Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kemiluminescensbaserade analyser för detektion av kväveoxid och dess derivat från autoxidation och nitroserade föreningar

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Här presenterar vi protokoll för att detektera kväveoxid och dess biologiskt relevanta derivat med hjälp av kemiluminescensbaserade analyser med hög känslighet.

Abstract

Kväveoxid (NO) aktivitet in vivo är de kombinerade resultaten av dess direkta effekter, verkan av dess derivat genererade från NO-autoxidation och effekterna av nitroserade föreningar. Mätning av NO-metaboliter är avgörande för att studera NO-aktivitet både vid vaskulära nivåer och i andra vävnader, särskilt i experimentella miljöer där exogent NO administreras. Ozonbaserade kemiluminescensanalyser möjliggör exakta mätningar av NO- och NO-metaboliter i både vätskor (inklusive plasma, vävnadshomogenater, cellkulturer) och gasblandningar (t.ex. utandad andedräkt). NO reagerar med ozon för att generera kvävedioxid i ett upphetsat tillstånd. Den därav följande ljusemissionen möjliggör fotodesektion och generering av en elektrisk signal som återspeglar NO-innehållet i provet. Alikvoter från samma prov kan användas för att mäta specifika NO-metaboliter, såsom nitrat, nitrit, S-nitrosotiolaler och järn-nitrosylkomplex. Dessutom kvantifieras NO som konsumeras av cellfritt hemoglobin också med kemiluminescensanalys. En illustration av alla dessa tekniker tillhandahålls.

Introduction

Sedan Salvador Moncada och Nobelpristagarna Robert Furchgott, Louis Ignarro och Ferid Murad identifierade kväveoxid (NO) som den tidigare kända endotel-härledda avslappningsfaktorn (EDRF), har NO: s centrala roll fastställts i flera nyckelmekanismer som spänner över hela vaskulär biologi, neurovetenskap, metabolism och värdrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Exogen administrering av NO-gas har blivit en etablerad behandling för andningssvikt på grund av pulmonell hypertension hos nyfödda8. Kväveoxidgas har också undersökts för behandling av respiratorisk syncytialvirusinfektion (RSV), malaria och andra infektionssjukdomar, ischemi-reperfusionsskada och för förebyggande av akut njurskada hos patienter som genomgår hjärtkirurgi 9,10,11,12. Behovet av exakta mättekniker för att bedöma nivåerna av NO, dess metaboliter och nivåerna av dess målproteiner och föreningar härrör från både mekanistiska och interventionella studier.

På grund av sin höga reaktivitet kan NO genomgå olika reaktioner beroende på den biologiska matrisen i vilken den produceras och/eller friges. I frånvaro av hemoglobin (Hb) eller andra oxihemoproteiner oxideras NO nästan helt till nitrit (NO2-).

2NO + O2 →2NO2

NO2 + NO →N2O3

N2O3+H2O→NO2- + H +

NO genomgår först autoxidation med molekylärt syre (O2) för att ge kvävedioxid (NO2) och reagerar med NO2 själv för att generera dikvävetrioxid (N2O3). En molekyl avN2O3reagerar med vatten (H2O) för att bilda två molekyler av NO2- och en proton (H+)13. Inom helblodomvandlas 14,15, NO och NO2- snabbt till nitrat (NO3-) eftersom dessa molekyler reagerar ivrigt med de oxiderade hemgrupperna av Hb [Hb-Fe2+-O2 eller oxyhemoglobin (oxyHb)] för att ge NO 3-. Denna reaktion är kopplad till övergången av hemgruppen till järntillståndet [Hb-Fe3+ eller methemoglobin (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + INGEN → Hb-Fe3+ + NO3-

Barriären för röda blodkroppar (RBC) och utrymmet omedelbart intill endotelet är de viktigaste faktorerna som begränsar denna reaktion och tillåter en liten del av NO som frigörs av endotelet att fungera som EDRF16,17. Faktum är att cellfritt Hb i cirkulationen är känt för att störa vasodilatation i experimentella och kliniska miljöer17,18. Inom RBC, beroende på syresättning och NO 2-koncentration, reagerar en del av NO med deoxihemoglobin (Hb-Fe2+) för att bilda järn-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO eller HbNO):

Hb-Fe2+ + INGEN → Hb-Fe2+-NO

I RBC15,17 kan NO2- bilda Hb-Fe3+ genom att reducera Hb-Fe2+ vilket leder till frisättning av NO, vilket i sin tur binder Hb-Fe2+-O2 (företrädesvis) eller Hb-Fe2+.

Genereringen av NO-derivat bör inte betraktas som strikt enkelriktad eftersom NO kan regenereras från NO2- ochNO3- i olika vävnader och av olika enzymer (t.ex. av tarmbakterier eller inom mitokondrier, särskilt under hypoxiska förhållanden)19,20.

En varierande mängd NO som produceras (eller administreras) leder till nedströms generering av S-nitrosotioler, huvudsakligen genom tioltransnitrosation frånN2O3i närvaro av en nukleofil som skapar en NO+ givarmediär (Nuc-NO+-NO2-):

N2O3+ RS- → RS-NO + NO 2-

En annan möjlighet för S-nitrosotioler generering är nitrosylering av oxiderade tioler (NO reagerar med en oxiderad tiol):

RS• + INGEN → RS-NO

Denna mekanism och direkt tioloxidation med NO2 kan vara möjlig endast under mycket specifika förhållanden som beskrivs någon annanstans21. S-nitrosotioler sträcker sig från ljusmolekyler som S-nitrosoglutation till stora tiolhaltiga proteiner. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) bildas genom nitrosering av en tiolgrupp av en konserverad cysteinrest i β-chain (β93C)22.

Genereringen och metabolismen av S-nitrosotiolaler är en del av viktiga regleringsmekanismer. Exempel inkluderar reglering av glutation, kaspaser, N-metyl-D-aspartat (NMDA) och ryanodinreceptorer 23,24,25,26,27,28. Nitroserat albumin (S-nitroso-albumin) har tidigare betraktats som en viktig medlare av NO-biologi in vivo och verkar vara en NO/NO+-transportör utan någon specifik ytterligare biologisk aktivitet29.

Vid mätning av koncentrationen av NO och dess derivat från ett specifikt biologiskt prov inom en biologisk matris är det viktigt att överväga egenskaper som surhet, syresättning, temperatur och närvaron av reagenser. Exempel inkluderar administrerade exogena NO-givare och, vid inställning av akut inflammation, väteperoxid (H2O2) som reagerar med NO2 vilket leder till generering av supernormal koncentration av fria radikaler som peroxinitrit (ONOO-)21. Förutom den analysmetod som används är den preanalytiska fasen av provberedning och lagring grundläggande. Reaktioner nedströms som inte representerar in vivo NO-aktiviteten ska förutsägas, beaktas och blockeras. Ett giltigt exempel är instabiliteten hos S-NO-Hb, som kräver en särskild behandling av blodprover när den är avsedd för mätning22.

Kemiluminescensbaserade analyser är guldstandarden för att detektera nivåerna av NO och dess huvudmetaboliter [NO 2-,NO3-, S-NO och järn-nitrosylkomplex (Fe-NO)] i någon biologisk vätska, inklusive vävnadshomogenater 30,31. Dessa metoder bygger på kemiluminescensdetektorn (CLD), en anordning som rymmer reaktionen av NO med ozon (O3), vilket genererar NO2 i ett exciterat tillstånd (NO2•). Avslappning av NO2• orsakar utsläpp av en foton av ljus som detekteras av ett fotomultiplikerarrör, vilket genererar en elektrisk signal som är direkt proportionell mot NO-halten i den samplade gasblandningen32. Ett förenklat schema över CLD representeras.

Figure 1
Figur 1: Förenklat schema över en kemiluminescensdetektor för kväveoxidgas. Kemiluminescensbaserad detektion av kväveoxid (NO) är den stökiometriska generationen av en foton per NO-gasmolekyl som införs i kemiluminescensdetektorn (CLD). Kemiluminescensreaktionen erhålles i en utsedd kammare försedd med ozon (O3) från en intern generator, som hålls vid undertryck genom anslutning till en extern pump, vilket möjliggör kontinuerligt och konstant inflöde av provgas. Genereringen avO3 kräver diatomiskt syre (O2) som levereras av en dedikeradO2-tank ansluten till CLD (andra tillverkare tillhandahåller CLD som arbetar med omgivande luft). Inom reaktionskammaren reagerar varje molekyl av NO-gas som finns i den provterade gasen med syre för att ge en molekyl kvävedioxid i aktiverat tillstånd (NO2*). Genom att återgå till sitt marktillstånd avger varjeNO2*-molekyl en foton som detekteras av ett fotomultiplikorrör (PMT) som ligger intill reaktionskammaren. PMT med tillhörande förstärkare och centralprocessor producerar en signal som är proportionell mot fotontalet och antalet NO-molekyler i reaktionskammaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.

CLD:s provingringsprov kan anslutas till ett glassystem som innehåller en reaktionskammare för vätskeprover. Systemet rensas kontinuerligt med en inert gas såsom kväve, helium eller argon, vilket överför NO från reaktionskammaren till CLD. Vätskefasprover injiceras genom ett dedikerat membran i reningskärlet.

Figure 2
Figur 2: Struktur av ett reningskärl för kemiluminescensbaserad detektion av kväveoxidgas Reningskärlet (höger) möjliggör detektion av kväveoxid (NO) gas eller någon annan förening som lätt kan omvandlas till INGEN gas när den frigörs från ett vätskefasreagens. Det inerta gasinloppet är anslutet till en källa (tank) till en inert gas såsom Argon, Xeon eller diatomiskt kväve (N2). Nålventilen (öppnas till vänster) används för tryckreglering i reningskärlet och kan tas bort helt för att rengöra kärlet. Injektionsporten är täckt av ett lock med ett membranseptum för provinjektion. Membranet bör bytas ut ofta. En uppvärmd mantel omger reaktionskammaren och är ansluten till ett varmvattenbad för att utföra VCl3 i HCl-analysen. Reningskärlets utlopp är anslutet till kemiluminescensdetektorn (CLD) eller till NaOH-fällan (krävs för VCl3 i HCl-analyser). För att tömma reaktionskammarens innehåll, stäng först stoppkranarna vid det inerta gasinloppet och rensningskärlets utlopp, stäng nålventilen, ta bort locket vid injektionsporten och öppna slutligen stoppkranen vid avloppet. NaOH-fällan (vänster) måste placeras inline mellan reningskärlet och CLD om VCl3 i HCl-analysen utförs på grund av frätandet av HCl. Anslutningen till CLD kräver alltid att ett intensivt fältdielektriskt (IFD) filter placeras mellan CLD och utgången från rensningskärlet (eller NaOH-fällan, om den används). IFD-filtret tar bort luftburna partiklar och hindrar vätska från att passera genom reningskärlet. PTFE = polytetrafluoretylen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Som en konsekvens kan varje förening som kan omvandlas till NO genom en specifik och kontrollerad kemisk reaktion detekteras med hög känslighet i vilken biologisk vätska och vävnadshomogenat som helst24. Direkt mätning av gasfas NO genom kemiluminescens utförs i både experimentella och kliniska miljöer. Dessa tekniker beskrivs utförligt någon annanstans 33,34,35. Mätning av NO2-, S-nitrosotioler, S-nitroserade proteiner och Fe-NOs kan utföras genom tillsats av prover i en reaktionsblandning med trijodid (I3-), som stökiometriskt frigör INGEN gas från alla dessa föreningar:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO +I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

medan jag3- inte reagerar med NO 3-15. Exakta mätningar av varje förening möjliggörs genom förbehandling av provalikvoter med surgjord sulfanilamid (AS) med eller utan kvicksilverklorid (HgCl2). Specifikt tar förbehandling med AS bort allt NO 2-innehåll. Till följd av detta återspeglar NO-halten mätt med CLD endast summan av koncentrationen av S-NOs och Fe-NOs. Injektion avHgCl2 i ett prov alikvot före AS-injektion orsakar att NO2- frigörs av S-NO. Behandling med AS (vilket leder till borttagning av NO2) säkerställer att den uppmätta NO-halten endast återspeglar koncentrationen av Fe-NO. En serie subtraktioner mellan bedömningarna gör det möjligt att beräkna den exakta koncentrationen av de tre NO-derivaten22.

Figure 3
Figur 3: Steg i provberedningen för I3- i ättiksyrakemiluminiscensanalysen. De sekventiella stegen för framställning av I3- i ättiksyrakemiluminiscensanalys illustreras. Användning av ljusskyddade centrifugrör krävs. Rör 1, 2 och 3 är de som används för att förbereda sig för analysen. En annan provalimit (rör 4) behövs förVCl3 i HCl-analysen om mätning av nitrat (NO3-) krävs. Steg indikeras med siffror i rött. Förfyllning (steg 1) enligt vad som anges med fosfatbuffertsaltlösning (PBS) ellerHgCl2 innan provvolymen tillsätts. Tillsätt provvolymen (2) enligt anvisningarna, virvel och inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur (RT). Tillsätt (3) PBS eller surgjord sulfanilamid (AS) enligt anvisningarna, virvel och inkubera i 3 min vid RT. Kör analysen (4). Den koncentration som mäts med analysen är summan av koncentrationen av de föreningar som rapporterats under varje rör. Rör nummer 1 möjliggör mätningar av nitrit (NO2-), S-nitrosotiolaler (S-NO) och järn-nitrosylkomplex (Fe-NOs) som en enda signal. För nitratmätning (NO3-) ska proverna köras med både I 3-i ättiksyra och VCl3 i HCl-analyser, och det värde som erhålls från rör 1 ska subtraheras från det som erhålls från rör 4. *föreslagna kvantiteter som ska användas för Hb-analys för bestämning av kvarvarande NO2-, S-nitrosohemoglobin och järn-nitrosyl-hemoglobin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För NO 3-mätning används vanadin (III)klorid (VCl3) i saltsyra (HCl) för omvandling av NO3- till NO i reningskärlet för att mäta NO 3-stökiometriskt med CLD:

2 NO3-+ 3V + 3 + 2H2 O → 2NO+ 3VO2+ + 4H+

För att uppnå en tillräckligt snabb omvandling måste reaktionen utföras vid 90-95 °C. Reduktion från NO3- till NO2- är kopplad till reduktion av NO2- till NO med HCl. Vanadinmetall minskar också S-NOs som frigör sin NO-del22,36. Den slutliga koncentrationen erhållen genom CLD medVCl3 i HCl återspeglar den aggregerade koncentrationen avNO3-,NO2- och andra nitroserade föreningar. Subtraktion av det senare värdet från den koncentration som avges med CLD med I3- möjliggör beräkning av NO 3-koncentration 36,37 (figur 3).

I NO-konsumtionsanalysen genererar den kontinuerliga frisättningen av NO i reningskärlet av NO-givare som (Z)-1-[2-(2-aminoetyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate) en stabil signal som möjliggör kvantifiering av cellfri oxyHb i de injicerade proverna. Mängden NO som konsumeras i reningskärlet är i ett stökiometriskt förhållande till mängden oxyHb i provet38.

Protokoll för mätning av NO2-,NO3-, S-nitrosotiolaler, järn-nitrosylkomplex och NO-konsumtion med cellfritt Hb i plasmaprover illustreras. Studier av NO i RBC-miljön kräver specifik provbehandling följt av uteslutningskromatografi för att mäta extremt ömtålig S-NO-Hb och Hb-NO i kombination med bestämning av total Hb-koncentration15,22. Provberedning är avgörande för att korrigera mätningen. Förekomst av NO2- iH2Ooch frisättning av NO2- under analysen kan leda till mätning av artificiellt högre koncentrationer av NO-derivat såsom S-NO-Hb14,39. Viktiga aspekter av provberedning presenteras också.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De förfaranden som anges i detta protokoll är i enlighet med granskningsnämnden för Massachusetts General Hospital. De blodprover som användes hade samlats in under en tidigare studie och avidentifierats för det aktuella ändamålet18.

OBS: Se tillverkarens instruktioner för specifik vägledning om optimala anslutningar mellan slangar och glas som utgör reningskärlet, tvätt och allmänt underhåll. Anslutningarna måste vara fasta och noggrant gjorda för att inte skada glaset. Identifiera komponenterna i glasreningskärlet: gasinloppsledning, reningskärl med värmemantel och kondensor, natriumhydroxid (NaOH) gasbubbelfälla, anslutningsledning mellan rensningskärlet och bubblaren, rensningskärlets utloppsgasledning (till CLD) utrustad med ett intensivt fältdelelektriskt (IFD) filter. En IFD-filterlinje mellan reningskärlet och CLD-provinloppen måste finnas på plats varje gång INGA metaboliter i flytande form (plasma, cellkulturer, vävnadshomogenater) mäts (alla analyser som presenteras i protokollet). Provberedning beror på vätskan eller vävnaden som analyseras och på föreningarna av intresse. Viktiga aspekter av den preanalytiska fasen behandlas i avsnitt 1 och 2. Särskilda förberedelsesteg för specifika analyser ingår i avsnitten 3–5. 6-8 §§ gäller för alla analyser.

1. Beredning av särskilda reagenser

OBS: För mer information, se tidigare publikationer15,22.

  1. Bered 5% (290 mM) surgjord sulfanilamidlösning (AS) för NO 2-avlägsnande genom att lösa upp 500 mg sulfanilamid i 10 ml 1N HCl. Denna lösning är stabil i flera månader.
  2. Förbered 50 mM kvicksilverkloridlösning (HgCl2) för NO 2-frisättning från S-NO genom att lösa upp 67,9 mg HgCl2 till 5 ml PBS. Skydda stamlösningen från ljus.
  3. Förbered NO 2-blockerande lösning med 800 mM ferricyanid [K3Fe (CN)6] för att oxidera Hb tillsammans med 100 mM N-etylmaletimid (NEM) för att blockera tiolgrupper och (VALFRITT) 10% nonylfenyl-polyetylenglykollösning (Nonidet p-40) för att solubilisera röda cellmembran.
    1. TillsättK3Fe(CN)6 till avjoniserat och destillerat vatten (ddH2O, 263,5 g pulver per liter) för att erhålla en slutlig koncentration av 800 mM.
    2. Tillsätt NEM till 800 mM K3Fe (CN) 6 i ddH2 O-lösningen(12,5 g pulver per liter för att ha 100 mM koncentration) och blanda lösningen för att lösa upp alla kristaller.
    3. Tillsätt en del av 10% NP-40 till nio delar av 800 mM NEM K3Fe (CN) 6 100 mM NEM-lösning (111 ml per liter) och blanda väl (obligatoriskt steg för helblodsanalys).
  4. Förbered S-NO-Hb-stabiliseringslösningen innehållande 12 mMK3Fe (CN) 6, 10 mM NEM, 100 μM dietylentraminepentaättiksyra (DTPA, för metallkelering) och 1% Nonidet p-40 tvättmedel från deras stamlösningar.
    1. Förbered en 200 mM NEM-lösning genom att tillsätta NEM-kristaller till PBS (25 mg / ml, t.ex. 250 mg i 10 ml PBS) och blanda lösningen tills alla kristaller är upplösta (ska göras på experimentdagen).
    2. Förbered en 800 mMK3Fe(CN)6-lösning genom att tillsättaK3Fe(CN)6 till ddH2O(263,5 mg/ml, t.ex. 1,32 g i 5 ml ddH2O för att erhålla en slutlig koncentration på 800 mM) (som ska göras på experimentdagen).
    3. Förbered en 10 mM DTPA-stamlösning genom att tillsätta 786 mg DTPA till 200 ml ddH2O och justera pH till 7,0 med 5N NaOH för att helt solubilisera DTPA.
    4. Tillsätt 5 ml 200 mM NEM-lösning, 1,5 ml 800 mM K3Fe(CN)6-lösning och 1 ml DTPA-stamlösning till 81,5 ml PBS vid 7,2 pH, och slutligen tillsätt slutligen 11 ml 10% NP-40 för att få den slutliga volymen till 100 ml.

2. Provtagning

OBS: För mer information om provinsamling, se tidigare publicerade verk 15,22,40.

  1. Samla helblod
    1. Samla blod i heparinbelagda rör som föredrar venös framför arteriellt kärl (om det inte specifikt krävs) och föredrar kateterplacering framför venipunktur (om möjligt) med kateter eller nålborrning på minst 20 G eller större för att minimera hemolys.
    2. Tillsätt omedelbart den NO 2-blockerande lösningen (1 del av lösningen till 4 delar helblod), bearbeta (avsnitt 3 eller 4) eller frys och förvara vid -80 °C.
  2. Samla plasma och röda blodkroppar (RBC)
    1. Samla blod i heparinbelagda rör som föredrar venös framför arteriellt blod (om det inte specifikt krävs) och nålar på minst 20 G eller större för att minimera hemolys och centrifug omedelbart i 5 minuter vid 4000 x g vid 4 ° C.
    2. Blanda supernatanten (plasma) med den NO 2-blockerande lösningen (1 del av lösningen till 4 delar av supernatanten) i ett nytt rör och en ny process (avsnitt 3 eller 4), eller frys in och förvara vid -80 °C.
      OBS: För NO-förbrukningsanalysen kan NO 2-blockeringslösningen inte användas. Analysen kan utföras utan plasmaförbehandling.
    3. Återutföra RBC-pelleten från botten till ett nytt rör förfyllt med S-NO-stabiliseringslösning (se steg 1.4) (1 ml pellets till 9 ml lösning) och inkubera i 5 minuter.
    4. Passera RBC-lysatet i en storlekskolonn med G-25 Sephadex-polymer som tidigare har sköljts medddH2Oför uteslutningskromatografi
    5. Samla in Hb-fraktionen för att bearbeta (avsnitt 4) och för att mäta Hb-koncentrationen med Drabkins reagens (för Hb-mätning, se tidigare publicerat arbete22).
      OBS: För att förbereda och prova en specifik vävnad / organ, identifiera dess hilum och kirurgiskt isolera den. Snitta venen, punktera artären och injicera med hepariniserad saltlösning (10 U / ml) via artären. Punktskatta vävnaden när saltlösning börjar återflöda vid det venösa snittet. Homogenisera vävnaden med en mekanisk homogenisator samtidigt som man tillsätter 1 del av NO 2-blockerande lösning till 4 delar homogeniserad vävnad.

3.VCl3 i HCl-analysberedning

OBS: För mer information om VCl3 i HCl-analysberedning, se tidigare publicerade verk37,41.

VARNING: CLD kommer att skadas om NaOH-fällan inte är ordentligt på plats när du utför denna analys. Detta beror på frätandet av HCl.

  1. Förbered standardlösningar av NO3- för standardkurva
    1. Lös upp 85 mgNaNO3 i 10 ml ddH2O för att erhålla 0,1 MNaNO3- (denna lösning förblir stabil i några veckor).
    2. Använd stamlösningen för att bereda standarder genom utspädning iddH2Oför att erhålla koncentrationer av 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μMNaNO3 för att utföra en kalibreringskurva för plasma- eller urinprover (använd lägre koncentrationer om du arbetar med cellkulturer).
  2. FörberedVCl3 (vanadinklorid) mättad lösning för NO 3-reduktion i reningskärlet
    VARNING: Reaktionen av vatten och VCl3 är exoterm. Var uppmärksam på hög glastemperatur när du tillsätter syra och när du sköljer glaset i slutet av experimentet.
    1. Lös upp 1,6 g VCl3 i 200 ml 1 M HCl genom att först tillsätta VCl3 i en ren kolv och sedan tillsätta 200 ml 1 M HCl.
    2. Vakuumfiltrea lösningen genom filterpapper (t.ex. 11 μm filterpapper, men valfritt filterpapper kan användas).
      OBS: Den filtrerade lösningen ska bli klarblå, medan den ofiltrerade VCl3-lösningen är brun på grund av oupplösta partiklar.
    3. Håll den mättade lösningen täckt med antingen aluminiumfolie eller polytetrafluoretylen (PTFE) tejp eftersom föreningen är ljuskänslig.
  3. Förbered det cirkulerande vattenbadet
    1. Anslut en cirkulerande vattenbadanordning till rensningskärlets vattenmantel. Se till att linjerna är torra innan du grundar.
    2. Starta vattenbadet vid 95 °C och kontrollera frånvaron av läckage på vattenledningarna genom att applicera (icke-vidhäftande) pappershanddukar runt linjerna.
  4. Ställ in gasbubbelfällan
    1. Kontrollera att bubblans PTFE-hylsa är på plats och att den inte är skadad.
    2. Öppna gasbubblaren och injicera 15 ml 1 M NaOH i bubbelbasen.
    3. Placera om gasbubblaren och täta anslutningen tätt genom att trycka botten mot toppen och vrida de två delarna något. Omöjligheten att vrida toppen av bubblaren utan att applicera kraft indikerar en korrekt tätning.
    4. Anslut utloppet från rensningskärlet till inloppet på gasbubberfällan.

4. I3- i ättiksyraanalysberedning

OBS: För mer information om I3- i ättiksyraanalysberedning, se tidigare publicerade verk 15,22,38,41,42.

  1. Förbered standardkurvan för NO2-
    1. Bered en stamlösning genom att lösa upp 69 mg natriumnitrit (NaNO2) i 10 ml ddH2O för att erhålla 100 mM lösning. Denna lösning är stabil om den förvaras i en lufttät behållare, kyls och skyddas mot ljus.
    2. Späd stamlösningen seriellt i 1,5 ml mikrocentrifugrör förfyllt med 900 μL ddH2 O: Tillsätt 100μL av stamlösningen till det första centrifugröret, blanda, märk och använd 100 μL av röret för det andra röret, upprepa sedan vilket resulterar i 10 mM, 1 mM och sedan 100 μM.
    3. Späd vidare medddH2Oför att erhålla 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM och 500 nMNaNO2 alikvoter som ska användas i kalibreringskurvan.
  2. Förbered I3- ättiksyra för reningskärlet (kan förvaras vid rumstemperatur (RT) i 1 vecka)22
    1. Tillsätt 2 g kaliumjodid (KI) och 1,3 g jod (I2) till 40 ml ddH2O och 140 ml ättiksyra.
    2. Blanda noggrant genom att omröra blandningen i minst 30 minuter.
  3. Förbered proverna för differentiell bestämning avNO2-, S-nitrosotiolar (S-NO-Hb, om Hb samlas in) och järn-nitrosylkomplex (Hb-NO om Hb samlas in) (Figur 3)
    1. Dela varje prov i 3 alikvoter om 270 μL (900 μL Hb vid mätning av S-NO-Hb och Hb-NO) i ljusskyddade mikrocentrifugrör, varav 2 är förfyllda med 30 μL 1x PBS (100 μL vid mätning av S-NO-Hb och Hb-NO) och det tredje röret med 30 μLHgCl2 (100 μL vid mätning av S-NO-Hb och Hb-NO), virvel och inkubera vid RT i 2 minuter (figur 3).
    2. Tillsätt 30 μL av 5% AS till provet medHgCl2 för att mäta Fe-NOs, (100 μL för Hb-NO) och till en med tillsatt PBS för att mäta S-NOs och Fe-NOs (100 μL för S-NO-Hb och Hb-NO) och tillsätt 30 μL PBS till den tredje som redan är förfylld med 1x PBS för att mäta NO2-, S-NOs och Fe-NOs (100 μL för återstående NO2- från Hb-insamling, S-NO och Hb-NO). Virvel och inkubera vid RT i 3 min (figur 3).

5. INGEN konsumtion genom cellfri Hb-inställning

OBS: För mer information, se det tidigare publicerade arbetet38.

  1. Bereda standardlösningar av oxyHb från en ren hb-lösning med en känd koncentration
    1. Späd stamlösningen seriellt i 1,5 ml mikrocentrifugrör genom tillsats avddH2Oför att erhålla de lösningar som kommer att användas för kalibreringskurvan: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Förbereda DETA-NONOate-lösningen
    1. Tillsätt 10 mg DETA-NONOate till 610 μL av 10 μM NaOH i pH 7,4 PBS för att generera 100 mM DETA-NONOate och hålla det på is.

6. Starta kemiluminescensdetektorn (CLD) och förbered rensningskärlet

OBS: För förberedelse av rensningskärlet, se det tidigare publicerade arbetet43.

  1. Verifiera de viktigaste anslutningarna till och från CLD
    1. Anslut syreledningen till CLD och öppna syretanken vid ett tryck som är i samförstånd med CLD: s tillverkare.
    2. Se till att IFD-filterledningen (Intense Field Dielectric) är ansluten till CLD men inte till rensningskärlet eller NaOH-fällan
  2. Starta CLD
    1. På CLD-gränssnittet börjar du köra detekteringsprogrammet för vätskefasanalyser.
    2. Kontrollera att syretillförseln är tillräcklig. Om så är fallet kommer CLD framgångsrikt att starta provtagning från sitt inlopp och indikera detektering med en signal i millivolt (0-5 mV). Annars kommer CLD att uppmana en negativ diagnostisk signal.
  3. Förbered rensningskärlet
    1. Stäng rensningskärlet på alla tre portarna: skruva fast nålventilen helt åt höger, stäng inlopps- och utloppsstoppkranarna.
    2. Ta bort locket från reningskärlet och tillsätt en tillräcklig mängd av det reagens som är specifikt för den planerade analysen till reaktionskammaren (tabell 1) så att sprutnålen som används för att injicera proverna kan nå vätskekolonnen.
    3. Kontrollera förekomsten av en stabil önskad baslinje (tabell 1).
  4. Starta reningsgasflödet
    1. Se till att den inerta bensintanken (t.ex.N2) är utrustad med en tvåstegsregulator och anslut den inerta bensintanken till fartygets gasingret.
    2. Öppna gasen med ett utloppstryck vid regulatorn på 1-5 psi, öppna inloppet på rensningskärlet och öppna långsamt nålventilen på rensningskärlet för att tillåta inflöde av gas. Kontrollera bubblor i rensningskärlet.
  5. Justera gasflödet
    1. Registrera celltrycket uppmätt med CLD med IFD-filterledningens provtagning av omgivningsluft.
    2. Flytta locket på rensningskärlet, anslut IFD-filterledningen till rensningskärlet (eller till NaOH-fällan i VCl3 i HCl-analysen) och öppna utloppet på rensningskärlet.
    3. Använd nålventilen för att nå samma celltryck på CLD-nivå som registreras i omgivande luft.

7. Experimentera

OBS: För mer information om experimentet, se det tidigare publicerade arbetet43.

  1. Starta chemiluminescenssignalförvärvsprogrammet
    1. Anslut CLD: s seriella port till datorns seriella port i vilken förvärvsprogrammet har installerats.
    2. Kör analysprogrammet.
    3. Klicka på Skaffa, välj mappen för att spara .data-filen, skriv in filnamnet och klicka på Spara.
      OBS: Lägg märke till den förinställda körtiden på skärmen, eftersom inspelningen stoppas automatiskt när den förinställda tiden går. Vid behov kan den förinställda körtiden ökas.
  2. Förbered dig för upprepade provinjektioner
    1. Justera spänningsskalan på skärmen för att ha kontroll över den riktade baslinjen genom att klicka på knapparna Minimum och/eller Maximum och sedan ange önskat värde.
    2. Ha ett 20- eller 50 ml rör fyllt med ddH2O för att skölja sprutan mellan proverna.
    3. Ha en låda med känsliga våtservetter lättillgängliga.
  3. Provinjektion
    OBS: Börja med standardlösningarna för kalibreringskurvan (injicera från de minst koncentrerade till de mest koncentrerade proverna), fortsätt sedan till experimentproverna (överväg att göra det i dubbletter eller tre exemplar).
    1. Skölj sprutan minst två gånger eller mer med ddH2O innan du tar ut varje prov (och efter varje injektion) och kontrollera varje gång obehindrat vattenutkastning på en uppgiftstorka.
    2. Sätt in sprutan i provröret medan du håller både sprutan och röret på nära avstånd, dra upp kolven till önskad volym samtidigt som du säkerställer att ingen luftbubbla och / eller icke-homogeniserade fasta delar fastnar.
    3. Rengör sprutans spets med en uppgiftstorkare, sätt sedan in sprutan i septalocket vid injektionsporten och injicera efter att ha kontrollerat att sprutans spets ligger inom vätskefasen i reaktionskammaren.
  4. Markera injektionen i programmet och vänta
    1. Kontrollera att injektionen orsakar en uppåtgående förändring av signalen (kompletterande figur 1) (nedåt i NO-förbrukningen med cellfri Hb-analys) och skriv provnamnet genom att klicka på den grå rutan under Provnamn och klicka sedan på Markera injektion.
      OBS: Misstänker sprutobstruktion om provinjektionen inte genererar en signal.
    2. Vänta tills den elektriska signalen når baslinjen igen (det tar vanligtvis 3-4 minuter). Den här tiden kan användas för att utföra steg 7.3.1.
  5. Upprepa alla steg som anges i steg 7.3 och 7.4 under och efter varje injektion till slutet av experimentet. Kom ihåg att köra ett prov av konserveringslösningen (om den används)
  6. Stoppa experimentet
    1. Klicka på STOP för att avbryta signalupptagningen, stoppa CLD och stäng av vattenbadet (om NO3- mäts).
    2. Avbryt gasflödet, öppna nålventilen, ta bort locket från reningskärlet, placera en avfallsbehållare under avloppet och öppna dräneringsstoppkranen.
      Om experimentet kräver datainsamling längre än 60 minuter är det nödvändigt att starta om förvärvet efter 60 minuters körtid (upprepa steg 7.1.3) och skapa en ny fil.

8. Mätningar och beräkningar

OBS: Mätningar och beräkningar görs offline och kan utföras vid en annan tidpunkt.

  1. Starta chemiluminescensförvärvsprogrammet för offline-dataanalys
    1. Starta programmet och klicka på Bearbeta.
    2. Välj experimentfilen och klicka sedan på Öppna.
  2. Beräkna areal under kurvan för varje administrering
    1. Programvaran graferar automatiskt baslinjen på skärmen (kompletterande figur 2A, horisontell gul linje) och toppaxeln för varje våg som genereras av varje provadministration (vertikala gula linjer): verifiera deras korrekta position (eller justera genom att klicka på varje rad och flytta den med musen eller pilarna) och klicka på Tröskel OK (kompletterande figur 2B).
      OBS: I NO-förbrukningen med cellfri Hb-mätanalys lyckas programvaran vanligtvis inte korrekt fånga vågformen som genereras av provinjektion. Genom att zooma på varje vågform kan operatören enkelt hjälpa programvaran vid områdesberäkningen (kompletterande figur 2).
    2. Programvaran graferar automatiskt början (vertikal grön linje) och slutet (vertikal röd linje) för varje topp som orsakas av varje provadministration: verifiera deras korrekta position (eller justera genom att klicka på varje rad och flytta den med musen eller pilarna) och klicka på Integrera (kompletterande figur 2C).
      OBS: Vissa områden i spåret kan felaktigt definieras som injektioner vid denna tidpunkt, och vissa toppar kan räknas automatiskt två gånger. Båda misstagen kan identifieras på ny och tas bort under steg 8.2.2
    3. Programvaran matchar automatiskt varje signalområde efter en injektion markerad under experimentet och dess tilldelade namn: navigera varje topp (indikerad med en gul vertikal linje) med det tilldelade namnet genom att klicka på Next Peak och Previous Peak och klicka sedan på knappen All OK för att äntligen få beräkningen för alla områden på skärmen.
    4. För att korrigera alla namngivnings- eller matchningsfel som gjorts av användaren eller av programmet, använd vid behov knapparna som anges i tilläggsfil 1.
  3. Överför kalibreringskurvans värden till ett kalkylblad och generera en linjär regressionsekvation (kompletterande figur 3)
    1. Överför data från CLD-programmet till ett nytt kalkylblad genom att kopiera och klistra in. Ordna de två kolumnerna i databladet som Sample Concentration och Area Under curve och lägg till ett matchat värde på noll i båda kolumnerna.
    2. Markera de två kolumnerna, klicka på Infoga > Punktlista och välj sedan Lägg till diagramelement > Trendlinje > Linjär under menyn Diagramdesign.
    3. Högerklicka på den genererade trendlinjen, klicka på Formatera trendlinje och klicka sedan på alternativen Visa ekvationer på diagram och Visa R-kvadratvärde på diagram på menyn Formatera trendlinje för att få en enkel linjär kalibreringsekvation.
  4. Överför den beräknade ytan för varje prov för att beräkna dess koncentration (kompletterande figur 3)
    1. Rapportera varje värde i kalkylarket. I nästa kolumn tillämpar du ekvationen erhållen från steg 8.3.3 för att erhålla koncentrationen av varje injicerat prov, där y är koncentrationen (värdet på den nya kolonnen) och x är areon under kurvan mätt efter injektion.
      OBS: Kom ihåg att ta hänsyn till koncentrationen som mäts i konserveringslösningen (om den används) och subtrahera värdena i enlighet därefter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NO-förbrukningen genom cellfri Hb-analys användes i prover innehållande kända koncentrationer av cellfri oxyHb (figur 4). Eftersom ett hem av oxyHb stökiometriskt frigör en NO-molekyl i analysen används renad cellfri oxyHb för att bygga kalibreringskurvan för analysen (kompletterande figur 3).

Dos-responsförhållandet mellan cellfritt Hb (mätt med en kolorimetrisk analys) och INGEN konsumtion hos patienter som kommer från kardiopulmonell bypass (CPB) under hjärtkirurgi visas i figur 5. Det kan antas att det efter CPB finns en högre koncentration av hemgrupper i Hb-Fe2 +-O2-status (figur 5, röd) jämfört med patienter som får NO under CPB från vilken endast en minoritet av hemgrupper av cellfritt Hb konsumerar NO (Figur 5, grön).

Protokollet för bedömning av NO-konsumtion med cellfritt Hb tillämpades tidigare på testplasmaprover från 50 patienter som genomgår hjärtkirurgi och kräver CPB. Blod samlades in vid baslinjen och 15 min, 4 timmar och 12 timmar efter CPB. Syftet med studien var att undersöka det befintliga sambandet mellan både pulmonell och systemisk vaskulär resistens och den ökning av hemolys som observerats efter CPB. Cellfri Hb-koncentration bedömdes med en Hb-kolorimetrisk analys. Hemolysen nådde sin topp 15 minuter efter CPB. Det ackumulerade fria Hb eliminerades långsamt från plasma inom 12 timmar18 (figur 6A). INGEN förbrukning nådde istället en topp på 15 minuter och nådde baslinjevärden på bara 4 timmar (figur 6B). Linjära regressionskurvor för NO-konsumtion med cellfritt Hb uppvisade ett stökiometriskt förhållande vid 15 min post-CPB-tidspunkten i motsats till baslinjen, 4 timmar och 12 timmar efter CPB (figur 6C). Förklaringen till den observerade skillnaden i kinetik ligger i överflödet av nyligen släppt fritt Hb som ännu inte har stött på NO-molekyler som frigörs av patientens endotel. Koncentrationen av oxyHb (rensning av NO och resulterande i konsumtion i analysen) var i själva verket högre vid 15 minuter än vid någon annan tidpunkt. Plasma som samlats in vid baseline och vid andra tidpunkter hade en relativt högre komponent av metHb, som redan hade oxiderats av NO, inte binder NO och orsakade inte konsumtion i analysen. Pulmonell och systemisk vaskulär resistens mättes invasivt och nådde sin topp vid 15 minuter. För första gången i denna specifika patientpopulation observerades INGEN konsumtion av fritt Hb vara temporärt kopplad till vasokonstriktion, vilket bekräftade tidigare observationer i djurmodeller och hos patienter med sicklecellsjukdom18.

Administreringen av NO-gas under CPB och efter operationen ökar den relativa mängden cirkulerande metHb kontra oxyHb. När patienter som genomgick hjärtkirurgi behandlades med NO-gas intraoperativt och postoperativt var den observerade ökningen av fritt Hb efter CPB (figur 7A) inte kopplad till någon ökning av NO-förbrukningen, mätt med ovannämnda protokoll (figur 7B). Den exogent administrerade NO-gasen omvandlar det mesta oxyHb till metHb, vilket i sin tur inte rensar NO in vivo eller förbrukar NO in vitro (opublicerade data).

Figure 4
Figur 4: Kväveoxidförbrukning med renat cellfritt oxyhemoglobin. Kväveoxidförbrukningsanalys utförd genom injektion av prover av kända koncentrationer av renat cellfritt oxyhemoglobin. Regressionslinjen visas i rött. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5. Kväveoxidförbrukning och cellfri hemoglobinkoncentration från patienter som genomgår hjärtkirurgi med kardiopulmonell bypass. Varje patients cellfria hemoglobinnivå, mätt med ett kolorimetriskt kit, plottades med kväveoxidförbrukningen (NO) mätt genom kemiluminescens. Blodprover togs 15 minuter efter CPB: s slut. Regressionslinjer visas för hjärtkirurgiska patienter som inte får (i rött) eller får (i grönt) NO under kardiopulmonell bypass (CPB). Hemoglobin uttrycks i μM av hemgrupper. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Kväveoxidförbrukning och cellfritt hemoglobin hos hjärtkirurgiska patienter. (A) Cellfri hemoglobinkoncentration (Hb) i plasma hos patienter som genomgår hjärtkirurgi med kardiopulmonell bypass (CPB) (N = 50) bestämdes vid olika tidpunkter med användning av ett kommersiellt tillgängligt kolorimetriskt bestämningssats. Data analyserades genom att montera en blandad modell med bevis på en fast effekt mellan tidpunkter. Plasmakoncentrationen vid olika tidpunkter jämfördes med baseline med Tukeys multipla jämförelsetest. (B) Kväveoxid (NO) konsumtion av plasma erhållen från samma prover som används för kvantifiering av fritt Hb. Data analyserades genom att montera en blandad modell med bevis på en fast effekt mellan tidpunkterna. Plasmakoncentrationen vid olika tidpunkter jämfördes med baseline med Dunnetts multipla jämförelsetest. (C) Regressionslinjer för cellfritt Hb-plasmainnehåll matchat med INGEN förbrukning. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns inte signifikant. Data presenteras som median ± interkvartilintervall. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Effekter av administrering av kväveoxidgas på kväveoxidkonsumtion hos patienter som genomgår hjärtkirurgi. (A) Cellfri hemoglobinkoncentration i plasma hos patienter som genomgår hjärtkirurgi med kardiopulmonell bypass (CPB) som antingen får placebo (N = 28) eller kväveoxid (NO) gas (N = 22) i 24 timmar sedan CPB började. Koncentrationen bestämdes vid olika tidpunkter med användning av ett kommersiellt tillgängligt kolorimetriskt kit. Data analyserades av Friedmans test, vilket indikerar närvaron av en effekt mellan tidpunkter i båda grupperna. Plasmakoncentrationen vid olika tidpunkter jämfördes med baseline med Dunns multipla jämförelsetest. (B) INGEN konsumtion av plasma erhållen från samma prover som används för kvantifiering av cellfritt Hb. Data analyserades av Friedmans test, vilket indikerar närvaron av en effekt mellan tidpunkter i båda grupperna. Plasmakoncentrationen vid olika tidpunkter jämfördes med baseline med Dunns multipla jämförelsetest. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Data presenteras som median ± interkvartilintervall. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Prövning Reagensblandning Målbaslinje (mV)
VCl3 i HCl 5 mlVCl3 i HCl-mättad lösning + 100 μL skumdämningsmedel 0–5 mV*
I3– i ättiksyra 5–7 ml I3– reagens 0–5 mV*
INGEN konsumtion av cellfritt hemoglobin 5–7 ml PBS vid pH 7,4 + 100 μL skumdämningsmedel + 20 μL expanderad DETA-NONOate-lösning 70–100 mV**
*idealvärde: baslinjen kan vara högre på grund av luftens kvalitet i experimentmiljön
** säkerställa stabilitet i 20 minuter innan experimentet påbörjas.

Tabell 1: Rensningskärlets reagenssammansättning och målbaslinje för olika kemiluminescensanalyser. Reagenskompositionen för rensningskärlet för varje beskriven analys. NO = kväveoxid; PBS = fosfatbuffertsaltlösning; DETA-NONOate: (Z)-1-[2-(2-aminoetyl)-N-(2-ammonioetyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat. *idealvärde: baslinjen kan vara högre på grund av luftens kvalitet i experimentmiljön. ** säkerställa stabilitet i 20 minuter innan experimentet påbörjas. För att utföra NO-förbrukningsanalysen bör skalan ändras på programvaran för att fånga värden mellan 70 mV och 100 mV (t.ex. 0-100 mV), vilket är den riktade baslinjespänningen. Denna justering föreslås ha full kontroll över provinjektionen, vilket gör det möjligt att dokumentera signalen som rör sig från baslinjen efter injektionen av ett prov och att observera signalen som återgår till baslinjen. Dataregistrering påverkas inte av eller begränsas till den visualiserade skalan.

Kompletterande figur 1: Toppar efter NO-detektion i VCl3 i HCl-analysen. Topparna som följer provadministrationen i VCl3 i HCl visas på CLD-paketprogramvaran. Beräkning av areal under toppen för varje injektion visas för enkelhets skull och förklaras i kompletterande figur 2. I detta experiment har standarder för olika koncentrationer administrerats för kalibreringskurvan, följt av plasmaprover. Utspädning är en användbar lösning för att beräkna metaboliter från prover som ger NO i den höga änden eller till och med utanför kalibreringskurvan. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Användarassisterad automatiserad beräkning av området under toppen. När du utför NO-konsumtionsanalysen med cellfritt hemoglobin kan det vara nödvändigt att ställa in toppar manuellt för att ge programvaran de mest exakta gränserna för att mäta arean under toppen som genereras av varje provinjektion. (A) Representativ fullständig bild av ett inspelat experiment. Den nås genom att klicka på Bearbeta i huvudmenyn och genom att välja och öppna den inspelade filen av intresse. Den gula linjen representerar signaltröskeln (mV) som utgör det raka segmentet av området under toppen. Genom att klicka på den kan användaren dra den mot signalområdet. X- och y-axeln kan ändras för att zooma på toppen av intresse för exakt mätning genom att antingen klicka på de nedre vänstra knapparna eller genom att skriva in önskat minimi- och maximivärde för varje. (B) Tröskelpositionering. Användaren kan välja den optimala baslinjetröskeln genom att dra den gula linjen till signalens mittpunkt precis före signalnedgången som orsakas av provinjektionen. För att fortsätta begränsa området ska användaren klicka på knappen Ställ in toppar manuellt . (C) Placering av start- och slutmarkörer. Genom att klicka på knappen Ställ in startmarkör visas en grön linje på skärmen. Den gröna linjen ska placeras (genom att dra och släppa) i början av nedskridningen orsakad av provinjektionen. Samma knapp ändrar etiketten till Ställ in slutmarkör genom att klicka på vilken en röd linje visas på skärmen. Den röda linjen ska placeras vid den punkt där signalen når baslinjen igen efter avböjningen orsakad av INGEN förbrukning från det injicerade provet. Sammantaget beskriver tröskellinjen (gul, B), den gröna linjen och den röda linjen exakt det område som genereras av provinjektionen. (D) Ge området under toppen. Genom att klicka på knappen Integrera (C) visas det beräknade området under toppen längst upp till höger på skärmen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Representativt kalkylblad med kalibreringskurva och resultat. De beräknade områdena under topparna som genereras från kväveoxidförbrukning (NO) genom injektion av prover med en känd koncentration av cellfritt hemoglobin (uttryckt som [μM] av heme) visas längst upp till vänster (på gul bakgrund). Värdena ritas för att bygga kalibreringskurvan och dess resulterande linjära ekvation y = mx + q. Lutningen (m) är antalet oxyHb-hemgrupper (μM) som krävs för att minska signalen som detekteras av fotomultiplikerröret med 1 mV. Beräknade värden från tredubbla injektioner (Kör N 1,2,3) av prover från en patient som erhållits vid fyra olika tidpunkter (markerade med olika bakgrundsfärger) angavs i kalkylbladet. Genomsnittet av varje tre exemplar användes för att ge värdet av INGEN konsumtion orsakad av varje prov genom att lösa den linjära ekvationen: Klicka här för att ladda ner den här filen.

Equation 1

Kompletterande fil 1: Granska topparna med hjälp av den medföljande programvaran. Den här filen innehåller en skärmdump från den medföljande programvaran och de åtgärder som tillåts för varje knapp. För varje topp (inklusive falska toppar som orsakas av artefakter) kan användaren använda knapparna som anges i filen för att bekräfta, ignorera, ta bort eller namnge en viss topp efter behov. Användaren kan också spela in en topp som inte tidigare har identifierats. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grund av den höga känsligheten har kemiluminescensbaserade analyser för bestämning av NO och besläktade föreningar en hög risk för NO 2-kontaminering. Varje reagens (särskilt NO 2-blockerande lösning) och spädningsmedel (inklusive ddH2O) som används i experimentet bör testas för dess NO 2-innehåll för att korrigera för bakgrundssignal. Nitrit är extremt reaktivt med en halveringstid i helblod runt 10 min och genererar snabbt NO3-. Tiden som går mellan blodinsamling och centrifugering, eller NO 2-blockering, kan därför orsaka preanalytiska fel och bör minimeras15. I en analys med plasmaprover, samla blod företrädesvis i heparinrör och centrifug vid 750 x g i 5 min vid 4 °C efter tiolgruppsblockad med 40 μL 200 nM NEM framställd genom upplösning av 250 mg NEM till 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Stamlösningen kan förvaras vid 4 °C. Föreningar såsom nitroarginin, nitroprussid och nitroglycerin som hämmar NO-syntas (NOS) genomgår långsam icke-kvantitativ omvandling till NO, vilket resulterar i en baslinjehöjning. Om användningen av NOS-hämmare är en del av undersökningen rekommenderas att blockerare som inte innehåller nitrogrupper används43. Inloppstrycket i reningskärlet bör matcha det kontinuerliga undertryck som CLD gör för provtagning. Om inloppstrycket är lågt kan vakuumdestillationen av mediet leda till att gasrensningsledningar och kammare förorenar gas, vilket resulterar i signalförvrängning. Dessutom kan små volymer luft komma in i reningskärlet och reagera med lösningen för att generera överdriven NO. Tvärtom kan överdrivet tryck som orsakas av en flödeshastighet som är högre än provuttagsflödet släppa ut NO i atmosfären vilket leder till en underskattning av signalen15. Dessutom kräver både VCl3 i HCl och I3- i ättiksyraprotokollet flera utspädningar under beredningen och flera beräkningar för att ge provkoncentration. Varje steg bör noggrant registreras som utspädningar och beräkningar erkänns av många grupper som den huvudsakliga felkällan44.

Tillsats av NO 2-blockerande lösning (steg 2.1.2) orsakar röda blodkroppar att lysa, vilket reducerar all OxyHb till MetHb. Det undviker en snabb minskning av järnhaltiga proteiner (främst OxyHb) med NO2- med efterföljande generering av NO3-. Behandling av prover med denna lösning vid insamling krävs för att korrekt mäta NO2- och/ eller NO3-. Däremot bör lösningen inte användas vid planering av NO-förbrukningen genom cellfri Hb-analys. Alikvoter av NO 2-blockeringslösningen ska lagras tillsammans med proverna och användas för att avlägsna den del av signalen som orsakas av själva lösningen. Slutligen bör utspädningsfaktorerna beaktas vid beräkningen av den slutliga koncentrationen av den uppmätta metaboliten. II3-i ättiksyraanalysen erhållsNO2-koncentrationen genom att subtrahera koncentrationen av alikvoten innehållande AS utanHgCl2 (S-NO och Fe-NO) från koncentrationen av alikvot innehållande endast PBS (NO2-, S-NO, Fe-NO). För att beräkna koncentrationen av S-NO (kvicksilver-labila proteiner) bör koncentrationen av alikvoten behandlad med AS medHgCl2 (Fe-NOs eller kvicksilverstabila nitrosoproteiner) subtraheras från koncentrationen av den alikvot som behandlats med AS utanHgCl2. Innan subtraheras bör användaren komma ihåg att multiplicera varje alikvots koncentration med 0,8181 (270/330) för att ta hänsyn till den utspädningsfaktor som används under provberedningar (figur 3). Samma koncept gäller för S-NO-Hb- och Hb-NO-mätning, där absoluta koncentrationer är en bråkdel av uppmätt Hb22. Beroende på typ av prov kan ett exakt antal av NO 3-koncentrationen kräva att både VCl3 i HCl-protokollet och I 3-i ättiksyraprotokollet körs för att slutligen subtrahera koncentrationen av NO2- från koncentrationen av NO3- och NO2-. Detta är inte alltid nödvändigt i helblods- och plasmaprover, till exempel där NO3- vanligtvis vida överstiger NO2-.

Det är mycket viktigt att påminna om att CLD kommer att skadas om NaOH-fällan inte är på rätt plats när man utför en VCl3 i HCl-analys på grund av HCl: s korrosivitet. 1 M NaOH-lösningen som används för att fylla NaOH-fällan kan köpas eller framställas antingen genom upplösning av 4 g NaOH-salt i 100 mlddH2Oeller genom utspädning av 5 ml 50% NaOH i 100 ml ddH2O. Vid ytterligare utspädning till 10 μM medddH2Oär NaOH mycket användbar för att avlägsna proteinskräp genom injektion i rensningskärlet.

Baslinjesignalen som detekteras av CLD bör vara stabil och inom 0-5 mV. En högre baslinjesignal kan orsakas av luftföroreningar (av NO och derivat), och detta kan verifieras genom att lämna inloppet utomhus. Om en högre spänning endast observeras i rensningskärlet, medan förorening av tanken med inert gas bör övervägas, beror det oftast på persistensen av organiska rester eller närvaron av NO2- i röret. Att tvätta rensningskärlet flera gånger med ddH2O kan hjälpa till att minimera baslinjespänningen. Om det inte lyckas hjälper inkubationen av reningskärlet med 100 mM NaOH i 24-48 timmar följt av flera tvättar medddH2O att eliminera föroreningar. I NO-förbrukningen med cellfri Hb-analys är den erforderliga CLD-signalen 70-100 mV i minst 20-30 min. Om signalen inte är stabil (dvs. spänningen minskar) kan en extra dos på 10 μL DETA NONOate tillsättas till reningskärlet. Detta kan upprepas efter behov. Det är viktigt att komma ihåg att både oanvänt pulver och redan expanderat DETA NONOate bör hållas vid -80 °C. Detta reagens sönderfaller snabbt trots optimal lagring och kanske underpresterar när det inte är nyberedt, vilket kräver flera injektioner i reningskärlet och leder till en mindre stabil isoelektrisk signal. Ännu viktigare är att den bör expanderas i PBS med pH 7,4 eftersom detta optimerar dess halveringstid (56 timmar vid pH 7,4 vid rumstemperatur kontra kvasi-omedelbar dissociation vid pH på 5,0)45. Sprutan som används för injektion av DETA NONOate ska uteslutande vara avsedd för denna åtgärd och inte användas för injektion av prover.

Om injektionen av ett prov genererar en topp som är högre än kalibreringskurvans övre punkt, särskilt om den genererar en spänning högre än 700 mv, rekommenderas att späda provet (2x eller 4x) för att minimera felet. Detta gäller även NO-konsumtionsanalysen om doppet som orsakas av provinjektionen är djupare än det som orsakas av injektionen av det mest koncentrerade provet som används i kalibreringskurvan. Bevisen för en topp (eller en genomgående) signal efter injektion som är mindre än förväntat eller frånvarande kan indikera igensättning av precisionssprutan som används för injektion. På grund av de små volymer som används (10-20 μL/prov), särskilt om plasma- eller urinanalyser utförs, kan det vara svårt att skilja mellan en fylld spruta och frånvaron av provet på grund av igensättning av sprutan. Det rekommenderas att vara uppmärksam på kolvens motstånd. Efter bekräftelse genom inspektion av sprutan kan avlägsnande av obstruktionen försökas genom att upprepade gånger tvätta sprutan med ddH2Ooch genom att gnugga sprutan på en känslig uppgift torka om hindret är synligt utåt. Om du är osäker rekommenderas att du matar ut provvolymen på en uppgiftstork och går tillbaka för att tvätta sprutan med ddH2O och försök att upprepa provadministrationen. Skumning är en vanlig komplikation och tvingar experimentet att avslutas när vätskekolonnens höjd överstiger reaktionskolonnens, vilket orsakar signalinstabilitet. Överskridande av den dos av skumdämningsmedel som anges i protokollet kan leda till en ökning av baslinjesignalen och bör undvikas. Antalet prover som orsakar bildandet av överdriven skumning blir förutsägbart när upprepade analyser utförs, ett fenomen som bör informera hur experimentet kan planeras optimalt. Ett valfritt steg för att minska skumningen är att blanda plasma eller vävnadssupernatant med kall metanol (förhållande 1:1) och centrifug i 15 min, 13000 x g vid 4 °C. Det bör beaktas att metanol får proteiner att fällas ut. Endast lätta S-NOs och Fe-NOs som inte är proteiska till sin natur mäts. Därmed kan detta alternativ inte antas i studier på helblod eller i något annat fall där det finns intresse för S-NO- och Fe-NO-proteiner.

Fler andra reagenslösningar än VCl3 i HCl och I3- i ättiksyra har beskrivits och framgångsrikt antagits. Askorbinsyrareducerar specifikt NO 2-, reagerar inte med NO3- eller S-NOs och kan användas för att minska huvuddelen av injicerade prover och beräkningar i situationer där NO2- är den enda molekylen av intresse. Den huvudsakliga fallgropen är reagensens begränsade stabilitet, vilket kräver mer frekventa förändringar av reagenslösningen och därmed upprepade kalibreringar46. En analys med kolmonoxid och kopparklorid (CuCl)-mättad cystein (3C-metod) kan specifikt detektera S-NOs med en känslighet som är jämförbar med I3- men som fortfarande kräver behandling med och utanHgCl2 för att undvika icke-specifika reaktioner47. För att uppnå högre precision i signalanalysen registreras experiment i .data-formatet så att offlinevågformsanalys kan slutföras med annan programvara än det paketprogram som visas i protokollet.

När den första injektionen har gjorts kan experimentet inte stoppas. Om en paus behövs och/eller om något tillstånd ändras (sammansättningen av rensningskärlets medium, reningsgasflöde, baslinjespänning) är experimentet endast giltigt för de prover som injicerats fram till den punkten. En ny standardkurva bör utföras innan fler prover mäts. Precisionen som tillåts av kemiluminescensbaserade analyser kommer med ett pris. Analyserna är tidskrävande av flera skäl: 1) automatisering är inte möjlig eftersom manuell provinjektion krävs i dubbletter; 2) de flesta reagenser som används inte kan lagras under långa perioder; 3) varje försök måste inledas med att köra standardprover i kända koncentrationer för kalibrering och kan inte pausas om inte kalibreringen upprepas, 4) varje prov är uppdelat i alikvoter innehållande olika blandningar av reagenser för att blockera specifika reaktioner för att slutligen beräkna koncentrationen av specifika metaboliter genom att subtrahera andra.

Detta arbete är inriktat på enheten Zysense NOA 280i, som har en detektionströskel på <1 ppb NO i gasfasen (motsvarande upp till 1 pM NO i vätskefasen) och ett provtagningsflöde på 10-300 ml / min. Andra CLD finns med ett buntslangsystem för mätning av metaboliter i vätskefasen. Ecophysics CLDs har en högre känslighetströskel, 1 ppb i sin mest känsliga modell men fördelen med att inte kräva en syretank för ozongenerering. Å andra sidan är deras rapporterade provtagningsflöde 1000 ml / min, vilket innebär en högre förbrukning av den inerta bensintanken som används för reningskärlet. Andra CLD-maskiner är avsedda för utandad NO-analys för klinisk användning.

Kemiluminescens är den mest känsliga och validerade metoden för att specifikt bedöma NO-konsumtion med cellfritt Hb inom hemolysområdet. Andra tekniker finns tillgängliga för att mäta NO, NO2-,NO3-, S-NOs och kvicksilver-labila nitrosoföreningar. Den direkta mätningen av NO-gas kan erhållas antingen genom kemiluminescens eller med användning av dedikerade elektroder som sträcker sig från mätningen av den utandade gasen till encelliga elektroder. Dessa mäter endast INGEN gas, är billigare (men ändå mer lättfördärvliga), kräver kalibrering oftare och är mindre exakta jämfört med en CLD31. Nitrit och NO3- har historiskt mätts med Griess-reaktionen, en kolorimetrisk teknik som i sin ursprungliga version detekterar båda molekylerna utan möjlighet att särskilja deras relativa koncentration i provet. Moderna varianter av tekniken involverar omvänd faskromatografi som använder separation av provet i två kolumner, vilket möjliggör två oberoende reaktioner med NO3- och NO2-. Känsligheten hos dessa metoder är mikromolär eller något mindre, jämfört med 1 nM med CLD. De viktigaste fallgroparna är tidsförbrukning och oförenlighet med prover som förbehandlats med kvicksilver och/eller ferricyanid14. S-NOs kan detekteras med kolorimetriska och fluorometriska tekniker samt med en känslighet upp till 0,5 μM jämfört med 100 fM som beskrivs genom att använda kemiluminescens som visas i I3- i ättiksyraprotokollet 14,41,42. Biotin-switch-analysen, trots att den inte detekterar S-NOs i det pikomolära intervallet, har fördelen att generera biotinmärkta proteiner som kan renas och identifieras med proteomisk analys48. När man tittar på i detalj delar varje teknik en gemensam fallgrop, vilket är den extrema reaktiviteten hos NO och dess derivat som kräver blockad av reaktioner i syfte att in vitro-mätning. Förbehandling av prover är kritisk, och att svara på frågan om en viss förbehandling helt blockerar en reaktion eller gör det bättre än en annan har hittills varit en drivkraft mot en ökning av metodologiska studier. Medan den extrema reaktiviteten in vivo av NO verkligen har varit en drivkraft för att undersöka känsliga metoder för detektion av dess metaboliter, har direkt mätning av NO mött betydande framsteg under de senaste tre decennierna sedan den första amperometriska detektorn utvecklades 1990. Mer än tjugo olika sonder har beskrivits sedan dess, inklusive nanosensorer som används för att studera encelligt NO-innehåll49. Elektrokemiska sensorer är de viktigaste verktygen som kan upptäcka NO både in vivo och i realtid. Inom lungmedicin har flera studier jämfört elektrodbaserade maskiner med CLD. Mätning av utandad NO är enklare än andra analyser för metabolitdetektering, vilket kräver antingen direkt anslutning av gasledningen (via IFD-filter) till ett andningstillägg i slutet system eller några andetag i en påse för offlineanalys, men kostnaden och sämre bärbarhet för CLD står stilla. Ett antal elektrokemiska enheter uppfyller för närvarande kriterierna för klinisk användning, även om de har lägre känslighet och reproducerbarhet jämfört med CLD. Dessutom är överensstämmelsen i termer av absoluta uppmätta värden suboptimal mellan produkterna, så det rekommenderas att patienterna alltid följs upp med samma elektrokemiskaenhet 50. Användningen av CLD i inställningar som mätning nasal utandad NO och i forskningsinställningar som terapeutisk låg och hög dos inhalerad NO är fortfarande nödvändig.

Exakta mätningar av NO, dess derivat och NO-bindande proteiner är nödvändiga på många nivåer för att förstå en förbisedd och fortfarande mestadels okänd signalmekanism. Tillämpningsområdena spänner över biologi och patologi på både preklinisk och klinisk nivå med specifika målområden, inklusive immunbiologi, neurovetenskap, kardiovaskulär vetenskap och infektionssjukdomar. Prekliniska studier och kliniska prövningar undersöker användningen av inhalerad NO-gas som ett terapeutiskt medel. Djupare kunskap om hur exogen NO-gas påverkar koncentrationen av NO-metaboliter och NO-bundna proteiner på alla nivåer, från plasma till cellfack, kommer att krävas. Implementering av högavkastande proteomik kan sannolikt öka antalet kända mediatorer som påverkas av NO och dess derivat och kan kräva nya mekanistiska undersökningar som kräver exakta mätningar av NO-metaboliter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.B. får lönestöd från K23 HL128882/NHLBI NIH som huvudprövare för sitt arbete med hemolys och kväveoxid. LB får bidrag från "Fast Grants for COVID-19 research" vid Mercatus Center vid George Mason University och från iNO Therapeutics LLC. B.Y. stöds av bidrag från en NHLBI/#R21HL130956 och DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. erhöll patent vid MGH på elproduktion av kväveoxid.

L.B. och B.Y. har lämnat in patentansökan för NO delivery in COVID-19 disease PCT application number: PCT/US2021/036269 inlämnad den 7 juni 2021. RWC erhåller lönestöd från Unitaid som huvudprövare för teknikutveckling som syftar till decentraliserad diagnos av tuberkulos hos barn i resurssnåla miljöer.

Acknowledgments

Protokollen som rapporteras i detta manuskript möjliggjordes av de ackumulerade bidragen från tidigare kamrater från Dr. Warren Zapols laboratorium för anestesiforskning i kritisk vård, avdelningen för anestesi vid Massachusetts General Hospital. Vi erkänner bidraget från Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli och Emanuele Rezoagli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186 (1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550 (2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550 (2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238 (2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879 (2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Tags

Medicin utgåva 180
Kemiluminescensbaserade analyser för detektion av kväveoxid och dess derivat från autoxidation och nitroserade föreningar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R.… More

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter