Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Chemiluminescensbaserede assays til påvisning af nitrogenoxid og derivater heraf fra autoxidation og nitroserede forbindelser

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Her præsenterer vi protokoller til påvisning af nitrogenoxid og dets biologisk relevante derivater ved hjælp af kemiluminescensbaserede assays med høj følsomhed.

Abstract

Nitrogenoxid (NO) aktivitet in vivo er de kombinerede resultater af dets direkte virkninger, virkningen af dets derivater genereret af NO autoxidation og virkningerne af nitroserede forbindelser. Måling af NO-metabolitter er afgørende for at studere NO-aktivitet både på vaskulære niveauer og i andre væv, især i de eksperimentelle indstillinger, hvor eksogen NO administreres. Ozonbaserede kemiluminescensassays muliggør præcise målinger af NO- og NO-metabolitter i både væsker (herunder plasma, vævshomogenater, cellekulturer) og gasblandinger (f.eks. Udåndingsåndedræt). NO reagerer med ozon for at generere nitrogendioxid i en ophidset tilstand. Den deraf følgende lysemission tillader fotosektion og generering af et elektrisk signal, der afspejler NO-indholdet i prøven. Aliquots fra den samme prøve kan bruges til at måle specifikke NO-metabolitter, såsom nitrat, nitrit, S-nitrosothioler og jern-nitrosylkomplekser. Derudover kvantificeres NO forbruges af cellefrit hæmoglobin også med kemiluminescensanalyse. En illustration af alle disse teknikker er tilvejebragt.

Introduction

Siden Salvador Moncada og nobelpristagerne Robert Furchgott, Louis Ignarro og Ferid Murad identificerede nitrogenoxid (NO) som den tidligere kendte endotelafledte afslapningsfaktor (EDRF), er NO's centrale rolle blevet etableret i flere nøglemekanismer, der spænder over vaskulær biologi, neurovidenskab, metabolisme og værtsrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Eksogen administration af NO-gas er blevet en etableret behandling for respirationssvigt på grund af pulmonal hypertension hos den nyfødte8. Nitrogenoxidgas er også blevet undersøgt til behandling af respiratorisk syncytialvirus (RSV) infektion, malaria og andre infektionssygdomme, iskæmi-reperfusionsskade og til forebyggelse af akut nyreskade hos patienter, der gennemgår hjertekirurgi 9,10,11,12. Behovet for præcise måleteknikker til vurdering af niveauerne af NO, dets metabolitter og niveauerne af dets målproteiner og forbindelser stammer fra både mekanistiske og interventionelle undersøgelser.

På grund af sin høje reaktivitet kan NO gennemgå forskellige reaktioner afhængigt af den biologiske matrix, hvori den produceres og/eller frigives. I mangel af hæmoglobin (Hb) eller andre oxy-hæmoproteiner oxideres NO næsten fuldstændigt til nitrit (NO2-).

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 +H20→ NO2- + H+

NO gennemgår først autoxidation med molekylært oxygen (O2) for at give nitrogendioxid (NO2) og reagerer medNO2 selv for at generere dinitrogentrioxid (N203). Et molekyleN203reagerer med vand (H20) for at danne to molekyler afNO2- og en proton (H +)13. Inden for fuldblodomdannes 14,15, NO og NO2- hurtigt til nitrat (NO3-), da disse molekyler reagerer ivrigt med de oxiderede hæmgrupper af Hb [Hb-Fe2+-O2 eller oxyhemoglobin (oxyHb)] for at give NO3-. Denne reaktion er kombineret med overgangen af hæmgruppen til jerntilstanden [Hb-Fe3+ eller methemoglobin (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

Barrieren for røde blodlegemer (RBC) og rummet umiddelbart ved siden af endotelet er de vigtigste faktorer, der begrænser denne reaktion og tillader en lille del af NO frigivet af endotelet at fungere som EDRF16,17. Faktisk er cellefri Hb i cirkulationen kendt for at forstyrre vasodilatation i eksperimentelle og kliniske indstillinger17,18. Inden for RBC, afhængigt af iltning ogNO2-koncentration, reagerer en del af NO med deoxyhemoglobin (Hb-Fe2+) for at danne jern-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO eller HbNO):

Hb-Fe2+ + INGEN → Hb-Fe2+-NO

I RBC15,17 kan NO2- danne Hb-Fe3+ ved at reducere Hb-Fe2+, hvilket fører til frigivelse af NO, hvilket igen binder Hb-Fe2+-O2 (fortrinsvis) eller Hb-Fe2+.

Generering af NO-derivater bør ikke betragtes som strengt ensrettet, da NO kan regenereres fra NO2- og NO3- i forskellige væv og af forskellige enzymer (f.eks. af tarmbakterier eller i mitokondrier, især under hypoxiske tilstande)19,20.

En variabel mængde NO produceret (eller administreret) fører til downstream-generering af S-nitrosothioler, hovedsagelig ved thioltransnitrosation fraN203i nærvær af en nukleofil, der skaber et NO+ -donormellemprodukt (Nuc-NO+-NO2-):

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

En anden mulighed for generering af S-nitrosothioler er nitrosylering af oxiderede thioler (NO reagerer med en oxideret thiol):

RS• + INGEN → RS-NO

Denne mekanisme og direkte thioloxidation ved NO2 kan kun være mulig under meget specifikke forhold, som er beskrevet andetsteds21. S-nitrosothioler spænder fra lette molekyler som S-nitrosoglutathion til store thiolholdige proteiner. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) dannes ved nitrosering af en thiolgruppe af en konserveret cysteinrest i β(β93C)22.

Generering og metabolisme af S-nitrosothioler er en del af vigtige reguleringsmekanismer. Eksempler indbefatter regulering af glutathion, caspaser, N-methyl-D-aspartat (NMDA) og ryanodinreceptorer 23,24,25,26,27,28. Nitroseret albumin (S-nitroso-albumin), der tidligere blev betragtet som en vigtig formidler af NO-biologi in vivo, synes at være en NO/NO+-transportør uden nogen specifik yderligere biologisk aktivitet29.

Ved måling af koncentrationen af NO og dets derivater fra en specifik biologisk prøve inden for en biologisk matrix er det vigtigt at overveje egenskaber som surhedsgrad, iltning, temperatur og tilstedeværelsen af reagenser. Eksempler indbefatter administrerede eksogene NO-donorer og, i forbindelse med akut inflammation, hydrogenperoxid (H202), der reagerer medNO2, hvilket fører til generering af supernormal koncentration af frie radikaler som peroxynitrit (ONOO-)21. Ud over den anvendte analysemetode er den præanalytiske fase af prøveforberedelse og opbevaring grundlæggende. Downstreamreaktioner, der ikke repræsenterer in vivo NO-aktiviteten, skal forudsiges, overvejes og blokeres. Et gyldigt eksempel er ustabiliteten af S-NO-Hb, der kræver en dedikeret behandling af blodprøver, når den er målrettet til måling22.

Chemiluminescensbaserede assays er guldstandarden til påvisning af niveauerne af NO og dets vigtigste metabolitter [NO2-, NO3-, S-NO- og jern-nitrosylkomplekser (Fe-NO)] i enhver biologisk væske, herunder vævshomogenater30,31. Disse metoder er afhængige af kemiluminescensdetektoren (CLD), en enhed, der huser reaktionen af NO med ozon (O3), hvilket genererer NO2 i en ophidset tilstand (NO2•). Afslapning af NO2• forårsager emission af en foton af lys, der detekteres af et fotomultiplikatorrør, hvilket genererer et elektrisk signal, der er direkte proportionalt med NO-indholdet i den samplede gasblanding32. En forenklet skematisk oversigt over CLD er repræsenteret.

Figure 1
Figur 1: Forenklet skematisk for en kemiluminescensdetektor for nitrogenoxidgas. Kemiluminescensbaseret detektion af nitrogenoxid (NO) er den støkiometriske generering af en foton pr. NO-gasmolekyle, der indføres i kemiluminescensdetektoren (CLD). Kemiluminescensreaktionen opnås i et udpeget kammer forsynet med ozon (O3) fra en intern generator, som holdes ved undertryk ved forbindelse med en ekstern pumpe, hvilket muliggør kontinuerlig og konstant tilstrømning af prøvegas. Genereringen afO3 kræver diatomisk ilt (O2), der leveres af en dedikeretO2-tank , der er forbundet med CLD (andre producenter leverer CLD'er, der opererer med omgivende luft). Inden for reaktionskammeret reagerer hvert molekyle af NO-gas indeholdt i den samplede gas med ilt for at give et molekyle nitrogendioxid i aktiveret tilstand (NO2 *). Ved at vende tilbage til sin grundtilstand udsender hvert NO2 * molekyle en foton, der detekteres af et fotomultiplikatorrør (PMT) placeret ved siden af reaktionskammeret. PMT med den tilhørende forstærker og centrale behandlingsenhed producerer et signal, der er proportionalt med fotontællingen og antallet af NO-molekyler i reaktionskammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Prøveindslysningen af CLD kan tilsluttes et glasvaresystem, der indeholder et reaktionskammer til flydende prøver. Systemet renses kontinuerligt med en inert gas, såsom nitrogen, helium eller argon, der overfører NO fra reaktionskammeret til CLD. Væskefaseprøver injiceres gennem en dedikeret membran i udrensningsbeholderen.

Figure 2
Figur 2: Struktur af et udrensningsfartøj til kemiluminescensbaseret detektion af nitrogenoxidgas Udrensningsbeholderen (til højre) gør det muligt at detektere nitrogenoxid (NO) gas eller enhver anden forbindelse, der let kan omdannes til INGEN gas, når den frigives fra et flydende fasereagens. Det inerte gasindgang er forbundet med en kilde (tank) af en inert gas, såsom Argon, Xeon eller diatomisk nitrogen (N2). Nåleventilen (åbner til venstre) bruges til trykregulering i udrensningsbeholderen og kan fjernes fuldstændigt for at rengøre beholderen. Injektionsporten er dækket af en hætte med en membranseptum til prøveinjektion. Membranen skal udskiftes ofte. En opvarmet jakke omgiver reaktionskammeret og er forbundet til et varmtvandsbad for at udføre VCl3 i HCL-assay. Udrensningsbeholderudløbet er forbundet til kemiluminescensdetektoren (CLD) eller til NaOH-fælden (kræves til VCl3 i HCl-assays). For at dræne reaktionskammerets indhold skal du først lukke stophanerne ved det inerte gasindløb og udrensningsbeholderens udløb, lukke nåleventilen, fjerne hætten ved injektionsporten og til sidst åbne stophanen ved afløbet. NaOH-fælden (til venstre) skal placeres inline mellem udrensningsbeholderen og CLD'en, hvis VCl3 i HCl-assay udføres på grund af HCI's ætsning. Forbindelsen til CLD kræver altid, at der placeres et intenst felt dielektrisk filter (IFD) mellem CLD og udgangen fra udrensningsbeholderen (eller NaOH-fælden, hvis den anvendes). IFD-filteret fjerner luftbårne partikler og forhindrer væske i at passere gennem udrensningsbeholderen. PTFE = polytetrafluorethylen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Som følge heraf kan enhver forbindelse, der kan omdannes til NO gennem en specifik og kontrolleret kemisk reaktion, påvises med høj følsomhed i enhver biologisk væske og vævshomogenat24. Direkte måling af gasfase NO gennem kemiluminescens udføres i både eksperimentelle og kliniske omgivelser. Disse teknikker er udførligt beskrevet andetsteds 33,34,35. Måling af NO2-, S-nitrosothioler, S-nitrositrerede proteiner og Fe-NO'er kan udføres ved at tilsætte prøver i en reaktionsblanding med triiodid (I3-), som støkiometrisk frigiver INGEN gas fra alle disse forbindelser:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

mens jeg3- ikke reagerer med NO 3-15. Præcise målinger af hver forbindelse er muliggjort ved forbehandling af prøveallikvoter med syrnet sulfanilamid (AS) med eller uden mercuricchlorid (HgCl2). Konkret fjerner forbehandling med AS alt NO 2-indhold. Som følge heraf afspejler NO-indholdet målt ved CLD kun summen af S-NOs og Fe-NOs koncentration. Injektion af HgCl2 i en prøveallikvote før AS-injektion medfører, at NO2- frigives af S-NO. Behandling med AS (hvilket fører til NO 2-fjernelse) sikrer, at det målte NO-indhold kun afspejler koncentrationen af Fe-NO'er. En række subtraktioner mellem vurderingerne gør det muligt at beregne den nøjagtige koncentration af de tre NO-derivater22.

Figure 3
Figur 3: Trin i prøveforberedelse tilI3- i eddikesyre chemiluminescensassay. De sekventielle trin til fremstilling afI3- i eddikesyre chemiluminescensassay er illustreret. Brug af lysbeskyttede centrifugerør er påkrævet. Rør 1, 2 og 3 er dem, der bruges til at forberede sig på analysen. En anden prøve aliquot (rør 4) er nødvendig for VCl3 i HCI-assay, hvis måling af nitrat (NO3-) er påkrævet. Trin er angivet med tal med rødt. Forfyld (trin 1) som angivet med fosfatbuffer saltvand (PBS) ellerHgCl2, inden prøvevolumenet tilsættes. Tilsæt prøvevolumen (2) som angivet, hvirvel, og inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur (RT). Tilsæt (3) PBS eller syrnet sulfanilamid (AS) som angivet, hvirvel, og inkuber i 3 minutter ved RT. Koncentrationen målt ved assay er summen af koncentrationen af de forbindelser, der er rapporteret under hvert rør. Rør nummer 1 vil tillade målinger af nitrit (NO2-), S-nitrosothioler (S-NO) og jern-nitrosylkomplekser (Fe-NO'er) som et enkelt signal. Ved måling af nitrat (NO3-) skal der udtages prøver med bådeI3- i eddikesyre ogVCl3 i HCl-assays, og værdien fra rør 1 skal trækkes fra den, der er opnået fra rør 4. *foreslåede mængder, der skal anvendes til Hb-analyse til bestemmelse af resterende NO2-, S-nitrosohemoglobin og jern-nitrosyl-hæmoglobin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ved MÅLING NR. 3- anvendes vanadiumchlorid (III)chlorid (VCl3) i saltsyre (HCI) til omdannelse afNO3- til NO i udrensningsbeholderen med henblik på at måle NO3- støkiometrisk med CLD:

2 NO3-+ 3V+3 + 2H20 → 2NO+ 3VO2+ + 4H+

For at opnå en tilstrækkelig hurtig omdannelse skal reaktionen udføres ved 90-95 °C. Reduktion fra NO3- til NO2- er kombineret med reduktion af NO2- til NO med HCl. Vanadiummetal reducerer også S-NO'er, der frigør deres NO-moiety22,36. Den endelige koncentration opnået ved CLD medVCl3 i HCl afspejler den samlede koncentration afNO3-,NO2 og andre nitroserede forbindelser. Subtraktion af sidstnævnte værdi fra koncentrationen opnået med CLD med I3- gør det muligt at beregne NO 3-koncentration 36,37 (figur 3).

I NO-forbrugsassayet genererer den kontinuerlige frigivelse af NO i udrensningsbeholderen af NO-donorer som (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate) et stabilt signal, der gør det muligt at kvantificere cellefri oxyHb i de injicerede prøver. Mængden af NO, der forbruges i udrensningsbeholderen, er i et støkiometrisk forhold til mængden af oxyHb i prøven38.

Protokoller til måling af NO2-, NO3-, S-nitrosothioler, jern-nitrosylkomplekser og INTET forbrug af cellefri Hb i plasmaprøver er illustreret. Undersøgelser af NO i RBC-miljøet kræver specifik prøvebehandling efterfulgt af udelukkelseskromatografi for at måle ekstremt skrøbelig S-NO-Hb og Hb-NO kombineret med bestemmelse af total Hb-koncentration15,22. Prøveforberedelse er medvirkende til at korrigere målingen. Præ-eksistens af NO2- iH20og frigivelse afNO2- under analysen kan føre til måling af kunstigt højere koncentrationer af NO-derivater såsom S-NO-Hb14,39. Vigtige aspekter af prøveforberedelse præsenteres også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De procedurer, der er angivet i denne protokol, er i overensstemmelse med review board of Massachusetts General Hospital. De blodprøver, der blev brugt, var blevet indsamlet under en tidligere undersøgelse og blev afidentificeret til det nuværende formål18.

BEMÆRK: Se producentens anvisninger for specifik vejledning vedrørende optimale forbindelser mellem slanger og glasvarer, der udgør udrensningsbeholderen, vask og generel vedligeholdelse. Forbindelserne skal være faste og omhyggeligt lavet for ikke at beskadige glasvarerne. Identificer komponenterne i glasudrensningsbeholderen: gasindløbsledning, udrensningsbeholder med varmekappe og kondensator, natriumhydroxid (NaOH) gasboblerfælde, forbindelsesledning mellem udrensningsbeholderen og bobleren, udrensningsbeholderens udløbsgasledning (til CLD) udstyret med et intenst felt dielektrisk (IFD) filter. En IFD-filterlinje mellem udrensningsbeholderen og prøvegenneglen til CLD'en skal være på plads, hver gang der måles INGEN metabolitter i flydende form (plasma, cellekulturer, vævshomogenater) (alle de assays, der præsenteres i protokollen). Prøveforberedelse afhænger af væsken eller vævet, der analyseres, og af de forbindelser, der er af interesse. Vigtige aspekter af den præanalytiske fase er omfattet af afsnit 1 og 2. Specifikke forberedelsestrin til specifikke assays er inkluderet i afsnit 3-5. Afsnit 6-8 finder anvendelse på alle assays.

1. Fremstilling af dedikerede reagenser

BEMÆRK: For flere detaljer henvises til tidligere publikationer15,22.

  1. 5 % (290 mM) syrnet sulfanilamidopløsning (AS) fremstilles til fjernelse af NO2 ved at opløse 500 mg sulfanilamid i 10 ml 1 N HCl. Denne løsning er stabil i flere måneder.
  2. 50 mM mercuricchlorid (HgCl2) opløsning fremstilles tilNO2-frigivelse fra S-NO'er ved at opløse 67,9 mgHgCl2 i 5 ml PBS. Beskyt stamopløsningen mod lys.
  3. Forbered NO 2-blokerende opløsning med 800 mM ferricyanid [K3Fe(CN)6] for at oxidere Hb sammen med 100 mM N-ethylmaleimid (NEM) for at blokere thiolgrupper og (VALGFRIT) 10% nonylphenyl-polyethylenglycolopløsning (Nonidet p-40) for at opløse røde cellemembraner.
    1. Der tilsættesK3Fe(CN)6 til deioniseret og destilleret vand (ddH20, 263,5 g pulver pr. liter) for at opnå en endelig koncentration på 800 mM.
    2. Tilsæt NEM til 800 mM K3Fe(CN)6 i ddH20-opløsning(12,5 g pulver pr. liter for at have en koncentration på 100 mM), og opløsningen blandes for at opløse alle krystaller.
    3. Tilsæt en del af 10 % NP-40 til ni dele af 800 mM NEM K3Fe(CN)6 100 mM NEM-opløsningen (111 ml pr. liter) og bland godt (obligatorisk trin til fuldblodsanalyse).
  4. S-NO-Hb-stabiliseringsopløsningen indeholdende 12 mMK3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM diethylentriaminpentaeddikesyre (DTPA, til metalchelatering) og 1% Nonidet p-40 vaskemiddel fra deres stamopløsninger.
    1. Der fremstilles en 200 mM NEM-opløsning ved at tilsætte NEM-krystaller til PBS (25 mg/ml, f.eks. 250 mg i 10 ml PBS) og blandingen, indtil alle krystaller er opløst (skal fremstilles på forsøgsdagen).
    2. En 800 mM K3Fe(CN)6-opløsning fremstilles ved tilsætning afK3Fe(CN)6 til ddH20 (263,5 mg/ml, f.eks. 1,32 g i 5 ml ddH20 for at opnå en endelig koncentration på 800 mM) (skal fremstilles på forsøgsdagen).
    3. Forbered en 10 mM DTPA-stamopløsning ved at tilsætte 786 mg DTPA til 200 mlddH20og juster pH til 7,0 med 5N NaOH for fuldt opløselig DTPA.
    4. Tilsæt 5 ml 200 mM NEM-opløsning, 1,5 ml 800 mM K3Fe(CN)6-opløsning og 1 ml DTPA-stamopløsning til 81,5 ml PBS ved 7,2 pH, og til sidst tilsættes 11 ml 10 % NP-40 til sidst for at bringe det endelige volumen op på 100 ml.

2. Indsamling af prøver

BEMÆRK: For flere detaljer om prøveindsamling henvises til tidligere offentliggjorte værker 15,22,40.

  1. Saml fuldblod
    1. Opsaml blod i heparinbelagte rør, der foretrækker venøs frem for arteriel kar (medmindre det specifikt kræves) og foretrækker kateterplacering frem for venipunktur (hvis muligt) med kateter eller nåleboring på mindst 20 G eller større for at minimere hæmolyse.
    2. DenNO2-blokerende opløsning tilsættes straks (1 del af opløsningen til 4 dele fuldblod), behandles (punkt 3 eller 4), eller fryses og opbevares ved -80 °C.
  2. Saml plasma og røde blodlegemer (RBC'er)
    1. Opsaml blod i heparinbelagte rør, der foretrækker venøst frem for arterielt blod (medmindre det specifikt kræves) og nåle på mindst 20 G eller derover for at minimere hæmolyse og centrifuge straks i 5 minutter ved 4000 x g ved 4 ° C.
    2. Supernatanten (plasma) blandes med no 2-blokerende opløsning (1 del af opløsningen til 4 dele af supernatanten) i et nyt rør og en ny proces (punkt 3 eller 4), eller fryses og opbevares ved -80 °C.
      BEMÆRK: Til NO-forbrugsanalysen kan NO 2-blokeringsopløsningen ikke bruges. Assayet kan udføres uden plasmaforbehandling.
    3. Resuspend RBC-pelleten fra bunden til et nyt rør, der er fyldt med S-NO-stabiliseringsopløsning (se trin 1.4) (1 ml pellet til 9 ml opløsning) og inkuber i 5 minutter.
    4. Før RBC-lysatet i en størrelseskolonne med G-25 Sephadex-polymer, der tidligere er skyllet medddH20til udelukkelseskromatografi
    5. Indsaml Hb-fraktionen til behandling (afsnit 4) og til måling af Hb-koncentration ved hjælp af Drabkins reagens (for Hb-måling henvises til tidligere offentliggjort arbejde22).
      BEMÆRK: For at forberede og prøve et specifikt væv / organ skal du identificere dets hilum og kirurgisk isolere det. Incise venen, punktere arterien, og injicere med hepariniseret saltvand (10 U / ml) via arterien. Punktafgift vævet, når saltvand begynder at tilbageløb ved det venøse snit. Homogeniser vævet med en mekanisk homogenisator, mens der tilsættes 1 delNO2-blokerende opløsning til 4 dele homogeniseret væv.

3.VCl3 i HCI-assaypræparat

BEMÆRK: For flere detaljer om VCl3 i HCl-assayforberedelse henvises til tidligere offentliggjorte værker37,41.

FORSIGTIG: CLD'en vil blive beskadiget, hvis NaOH-fælden ikke er korrekt på plads, når du udfører dette assay. Dette skyldes ætsning af HCI.

  1. Forbered standardopløsninger af NO3- til standardkurve
    1. 85 mgNaNO3 opløses i 10 ml ddH20 for at opnå 0,1 MNaNO3- (denne opløsning forbliver stabil i et par uger).
    2. Brug stamopløsningen til at fremstille standarder ved fortynding i ddH20 for at opnå koncentrationer på 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 for at udføre en kalibreringskurve for plasma- eller urinprøver (brug lavere koncentrationer, hvis du arbejder med cellekulturer).
  2. VCl3 (vanadiumchlorid) mættet opløsning fremstilles tilNO3-reduktion i udrensningsbeholderen
    FORSIGTIG: Reaktionen af vand ogVCl3 er eksoterm. Vær opmærksom på høj glasvaretemperatur, når du tilsætter syre, og når du skyller glasvarerne i slutningen af eksperimentet.
    1. 1,6 g VCl3 opløses i 200 ml 1 M HCl ved først at tilsætte VCl3 i en ren kolbe og derefter tilsætte 200 ml 1 M HCl.
    2. Vakuumfiltrer opløsningen gennem filterpapir (f.eks. 11 μm filterpapir, men ethvert filterpapir kan bruges).
      BEMÆRK: Den filtrerede opløsning skal blive klar blå, mens den ufiltrerede VCl3-opløsning er brun på grund af uopløste partikler.
    3. Hold den mættede opløsning dækket med enten aluminiumsfolie eller polytetrafluorethylen (PTFE) tape, da forbindelsen er lysfølsom.
  3. Forbered det cirkulerende vandbad
    1. Tilslut en cirkulerende vandbadsanordning til udrensningsbeholderens vandkappe. Sørg for, at linjerne er tørre inden grundning.
    2. Start vandbadet ved 95 °C, og kontroller, at der ikke er lækager på vandledningerne ved at påføre (ikke-adhændelige) køkkenrulle rundt om linjerne.
  4. Sæt gasboblerfælden op
    1. Kontroller, at boblerens PTFE-muffe er på plads, og at den ikke er beskadiget.
    2. Åbn gasbobleren, og injicer 15 ml 1 M NaOH i boblerbasen.
    3. Flyt gasbobleren igen, og forsegl forbindelsen tæt ved at trykke bunden mod toppen og dreje de to dele let. Umuligheden af at dreje toppen af bobleren uden at anvende kraft indikerer en korrekt tætning.
    4. Tilslut udrensningsbeholderens udløb til indløbet til gasboblerfælden.

4. I3- i eddikesyreassaypræparat

BEMÆRK: For flere detaljer om I3- i eddikesyreassaypræparat, se tidligere offentliggjorte værker 15,22,38,41,42.

  1. Forbered standardkurve for NO2-
    1. En stamopløsning fremstilles ved at opløse 69 mg natriumnitrit (NaNO2) i 10 ml ddH20 for at opnå 100 mM opløsning. Denne opløsning er stabil, hvis den opbevares i en lufttæt beholder, nedkølet og beskyttet mod lys.
    2. Fortynd stamopløsningen serielt til 1,5 ml mikrocentrifugerør, der er fyldt med 900 μL ddH2O: Tilsæt 100 μL af stamopløsningen til det første centrifugerør, bland, mærk og brug 100 μL af røret til det andet rør, gentag derefter resulterende i 10 mM, 1 mM og derefter 100 μM.
    3. Yderligere fortyndes medddH20for at opnå 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM og 500 nM NaNO 2-alikvoter, der skal anvendes i kalibreringskurven.
  2. Forbered I3- i eddikesyre til udrensningsbeholderen (kan opbevares ved stuetemperatur (RT) i 1 uge)22
    1. Der tilsættes 2 g kaliumiodid (KI) og 1,3 g jod (I2) til 40 ml ddH20 og 140 ml eddikesyre.
    2. Bland grundigt ved omrøring af blandingen i mindst 30 min.
  3. Prøverne forberedes til differentiel bestemmelse afNO2-, S-nitrosothioler (S-NO-Hb, hvis Hb opsamles) og jern-nitrosylkomplekser (Hb-NO, hvis Hb opsamles) (figur 3)
    1. Hver prøve opdeles i 3 alikvoter på 270 μL (900 μL Hb, hvis der måles S-NO-Hb og Hb-NO) i lysbeskyttede mikrocentrifugerør, hvoraf 2 er fyldt med 30 μL 1x PBS (100 μL ved måling af S-NO-Hb og Hb-NO) og det tredje rør med 30 μL HgCl2 (100 μL, hvis S-NO-Hb og Hb-NO måles) hvirvel og inkubere ved RT i 2 min (figur 3).
    2. Der tilsættes 30 μL 5 % AS til prøven med HgCl2 for at måle Fe-NO'er (100 μL for Hb-NO) og til en med tilsat PBS til måling af S-NO'er og Fe-NO'er (100 μL for S-NO-Hb og Hb-NO), og der tilsættes 30 μL PBS til den tredje, der allerede er fyldt med 1x PBS for at måle NO2-, S-NOO'er og Fe-NO'er (100 μL for resterende NO2- fra Hb-indsamling, S-NO og Hb-NO). Hvirvel og inkuber ved RT i 3 min (figur 3).

5. INTET forbrug ved cellefri Hb-opsætning

BEMÆRK: Du kan finde flere oplysninger i det tidligere offentliggjorte værk38.

  1. Standard oxyHb-opløsninger fremstilles ud fra en renset hb-stamopløsning med en kendt koncentration
    1. Fortynd stamopløsningen serielt i 1,5 ml mikrocentrifugerør ved tilsætning afddH20for at opnå de opløsninger, der skal anvendes til kalibreringskurven: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Forbered DETA-NONOate-opløsningen
    1. Tilsæt 10 mg DETA-NONOate til 610 μL 10 μM NaOH i pH 7,4 PBS for at generere 100 mM DETA-NONOate og holde det på is.

6. Start kemiluminescensdetektoren (CLD), og forbered udrensningsbeholderen

BEMÆRK: For forberedelse af udrensningsbeholderen henvises til det tidligere offentliggjorte værk43.

  1. Kontrollér de vigtigste forbindelser til og fra CLD'en
    1. Tilslut iltledningen til CLD'en, og åbn ilttanken ved et tryk, der er i overensstemmelse med CLD's producent.
    2. Sørg for, at filterlinjen Intense Field Dielectric (IFD) er forbundet til CLD'en, men ikke til udrensningsbeholderen eller NaOH-fælden
  2. Start the CLD
    1. På CLD-grænsefladen skal du begynde at køre detektionsprogrammet til væskefaseassays.
    2. Kontroller, at iltforsyningen er tilstrækkelig. Hvis dette er tilfældet, vil CLD'en med succes begynde at prøve fra sit indløb og indikere detektion med et signal i millivolt (0-5 mV). Ellers vil CLD'en bede om et negativt diagnostisk signal.
  3. Forbered udrensningsbeholderen
    1. Luk udrensningsbeholderen på alle tre porte: Skru nåleventilen helt til højre, luk indløbs- og udløbsstophanerne.
    2. Hætten fjernes fra udrensningsbeholderen, og der tilsættes en tilstrækkelig mængde af det reagens, der er specifikt for det planlagte assay, til reaktionskammeret (tabel 1), således at sprøjtenålen, der anvendes til at injicere prøverne, kan nå væskekolonnen.
    3. Kontrollér tilstedeværelsen af en stabil ønsket basislinje (tabel 1).
  4. Start udrensningsgasstrømmen
    1. Sørg for, at den inerte gastank (f.eks. N2) er udstyret med en to-trins regulator, og tilslut den inerte gastank med beholderens gastilløb.
    2. Åbn gassen med et udløbstryk ved regulatoren på 1-5 psi, åbn indløbet til udrensningsbeholderen og åbn langsomt nåleventilen på udrensningsbeholderen for at tillade tilstrømning af gas. Kontroller boblende i udrensningsbeholderen.
  5. Juster gasstrømmen
    1. Registrer celletrykket målt af CLD'en med IFD-filterledningen, der prøver omgivende luft.
    2. Flyt hætten på udrensningsbeholderen, tilslut IFD-filterledningen til udrensningsbeholderen (eller til NaOH-fælden i VCl3 i HCl-assay), og åbn udrensningsbeholderens udløb.
    3. Brug nåleventilen til at nå det samme celletryk på CLD-niveau, der registreres i den omgivende luft.

7. Forsøg

BEMÆRK: For flere detaljer om eksperimentet henvises til det tidligere offentliggjorte arbejde43.

  1. Start programmet til erhvervelse af kemiluminescenssignaler
    1. Tilslut CLD'ens serielle port til computerens serielle port, som anskaffelsesprogrammet er installeret i.
    2. Kør analyseprogrammet.
    3. Klik på Erhverv, vælg mappen for at gemme .data-filen, indtast filnavnet, og klik på Gem.
      BEMÆRK: Bemærk den forudindstillede kørselstid på skærmen, da optagelsen stopper automatisk, når den forudindstillede tid går. Hvis det er nødvendigt, kan den forudindstillede køretid øges.
  2. Forbered dig på gentagne prøveinjektioner
    1. Juster spændingsskalaen på skærmen for at have kontrol over den målrettede basislinje ved at klikke på knapperne Minimum og / eller Maksimum og derefter indtaste den ønskede værdi.
    2. Få et 20- eller 50 ml rør fyldt med ddH2O for at skylle sprøjten mellem prøverne.
    3. Hav en kasse med delikate arbejdsservietter let tilgængelige.
  3. Prøve injektion
    BEMÆRK: Start fra standardopløsningerne til kalibreringskurven (injicer fra de mindst koncentrerede til de mest koncentrerede prøver), og fortsæt derefter til eksperimentprøverne (overvej at gøre det i dubletter eller triplikater).
    1. Skyl sprøjten mindst to gange eller mere med ddH2O, før hver prøve trækkes ud (og efter hver injektion), og kontroller, hver gang uhindret vandudstødning på en opgaveaftørring.
    2. Indsæt sprøjten i prøverøret, mens du holder både sprøjten og røret i tæt afstand, træk stemplet op til det ønskede volumen, samtidig med at det sikres, at ingen luftboble og / eller ikke-homogeniserede faste dele er fanget.
    3. Rengør spidsen af sprøjten med en opgavevisker, indsæt derefter sprøjten i septahætten ved injektionsporten og injicer efter at have kontrolleret, at spidsen af sprøjten er inden for væskefasen i reaktionskammeret.
  4. Marker injektionen i softwareprogrammet, og vent
    1. Kontroller, at injektionen forårsager en opadgående ændring i signalet (supplerende figur 1) (nedad i NO-forbruget ved cellefri Hb-assay), og skriv prøvenavnet ved at klikke på det grå felt under Prøvenavne, og klik derefter på Markér injektion.
      BEMÆRK: Mistanke om sprøjteobstruktion, hvis prøveinjektionen ikke genererer et signal.
    2. Vent på, at det elektriske signal når baseline igen (dette tager normalt 3-4 minutter). Denne tid kan bruges til at udføre trin 7.3.1.
  5. Gentag alle trin, der er angivet i trin 7.3 og 7.4, under og efter hver injektion indtil forsøgets afslutning. Husk at køre en prøve af konserveringsopløsningen (hvis brugt)
  6. Stop eksperimentet
    1. Klik på STOP for at afbryde signalopsamlingen, stoppe CLD'en og slukke for vandbadet (hvis NO3- måles).
    2. Afbryd gasstrømmen, åbn nåleventilen, fjern hætten fra udrensningsbeholderen, læg en affaldsbeholder under afløbet og åbn den drænende stophane.
      BEMÆRK: Hvis eksperimentet kræver dataindsamling i mere end 60 minutter, er det nødvendigt at genstarte erhvervelsen efter 60 minutters driftstid (gentag trin 7.1.3) og oprette en ny fil.

8. Målinger og beregninger

BEMÆRK: Målinger og beregninger foretages offline og kan udføres på et andet tidspunkt.

  1. Start programmet til erhvervelse af kemiluminescens til offline dataanalyse
    1. Start programmet, og klik på Proces.
    2. Vælg eksperimentfilen, og klik derefter på Åbn.
  2. Beregn arealet under kurven for hver administration
    1. Softwaren graferer automatisk på skærmen basislinjen (supplerende figur 2A, vandret gul linje) og topaksen for hver bølge, der genereres af hver prøveadministration (lodrette gule linjer): Kontroller deres korrekte position (eller juster ved at klikke på hver linje og flytte den med musen eller pilene) og klik på Tærskel OK (supplerende figur 2B).
      BEMÆRK: I NO-forbruget ved cellefri Hb-måleassay formår softwaren typisk ikke at fange bølgeformen genereret ved prøveinjektion korrekt. Ved at zoome på hver bølgeform kan operatøren nemt hjælpe softwaren med arealberegningen (supplerende figur 2).
    2. Softwaren grafer automatisk begyndelsen (lodret grøn linje) og slutningen (lodret rød linje) af hver top forårsaget af hver prøveadministration: Kontroller deres korrekte position (eller juster ved at klikke på hver linje og flytte den med musen eller pilene) og klik på Integrer (supplerende figur 2C).
      BEMÆRK: Nogle områder i sporet kan fejlagtigt defineres som injektioner på dette tidspunkt, og nogle toppe kan automatisk tælles to gange. Begge fejl kan identificeres igen og fjernes i trin 8.2.2
    3. Softwaren matcher automatisk hvert signalområde efter en injektion markeret under eksperimentet og dets tildelte navn: naviger hver top (angivet med en gul lodret linje) med det tildelte navn ved at klikke på Next Peak og Previous Peak, og klik derefter på knappen All OK for endelig at få beregningen for alle områder på skærmen.
    4. For at rette alle navngivnings- eller matchningsfejl, der er foretaget af brugeren eller af programmet, skal du efter behov bruge knapperne angivet i Supplerende fil 1.
  3. Overfør kalibreringskurveværdierne til et regneark, og generer en lineær regressionsligning (supplerende figur 3)
    1. Overfør dataene fra CLD-programmet til et nyt regneark via copy-paste. Arranger de to kolonner i dataarket som Eksempelkoncentration og Areal under kurven, og tilføj en matchet værdi på nul på begge kolonner.
    2. Vælg de to kolonner, klik på Indsæt > scatter, og vælg derefter Tilføj diagramelement under menuen Diagramdesign > Trendlinje > lineær.
    3. Højreklik på den genererede trendlinje, klik på Format Trendline, og klik derefter på indstillingerne Vis ligninger på diagram og Vis R-kvadreret værdi på diagram i menuen Format Trendline for at opnå en simpel lineær kalibreringsligning.
  4. Overfør det beregnede areal af hver prøve for at beregne dens koncentration (supplerende figur 3)
    1. Rapportér alle værdier i regnearket. I den næste kolonne anvendes ligningen opnået fra trin 8.3.3 for at opnå koncentrationen af hver injiceret prøve, hvor y er koncentrationen (værdien af den nye kolonne), og x er arealet under kurven målt efter injektion.
      BEMÆRK: Husk at tage højde for koncentrationen målt i konserveringsopløsningen (hvis den anvendes) og træk værdierne i overensstemmelse hermed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NO-forbruget ved cellefrit Hb-assay blev anvendt i prøver, der indeholdt kendte koncentrationer af cellefri oxyHb (figur 4). Da en hæm af oxyHb stoichiometrisk frigiver et NO-molekyle i analysen, anvendes renset cellefri oxyHb til at opbygge kalibreringskurven for assayet (supplerende figur 3).

Dosis-respons-forholdet mellem cellefri Hb (målt med et kolorimetrisk assay) og INTET forbrug hos patienter, der kommer ud af kardiopulmonal bypass (CPB) under hjertekirurgi, er vist i figur 5. Det kan antages, at der efter CPB er en højere koncentration af hæmgrupper i Hb-Fe2+-O2-status (figur 5, rød) sammenlignet med patienter, der får NO under CPB, hvorfra kun et mindretal af hæmgrupper af cellefri Hb indtager NO (figur 5, grøn).

Protokollen til vurdering af NO forbrug af cellefri Hb blev tidligere anvendt til at teste plasmaprøver fra 50 patienter, der gennemgår hjertekirurgi og kræver CPB. Blod blev indsamlet ved baseline og 15 min, 4 timer og 12 timer efter CPB. Formålet med undersøgelsen var at undersøge det eksisterende forhold mellem både lunge- og systemisk vaskulær resistens og stigningen i hæmolyse observeret efter CPB. Cellefri Hb-koncentration blev vurderet med et Hb-kolorimetrisk assay. Hæmolyse toppede 15 minutter efter CPB. Den akkumulerede frie Hb blev langsomt elimineret fra plasma inden for 12 timer18 (figur 6A). INTET forbrug toppede i stedet ved 15 minutter og nåede baselineværdier på kun 4 timer (figur 6B). Lineære regressionskurver for NO-forbrug ved cellefri Hb udviste et støkiometrisk forhold ved 15 minutters post-CPB-tidspunktet i modsætning til baseline, 4 timer og 12 timer efter CPB (figur 6C). Forklaringen på den observerede forskel i kinetik ligger i overflod af nyligt frigivet fri Hb, der endnu ikke er stødt på INGEN molekyler, der frigives af patientens endotel. Koncentrationen af oxyHb (oprensning af NO og resulterende i forbrug i analysen) var faktisk højere på 15 minutter end på noget andet tidspunkt. Plasma indsamlet ved baseline og på andre tidspunkter havde en relativt højere komponent af metHb, som allerede var blevet oxideret af NO, ikke bandt NO og forårsagede ikke forbrug i assayet. Lunge- og systemisk vaskulær resistens blev målt invasivt og toppede ved 15 min. For første gang i denne specifikke patientpopulation blev DER IKKE observeret noget forbrug af fri Hb at være tidsmæssigt kombineret med vasokonstriktion, hvilket bekræftede tidligere observationer i dyremodeller og hos patienter med seglcellesygdom18.

Administrationen af NO-gas under CPB og efter operationen øger den relative mængde cirkulerende metHb vs. oxyHb. Når patienter, der gennemgik hjertekirurgi, blev behandlet med NO-gas intraoperativt og postoperativt, var den observerede stigning i fri Hb efter CPB (figur 7A) ikke kombineret med nogen stigning i NO-forbruget målt med ovennævnte protokol (figur 7B). Den eksogent administrerede NO-gas omdanner det meste oxyHb til metHb, som igen ikke fjerner NO in vivo eller forbruger NO in vitro (upublicerede data).

Figure 4
Figur 4: Nitrogenoxidforbrug ved oprenset cellefrit oxyhemoglobin. Nitrogenoxidforbrugsassay udført ved injektion af prøver af kendte koncentrationer af oprenset cellefrit oxyhemoglobin. Regressionslinjen vises med rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. Nitrogenoxidforbrug og cellefri hæmoglobinkoncentration fra patienter, der gennemgår hjertekirurgi med kardiopulmonal bypass. Hver patients cellefrie hæmoglobinniveau, målt med et kolorimetrisk kit, blev plottet med nitrogenoxidforbruget (NO) målt gennem kemiluminescens. Blodprøver blev udtaget 15 minutter efter CPB's afslutning. Regressionslinjer vises for hjertekirurgiske patienter, der ikke modtager (i rødt) eller modtager (i grønt) NO under kardiopulmonal bypass (CPB). Hæmoglobin udtrykkes i μM af hæmgrupper. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Nitrogenoxidforbrug og cellefrit hæmoglobin hos hjertekirurgiske patienter. (A) Cellefri hæmoglobin (Hb) koncentration i plasmaet hos patienter, der gennemgår hjertekirurgi med kardiopulmonal bypass (CPB) (N = 50) blev bestemt på forskellige tidspunkter ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kolorimetrisk bestemmelsessæt. Data blev analyseret ved at tilpasse en blandet model med bevis for en fast effekt mellem tidspunkter. Plasmakoncentration på forskellige tidspunkter blev sammenlignet med baseline med Tukeys multiple sammenligningstest. (B) Nitrogenoxid (NO) forbrug af plasma opnået fra de samme prøver, der anvendes til kvantificering af fri Hb. Data blev analyseret ved at montere en blandet model med bevis for en fast effekt mellem tidspunkter. Plasmakoncentration på forskellige tidspunkter blev sammenlignet med baseline med Dunnetts multiple sammenligningstest. (C) Regressionslinjer for cellefrit Hb-plasmaindhold matchet med INTET forbrug. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns ikke signifikant. Data præsenteres som median ± interkvartilområde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Virkninger af administration af nitrogenoxidgas på nitrogenoxidforbrug hos patienter, der gennemgår hjertekirurgi. (A) Cellefri hæmoglobinkoncentration i plasmaet hos patienter, der gennemgår hjertekirurgi med kardiopulmonal bypass (CPB), der enten modtager placebo (N = 28) eller nitrogenoxid (NO) gas (N = 22) i 24 timer siden begyndelsen af CPB. Koncentrationen blev bestemt på forskellige tidspunkter ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kolorimetrisk kit. Data blev analyseret af Friedmans test, hvilket indikerer tilstedeværelsen af en effekt mellem tidspunkter i begge grupper. Plasmakoncentrationen på forskellige tidspunkter blev sammenlignet med baseline med Dunns multiple sammenligningstest. (B) INTET forbrug af plasma opnået fra de samme prøver, der blev anvendt til kvantificering af cellefri Hb. Data blev analyseret ved Friedmans test, hvilket indikerer tilstedeværelsen af en effekt mellem tidspunkter i begge grupper. Plasmakoncentrationen på forskellige tidspunkter blev sammenlignet med baseline med Dunns multiple sammenligningstest. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Data præsenteres som median ± interkvartilområde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Undersøgelse Reagensblanding Målgrundlag (mV)
VCl3 i HCl 5 mlVCl3 i HCL-mættet opløsning + 100 μL skumdæmpende middel 0-5 mV*
I3- i eddikesyre 5-7 ml I 3-reagens 0-5 mV*
INTET forbrug af cellefrit hæmoglobin 5-7 ml PBS ved pH 7,4 + 100 μL skumdæmpende middel + 20 μL ekspanderet DETA-NONOATopløsning 70-100 mV**
*ideel værdi: Baseline kan være højere på grund af luftkvaliteten i forsøgsmiljøet
**sørg for stabilitet i 20 minutter, før eksperimentet påbegyndes.

Tabel 1: Reagenssammensætning af udrensningsbeholdere og målbaseline for forskellige kemiluminescensassays. Sammensætningen af rensningsbeholderreagenset for hvert beskrevet assay. NO = nitrogenoxid; PBS = fosfatbuffer saltvand; DETA-NONOAT: (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat. *ideel værdi: Baseline kan være højere på grund af luftens kvalitet i forsøgsmiljøet. **sørg for stabilitet i 20 minutter, før eksperimentet påbegyndes. For at udføre NO-forbrugsanalysen skal skalaen ændres på softwaren for at fange værdier mellem 70 mV og 100 mV (f.eks. 0-100 mV), som er den målrettede basisspænding. Denne justering foreslås at have fuld kontrol over prøveinjektionen, hvilket gør det muligt at dokumentere signalets bevægelse fra baseline efter injektionen af en prøve og observere signalet, der vender tilbage til basislinjen. Dataregistrering påvirkes ikke af eller begrænses til den visualiserede skala.

Supplerende figur 1: Toppe efter INGEN detektion i VCl3 i HCl-assay. De toppe, der følger prøveadministrationen i VCl3 i HCl, vises på CLD-bundtsoftwaren. Beregning af arealet under toppen for hver injektion er vist for nemheds skyld og forklaret i supplerende figur 2. I dette eksperiment er der administreret standarder for forskellige koncentrationer for kalibreringskurven efterfulgt af plasmaprøver. Fortynding er en nyttig løsning til beregning af metabolitter fra prøver, der giver NO i den høje ende eller endda uden for kalibreringskurven. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Brugerassisteret automatiseret beregning af arealet under toppen. Ved udførelse af NO-forbrugsanalysen med cellefrit hæmoglobin kan det være nødvendigt at indstille toppe manuelt for at give softwaren de mest præcise grænser for at måle området under toppen genereret af hver prøveinjektion. (A) Repræsentativt fuldt overblik over et registreret eksperiment. Det nås ved at klikke på Proces i hovedmenuen og ved at vælge og åbne den optagede fil af interesse. Den gule linje repræsenterer signaltærsklen (mV), der udgør det lige segment af området under toppen. Ved at klikke på det kan brugeren trække det mod signalområdet. X- og y-aksen kan ændres til at zoome på toppen af interesse for præcis måling ved enten at klikke på knapperne nederst til venstre eller ved at indtaste den ønskede minimums- og maksimumsværdi for hver. B) Positionering af tærskler. Brugeren kan vælge den optimale basisgrænse ved at trække den gule linje til signalets midtpunkt lige før signalnedskredningen forårsaget af prøveinjektionen. For at fortsætte med at begrænse området skal brugeren klikke på knappen Indstil spidsbelastninger manuelt . (C) Placering af start- og slutmarkører. Ved at klikke på knappen Indstil startmarkør vises en grøn linje på skærmen. Den grønne linje skal placeres (ved at trække og frigive) i begyndelsen af nedslidningen forårsaget af prøveinjektionen. Den samme knap ændrer sin etiket til Indstil slutmarkør ved at klikke på, hvilken rød linje der vises på skærmen. Den røde linje skal placeres på det sted, hvor signalet når basislinjen igen efter afbøjningen forårsaget af INTET forbrug fra den injicerede prøve. Alt i alt skitserer tærskellinjen (gul, B), den grønne linje og den røde linje nøjagtigt det område, der genereres af prøveinjektionen. (D) Giver arealet under toppen. Ved at klikke på knappen Integrer (C) vises det beregnede område under toppen øverst til højre på skærmen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Repræsentativt regneark med kalibreringskurve og resultater. De beregnede områder under toppe genereret ved indtagelse af nitrogenoxid (NO) ved injektion af prøver med en kendt koncentration af cellefrit hæmoglobin (udtrykt som [μM] hæm) er vist øverst til venstre (på gul baggrund). Værdierne er afbildet for at opbygge kalibreringskurven og dens resulterende lineære ligning y = mx + q. Hældningen (m) er antallet af oxyHb-hæmgrupper (μM), der kræves for at reducere signalet detekteret af fotomultiplikatorrøret med 1 mV. Beregnede værdier fra tredobbelte injektioner (Run N 1,2,3) af prøver fra en patient opnået på fire forskellige tidspunkter (markeret med forskellige baggrundsfarver) blev indtastet i regnearket. Gennemsnittet af hvert triplikat blev brugt til at give værdien af INTET forbrug forårsaget af hver prøve ved at løse den lineære ligning: Klik her for at downloade denne fil.

Equation 1

Supplerende fil 1: Gennemgang af toppe ved hjælp af den medfølgende software. Denne fil indeholder et skærmbillede taget fra den medfølgende software og de handlinger, der er tilladt for hver knap. For hver top (herunder falske toppe forårsaget af artefakter) kan brugeren bruge de knapper, der er angivet i filen, til at bekræfte eller se bort fra eller slette eller navngive en bestemt top efter behov. Brugeren kan også registrere en top, der ikke tidligere blev registreret. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grund af den høje følsomhed har kemiluminescensbaserede assays til bestemmelse af NO og beslægtede forbindelser en høj risiko for NO 2-kontaminering. Hvert reagens (isærNO2-blokerende opløsning) og fortyndingsmiddel (herunder ddH2O), der anvendes i forsøget, bør testes for dets NO 2-indhold for at korrigere for baggrundssignal. Nitrit er ekstremt reaktivt med en halveringstid i fuldblod omkring 10 min og genererer hurtigt NO3-. Den tid, der går mellem blodopsamling og centrifugering, eller NO 2-blokering, kan derfor forårsage præanalytiske fejl og bør minimeres15. I et assay ved hjælp af plasmaprøver opsamles blod fortrinsvis i heparinrør og centrifuge ved 750 x g i 5 minutter ved 4 °C efter thiolgruppeblokade med 40 μL 200 nM NEM produceret ved opløsning af 250 mg NEM i 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS). Stamopløsningen kan opbevares ved 4 °C. Forbindelser såsom nitroarginin, nitroprussid og nitroglycerin, der hæmmer NO-syntase (NOS), gennemgår langsom ikke-kvantitativ omdannelse til NO, hvilket resulterer i en baseline-højde. Hvis brugen af NOS-hæmmere er en del af undersøgelsen, anbefales det, at blokkere, der ikke indeholder nitrogrupper, anvendes43. Indløbstrykket i udrensningsbeholderen skal svare til det kontinuerlige undertryk, som CLD'en foretager til prøveudtagning. Hvis indløbstrykket er lavt, kan vakuumdestillationen af mediet føre til kontaminerede gasrensningsledninger og -kamre, hvilket resulterer i signalforvrængning. Desuden kan små mængder luft komme ind i udrensningsbeholderen og reagere med opløsningen for at generere overdreven NO. Tværtimod kan for stort tryk forårsaget af en strømningshastighed, der er højere end prøveudtagningsstrømmen, frigive NO i atmosfæren, hvilket fører til en undervurdering af signalet15. Derudover kræver både VCl3 i HCI ogI3- i eddikesyreprotokollen flere fortyndinger under forberedelsen og flere beregninger for at give prøvekoncentration. Hvert trin skal registreres omhyggeligt, da fortyndinger og beregninger anerkendes af mange grupper som den vigtigste fejlkilde44.

Tilsætning af NO 2-blokerende opløsning (trin 2.1.2) får røde blodlegemer til at lyse, hvilket reducerer al OxyHb til MetHb. Det undgår hurtig reduktion af jernholdige proteiner (primært OxyHb) medNO2- med efterfølgende generation af NO3-. Behandling af prøver med denne opløsning ved indsamling er nødvendig for korrekt måling af NO2- og/eller NO3-. I modsætning hertil bør opløsningen ikke anvendes ved planlægning af NO-forbruget ved cellefri Hb-assay. Aliquots af NO 2-blokerende opløsning skal opbevares sammen med prøverne og bruges til at fjerne den del af signalet, der er forårsaget af selve opløsningen. Endelig bør fortyndingsfaktorerne tages i betragtning ved beregningen af den endelige koncentration af den målte metabolit. II3- i eddikesyreassay opnåsNO2-koncentrationen ved at trække koncentrationen af alikvoten indeholdende AS udenHgCl2 (S-NO og Fe-NO) fra koncentrationen af alikvote, der kun indeholder PBS (NO2-, S-NO, Fe-NO). For at beregne koncentrationen af S-NO (kviksølv-labile proteiner) bør koncentrationen af alikvoten behandlet med AS medHgCl2 (Fe-NO'er eller kviksølvstabile nitrosoproteiner) trækkes fra koncentrationen af alikvoten behandlet med AS uden HgCl2. Før fratrækningen skal brugeren huske at gange hver alikvots koncentration med 0,8181 (270/330) for at tage hensyn til den fortyndingsfaktor, der blev anvendt under prøvepræparater (figur 3). Det samme koncept gælder for S-NO-Hb og Hb-NO måling, hvor absolutte koncentrationer er en brøkdel af målt Hb22. Afhængigt af prøvetypen kan en præcis optælling afNO3-koncentrationen kræve, at der køres bådeVCl3 i HCl-protokollen og I3-i eddikesyreprotokollen for endelig at trække koncentrationen afNO2- fra koncentrationen afNO3- og NO2-. Dette er ikke altid nødvendigt i f.eks. fuldblods- og plasmaprøver, hvor NO3- typisk langt overstiger NO2-.

Det er meget vigtigt at minde om, at CLD vil blive beskadiget, hvis NaOH-fælden ikke er på det rette sted, når du udfører en VCl3 i HCL-assay på grund af HCI's ætsning. Den 1 M NaOH-opløsning, der anvendes til at fylde NaOH-fælden, kan købes eller fremstilles enten ved at opløse 4 g NaOH-salt i 100 mlddH20eller ved fortynding af 5 ml 50 % NaOH i 100 ml ddH20. Når den fortyndes yderligere til 10 μM medddH20, er NaOH meget nyttig til at fjerne proteinaffald ved injektion i udrensningsbeholderen.

Det udgangssignal, der detekteres af CLD'en, skal være stabilt og inden for 0-5 mV. Et højere basissignal kan være forårsaget af luftforurening (ved NO og derivater), og dette kan verificeres ved at lade indslusningstå være i fri luft. Hvis der kun observeres en højere spænding i udrensningsbeholderen, mens forurening af tanken med inert gas bør overvejes, skyldes det oftest vedholdenheden af organiske rester eller tilstedeværelsen af NO2- i røret. Vask af udrensningsbeholderen flere gange med ddH2O kan hjælpe med at minimere basisspændingen. Hvis det ikke lykkes, hjælper inkubationen af udrensningsbeholderen med 100 mM NaOH i 24-48 timer efterfulgt af flere vaske medddH20med at eliminere forurenende stoffer. I NO-forbruget ved cellefri Hb-assay er det krævede CLD-signal 70-100 mV i mindst 20-30 minutter. Hvis signalet ikke er stabilt (dvs. spændingen falder), kan der tilsættes en ekstra dosis på 10 μL DETA NONOate til udrensningsbeholderen. Dette kan gentages efter behov. Det er vigtigt at huske, at både ubrugt pulver og allerede udvidet DETA NONOate skal opbevares ved -80 °C. Dette reagens henfalder hurtigt på trods af optimal opbevaring og underpræsterer måske, når det ikke er frisklavet, hvilket kræver flere injektioner i udrensningsbeholderen og fører til et mindre stabilt isoelektrisk signal. Endnu vigtigere bør det udvides i PBS med pH 7,4, da dette optimerer dets halveringstid (56 timer ved pH 7,4 ved stuetemperatur vs. kvasi-øjeblikkelig dissociation ved pH på 5,0)45. Den sprøjte, der anvendes til injektion af DETA NONOate, bør udelukkende være dedikeret til denne virkning og må ikke anvendes til injektion af prøver.

Hvis injektionen af en prøve genererer en top, der er højere end kalibreringskurvens øverste punkt, især hvis den genererer en spænding højere end 700 mv, anbefales det at fortynde prøven (2x eller 4x) for at minimere fejl. Dette gælder også for NO-forbrugsanalysen, hvis det dyk, der er forårsaget af prøveinjektionen, er dybere end det, der er forårsaget af injektionen af den mest koncentrerede prøve, der anvendes i kalibreringskurven. Beviset for en top (eller en gennem) i signal efter injektion, der er mindre end forventet eller fraværende, kan indikere tilstopning af præcisionssprøjten, der anvendes til injektion. På grund af de små mængder, der anvendes (10-20 μL/prøve), især hvis der udføres plasma- eller urinassays, kan det være vanskeligt at skelne mellem en fyldt sprøjte og fraværet af prøven på grund af tilstopning af sprøjten. Det anbefales at være opmærksom på modstanden fra stemplet. Efter bekræftelse ved inspektion af sprøjten kan fjernelse af forhindringen forsøges ved gentagne gange at vaske sprøjten medddH20og ved at gnide sprøjten på en delikat opgaveaftørring, hvis forhindringen er eksternt synlig. I tvivlstilfælde anbefales det at skubbe prøvevolumenet ud på en opgaveaftørring og gå tilbage for at vaske sprøjten med ddH2O og forsøge at gentage prøveadministrationen. Skumdannelse er en almindelig komplikation og tvinger eksperimentet til at blive afsluttet, når højden af væskekolonnen overstiger reaktionskolonnens, hvilket forårsager signalstabilitet. Overskridelse af den dosis af skumdæmpende middel, der er angivet i forsøgsprotokollen, kan føre til en stigning i basislinjesignalet og bør undgås. Antallet af prøver, der forårsager dannelse af overdreven skumdannelse, bliver forudsigeligt, når gentagne assays udføres, et fænomen, der skal informere, hvordan eksperimentet kan planlægges optimalt. Et valgfrit trin til at reducere skumdannelse er at blande plasma eller vævssupernatant med kold methanol (forhold 1: 1) og centrifuge i 15 minutter, 13000 x g ved 4 ° C. Det bør overvejes, at methanol får proteiner til at udfælde. Kun lette S-NOs og Fe-NOs, der ikke er proteiske i naturen, måles. Dermed kan denne mulighed ikke anvendes i undersøgelser af fuldblod eller i andre tilfælde, hvor der er interesse for S-NO- og Fe-NO-proteiner.

Flere andre reagensopløsninger endVCl3 i HCl ogI3-i eddikesyre er blevet beskrevet og vedtaget med succes. Ascorbinsyre reducerer specifikt NO2-, reagerer ikke med NO3- eller S-NO'er og kan bruges til at reducere hovedparten af injicerede prøver og beregninger i situationer, hvor NO2- er det eneste molekyle af interesse. Den største faldgrube er reagensets begrænsede stabilitet, hvilket kræver hyppigere ændringer af reagensopløsningen og dermed gentagne kalibreringer46. Et assay ved hjælp af kulilte og cuprouschlorid (CuCl)-mættet cystein (3C-metode) kan specifikt detektere S-NO'er med en følsomhed, der er sammenlignelig med I3- men stadig kræver behandling med og uden HgCl2 for at undgå ikke-specifikke reaktioner47. For at opnå højere præcision i signalanalyse registreres eksperimenter i .data-formatet, så offline bølgeformanalyse kan afsluttes med anden software end det bundtprogram, der er vist i protokollen.

Når den første injektion er foretaget, kan eksperimentet ikke stoppes. Hvis der er behov for en pause, og/eller hvis en betingelse ændres (sammensætningen af udrensningsbeholdermediet, udrensningsgasstrømmen, basisspændingen), er forsøget kun gyldigt for de prøver, der er injiceret i imidlertid. Der bør udføres en ny standardkurve, inden flere prøver måles. Den præcision, der tillades af kemiluminescensbaserede assays, kommer med en pris. Analyserne er tidskrævende af en række årsager: 1) automatisering er ikke mulig, da manuel prøveinjektion er påkrævet i dubletter; 2) de fleste reagenser, der anvendes, kan ikke lagres i lange perioder; 3) hvert forsøg skal startes ved at køre standardprøver i kendte koncentrationer til kalibrering og kan ikke sættes på pause, medmindre kalibreringen gentages. 4) Hver prøve er opdelt i alikvoter indeholdende forskellige blandinger af reagenser for at blokere specifikke reaktioner for endeligt at beregne koncentrationen af specifikke metabolitter ved at trække andre fra.

Dette arbejde er fokuseret på enheden Zysense NOA 280i, som har en detektionstærskel på <1 ppb NO i gasfasen (svarende til op til 1 pM NO i væskefasen) og en prøveudtagningsstrøm på 10-300 ml/ min. Andre CLD'er fås med et bundtrørssystem til måling af metabolitter i væskefasen. Økofysiske CLD'er har en højere følsomhedstærskel, 1 ppb i deres mest følsomme model, men fordelen ved ikke at kræve en ilttank til ozongenerering. På den anden side er deres rapporterede prøveudtagningsstrøm 1000 ml / min, hvilket indebærer et højere forbrug af den inerte gastank, der anvendes til udrensningsbeholderen. Andre CLD-maskiner er dedikeret til udånding NO-analyse til klinisk brug.

Chemiluminescens er den mest følsomme og validerede metode til specifikt at vurdere INTET forbrug af cellefri Hb inden for hæmolyse. Andre teknikker er tilgængelige til måling af NO, NO2-, NO3-, S-NO'er og kviksølv-labile nitrosoforbindelser. Den direkte måling af NO-gas kan opnås enten ved kemiluminescens eller ved anvendelse af dedikerede elektroder, der spænder fra måling af udåndingsgassen til enkeltcelleelektroder. Disse måler kun INGEN gas, er billigere (men alligevel mere letfordærvelige), kræver kalibrering oftere og er mindre præcise sammenlignet med en CLD31. Nitrit og NO3- er historisk blevet målt med Griess-reaktionen, en kolorimetrisk teknik, der i sin oprindelige version detekterer begge molekyler uden mulighed for at skelne mellem deres relative koncentration i prøven. Moderne varianter af teknikken involverer omvendt fasekromatografi ved anvendelse af adskillelse af prøven i to kolonner, hvilket muliggør to uafhængige reaktioner med NO3- og NO2-. Følsomheden af disse metoder er mikromolær eller lidt mindre sammenlignet med 1 nM med CLD. De vigtigste faldgruber er tidsforbrug og uforenelighed med prøver, der er forbehandlet med kviksølv og/ellerferricyanid 14. S-INO'er kan også detekteres med kolorimetriske og fluorometriske teknikker med en følsomhed på op til 0,5 μM sammenlignet med 100 fM beskrevet ved anvendelse af kemiluminescens som vist i I3- i eddikesyreprotokol 14,41,42. Biotin-switch-assayet, på trods af at det ikke er muligt at detektere S-NOM'er i det picomolære område, har den fordel, at det genererer biotinmærkede proteiner, der kan renses og identificeres med proteomisk analyse48. Når man ser nærmere på den, deler hver teknik en fælles faldgrube, som er den ekstreme reaktivitet af NO og dens derivater, der kræver blokade af reaktioner med henblik på in vitro-måling. Forbehandling af prøver er kritisk, og besvarelsen af spørgsmålet om, hvorvidt en bestemt forbehandling fuldstændig blokerer for en reaktion eller gør det bedre end en anden, har hidtil været en drivkraft i retning af en stigning i metodologiske undersøgelser. Mens den ekstreme reaktivitet in vivo af NO helt sikkert har været et drev til at undersøge følsomme metoder til påvisning af dets metabolitter, har direkte måling af NO mødt betydelige fremskridt i de sidste tre årtier, siden den første amperometriske detektor blev udviklet i 1990. Mere end tyve forskellige sonder er blevet beskrevet siden da, herunder nanosensorer, der bruges til at studere enkeltcellet NO-indhold49. Elektrokemiske sensorer er de vigtigste værktøjer, der kan registrere NO både in vivo og i realtid. I lungemedicin har flere undersøgelser sammenlignet elektrodebaserede maskiner med CLD'er. Måling af udåndet NO er mere enkel end andre assays til metabolitdetektion, hvilket kræver enten direkte forbindelse af gasledningen (via IFD-filter) til et lukket åndedrætstillæg eller et par vejrtrækninger i en pose til offline analyse, men omkostningerne og dårligere bærbarhed af CLD'er står stille. En række elektrokemiske anordninger opfylder i øjeblikket kriterierne for klinisk brug, selv om de har lavere følsomhed og reproducerbarhed sammenlignet med CLD'er. Desuden er konkordansen med hensyn til absolutte målte værdier suboptimal mellem udstyr, så det anbefales, at patienterne altid følges op med det samme elektrokemiskeudstyr 50. Anvendelsen af CLD'er i indstillinger som måling nasal udånding NO og i forskningsmiljøer som terapeutisk lav og højdosis inhaleret NO er stadig nødvendig.

Præcise målinger af NO, dets derivater og NO-bindende proteiner er nødvendige på mange niveauer for at forstå en overset og stadig for det meste ukendt signalmekanisme. Anvendelsesområderne spænder over biologi og patologi på både præklinisk og klinisk niveau med specifikke målområder, herunder immunbiologi, neurovidenskab, kardiovaskulær videnskab og infektionssygdomme. Prækliniske undersøgelser og kliniske forsøg undersøger brugen af inhaleret NO-gas som terapeutisk middel. Der vil være behov for dybere viden om, hvordan eksogen NO-gas påvirker koncentrationen af NO-metabolitter og NO-bundne proteiner på alle niveauer, fra plasma til cellerum. Implementering af proteomics med højt udbytte kan sandsynligvis øge antallet af kendte mediatorer, der påvirkes af NO og derivater heraf, og kan give mandat til nye mekanistiske undersøgelser, der kræver præcise målinger af NO-metabolitter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.B. modtager lønstøtte fra K23 HL128882/NHLBI NIH som hovedforsker for sit arbejde med hæmolyse og nitrogenoxid. LB modtager tilskud fra "Fast Grants for COVID-19 research" på Mercatus Center ved George Mason University og fra iNO Therapeutics LLC. B.Y. er støttet af tilskud fra en NHLBI/#R21HL130956 og DOD/Genève Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. modtog patenter på MGH på elektrisk produktion af nitrogenoxid.

L.B. og B.Y. har indgivet patentansøgning om INGEN levering i COVID-19 sygdom PCT ansøgningsnummer: PCT / US2021 / 036269 indgivet den 7. juni 2021. RWC modtager lønstøtte fra Unitaid som hovedforsker for teknologiudvikling rettet mod decentral diagnose af tuberkulose hos børn beliggende i lavressourceindstillinger.

Acknowledgments

Protokollerne rapporteret i dette manuskript blev muliggjort af de akkumulerede bidrag fra tidligere stipendiater fra Dr. Warren Zapols laboratorium for anæstesiforskning i kritisk pleje, Anæstesiafdelingen på Massachusetts General Hospital. Vi anerkender bidraget fra Dr. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli og Emanuele Rezoagli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186 (1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550 (2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550 (2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238 (2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879 (2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Tags

Medicin udgave 180
Chemiluminescensbaserede assays til påvisning af nitrogenoxid og derivater heraf fra autoxidation og nitroserede forbindelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R.… More

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter