehr, um die Hämolyse zu minimieren, und zentrifen Sie sofort für 5 min bei 4000 x g bei 4 ° C.
    2. Mischen Sie den Überstand (Plasma) mit der NO 2-blockierenden Lösung (1 Teil der Lösung auf 4 Teile des Überstands) in einem neuen Röhrchen und Verfahren (Abschnitte 3 oder 4) oder frieren Sie es ein und lagern Sie es bei -80 °C.
      HINWEIS: Für den NO-Verbrauchsassay kann die NO 2-Blockierungslösung nicht verwendet werden. Der Assay kann ohne Plasmavorbehandlung durchgeführt werden.
    3. Resuspendiert das RBC-Pellet von unten in ein neues Röhrchen, das mit S-NO-Stabilisierungslösung vorgefüllt ist (siehe Schritt 1.4) (1 ml Pellet auf 9 ml Lösung) und 5 min inkubieren.
    4. Führen Sie das RBC-Lysat in einer Größensäule mit G-25 Sephadex-Polymer durch, das zuvor mit ddH2O für die Ausschlusschromatographie gespült wurde
    5. Die Hb-Fraktion wird gesammelt, um sie zu verarbeiten (Abschnitt 4) und die Hb-Konzentration mit dem Drabkin-Reagenz zu messen (zur Hb-Messung siehe zuvor veröffentlichte Arbeit22).
      HINWEIS: Um ein bestimmtes Gewebe / Organ vorzubereiten und zu beproben, identifizieren Sie sein Hilum und isolieren Sie es chirurgisch. Schneiden Sie die Vene ein, punktieren Sie die Arterie und injizieren Sie heparinisierte Kochsalzlösung (10 U / ml) über die Arterie. Schneiden Sie das Gewebe aus, wenn die Kochsalzlösung am venösen Schnitt zu fließen beginnt. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem mechanischen Homogenisator, während Sie 1 Teil der NO 2-blockierenden Lösung zu 4 Teilen des homogenisierten Gewebes hinzufügen.

3.VCl3 in der HCl-Assay-Vorbereitung

HINWEIS: Weitere Einzelheiten zuVCl 3 in der HCl-Assay-Vorbereitung finden Sie in den zuvor veröffentlichten Arbeiten37,41.

ACHTUNG: Die CLD wird beschädigt, wenn die NaOH-Falle bei der Durchführung dieses Assays nicht ordnungsgemäß angebracht ist. Dies ist auf die Korrosivität von HCl zurückzuführen.

  1. Bereiten Sie Standardlösungen von NO3- für die Standardkurve vor
    1. 85 mgNaNO3 in 10 ml ddH2O auflösen, um 0,1 M NaNO3- zu erhalten (diese Lösung bleibt einige Wochen stabil).
    2. Verwenden Sie die Stammlösung, um Standards durch Verdünnung in ddH2O herzustellen, um Konzentrationen von 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μMNaNO 3 zu erhalten, um eine Kalibrierkurve für Plasma- oder Urinproben durchzuführen (verwenden Sie niedrigere Konzentrationen, wenn Sie mit Zellkulturen arbeiten).
  2. Herstellung der mitVCl 3 (Vanadiumchlorid) gesättigten Lösung zur NO3- Reduktion im Spülgefäß
    ACHTUNG: Die Reaktion von Wasser undVCl3 ist exotherm. Achten Sie beim Hinzufügen von Säure und beim Spülen der Glaswaren am Ende des Experiments auf eine hohe Glasindustrie.
    1. 1,6 g VCl 3 in 200 ml 1 M HCl lösen, indem zuerstVCl 3 in einensauberen Kolben gegeben und dann 200 ml 1 M HCl zugegeben werden.
    2. Vakuumfiltern Sie die Lösung durch Filterpapier (z. B. 11 μm Filterpapier, aber jedes Filterpapier kann verwendet werden).
      HINWEIS: Die gefilterte Lösung wird klar blau, während die ungefilterteVCl 3-Lösung aufgrund ungelöster Partikel braun ist.
    3. Halten Sie die gesättigte Lösung entweder mit Aluminiumfolie oder Polytetrafluorethylen (PTFE) -Band bedeckt, da die Verbindung lichtempfindlich ist.
  3. Bereiten Sie das zirkulierende Wasserbad vor
    1. Schließen Sie ein zirkulierendes Wasserbadgerät an den Wassermantel des Spülgefäßes an. Stellen Sie sicher, dass die Leitungen vor dem Grundieren trocken sind.
    2. Starten Sie das Wasserbad bei 95 ° C und überprüfen Sie, ob keine Lecks an den Wasserleitungen vorhanden sind, indem Sie (nicht haftende) Papiertücher um die Leitungen herum anbringen.
  4. Richten Sie die Gasblasenfalle ein
    1. Stellen Sie sicher, dass die PTFE-Hülse des Bubblers an Ort und Stelle ist und nicht beschädigt ist.
    2. Öffnen Sie den Gasblaser und injizieren Sie 15 ml 1 M NaOH in den Bubbler-Boden.
    3. Positionieren Sie den Gasblaser neu und dichten Sie die Verbindung dicht ab, indem Sie die Unterseite nach oben drücken und die beiden Teile leicht verdrehen. Die Unmöglichkeit, die Oberseite des Bubblers ohne Kraftaufwand zu drehen, deutet auf eine korrekte Abdichtung hin.
    4. Schließen Sie den Auslass des Spülbehälters an den Einlass der Gasblasenfalle an.

4. I3- in Essigsäure-Assay-Zubereitung

ANMERKUNG: Weitere Einzelheiten zu I3- in der Essigsäure-Assay-Vorbereitung finden Sie in den zuvor veröffentlichten Arbeiten15,22,38,41,42.

  1. Standardkurve für NO2- vorbereiten
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung vor, indem Sie 69 mg Natriumnitrit (NaNO2) in 10 ml ddH2O auflösen, um eine 100 mM Lösung zu erhalten. Diese Lösung ist stabil, wenn sie in einem luftdichten Behälter gelagert, gekühlt und vor Licht geschützt ist.
    2. Verdünnen Sie die Stammlösung seriell in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 900 μL ddH2O vorgefüllt ist: Geben Sie 100 μL der Stammlösung in das erste Zentrifugenröhrchen, mischen, etikettieren und verwenden Sie 100 μL des Röhrchens für das zweite Röhrchen, dann wiederholen Sie es, was zu 10 mM, 1 mM und dann 100 μM führt.
    3. Weiter verdünnen mit ddH2O, um 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM und 500 nMNaNO2 Aliquots zu erhalten, die in der Kalibrierkurve verwendet werden sollen.
  2. Bereiten Sie die I3- in Essigsäure für das Spülgefäß vor (kann bei Raumtemperatur (RT) für 1 Woche gelagert werden)22
    1. 2 g Kaliumiodid (KI) und 1,3 g Jod (I2) zu 40 ml ddH2O und 140 ml Essigsäure hinzufügen.
    2. Gründlich mischen, indem Sie die Mischung für mindestens 30 min umrühren.
  3. Vorbereitung der Proben für die differentielle Bestimmung von NO2-, S-Nitrosothiolen (S-NO-Hb, wenn Hb gesammelt wird) und Eisen-Nitrosyl-Komplexen (Hb-NO, wenn Hb gesammelt wird) (Abbildung 3)
    1. Teilen Sie jede Probe in 3 Aliquots von 270 μL (900 μL Hb bei Messung von S-NO-Hb und Hb-NO) in lichtgeschützten Mikrozentrifugenröhrchen, von denen 2 mit 30 μL 1x PBS (100 μL bei Messung von S-NO-Hb und Hb-NO) und das dritte Röhrchen mit 30 μL HgCl2 (100 μL bei Messung von S-NO-Hb und Hb-NO) vorgefüllt sind, 2 Minuten lang bei RT vorwirbeln und inkubieren (Abbildung 3).
    2. 30 μL von 5% AS in die Probe mit HgCl2 zur Messung von Fe-NOs (100 μL für Hb-NO) und zu einer mit zugesetztem PBS zur Messung von S-NOs und Fe-NOs (100 μL für S-NO-Hb undHb-NO) und 30 μL PBS zu der bereits mit 1x PBS vorgefüllten PBS hinzufügen, um NO2-, S-NOs und Fe-NOs (100 μL für Rest-NO2- aus der Hb-Sammlung) zu messen, S-NO und Hb-NO). Vortex und Inkubation bei RT für 3 min (Abbildung 3).

5. KEIN Verbrauch durch zellenlosen Hb-Aufbau

HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in der zuvor veröffentlichten Arbeit38.

  1. Herstellung von Standard-oxyHb-Lösungen aus einer gereinigten Hb-Lösung mit bekannter Konzentration
    1. Die Stammlösung wird durch Zugabe von ddH2O in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt, um die Lösungen zu erhalten, die für die Kalibrierkurve verwendet werden: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Vorbereiten der DETA-NONOate-Lösung
    1. Fügen Sie 10 mg DETA-NONOat zu 610 μL 10 μM NaOH in pH 7,4 PBS hinzu, um 100 mM DETA-NONOat zu erzeugen und es auf Eis zu halten.

6. Starten Sie den Chemilumineszenzdetektor (CLD) und bereiten Sie das Spülgefäß vor

HINWEIS: Für die Vorbereitung des Spülgefäßes verweisen wir auf die zuvor veröffentlichte Arbeit43.

  1. Überprüfen der Hauptverbindungen zur und von der CLD
    1. Schließen Sie die Sauerstoffleitung an die CLD an und öffnen Sie den Sauerstofftank bei einem Druck, der mit dem Hersteller der CLD übereinstimmt.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Intense Field Dielectric (IFD)-Filterleitung mit dem CLD, aber nicht mit dem Spülbehälter oder der NaOH-Falle verbunden ist.
  2. CLD starten
    1. Starten Sie auf der CLD-Schnittstelle das Detektionsprogramm für Flüssigphasenassays.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Sauerstoffversorgung ausreichend ist. Wenn dies der Fall ist, startet der CLD erfolgreich die Abtastung von seinem Eingang und zeigt die Detektion durch ein Signal in Millivolt (0-5 mV) an. Andernfalls fordert die CLD ein negatives Diagnosesignal an.
  3. Bereiten Sie das Spülgefäß vor
    1. Schließen Sie das Spülgefäß an allen drei Anschlüssen: Schrauben Sie das Nadelventil vollständig nach rechts, schließen Sie die Einlass- und Auslasshähne.
    2. Entfernen Sie die Kappe aus dem Spülgefäß und geben Sie der Reaktionskammer eine ausreichende Menge des für den geplanten Assay spezifischen Reagenzes hinzu (Tabelle 1), damit die zum Einspritzen der Proben verwendete Spritzennadel die Flüssigkeitssäule erreichen kann.
    3. Überprüfen Sie, ob eine stabile gewünschte Baseline vorhanden ist (Tabelle 1).
  4. Starten Sie den Spülgasstrom
    1. Stellen Sie sicher, dass der Inertgastank (z. B.N2) mit einem zweistufigen Regler ausgestattet ist, und verbinden Sie den Inertgastank mit dem Gaseinlass des Behälters.
    2. Öffnen Sie das Gas mit einem Ausgangsdruck am Regler von 1-5 psi, öffnen Sie den Einlass des Spülbehälters und öffnen Sie langsam das Nadelventil des Spülbehälters, um den Zufluss von Gas zu ermöglichen. Überprüfen Sie das Blubbern innerhalb des Spülgefäßes.
  5. Passen Sie den Gasfluss an
    1. Erfassen Sie den vom CLD gemessenen Zelldruck mit der IFD-Filterleitung zur Probenahme der Umgebungsluft.
    2. Positionieren Sie die Kappe am Spülbehälter neu, schließen Sie die IFD-Filterleitung an den Spülbehälter (oder an die NaOH-Falle imVCl 3 im HCl-Assay) an und öffnen Sie den Auslass des Spülbehälters.
    3. Verwenden Sie das Nadelventil, um den gleichen Zelldruck auf dem CLD-Niveau zu erreichen, der in der Umgebungsluft aufgezeichnet wird.

7. Experiment

HINWEIS: Weitere Informationen zum Experiment finden Sie in der zuvor veröffentlichten Arbeit43.

  1. Starten Sie das Programm zur Erfassung von Chemilumineszenzsignalen
    1. Verbinden Sie die serielle Schnittstelle des CLD mit der seriellen Schnittstelle des Computers, in der das Erfassungsprogramm installiert wurde.
    2. Führen Sie das Analyseprogramm aus.
    3. Klicken Sie auf Erwerben, wählen Sie den Ordner aus, in dem die .data-Datei gespeichert werden soll, geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern.
      HINWEIS: Beachten Sie die voreingestellte Laufzeit auf dem Bildschirm, da die Aufzeichnung automatisch beendet wird, wenn die voreingestellte Zeit abgelaufen ist. Bei Bedarf kann die voreingestellte Laufzeit erhöht werden.
  2. Bereiten Sie sich auf wiederholte Probeninjektionen vor
    1. Passen Sie die Spannungsskala auf dem Bildschirm an, um die Kontrolle über die angestrebte Baseline zu haben, indem Sie auf die Schaltflächen Minimum und / oder Maximum klicken und dann den gewünschten Wert eingeben.
    2. Lassen Sie ein 20- oder 50-ml-Röhrchen mit ddH2O füllen, um die Spritze zwischen den Proben zu spülen.
    3. Halten Sie eine Schachtel mit empfindlichen Aufgabentüchern bereit.
  3. Probeninjektion
    HINWEIS: Beginnen Sie mit den Standardlösungen für die Kalibrierkurve (injizieren Sie von den am wenigsten konzentrierten zu den konzentriertesten Proben), fahren Sie dann mit den Experimentproben fort (erwägen Sie, dies in Duplikaten oder Verdreifachungen zu tun).
    1. Spülen Sie die Spritze mindestens zweimal oder öfter mit ddH 2 O ab, bevor Sie jede Probe entnehmen (und nach jeder Injektion), und überprüfen Sie jedes Mal den ungehinderten Wasserauswurf auf einem Aufgabentuch.
    2. Setzen Sie die Spritze in das Probenröhrchen ein, während Sie sowohl die Spritze als auch das Röhrchen in einem engen Abstand halten, ziehen Sie den Kolben auf das gewünschte Volumen hoch, während Sie sicherstellen, dass keine Luftblase und / oder nicht homogenisierte feste Teile eingeschlossen werden.
    3. Reinigen Sie die Spitze der Spritze mit einem Aufgabenwischer, setzen Sie die Spritze dann in die Septakappe am Injektionsanschluss ein und injizieren Sie, nachdem Sie überprüft haben, dass sich die Spitze der Spritze innerhalb der flüssigen Phase in der Reaktionskammer befindet.
  4. Markieren Sie die Injektion im Softwareprogramm und warten Sie
    1. Stellen Sie sicher, dass die Injektion eine Veränderung des Signals nach oben bewirkt (Ergänzende Abbildung 1) (nach unten im NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Assay), geben Sie den Probennamen ein, indem Sie auf das graue Feld unter Probennamen klicken und dann auf Injektion markieren klicken.
      HINWEIS: Vermuten Sie eine Spritzenobstruktion, wenn die Probeninjektion kein Signal erzeugt.
    2. Warten Sie, bis das elektrische Signal wieder die Grundlinie erreicht hat (dies dauert normalerweise 3-4 Minuten). Diese Zeit kann verwendet werden, um Schritt 7.3.1 auszuführen.
  5. Wiederholen Sie alle in den Schritten 7.3 und 7.4 angegebenen Schritte während und nach jeder Injektion bis zum Ende des Experiments. Denken Sie daran, eine Stichprobe der Erhaltungslösung auszuführen (falls verwendet)
  6. Stoppen Sie das Experiment
    1. Klicken Sie auf STOP , um die Signalerfassung zu unterbrechen, stoppen Sie die CLD und schalten Sie das Wasserbad aus (wenn NO3- gemessen wird).
    2. Unterbrechen Sie den Gasfluss, öffnen Sie das Nadelventil, entfernen Sie die Kappe aus dem Spülbehälter, stellen Sie einen Abfallbehälter unter den Abfluss und öffnen Sie den Abtropfarmhahn.
      HINWEIS: Wenn das Experiment eine Datenerfassung von mehr als 60 Minuten erfordert, ist es notwendig, die Erfassung nach 60 Minuten Laufzeit neu zu starten (Schritt 7.1.3 wiederholen) und eine neue Datei zu erstellen.

8. Messungen und Berechnungen

HINWEIS: Messungen und Berechnungen werden offline durchgeführt und können zu einem anderen Zeitpunkt durchgeführt werden.

  1. Starten Sie das Chemilumineszenz-Erfassungsprogramm für die Offline-Datenanalyse
    1. Starten Sie das Programm und klicken Sie auf Verarbeiten.
    2. Wählen Sie die Experimentdatei aus und klicken Sie dann auf Öffnen.
  2. Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve für jede Verwaltung
    1. Die Software stellt automatisch auf dem Bildschirm die Basislinie (Ergänzende Abbildung 2A, horizontale gelbe Linie) und die Peakachse jeder Welle dar, die von jeder Probenverabreichung erzeugt wird (vertikale gelbe Linien): Überprüfen Sie ihre korrekte Position (oder passen Sie sie an, indem Sie auf jede Linie klicken und sie mit der Maus oder den Pfeilen bewegen) und klicken Sie auf Schwellenwert OK (Ergänzende Abbildung 2B).
      HINWEIS: Beim NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Messassay gelingt es der Software in der Regel nicht, die durch die Probeninjektion erzeugte Wellenform korrekt zu erfassen. Durch Zoomen auf jede Wellenform kann der Bediener die Software bei der Flächenberechnung leicht unterstützen (Ergänzende Abbildung 2).
    2. Die Software stellt automatisch den Anfang (vertikale grüne Linie) und das Ende (vertikale rote Linie) jedes Peaks grafisch dar, der durch jede Probenverabreichung verursacht wird: Überprüfen Sie ihre korrekte Position (oder passen Sie sie an, indem Sie auf jede Linie klicken und sie mit der Maus oder den Pfeilen bewegen) und klicken Sie auf Integrieren (Ergänzende Abbildung 2C).
      HINWEIS: Einige Bereiche in der Spur können an dieser Stelle fälschlicherweise als Injektionen definiert werden, und einige Spitzen können automatisch zweimal gezählt werden. Beide Fehler können in Schritt 8.2.2 erneut identifiziert und entfernt werden.
    3. Die Software gleicht automatisch jeden Signalbereich nach einer während des Experiments markierten Injektion und dem zugewiesenen Namen ab: Navigieren Sie zu jedem Gipfel (gekennzeichnet durch eine gelbe vertikale Linie) mit dem zugewiesenen Namen, indem Sie auf Nächster Peak und Vorheriger Peak klicken, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche All OK, um schließlich die Berechnung für alle Bereiche auf dem Bildschirm zu erhalten.
    4. Um alle vom Benutzer oder vom Programm gemachten Benennungs- oder Übereinstimmungsfehler zu korrigieren, verwenden Sie nach Bedarf die in der Zusatzdatei 1 angegebenen Schaltflächen.
  3. Übertragen Sie die Werte der Kalibrierkurve in eine Kalkulationstabelle und generieren Sie eine lineare Regressionsgleichung (Ergänzende Abbildung 3)
    1. Übertragen Sie die Daten aus dem CLD-Programm per Kopieren und Einfügen in eine neue Tabelle. Ordnen Sie die beiden Spalten im Datenblatt als Stichprobenkonzentration und Fläche unter der Kurve an, und fügen Sie in beiden Spalten den übereinstimmenden Wert Null hinzu.
    2. Wählen Sie die beiden Spalten aus, klicken Sie auf > Punkt, und wählen Sie dann im Menü Diagrammentwurf die Option Diagrammelement > Trendlinie > linear hinzufügen aus.
    3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die generierte Trendlinie, klicken Sie auf Trendlinie formatieren und klicken Sie dann im Menü Trendlinie formatieren auf die Optionen Gleichungen im Diagramm anzeigen und R-Quadrat-Wert im Diagramm anzeigen, um eine einfache lineare Kalibrierungsgleichung zu erhalten.
  4. Übertragen Sie die berechnete Fläche jeder Probe, um ihre Konzentration zu berechnen (Ergänzende Abbildung 3)
    1. Melden Sie jeden Wert in der Tabelle. In der nächsten Spalte ist die Gleichung aus Schritt 8.3.3 anzuwenden, um die Konzentration jeder injizierten Probe zu erhalten, wobei y die Konzentration (Wert der neuen Säule) und x die nach der Injektion gemessene Fläche unter der Kurve ist.
      HINWEIS: Denken Sie daran, die in der Konservierungslösung gemessene Konzentration (falls verwendet) zu berücksichtigen und die Werte entsprechend zu subtrahieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Assay wurde in Proben verwendet, die bekannte Konzentrationen von zellfreiem oxyHb enthielten (Abbildung 4). Da ein Häm von oxyHb stöchiometrisch ein NO-Molekül im Assay freisetzt, wird gereinigtes zellfreies oxyHb verwendet, um die Kalibrierkurve für den Assay zu erstellen (Ergänzende Abbildung 3).

Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen zellfreiem Hb (gemessen mit einem kolorimetrischen Assay) und NO-Verbrauch bei Patienten, die während einer Herzoperation vom kardiopulmonalen Bypass (CPB) abkommen, ist in Abbildung 5 dargestellt. Es ist davon auszugehen, dass nach CPB eine höhere Konzentration von Hämgruppen im Hb-Fe2+-O2-Status (Abbildung 5, rot) im Vergleich zu Patienten vorliegt, die während des CPB NO erhalten, von denen nur eine Minderheit der Hämgruppen zellfreiem Hb NO konsumiert (Abbildung 5, grün).

Das Protokoll zur Beurteilung des NO-Verbrauchs von zellfreiem Hb wurde zuvor angewendet, um Plasmaproben von 50 Patienten zu testen, die sich einer Herzoperation unterziehen und CPB benötigen. Blut wurde zu Studienbeginn und 15 min, 4 h und 12 h nach CPB gesammelt. Ziel der Studie war es, den bestehenden Zusammenhang zwischen pulmonalem und systemischem Gefäßwiderstand und dem nach dem CPB beobachteten Anstieg der Hämolyse zu untersuchen. Die zellfreie Hb-Konzentration wurde mit einem kolorimetrischen Hb-Assay beurteilt. Die Hämolyse erreichte ihren Höhepunkt 15 Minuten nach CPB. Das akkumulierte freie Hb wurde innerhalb von 12 h18 langsam aus dem Plasma eliminiert (Abbildung 6A). Der NO-Verbrauch erreichte stattdessen mit 15 Minuten seinen Höhepunkt und erreichte die Ausgangswerte in nur 4 Stunden (Abbildung 6B). Lineare Regressionskurven des NO-Verbrauchs durch zellfreies Hb zeigten eine stöchiometrische Beziehung zum 15-minütigen Post-CPB-Zeitpunkt im Gegensatz zu Baseline, 4 h und 12 h nach CPB (Abbildung 6C). Die Erklärung für den beobachteten Unterschied in der Kinetik liegt in der Fülle von neu freigesetztem Hb, das noch nicht auf NO-Moleküle gestoßen ist, die vom Endothel des Patienten freigesetzt werden. Die Konzentration von oxyHb (Absaugung von NO und Verbrauch im Assay) war in der Tat bei 15 min höher als zu jedem anderen Zeitpunkt. Plasma, das zu Studienbeginn und zu anderen Zeitpunkten gesammelt wurde, hatte eine relativ höhere Komponente von metHb, die bereits durch NO oxidiert worden war, kein NO bindet und keinen Verbrauch im Assay verursachte. Pulmonale und systemische Gefäßwiderstände wurden invasiv gemessen und erreichten ihren Höhepunkt bei 15 min. Zum ersten Mal in dieser spezifischen Patientenpopulation wurde beobachtet, dass der NO-Verbrauch durch freies Hb zeitlich mit einer Vasokonstriktion gekoppelt war, was frühere Beobachtungen in Tiermodellen und bei Patienten mit Sichelzellenanämiebestätigte 18.

Die Verabreichung von NO-Gas während CPB und nach der Operation erhöht die relative Menge an zirkulierendem metHb vs. oxyHb. Wenn Patienten, die sich einer Herzoperation unterzogen, intraoperativ und postoperativ mit NO-Gas behandelt wurden, war der beobachtete Anstieg des freien Hb nach CPB (Abbildung 7A) nicht mit einem Anstieg des NO-Verbrauchs verbunden, wie mit dem oben genannten Protokoll gemessen (Abbildung 7B). Das exogen verabreichte NO-Gas wandelt den größten Teil von oxyHb in metHb um, das wiederum weder NO in vivo abfängt noch NO in vitro verbraucht (unveröffentlichte Daten).

Figure 4
Abbildung 4: Stickstoffmonoxidverbrauch durch gereinigtes zellfreies Oxyhämoglobin. Stickstoffmonoxid-Verbrauchstest, der durch Injektion von Proben bekannter Konzentrationen von gereinigtem zellfreiem Oxyhämoglobin durchgeführt wird. Die Regressionslinie ist rot dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5. Stickstoffmonoxidverbrauch und zellfreie Hämoglobinkonzentration von Patienten, die sich einer Herzoperation mit kardiopulmonalem Bypass unterziehen. Der zellfreie Hämoglobinspiegel jedes Patienten, gemessen mit einem kolorimetrischen Kit, wurde mit dem durch Chemilumineszenz gemessenen Stickstoffmonoxid (NO)-Verbrauch aufgetragen. Blutproben wurden 15 Minuten nach dem Ende der CPB entnommen. Regressionslinien sind für Patienten mit Herzchirurgie dargestellt, die während des kardiopulmonalen Bypasses (CPB) kein NO erhalten (in rot) oder (in grün) erhalten. Hämoglobin wird in μM von Hämgruppen exprimiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Stickstoffmonoxidverbrauch und zellfreies Hämoglobin bei herzchirurgischen Patienten. (A) Die Konzentration von zellfreiem Hämoglobin (Hb) im Plasma von Patienten, die sich einer Herzoperation mit kardiopulmonalem Bypass (CPB) (N = 50) unterziehen, wurde zu verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung eines handelsüblichen kolorimetrischen Bestimmungskits bestimmt. Die Daten wurden analysiert, indem ein gemischtes Modell mit dem Nachweis eines festen Effekts zwischen den Zeitpunkten angepasst wurde. Die Plasmakonzentration zu verschiedenen Zeitpunkten wurde mit dem Multi-Vergleichstest von Tukey mit dem Ausgangswert verglichen. (B) Stickstoffmonoxid (NO)-Verbrauch durch Plasma, das aus denselben Proben gewonnen wird, die zur Quantifizierung von freiem Hb verwendet werden. Die Daten wurden analysiert, indem ein gemischtes Modell mit dem Nachweis eines festen Effekts zwischen den Zeitpunkten angepasst wurde. Die Plasmakonzentration zu verschiedenen Zeitpunkten wurde mit Dunnetts multiplem Vergleichstest mit dem Ausgangswert verglichen. (C) Regressionslinien für den zellfreien Hb-Plasmagehalt, der mit dem NO-Verbrauch abgeglichen ist. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns nicht signifikant. Die Daten werden als Median- ± Interquartilsbereich dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Auswirkungen der Verabreichung von Stickstoffmonoxidgas auf den Stickoxidverbrauch bei Patienten, die sich einer Herzoperation unterziehen. (A) Zellfreie Hämoglobinkonzentration im Plasma von Patienten, die sich einer Herzoperation mit kardiopulmonalem Bypass (CPB) unterziehen und entweder ein Placebo (N = 28) oder Stickstoffmonoxidgas (NO) (N = 22) für 24 h seit Beginn der CPB erhalten. Die Konzentration wurde zu verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung eines handelsüblichen kolorimetrischen Kits bestimmt. Die Daten wurden von Friedmans Test analysiert, was auf das Vorhandensein eines Effekts zwischen den Zeitpunkten in beiden Gruppen hinweist. Die Plasmakonzentration zu verschiedenen Zeitpunkten wurde mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunn mit dem Ausgangswert verglichen. (B) KEIN Verbrauch von Plasma aus denselben Proben, die zur Quantifizierung von zellfreiem Hb verwendet werden. Die Daten wurden mit Friedmans Test analysiert, was auf das Vorhandensein eines Effekts zwischen den Zeitpunkten in beiden Gruppen hinweist. Die Plasmakonzentration zu verschiedenen Zeitpunkten wurde mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunn mit dem Ausgangswert verglichen. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Die Daten werden als Median- ± Interquartilsbereich dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Probe Reagenzienmischung Ziel-Baseline (mV)
VCl3 in HCl 5 mlVCl3 in HCl gesättigter Lösung + 100 μL Antischaummittel 0–5 mV*
I3– in Essigsäure 5–7 ml I3– Reagenz 0–5 mV*
KEIN Verbrauch durch zellfreies Hämoglobin 5–7 ml PBS bei pH 7,4 + 100 μL Antischaummittel + 20 μL expandierte DETA-NONOat-Lösung 70–100 mV**
*Idealwert: Die Baseline kann aufgrund der Luftqualität in der Experimentumgebung höher sein
**Stellen Sie eine Stabilität für 20 Minuten sicher, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.

Tabelle 1: Zusammensetzung des Spülgefäßreagenzes und Zielbasislinie für verschiedene Chemilumineszenz-Assays. Reinigen Sie die Zusammensetzung des Gefäßreagenzes für jeden beschriebenen Assay. NEIN = Stickstoffmonoxid; PBS = Phosphatpufferkocher; DETA-NONOat: (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat. *Idealwert: Die Baseline kann aufgrund der Luftqualität in der Experimentumgebung höher sein. **Stellen Sie eine Stabilität für 20 Minuten sicher, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Um den NO-Verbrauchsassay durchzuführen, sollte die Skala in der Software geändert werden, um Werte zwischen 70 mV und 100 mV (z. B. 0-100 mV) zu erfassen, was der angestrebten Ausgangsspannung entspricht. Diese Anpassung wird vorgeschlagen, um die volle Kontrolle über die Probeninjektion zu haben, was es ermöglicht, das Signal, das sich nach der Injektion einer Probe von der Basislinie bewegt, zu dokumentieren und zu beobachten, wie das Signal zum Ausgangswert zurückkehrt. Die Datenaufzeichnung wird weder von der visualisierten Skala beeinflusst noch ist sie darauf beschränkt.

Ergänzende Abbildung 1: Peaks nach NO-Nachweis imVCl-3-in-HCl-Assay . Die Peaks, die der Beispieladministration imVCl 3 in HCl folgen, werden auf der CLD-Bundle-Software angezeigt. Die Berechnung der Fläche unter dem Peak für jede Injektion ist der Einfachheit halber dargestellt und in ergänzender Abbildung 2 erläutert. In diesem Experiment wurden Standards unterschiedlicher Konzentrationen für die Kalibrierkurve verabreicht, gefolgt von Plasmaproben. Die Verdünnung ist eine nützliche Lösung, um Metaboliten aus Proben zu berechnen, die am oberen Ende oder sogar außerhalb der Kalibrierkurve NO ergeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Benutzergestützte automatisierte Berechnung der Fläche unter dem Peak. Bei der Durchführung des NO-Verbrauchstests mit zellfreiem Hämoglobin kann es erforderlich sein, die Peaks manuell festzulegen, um der Software die genauesten Grenzwerte zur Messung des Bereichs unter dem Peak zur Verfügung zu stellen, der durch jede Probeninjektion erzeugt wird. (A) Repräsentative Vollansicht eines aufgezeichneten Experiments. Sie erreichen es, indem Sie im Hauptmenü auf Prozess klicken und die aufgezeichnete Datei von Interesse auswählen und öffnen. Die gelbe Linie stellt den Signalschwellenwert (mV) dar, der das gerade Segment des Bereichs unter dem Peak darstellt. Durch einen Klick darauf kann der Benutzer es in Richtung des Signalbereichs ziehen. Die x- und y-Achse kann geändert werden, um den Höhepunkt des Interesses für eine präzise Messung zu zoomen, indem Sie entweder auf die unteren linken Schaltflächen klicken oder den gewünschten Minimal- und Maximalwert für jeden eingeben. (B) Schwellenwertpositionierung. Der Benutzer kann den optimalen Basisschwellenwert auswählen, indem er die gelbe Linie bis zum Signalmittelpunkt direkt vor dem durch die Probeninjektion verursachten Signalabsturz zieht. Um den Bereich weiter einzuschränken, muss der Benutzer auf die Schaltfläche Peaks manuell einstellen klicken . (c) Starten und Beenden der Cursorpositionierung. Durch Klicken auf die Schaltfläche Startcursor festlegen wird eine grüne Linie auf dem Bildschirm angezeigt. Die grüne Linie sollte (durch Ziehen und Loslassen) ganz am Anfang des durch die Probeninjektion verursachten Abrutschens platziert werden. Die gleiche Schaltfläche ändert ihre Beschriftung in Set End Cursor (Endcursor festlegen), indem sie auf eine rote Linie auf dem Bildschirm klickt. Die rote Linie sollte an der Stelle platziert werden, an der das Signal nach der Ablenkung, die durch KEINEN Verbrauch von der injizierten Probe verursacht wurde, wieder die Basislinie erreicht. Insgesamt umreißen die Schwellenlinie (gelb, B), die grüne Linie und die rote Linie genau den durch die Probeninjektion erzeugten Bereich. (D) Angabe der Fläche unter dem Peak. Mit einem Klick auf die Schaltfläche Integrieren (C) wird der berechnete Bereich unter dem Peak oben rechts auf dem Bildschirm angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Repräsentative Tabelle mit Kalibrierkurve und Ergebnissen. Die berechneten Flächen unter den Peaks, die aus dem Stickoxidverbrauch (NO) durch Injektion von Proben mit einer bekannten Konzentration an zellfreiem Hämoglobin (ausgedrückt als [μM] Häm) erzeugt werden, sind oben links (auf gelbem Hintergrund) dargestellt. Die Werte werden aufgetragen, um die Kalibrierkurve und die daraus resultierende lineare Gleichung y= mx + q zu erstellen. Die Steigung (m) ist die Anzahl der oxyHb-Hämgruppen (μM), die erforderlich sind, um das vom Photomultiplierrohr detektierte Signal um 1 mV zu verringern. Berechnete Werte aus dreifachen Injektionen (Durchlauf N 1,2,3) von Proben eines Patienten, die zu vier verschiedenen Zeitpunkten (gekennzeichnet durch verschiedene Hintergrundfarben) erhalten wurden, wurden in die Tabelle eingegeben. Der Durchschnitt jedes Triplikators wurde verwendet, um den Wert des NO-Verbrauchs zu ermitteln, der durch jede Stichprobe verursacht wurde, indem die lineare Gleichung gelöst wurde: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Equation 1

Ergänzende Datei 1: Überprüfung der Spitzen mit der mitgelieferten Software. Diese Datei enthält einen Screenshot aus der mitgelieferten Software und die für jede Schaltfläche zulässigen Aktionen. Für jeden Peak (einschließlich falscher Peaks, die durch Artefakte verursacht werden) kann der Benutzer die in der Datei angegebenen Schaltflächen verwenden, um einen bestimmten Peak nach Bedarf zu bestätigen oder zu ignorieren, zu löschen oder zu benennen. Der Benutzer kann auch einen Spitzenwert aufzeichnen, der zuvor nicht erkannt wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aufgrund der hohen Sensitivität haben Chemilumineszenz-basierte Assays zur Bestimmung von NO und verwandten Verbindungen ein hohes Risiko einerNO2-Kontamination. Jedes Reagenz (insbesondere die NO-2-Blockierungslösung) und jedes Verdünnungsmittel (einschließlich ddH 2 O), das im Experiment verwendet wird, sollte auf seinenNO-2-Gehaltgetestet werden, um das Hintergrundsignal zu korrigieren. Nitrit ist extrem reaktiv mit einer Halbwertszeit im Vollblut um 10 min und erzeugt schnell NO3-. Die Zeit, die zwischen Blutentnahme und Zentrifugation oder NO 2-Blockierung vergeht, kann daher zu präanalytischen Fehlern führen und sollte minimiertwerden 15. In einem Assay unter Verwendung von Plasmaproben wird Blut vorzugsweise in Heparinröhrchen gesammelt und bei 750 x g für 5 min bei 4 °C nach Thiolgruppenblockade mit 40 μL 200 nM NEM durch Auflösen von 250 mg NEM in 10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zentrifugiert. Die Lagerlösung kann bei 4 °C gelagert werden. Verbindungen wie Nitroarginin, Nitroprussid und Nitroglycerin, die NO-Synthase (NOS) hemmen, durchlaufen eine langsame nicht-quantitative Umwandlung in NO, was zu einer Baseline-Erhöhung führt. Wenn die Verwendung von NOS-Inhibitoren Teil der Untersuchung ist, wird empfohlen, Blocker zu verwenden, die keine Nitrogruppen enthalten43. Der Eingangsdruck im Spülbehälter sollte mit dem kontinuierlichen Unterdruck übereinstimmen, den der CLD für die Probenahme ausübt. Wenn der Eingangsdruck niedrig ist, kann die Vakuumdestillation des Mediums zu verunreinigenden Gasspülleitungen und -kammern führen, was zu Signalverzerrungen führt. Darüber hinaus können kleine Luftmengen in das Spülgefäß eindringen und mit der Lösung reagieren, um übermäßiges NO zu erzeugen. Im Gegenteil, ein übermäßiger Druck, der durch eine Durchflussrate verursacht wird, die höher ist als der Probenentnahmefluss, könnte NO in die Atmosphäre freisetzen, was zu einer Unterschätzung des Signals15 führt. Darüber hinaus erfordern sowohl das VCl-3-in-HCl- als auch das I3-in-Essigsäureprotokoll mehrere Verdünnungen während der Präparation und mehrere Berechnungen, um die Probenkonzentration zu erhalten. Jeder Schritt sollte sorgfältig aufgezeichnet werden, da Verdünnungen und Berechnungen von vielen Gruppen als Hauptfehlerquelle erkanntwerden 44.

Die Zugabe von NO 2-blockierender Lösung (Schritt 2.1.2) führt dazu, dass rote Blutkörperchen lysieren, wodurch OxyHb zu MetHb reduziert wird. Es vermeidet die schnelle Reduktion von eisenhaltigen Proteinen (primär OxyHb) durch NO2- mit anschließender Generierung von NO3-. Die Behandlung von Proben mit dieser Lösung bei der Entnahme ist erforderlich, um NO2- und/oder NO3- korrekt zu messen. Im Gegensatz dazu sollte die Lösung nicht bei der Planung des NO-Verbrauchs durch zellfreien Hb-Assay verwendet werden. Aliquots der NO2- blockierenden Lösung sollten zusammen mit den Proben gespeichert und verwendet werden, um den durch die Lösung selbst verursachten Signalanteil zu entfernen. Schließlich sollten die Verdünnungsfaktoren bei der Berechnung der Endkonzentration des gemessenen Metaboliten berücksichtigt werden. Im I3-in-Essigsäure-Assay erhält man dieNO2-Konzentration durch Subtrahieren der Konzentration des Aliquot, das AS ohne HgCl2(S-NO und Fe-NO) enthält, von der Konzentration von Aliquot, das nur PBS enthält (NO2-, S-NO, Fe-NO). Zur Berechnung der Konzentration von S-NO (quecksilberlabile Proteine) sollte die Konzentration des mit AS behandelten Aliquot mit HgCl2 (Fe-NOs oder quecksilberstabile Nitrosoproteine) von der des mit AS ohne HgCl2 behandelten Aliquot subtrahiert werden. Vor dem Subtrahieren sollte der Anwender daran denken, die Konzentration jedes Aliquot mit 0,8181 (270/330) zu multiplizieren, um den bei der Probenvorbereitung verwendeten Verdünnungsfaktor zu berücksichtigen (Abbildung 3). Das gleiche Konzept gilt für S-NO-Hb- und Hb-NO-Messungen, bei denen absolute Konzentrationen einen Bruchteil des gemessenen Hb22 betragen. Abhängig von der Art der Probe kann eine genaue Zählung der NO3-Konzentration erfordern, dass sowohl das VCl-3-in-HCl-Protokoll als auch dasI3-in-Essigsäureprotokoll ausgeführt werden, um schließlich die Konzentration von NO2- von denen von NO3- und NO2- abzuziehen. Dies ist beispielsweise bei Vollblut- und Plasmaproben nicht immer notwendig, wo NO3- typischerweise NO2- weit übersteigt.

Es ist sehr wichtig, daran zu erinnern, dass die CLD beschädigt wird, wenn die NaOH-Falle bei der Durchführung einesVCl 3 im HCl-Assay aufgrund der Korrosivität von HCl nicht an der richtigen Stelle ist. Die 1 M NaOH-Lösung, die zum Befüllen der NaOH-Falle verwendet wird, kann entweder durch Auflösen von 4 g NaOH-Salz in 100 ml ddH 2 O oder durch Verdünnenvon 5 ml 50% NaOH in 100 ml ddH2Oerworben oder hergestellt werden. Bei weiterer Verdünnung auf 10 μM mit ddH2O ist das NaOH sehr nützlich, um Proteinablagerungen durch Injektion in das Spülgefäß zu entfernen.

Das von der CLD erfasste Basissignal sollte stabil sein und innerhalb von 0-5 mV liegen. Ein höheres Basissignal könnte durch Luftverschmutzung (durch NO und Derivate) verursacht werden, und dies kann überprüft werden, indem der Einlass im Freien gelassen wird. Wenn eine höhere Spannung nur im Spülbehälter beobachtet wird, während eine Kontamination des Tanks mit Inertgas in Betracht gezogen werden sollte, ist dies meistens auf die Persistenz organischer Reste oder das Vorhandensein von NO2- im Rohr zurückzuführen. Das mehrmalige Waschen des Spülbehälters mit ddH2O kann dazu beitragen, die Grundspannung zu minimieren. Im Erfolgsfall hilft die Inkubation des Spülgefäßes mit 100 mM NaOH für 24-48 h, gefolgt von mehreren Wäschen mit ddH2O, Schadstoffe zu eliminieren. Beim NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Assay beträgt das erforderliche CLD-Signal 70-100 mV für mindestens 20-30 min. Wenn das Signal nicht stabil ist (d. h. die Spannung abnimmt), kann dem Spülbehälter eine zusätzliche Dosis von 10 μL DETA NONOat zugesetzt werden. Dies kann bei Bedarf wiederholt werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass sowohl unbenutztes Pulver als auch bereits expandiertes DETA NONOat bei -80 ° C gehalten werden sollten. Dieses Reagenz zerfällt trotz optimaler Lagerung schnell und ist möglicherweise unterdurchschnittlich, wenn es nicht frisch zubereitet wird, was mehrere Injektionen in das Spülgefäß erfordert und zu einem weniger stabilen isoelektrischen Signal führt. Noch wichtiger ist, dass es in PBS mit pH 7,4 erweitert werden sollte, da dies seine Halbwertszeit optimiert (56 h bei pH 7,4 bei Raumtemperatur vs. quasi-sofortige Dissoziation bei pH von 5,0)45. Die zur Injektion von DETA NONOate verwendete Spritze sollte ausschließlich für diese Wirkung bestimmt sein und nicht zur Injektion von Proben verwendet werden.

Wenn die Injektion einer Probe einen Peak erzeugt, der höher ist als der obere Punkt der Kalibrierkurve, insbesondere wenn sie eine Spannung von mehr als 700 mv erzeugt, wird empfohlen, die Probe (2x oder 4x) zu verdünnen, um den Fehler zu minimieren. Dies gilt auch für den NO-Verbrauchstest, wenn der durch die Probeninjektion verursachte Einbruch tiefer ist als derjenige, der durch die Injektion der konzentriertesten Probe verursacht wurde, die in der Kalibrierkurve verwendet wurde. Der Nachweis eines Peaks (oder eines Durchgangs) im Signal nach der Injektion, der geringer als erwartet ist oder fehlt, kann auf eine Verstopfung der für die Injektion verwendeten Präzisionsspritze hinweisen. Aufgrund der geringen verwendeten Volumina (10-20 μL/Probe), insbesondere wenn Plasma- oder Urinassays durchgeführt werden, kann es schwierig sein, zwischen einer gefüllten Spritze und dem Fehlen der Probe aufgrund von Verstopfung der Spritze zu unterscheiden. Es wird empfohlen, auf den Widerstand des Kolbens zu achten. Nach Bestätigung durch Inspektion der Spritze kann versucht werden, das Hindernis zu entfernen, indem die Spritze wiederholt mit ddH2O gewaschen und die Spritze auf einem empfindlichen Aufgabentuch gerieben wird, wenn das Hindernis äußerlich sichtbar ist. Im Zweifelsfall wird empfohlen, das Probenvolumen auf einem Aufgabentuch auszuwerfen und die Spritze mit ddH2O zu waschen und zu versuchen, die Probenverabreichung zu wiederholen. Schäumen ist eine häufige Komplikation und zwingt das Experiment, beendet zu werden, sobald die Höhe der Flüssigkeitssäule die der Reaktionssäule übersteigt, was zu Signalinstabilität führt. Eine Überschreitung der im Protokoll angegebenen Antischaummitteldosis kann zu einer Erhöhung des Ausgangssignals führen und sollte vermieden werden. Die Anzahl der Proben, die die Bildung einer übermäßigen Schaumbildung verursachen, wird vorhersehbar, wenn wiederholte Assays durchgeführt werden, ein Phänomen, das darüber informieren sollte, wie das Experiment optimal geplant werden kann. Ein optionaler Schritt zur Verringerung der Schaumbildung besteht darin, Plasma oder Gewebeüberstand mit kaltem Methanol (Verhältnis 1:1) zu mischen und 15 min, 13000 x g bei 4 °C zentrifugieren. Es sollte berücksichtigt werden, dass Methanol dazu führt, dass Proteine ausfallen. Es werden nur leichte S-NOs und Fe-NOs gemessen, die nicht proteischer Natur sind. Daher kann diese Option in Studien an Vollblut oder in anderen Fällen, in denen Interesse an S-NO- und Fe-NO-Proteinen besteht, nicht übernommen werden.

Weitere Reagenzienlösungen alsVCl3 in HCl und dieI3- in Essigsäure wurden beschrieben und erfolgreich eingesetzt. Ascorbinsäure reduziert spezifisch NO 2-, reagiert nicht mit NO3- oder S-NOs und kann verwendet werden, um den Großteil der injizierten Proben und Berechnungen in Situationen zu reduzieren, in denen NO2- das einzige Molekül von Interesse ist. Der Hauptfallstrick ist die begrenzte Stabilität des Reagenzes, die häufigere Änderungen der Reagenzlösung und damit wiederholte Kalibrierungen erfordert46. Ein Assay mit Kohlenmonoxid und Kupferchlorid (CuCl)-gesättigtem Cystein (3C-Methode) kann spezifisch S-NOs mit einer Empfindlichkeit nachweisen, die mit I3- vergleichbar ist, erfordert aber immer noch eine Behandlung mit und ohne HgCl2, um unspezifische Reaktionen zu vermeiden47. Um eine höhere Präzision in der Signalanalyse zu erreichen, werden Experimente im .data-Format aufgezeichnet, so dass die Offline-Wellenformanalyse mit einer anderen Software als dem im Protokoll gezeigten Bundle-Programm durchgeführt werden kann.

Sobald die erste Injektion durchgeführt wurde, kann das Experiment nicht mehr gestoppt werden. Wenn eine Pause erforderlich ist und/oder wenn eine Bedingung geändert wird (Zusammensetzung des Spülbehältermediums, Spülgasstrom, Basisspannung), gilt das Experiment nur für die bis zu diesem Zeitpunkt injizierten Proben. Vor der Messung weiterer Proben sollte eine neue Standardkurve durchgeführt werden. Die Präzision, die Chemilumineszenz-basierte Assays ermöglichen, hat ihren Preis. Die Assays sind aus verschiedenen Gründen zeitaufwendig: 1) Automatisierung ist nicht möglich, da eine manuelle Probeninjektion in Duplikaten erforderlich ist; 2) Die meisten Reagenzien, die verwendet werden, können nicht für lange Zeit gelagert werden; 3) Jedes Experiment muss mit dem Ausführen von Standardproben in bekannten Konzentrationen zur Kalibrierung begonnen werden und kann nicht pausiert werden, es sei denn, die Kalibrierung wird wiederholt. 4) Jede Probe wird in Aliquots unterteilt, die verschiedene Mischungen von Reagenzien enthalten, um spezifische Reaktionen zu blockieren, um schließlich die Konzentration spezifischer Metaboliten durch Subtraktion anderer zu berechnen.

Diese Arbeit konzentriert sich auf das Gerät Zysense NOA 280i, das eine Detektionsschwelle von <1 ppb NO in der Gasphase (entsprechend bis zu 1 pM NO in der flüssigen Phase) und einen Probenahmefluss von 10-300 ml/min aufweist. Weitere CLDs sind mit einem Bündelschlauchsystem zur Messung von Metaboliten in der flüssigen Phase erhältlich. Ökophysikalische CLDs haben eine höhere Empfindlichkeitsschwelle, 1 ppb in ihrem empfindlichsten Modell, aber den Vorteil, dass kein Sauerstofftank für die Ozonbildung benötigt wird. Auf der anderen Seite beträgt der gemeldete Probenahmefluss 1000 ml/min, was einen höheren Verbrauch des für das Spülschiff verwendeten Inertgastanks impliziert. Andere CLD-Geräte sind für die Ausatem-NO-Analyse für den klinischen Gebrauch vorgesehen.

Die Chemilumineszenz ist die empfindlichste und validierteste Methode, um den NO-Verbrauch durch zellfreies Hb im Bereich der Hämolyse spezifisch zu bewerten. Andere Techniken stehen zur Messung von NO, NO2-, NO3-, S-NOs und quecksilberlabilen Nitrosoverbindungen zur Verfügung. Die direkte Messung von NO-Gas kann entweder durch Chemilumineszenz oder unter Verwendung spezieller Elektroden erfolgen, die von der Messung des ausgeatmeten Gases bis hin zu Einzelzellenelektroden reichen. Diese messen nur KEIN Gas, sind kostengünstiger (aber verderblicher), erfordern häufiger eine Kalibrierung und sind im Vergleich zu einer CLD31 weniger präzise. Nitrite und NO3- wurden historisch mit der Griess-Reaktion gemessen, einer kolorimetrischen Technik, die in ihrer ursprünglichen Version beide Moleküle erkennt, ohne die Möglichkeit, ihre relative Konzentration in der Probe zu unterscheiden. Moderne Varianten der Technik beinhalten die Umkehrphasenchromatographie, bei der die Probe in zwei Säulen getrennt wird, wodurch zwei unabhängige Reaktionen mit NO3- und NO2- ermöglicht werden. Die Empfindlichkeit dieser Methoden ist mikromolar oder etwas geringer, verglichen mit 1 nM mit CLD. Die Hauptfallstricke sind der Zeitverbrauch und die Inkompatibilität mit Proben, die mit Quecksilber und/oder Ferricyanid14 vorbehandelt wurden. S-NOs können mit kolorimetrischen und fluorometrischen Techniken sowie mit einer Empfindlichkeit von bis zu 0,5 μM im Vergleich zu 100 fM, die unter Verwendung von Chemilumineszenz beschrieben werden, wie im I3- in Essigsäureprotokoll 14,41,42 beschrieben, nachgewiesen werden. Obwohl der Biotin-Switch-Assay keine S-NOs im Picomolarenbereich nachweisen kann, hat er den Vorteil, dass Biotin-markierte Proteine erzeugt werden, die mit einer Proteomanalyse gereinigt und identifiziertwerden können 48. Im Detail betrachtet, teilt jede Technik eine gemeinsame Falle, nämlich die extreme Reaktivität von NO und seinen Derivaten, die eine Blockade von Reaktionen zum Zwecke der In-vitro-Messung vorschreiben. Die Vorbehandlung von Proben ist von entscheidender Bedeutung, und die Beantwortung der Frage, ob eine bestimmte Vorbehandlung eine Reaktion vollständig blockiert oder dies besser tut als eine andere, war bisher eine treibende Kraft für eine Zunahme methodischer Studien. Während die extreme Reaktivität in vivo von NO sicherlich ein Antrieb für die Erforschung empfindlicher Methoden zum Nachweis seiner Metaboliten war, hat die direkte Messung von NO in den letzten drei Jahrzehnten seit der Entwicklung des ersten amperometrischen Detektors im Jahr 1990 erhebliche Fortschritte gemacht. Seitdem wurden mehr als zwanzig verschiedene Sonden beschrieben, darunter Nanosensoren, die zur Untersuchung des Einzelzell-NO-Gehalts49 verwendet werden. Elektrochemische Sensoren sind die wichtigsten Werkzeuge, die NO sowohl in vivo als auch in Echtzeit erkennen können. In der Lungenmedizin haben mehrere Studien elektrodenbasierte Maschinen mit CLDs verglichen. Die Messung von ausgeatmetem NO ist einfacher als andere Assays zum Nachweis von Metaboliten und erfordert entweder den direkten Anschluss der Gasleitung (über IFD-Filter) an ein geschlossenes Atemschutzzusatz oder ein paar Atemzüge in einem Beutel für die Offline-Analyse, aber die Kosten und die schlechtere Portabilität von CLDs stehen still. Eine Reihe von elektrochemischen Geräten erfüllen derzeit die Kriterien für den klinischen Einsatz, obwohl sie im Vergleich zu CLDs eine geringere Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit aufweisen. Darüber hinaus ist die Konkordanz in Bezug auf die absoluten Messwerte zwischen den Geräten suboptimal, daher wird empfohlen, dass die Patienten immer mit demselben elektrochemischen Gerät50 nachverfolgt werden. Die Verwendung von CLDs in Umgebungen wie der Messung von nasal ausgeatmetem NO und in Forschungsumgebungen wie therapeutischem niedrig und hochdosiertem inhalativem NO ist immer noch notwendig.

Präzise Messungen von NO, seinen Derivaten und NO-bindenden Proteinen sind auf vielen Ebenen notwendig, um einen übersehenen und noch weitgehend unbekannten Signalmechanismus zu verstehen. Die Anwendungsgebiete umfassen Biologie und Pathologie sowohl auf präklinischer als auch auf klinischer Ebene mit spezifischen Zielbereichen, darunter Immunbiologie, Neurowissenschaften, Herz-Kreislauf-Wissenschaften und Infektionskrankheiten. Präklinische Studien und klinische Studien untersuchen die Verwendung von inhalativem NO-Gas als Therapeutikum. Tieferes Wissen darüber, wie exogenes NO-Gas die Konzentration von NO-Metaboliten und NO-gebundenen Proteinen auf jeder Ebene, vom Plasma bis zu den Zellkompartimenten, beeinflusst, wird erforderlich sein. Die Implementierung von High-Yield-Proteomik könnte wahrscheinlich die Anzahl der bekannten Mediatoren erhöhen, die von NO und seinen Derivaten beeinflusst werden, und könnte neue mechanistische Untersuchungen erfordern, die genaue Messungen von NO-Metaboliten erfordern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.B. erhält Gehaltsunterstützung von K23 HL128882/NHLBI NIH als Principal Investigator für seine Arbeit an Hämolyse und Stickoxid. LB erhält Zuschüsse von "Fast Grants for COVID-19 research" am Mercatus Center der George Mason University und von iNO Therapeutics LLC. B.Y. wird durch Zuschüsse von einem NHLBI/#R21HL130956 und DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244) unterstützt. B.Y. erhielt bei MGH Patente auf die elektrische Erzeugung von Stickstoffmonoxid.

L.B. und B.Y. haben eine Patentanmeldung für NO delivery bei COVID-19-Krankheit eingereicht PCT-Anmeldenummer: PCT/US2021/036269 eingereicht am 7. Juni 2021. RWC erhält Gehaltsunterstützung von Unitaid als Hauptprüfer für die Technologieentwicklung zur dezentralen Diagnose von Tuberkulose bei Kindern in ressourcenarmen Umgebungen.

Acknowledgments

Die in diesem Manuskript berichteten Protokolle wurden durch die gesammelten Beiträge früherer Stipendiaten von Dr. Warren Zapols Labor für Anästhesieforschung in der Intensivmedizin, Abteilung für Anästhesie am Massachusetts General Hospital, ermöglicht. Wir danken Dr. Akito Nakagawa, Dr. Francesco Zadek, Dr. Emanuele Vassena, Dr. Chong Lei, Dr. Yasuko Nagasaka, Dr. Ester Spagnolli und Dr. Emanuele Rezoagli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186 (1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550 (2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550 (2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238 (2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879 (2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Tags

Medizin Ausgabe 180
Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R.… More

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter