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Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Qui presentiamo protocolli per rilevare l'ossido nitrico e i suoi derivati biologicamente rilevanti utilizzando saggi basati sulla chemiluminescenza ad alta sensibilità.

Abstract

L'attività dell'ossido nitrico (NO) in vivo è il risultato combinato dei suoi effetti diretti, dell'azione dei suoi derivati generati dall'autossidazione dell'NO e degli effetti dei composti nitrosi. La misurazione dei metaboliti no è essenziale per studiare l'attività dell'NO sia a livello vascolare che in altri tessuti, specialmente nei contesti sperimentali in cui viene somministrato NO esogeno. I saggi di chemiluminescenza a base di ozono consentono misurazioni precise dei metaboliti NO e NO sia nei fluidi (inclusi plasma, omogeneizzati tissutali, colture cellulari) che nelle miscele di gas (ad esempio, respiro espirato). L'NO reagisce con l'ozono per generare biossido di azoto allo stato eccitato. La conseguente emissione luminosa permette il fotorilevamento e la generazione di un segnale elettrico che riflette il contenuto di NO del campione. Le aliquote dello stesso campione possono essere utilizzate per misurare specifici metaboliti NO, come nitrati, nitriti, S-nitrosotioli e complessi ferro-nitrosilici. Inoltre, l'NO consumato dall'emoglobina priva di cellule viene anche quantificato con l'analisi di chemiluminescenza. Viene fornita un'illustrazione di tutte queste tecniche.

Introduction

Da quando Salvador Moncada e i premi Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro e Ferid Murad hanno identificato l'ossido nitrico (NO) come il fattore di rilassamento derivato dall'endotelio (EDRF) precedentemente noto, il ruolo centrale dell'NO è stato stabilito in diversi meccanismi chiave che abbracciano la biologia vascolare, le neuroscienze, il metabolismo e la risposta dell'ospite 1,2,3,4,5,6,7 . La somministrazione esogena di gas NO è diventata un trattamento consolidato per l'insufficienza respiratoria dovuta all'ipertensione polmonare nel neonato8. Il gas di ossido nitrico è stato anche studiato per il trattamento dell'infezione da virus respiratorio sinciziale (RSV), della malaria e di altre malattie infettive, del danno da ischemia-riperfusione e per la prevenzione del danno renale acuto in pazienti sottoposti a cardiochirurgia 9,10,11,12. La necessità di tecniche di misurazione precise per valutare i livelli di NO, i suoi metaboliti e quelli delle sue proteine e composti bersaglio deriva da studi sia meccanicistici che interventistici.

A causa della sua elevata reattività, l'NO può subire reazioni diverse a seconda della matrice biologica in cui viene prodotto e/o rilasciato. In assenza di emoglobina (Hb) o altre ossi-emoproteine, l'NO viene ossidato quasi completamente a nitrito (NO2-).

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H2O → NO2- + H+

L'NO subisce prima l'autossidazione con ossigeno molecolare (O2) per produrre biossido di azoto (NO2) e reagisce con l'NO2 stesso per generare triossido di diazoto (N2O3). Una molecola di N2O3 reagisce con l'acqua (H2O) per formare due molecole di NO2- e un protone (H+)13. All'interno del sangue intero 14,15, NO e NO2- vengono rapidamente convertiti in nitrato (NO3-) poiché queste molecole reagiscono avidamente con i gruppi eme ossidati di Hb [Hb-Fe2+-O2 o ossiemoglobina (oxyHb)] per produrre NO3-. Questa reazione è accoppiata con la transizione del gruppo eme allo stato ferrico [Hb-Fe3+ o metaemoglobina (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

La barriera dei globuli rossi (RBC) e lo spazio immediatamente adiacente all'endotelio sono i principali fattori che limitano questa reazione e consentono a una piccola porzione di NO rilasciato dall'endotelio di agire come EDRF16,17. Infatti, l'Hb privo di cellule in circolazione è noto per interrompere la vasodilatazione in contesti sperimentali e clinici17,18. All'interno del RBC, a seconda dell'ossigenazione e della concentrazione di NO2-, una porzione di NO reagisce con la deossiemoglobina (Hb-Fe2+) per formare ferro-nitrosil Hb (Hb-Fe2+-NO o HbNO):

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

Nell'RBC15,17, NO2- può formare Hb-Fe3+ riducendo Hb-Fe2+ portando al rilascio di NO, che a sua volta lega Hb-Fe2+-O 2 (preferenzialmente) o Hb-Fe2+.

La generazione di NO-derivati non deve essere considerata strettamente unidirezionale in quanto l'NO può essere rigenerato da NO2- e NO3- in vari tessuti e da diversi enzimi (ad esempio, da batteri intestinali o all'interno dei mitocondri, in particolare in condizioni ipossiche)19,20.

Una quantità variabile di NO prodotto (o somministrato) porta alla generazione a valle di S-nitrosotioli, principalmente mediante transnitrosazione tiolica da N2O3 in presenza di un nucleofilo che crea un intermedio donatore NO+ (Nuc-NO+-NO2-):

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

Un'altra possibilità per la generazione di S-nitrosotioli è la nitrosilazione dei tioli ossidati (NO che reagisce con un tiolo ossidato):

RS• + NO → RS-NO

Questo meccanismo e l'ossidazione diretta del tiolo da parte di NO2 potrebbero essere possibili solo in condizioni molto specifiche descritte altrove21. Gli S-nitrosotioli vanno da molecole leggere come S-nitrosoglutatione a grandi proteine contenenti tiolo. La S-nitrosoemoglobina (S-NO-Hb) è formata dalla nitrosazione di un gruppo tiolo di un residuo di cisteina conservato nella catena β (β93C)22.

La generazione e il metabolismo degli S-nitrosotioli fanno parte di importanti meccanismi di regolazione. Gli esempi includono la regolazione di glutatione, caspasi, N-metil-D-aspartato (NMDA) e recettori della rianodina 23,24,25,26,27,28. Precedentemente considerata come uno dei principali mediatori della biologia dell'NO in vivo, l'albumina nitrosata (S-nitroso-albumina) sembra essere un trasportatore NO/NO+ senza alcuna specifica attività biologica aggiuntiva29.

Quando si misura la concentrazione di NO e dei suoi derivati da uno specifico campione biologico all'interno di una matrice biologica, è importante considerare caratteristiche come l'acidità, l'ossigenazione, la temperatura e la presenza di reagenti. Gli esempi includono donatori di NO esogeni somministrati e, nel contesto dell'infiammazione acuta, il perossido di idrogeno (H2O2) che reagisce con NO2 portando alla generazione di concentrazione supernormale di radicali liberi come il perossinitrito (ONOO-)21. Oltre al metodo analitico che viene impiegato, è fondamentale la fase preanalitica di preparazione e conservazione del campione. Le reazioni a valle che non rappresentano l'attività di NO in vivo devono essere previste, considerate e bloccate. Un esempio valido è l'instabilità di S-NO-Hb, che richiede un trattamento dedicato dei campioni di sangue quando è mirato per la misurazione22.

I saggi basati sulla chemiluminescenza sono il gold standard per rilevare i livelli di NO e dei suoi principali metaboliti [NO2-, NO3-, S-NO e complessi ferro-nitrosilici (Fe-NO)] in qualsiasi fluido biologico, compresi gli omogeneizzati tissutali30,31. Questi metodi si basano sul rivelatore di chemiluminescenza (CLD), un dispositivo che ospita la reazione di NO con l'ozono (O3), generando NO2 in uno stato eccitato (NO2•). Il rilassamento di NO2• provoca l'emissione di un fotone di luce che viene rilevato da un tubo fotomoltiplicatore, generando un segnale elettrico direttamente proporzionale al contenuto di NO della miscela di gas campionata32. È rappresentato uno schema semplificato del CLD.

Figure 1
Figura 1: Schema semplificato di un rivelatore a chemiluminescenza per gas di ossido nitrico. Il rilevamento basato sulla chemiluminescenza dell'ossido nitrico (NO) è la generazione stechiometrica di un fotone per molecola di gas NO che viene introdotta nel rivelatore di chemiluminescenza (CLD). La reazione di chemiluminescenza è ottenuta in una camera designata alimentata con ozono (O3) da un generatore interno, che viene mantenuto a pressione negativa dal collegamento con una pompa esterna, consentendo un afflusso continuo e costante di gas campione. La generazione di O3 richiede ossigeno biatomico (O2) che viene fornito da un serbatoio O2 dedicato collegato al CLD (altri produttori forniscono CLD funzionanti con aria ambiente). All'interno della camera di reazione, ogni molecola di gas NO contenuta nel gas campionato reagisce con l'ossigeno per produrre una molecola di biossido di azoto allo stato attivato (NO2*). Tornando al suo stato fondamentale, ogni molecola di NO2* emette un fotone che viene rilevato da un tubo fotomoltiplicatore (PMT) situato adiacente alla camera di reazione. Il PMT con l'amplificatore associato e l'unità di elaborazione centrale produce un segnale proporzionale al conteggio dei fotoni e al numero di molecole di NO nella camera di reazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'ingresso del campione del CLD può essere collegato a un sistema di vetreria contenente una camera di reazione per campioni liquidi. Il sistema viene continuamente spurgato con un gas inerte come azoto, elio o argon, trasferendo NO dalla camera di reazione al CLD. I campioni in fase liquida vengono iniettati attraverso una membrana dedicata nel recipiente di spurgo.

Figure 2
Figura 2: Struttura di un recipiente di spurgo per il rilevamento basato sulla chemiluminescenza del gas di ossido nitrico Il recipiente di spurgo (a destra) consente il rilevamento di gas di ossido nitrico (NO) o di qualsiasi altro composto che può essere facilmente convertito in gas NO quando rilasciato da un reagente in fase liquida. L'ingresso del gas inerte è collegato a una fonte (serbatoio) di un gas inerte come Argon, Xeon o azoto biatomico (N2). La valvola a spillo (si apre a sinistra) viene utilizzata per il controllo della pressione all'interno del recipiente di spurgo e può essere completamente rimossa per pulire la nave. La porta di iniezione è coperta da un cappuccio con un setto a membrana per l'iniezione del campione. La membrana deve essere sostituita spesso. Una camicia riscaldata circonda la camera di reazione ed è collegata a un bagno di acqua calda per eseguire il test VCl3 in HCl. L'uscita del recipiente di spurgo è collegata al rivelatore di chemiluminescenza (CLD) o alla trappola NaOH (necessaria per VCl3 nei saggi HCl). Per drenare il contenuto della camera di reazione, chiudere prima i rubinetti all'ingresso del gas inerte e all'uscita del recipiente di spurgo, chiudere la valvola a spillo, rimuovere il tappo alla porta di iniezione e infine aprire il rubinetto di arresto allo scarico. La trappola NaOH (a sinistra) deve essere posizionata in linea tra il recipiente di spurgo e il CLD se il VCl3 nel test HCl viene eseguito a causa della corrosività dell'HCl. Il collegamento al CLD richiede sempre un filtro dielettrico a campo intenso (IFD) da posizionare tra il CLD e l'uscita del recipiente di spurgo (o della trappola NaOH, se utilizzata). Il filtro IFD rimuove le particelle sospese nell'aria e impedisce al liquido di passare attraverso il recipiente di spurgo. PTFE = politetrafluoroetilene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Di conseguenza, qualsiasi composto che può essere convertito in NO attraverso una reazione chimica specifica e controllata può essere rilevato con elevata sensibilità in qualsiasi fluido biologico e omogeneizzato tissutale24. La misurazione diretta dell'NO in fase gassosa attraverso la chemiluminescenza viene eseguita sia in ambito sperimentale che clinico. Queste tecniche sono ampiamente descritte altrove 33,34,35. La misurazione di NO2-, S-nitrosotioli, proteine S-nitrosate e Fe-NO può essere eseguita aggiungendo campioni in una miscela di reazione con triioduro (I3-), che rilascia stechiometricamente gas NO da tutti questi composti:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

mentre I3- non reagisce con NO 3-15. Misurazioni precise di ciascun composto sono rese possibili dal pretrattamento di aliquote campione con sulfanilamide acidificata (AS) con o senza cloruro mercurico (HgCl2). In particolare, il pre-trattamento con AS rimuove tutto il contenuto di NO2. Di conseguenza, il contenuto di NO misurato dal CLD riflette solo la somma della concentrazione di S-NO e Fe-NOs. L'iniezione di HgCl2 in un'aliquota del campione prima dell'iniezione di AS provoca il rilascio di NO2- da parte di S-NO. Il trattamento con AS (che porta alla rimozione di NO2-) assicura che il contenuto di NO misurato rifletta solo la concentrazione di Fe-NO. Una serie di sottrazioni tra le valutazioni permettono di calcolare la concentrazione precisa dei tre derivati no22.

Figure 3
Figura 3: Fasi della preparazione del campione per il saggio di chemiluminescenza dell'acido acetico I3- in. Vengono illustrate le fasi sequenziali per la preparazione del saggio di chemiluminescenza dell'acido acetico I3- in acido acetico. È richiesto l'uso di tubi centrifughi protetti dalla luce. I tubi 1, 2 e 3 sono quelli utilizzati per preparare il test. Un'altra aliquota di campionamento (tubo 4) è necessaria per il VCl3 nel saggio HCl se è richiesta la misurazione del nitrato (NO3-). I passi sono indicati da numeri in rosso. Preriempire (Fase 1) come indicato con tampone fosfato salino (PBS) o HgCl2 prima di aggiungere il volume del campione. Aggiungere il volume del campione (2) come indicato, vortice e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente (RT). Aggiungere (3) PBS o sulfanilamide acidificata (AS) come indicato, vortice e incubare per 3 minuti a RT. Eseguire il test (4). La concentrazione misurata dal saggio è la somma della concentrazione dei composti riportati sotto ciascun tubo. Il tubo numero 1 consentirà misurazioni di nitriti (NO2-), S-nitrosotioli (S-NO) e complessi ferro-nitrosilici (Fe-NO) come un singolo segnale. Per la misurazione dei nitrati (NO3-), i campioni devono essere eseguiti sia con I3- in acido acetico che con VCl3 nei saggi HCl, e il valore ottenuto dal tubo 1 deve essere sottratto da quello ottenuto dal tubo 4. *quantità suggerite da utilizzare per l'analisi dell'Hb per la determinazione dell'NO2 residuo, della S-nitrosoemoglobina e dell'emoglobina ferro-nitrosil-emoglobina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per la misurazione dell'NO3- il cloruro di vanadio (III) (VCl3) in acido cloridrico (HCl) viene utilizzato per la conversione di NO3- in NO nel recipiente di spurgo al fine di misurare stechiometricamente l'NO3- con il CLD:

2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+

Per ottenere una conversione sufficientemente veloce, la reazione deve essere eseguita a 90-95 °C. La riduzione da NO3- a NO2- è accoppiata con la riduzione di NO2- a NO da HCl. Il metallo vanadio riduce anche gli S-NO liberando la loro frazione di NO22,36. La concentrazione finale ottenuta da CLD con VCl3 in HCl riflette la concentrazione aggregata di NO3-, NO2 e altri composti nitrosi. La sottrazione di quest'ultimo valore dalla concentrazione prodotta con CLD con I3- consente il calcolo della concentrazione di NO3- 36,37 (Figura 3).

Nel test di consumo di NO, il rilascio continuo di NO nel vaso di spurgo da parte di donatori di NO come (Z)-1-[2-(2-amminoetil)-N-(2-ammonioetil)ammino]diazen-1-ium-1,2-diolato (DETA-NONOato) genera un segnale stabile che consente di quantificare l'ossiHb privo di cellule nei campioni iniettati. La quantità di NO consumata nel recipiente di spurgo è in una relazione stechiometrica con la quantità di oxyHb nel campione38.

Vengono illustrati i protocolli per la misurazione di NO2-, NO3-, S-nitrosotioli, complessi ferro-nitrosilici e consumo di NO da parte di Hb senza cellule in campioni di plasma. Gli studi sull'NO nell'ambiente RBC richiedono un trattamento specifico del campione seguito da cromatografia di esclusione per misurare S-NO-Hb e Hb-NO estremamente fragili accoppiati con la determinazione della concentrazione totale di Hb15,22. La preparazione del campione è strumentale alla correzione della misurazione. La preesistenza di NO2- in H2O e il rilascio di NO2- durante il test possono portare alla misurazione di concentrazioni artificialmente più elevate di derivati NO come S-NO-Hb14,39. Vengono inoltre presentati aspetti importanti della preparazione del campione.

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Protocol

Le procedure indicate in questo protocollo sono in conformità con il comitato di revisione del Massachusetts General Hospital. I campioni di sangue utilizzati erano stati raccolti durante uno studio precedente e sono stati de-identificati per lo scopo attuale18.

NOTA: vedere le istruzioni del produttore per indicazioni specifiche sui collegamenti ottimali tra tubi e bicchieri che costituiscono il recipiente di spurgo, il lavaggio e la manutenzione generale. Le connessioni devono essere solide e fatte con cura per non danneggiare la vetreria. Identificare i componenti del recipiente di spurgo del vetro: linea di ingresso del gas, recipiente di spurgo con camicia di riscaldamento e condensatore, trappola per gorgogliatori di gas idrossido di sodio (NaOH), linea di collegamento tra il recipiente di spurgo e il gorgogliatore, linea del gas di uscita del recipiente di spurgo (a CLD) dotata di un filtro dielettrico a campo intenso (IFD). Una linea filtrante IFD tra il recipiente di spurgo e l'ingresso del campione del CLD deve essere in posizione ogni volta che NON vengono misurati metaboliti in forma liquida (plasma, colture cellulari, omogeneizzati tissutali) (tutti i saggi presentati nel protocollo). La preparazione del campione dipende dal fluido o dal tessuto che viene analizzato e dai composti di interesse. Aspetti importanti della fase preanalitica sono trattati nelle sezioni 1 e 2. Le fasi di preparazione specifiche per test specifici sono incluse nelle sezioni 3-5. Le sezioni 6-8 si applicano a tutti i test.

1. Preparazione di reagenti dedicati

NOTA: Per maggiori dettagli, fare riferimento alle precedenti pubblicazioni15,22.

  1. Preparare la soluzione acidificata al 5% (290 mM) di sulfanilamide (AS) per la rimozione di NO2- sciogliendo 500 mg di sulfanilamide in 10 mL di 1N HCl. Questa soluzione è stabile per mesi.
  2. Preparare la soluzione di cloruro mercurico (HgCl2) da 50 mM per il rilascio di NO2 da S-NOs sciogliendo 67,9 mg di HgCl2 in 5 ml di PBS. Proteggere la soluzione madre dalla luce.
  3. Preparare la soluzione di NO2- bloccante con ferricianuro da 800 mM [K3Fe(CN)6] per ossidare Hb insieme a 100 mM N-etilmaleimmide (NEM) per bloccare i gruppi tiolici e (OPZIONALE) soluzione di glicole nonilfenile-polietilenico al 10% (Nonidet p-40) per solubilizzare le membrane dei globuli rossi.
    1. Aggiungere K3Fe(CN)6 all'acqua deionizzata e distillata (ddH2O, 263,5 g di polvere per litro) per ottenere una concentrazione finale di 800 mM.
    2. Aggiungere NEM agli 800 mM K3Fe(CN)6 in soluzione di ddH2O (12,5 g di polvere per litro per avere una concentrazione di 100 mM) e mescolare la soluzione per sciogliere tutti i cristalli.
    3. Aggiungere una parte del 10% di NP-40 a nove parti della soluzione NEM K3Fe(CN)6 100 mM da 800 mM NEM (111 ml per litro) e mescolare bene (passaggio obbligatorio per l'analisi del sangue intero).
  4. Preparare la soluzione di stabilizzazione S-NO-Hb contenente 12 mM K3Fe(CN)6, 10 mM NEM, acido dietilentriamminotentapentaacetico da 100 μM (DTPA, per la chelazione dei metalli) e detergente Nonidet p-40 all'1% dalle loro soluzioni stock.
    1. Preparare una soluzione NEM da 200 mM aggiungendo cristalli NEM al PBS (25 mg/mL, ad esempio 250 mg in 10 mL PBS) e mescolare la soluzione fino a quando tutti i cristalli sono disciolti (da produrre il giorno dell'esperimento).
    2. Preparare una soluzione di K3Fe(CN)6 da 800 mM aggiungendo K3Fe(CN)6 a ddH2O (263,5 mg/mL, ad esempio 1,32 g in 5 mL di ddH2O per ottenere una concentrazione finale di 800 mM) (da effettuare il giorno dell'esperimento).
    3. Preparare una soluzione madre di DTPA da 10 mM aggiungendo 786 mg di DTPA a 200 mL di ddH2O e regolare il pH a 7,0 con 5N NaOH per solubilizzare completamente DTPA.
    4. Aggiungere 5 mL di soluzione NEM da 200 mM, 1,5 mL di soluzione K3Fe(CN)6 da 800 mM e 1 mL di soluzione madre DTPA a 81,5 mL di PBS a 7,2 pH e, infine, aggiungere infine 11 mL di NP-40 al 10% per portare il volume finale a 100 mL.

2. Raccolta dei campioni

NOTA: Per maggiori dettagli sulla raccolta dei campioni, fare riferimento alle opere precedentemente pubblicate 15,22,40.

  1. Raccogli sangue intero
    1. Raccogliere il sangue in tubi rivestiti di eparina preferendo il vaso venoso a quello arterioso (a meno che non sia specificamente richiesto) e preferendo il posizionamento del catetere rispetto alla venipuntura (se possibile) con catetere o ago di almeno 20 G o più grande per ridurre al minimo l'emolisi.
    2. Aggiungere immediatamente la soluzione che blocca l'NO2 (1 parte della soluzione a 4 parti di sangue intero), elaborare (paragrafi 3 o 4) o congelare e conservare a -80 °C.
  2. Raccogliere plasma e globuli rossi (RBC)
    1. Raccogliere il sangue in tubi rivestiti di eparina preferendo il sangue venoso a quello arterioso (se non specificamente richiesto) e aghi di almeno 20 G o più grandi per ridurre al minimo l'emolisi e centrifugare immediatamente per 5 minuti a 4000 x g a 4 °C.
    2. Mescolare il surnatante (plasma) con la soluzione bloccante NO2 (1 parte della soluzione in 4 parti del surnatante) in un nuovo tubo e processo (sezioni 3 o 4), oppure congelare e conservare a -80 °C.
      NOTA: per il test di consumo NO, non è possibile utilizzare la soluzione di blocco NO2. Il test può essere eseguito senza pretrattamento al plasma.
    3. Risospesso il pellet RBC dal fondo in un nuovo tubo preriempito con soluzione di stabilizzazione S-NO (vedere fase 1.4) (1 mL di pellet a 9 mL di soluzione) e incubare per 5 min.
    4. Passare il lisato RBC in una colonna di dimensionamento con polimero G-25 Sephadex che è stato precedentemente risciacquato con ddH2O per cromatografia di esclusione
    5. Raccogliere la frazione Hb da processare (sezione 4) e misurare la concentrazione di Hb utilizzando il reagente di Drabkin (per la misurazione dell'Hb, fare riferimento al lavoroprecedentemente pubblicato 22).
      NOTA: Per preparare e campionare un tessuto/organo specifico, identificare il suo ilo e isolarlo chirurgicamente. Incidere la vena, perforare l'arteria e iniettare con soluzione salina eparinizzata (10 U / mL) attraverso l'arteria. Asportare il tessuto quando la soluzione salina inizia a riflusso all'incisione venosa. Omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore meccanico aggiungendo 1 parte di soluzione bloccante NO2 a 4 parti di tessuto omogeneizzato.

3. VCl3 nella preparazione del saggio HCl

NOTA: Per maggiori dettagli sul VCl3 nella preparazione del saggio HCl, fare riferimento ai lavori precedentemente pubblicati37,41.

ATTENZIONE: il CLD sarà danneggiato se la trappola NaOH non è correttamente in posizione durante l'esecuzione di questo test. Ciò è dovuto alla corrosività di HCl.

  1. Preparare soluzioni standard di NO3- per curve standard
    1. Sciogliere 85 mg di NaNO3 in 10 mL di ddH2O per ottenere 0,1 M NaNO3- (questa soluzione rimane stabile per alcune settimane).
    2. Utilizzare la soluzione madre per preparare gli standard mediante diluizione in ddH2O per ottenere concentrazioni di 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 al fine di eseguire una curva di calibrazione per campioni di plasma o urina (utilizzare concentrazioni più basse se si lavora con colture cellulari).
  2. Preparare la soluzione satura di VCl3 (cloruro di vanadio) per la riduzione di NO3- nel recipiente di spurgo
    ATTENZIONE: La reazione dell'acqua e del VCl3 è esotermica. Prestare attenzione all'alta temperatura della vetreria quando si aggiunge acido e quando si risciacqua la vetreria alla fine dell'esperimento.
    1. Sciogliere 1,6 g di VCl3 in 200 mL di 1 M HCl aggiungendo prima VCl3 in un matraccio pulito, quindi aggiungendo 200 mL di 1 M HCl.
    2. Filtrare sottovuoto la soluzione attraverso carta da filtro (ad esempio carta da filtro da 11 μm, ma è possibile utilizzare qualsiasi carta da filtro).
      NOTA: la soluzione filtrata deve diventare blu chiaro, mentre la soluzione di VCl3 non filtrata è marrone a causa di particelle non disciolte.
    3. Mantenere la soluzione satura coperta con un foglio di alluminio o nastro in politetrafluoroetilene (PTFE) poiché il composto è sensibile alla luce.
  3. Preparare il bagno d'acqua circolante
    1. Collegare un dispositivo a bagno d'acqua circolante alla camicia d'acqua del recipiente di spurgo. Assicurarsi che le linee siano asciutte prima dell'adescamento.
    2. Avviare il bagno d'acqua a 95 °C e verificare l'assenza di perdite sulle linee dell'acqua applicando (non aderenti) carta assorbente attorno alle linee.
  4. Impostare la trappola del gorgogliatore di gas
    1. Verificare che il manicotto in PTFE del gorgogliatore sia in posizione e che non sia danneggiato.
    2. Aprire il gorgogliatore di gas e iniettare 15 mL di 1 M NaOH nella base del gorgogliatore.
    3. Riposizionare il gorgogliatore di gas e sigillare saldamente la connessione premendo il fondo verso l'alto e ruotando leggermente le due parti. L'impossibilità di girare la parte superiore del gorgogliatore senza applicare forza indica una tenuta corretta.
    4. Collegare l'uscita del recipiente di spurgo all'ingresso della trappola del gorgogliatore di gas.

4. I3- nella preparazione del saggio dell'acido acetico

NOTA: Per maggiori dettagli su I3- nella preparazione del saggio dell'acido acetico, fare riferimento ai lavori precedentemente pubblicati 15,22,38,41,42.

  1. Preparare la curva standard per NO2-
    1. Preparare una soluzione madre sciogliendo 69 mg di nitrito di sodio (NaNO2) in 10 mL di ddH2O per ottenere una soluzione da 100 mM. Questa soluzione è stabile se conservata in un contenitore ermetico, refrigerata e protetta dalla luce.
    2. Diluire in serie la soluzione madre in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL preriempito con 900 μL di ddH2O: aggiungere 100 μL della soluzione madre al primo tubo centrifugo, mescolare, etichettare e utilizzare 100 μL del tubo per il secondo tubo, quindi ripetere risultando 10 mM, 1 mM, quindi 100 μM.
    3. Diluire ulteriormente con ddH2O per ottenere aliquote NaNO 2 da 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM e 500 nM NaNO2 da utilizzare nella curva di taratura.
  2. Preparare l'acido acetico I3- in per il recipiente di spurgo (può essere conservato a temperatura ambiente (RT) per 1 settimana)22
    1. Aggiungere 2 g di ioduro di potassio (KI) e 1,3 g di iodio (I2) a 40 ml di ddH2O e 140 ml di acido acetico.
    2. Mescolare accuratamente mescolando il composto per almeno 30 minuti.
  3. Preparare i campioni per la determinazione differenziale di NO2-, S-nitrosotioli (S-NO-Hb, se viene raccolto Hb) e complessi ferro-nitrosilici (Hb-NO se viene raccolto Hb) (Figura 3)
    1. Dividere ciascun campione in 3 aliquote di 270 μL (900 μL di Hb se si misurano S-NO-Hb e Hb-NO) in tubi microcentrifuga protetti dalla luce, 2 dei quali preriempiti con 30 μL di 1x PBS (100 μL se misurano S-NO-Hb e Hb-NO) e il terzo tubo con 30 μL di HgCl2 (100 μL se misurano S-NO-Hb e Hb-NO), vortice e incubazione a RT per 2 minuti (Figura 3).
    2. Aggiungere 30 μL di 5% AS al campione con HgCl2 per misurare Fe-NO-NOs, (100 μL per Hb-NO) e a uno con PBS aggiunto per misurare S-NOs e Fe-NOs (100 μL per S-NO-Hb e Hb-NO) e aggiungere 30 μL di PBS al terzo già pre-riempito con 1x PBS per misurare NO2-, S-NOs e Fe-NOs (100 μL per NOresiduo 2- dalla raccolta di Hb, S-NO e Hb-NO). Vortice e incubazione a RT per 3 minuti (Figura 3).

5. NESSUN consumo con configurazione Hb senza celle

NOTA: Per maggiori dettagli, fare riferimento al lavoro precedentemente pubblicato38.

  1. Preparare soluzioni standard di oxyHb da una soluzione di Hb stock purificata con una concentrazione nota
    1. Diluire serialmente la soluzione madre in tubi microcentrifuga da 1,5 mL con aggiunta di ddH2O per ottenere le soluzioni che verranno utilizzate per la curva di calibrazione: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3.125 μM, 1,56 μM.
  2. Preparare la soluzione DETA-NONOate
    1. Aggiungere 10 mg di DETA-NONOate a 610 μL di NaOH 10 μM in pH 7,4 PBS per generare 100 mM di DETA-NONOato e mantenerlo sul ghiaccio.

6. Avviare il rilevatore di chemiluminescenza (CLD) e preparare il recipiente di spurgo

NOTA: Per la preparazione della nave di spurgo, fare riferimento al lavoro precedentemente pubblicato43.

  1. Verificare le connessioni principali da e verso il CLD
    1. Collegare la linea dell'ossigeno al CLD e aprire il serbatoio dell'ossigeno a una pressione concordata con il produttore del CLD.
    2. Assicurarsi che la linea filtrante IFD (Intense Field Dielectric) sia collegata al CLD ma non al recipiente di spurgo o alla trappola NaOH
  2. Avviare il CLD
    1. Sull'interfaccia CLD, avviare l'esecuzione del programma di rilevamento per i saggi in fase liquida.
    2. Verificare che l'apporto di ossigeno sia adeguato. In questo caso, il CLD inizierà con successo il campionamento dal suo ingresso e indicherà il rilevamento da parte di un segnale in millivolt (0-5 mV). In caso contrario, il CLD richiederà un segnale diagnostico negativo.
  3. Preparare il recipiente di spurgo
    1. Chiudere il recipiente di spurgo su tutte e tre le porte: avvitare completamente la valvola a spillo a destra, chiudere i rubinetti di ingresso e di uscita.
    2. Rimuovere il tappo dal recipiente di spurgo e aggiungere una quantità sufficiente del reagente specifico per il saggio pianificato alla camera di reazione (Tabella 1) in modo che l'ago della siringa utilizzato per iniettare i campioni possa raggiungere la colonna di fluido.
    3. Verificare la presenza di una linea di base desiderata stabile (Tabella 1).
  4. Avviare il flusso di gas di spurgo
    1. Assicurarsi che il serbatoio del gas inerte (ad esempio, N2) sia dotato di un regolatore a due stadi e collegare il serbatoio del gas inerte con l'ingresso del gas del recipiente.
    2. Aprire il gas con una pressione di uscita al regolatore di 1-5 psi, aprire l'ingresso del recipiente di spurgo e aprire lentamente la valvola a spillo del recipiente di spurgo per consentire l'afflusso di gas. Verificare il gorgogliamento all'interno del recipiente di spurgo.
  5. Regolare il flusso di gas
    1. Registrare la pressione della cella misurata dal CLD con la linea di filtraggio IFD che campiona l'aria ambiente.
    2. Riposizionare il cappuccio sul recipiente di spurgo, collegare la linea del filtro IFD al recipiente di spurgo (o alla trappola NaOH nel VCl3 nel test HCl) e aprire l'uscita del recipiente di spurgo.
    3. Utilizzare la valvola a spillo per raggiungere la stessa pressione della cella al livello CLD registrato nell'aria ambiente.

7. Esperimento

NOTA: Per maggiori dettagli sull'esperimento, fare riferimento al lavoroprecedentemente pubblicato 43.

  1. Avviare il programma di acquisizione del segnale di chemiluminescenza
    1. Collegare la porta seriale del CLD alla porta seriale del computer in cui è stato installato il programma di acquisizione.
    2. Eseguire il programma di analisi.
    3. Fare clic su Acquisisci, selezionare la cartella in cui salvare il file .data, digitare il nome del file e fare clic su Salva.
      NOTA: notare il tempo di esecuzione preimpostato sullo schermo, poiché la registrazione si interrompe automaticamente allo scadere del tempo preimpostato. Se necessario, il tempo di esecuzione preimpostato può essere aumentato.
  2. Prepararsi per iniezioni ripetute di campioni
    1. Regolare la scala di tensione sullo schermo per avere il controllo sulla linea di base di destinazione facendo clic sui pulsanti Minimo e/o Massimo e quindi inserendo il valore desiderato.
    2. Avere un tubo da 20 o 50 ml riempito con ddH2O per risciacquare la siringa tra i campioni.
    3. Avere una scatola di salviette delicate prontamente disponibili.
  3. Iniezione del campione
    NOTA: Iniziare dalle soluzioni standard per la curva di calibrazione (iniettare dai campioni meno concentrati a quelli più concentrati), quindi procedere ai campioni dell'esperimento (considerare di farlo in duplicati o triplicati).
    1. Risciacquare la siringa almeno due volte o più con ddH2O prima di prelevare ogni campione (e dopo ogni iniezione) e verificare ogni volta l'espulsione di acqua senza ostacoli su una salvietta da attività.
    2. Inserire la siringa nella provetta del campione tenendo sia la siringa che il tubo a distanza ravvicinata, tirare lo stantuffo al volume desiderato assicurandosi che nessuna bolla d'aria e/o parti solide non omogeneizzate siano intrappolate.
    3. Pulire la punta della siringa con un tergicristallo, quindi inserire la siringa nel cappuccio dei setti in corrispondenza della porta di iniezione e iniettare dopo aver verificato che la punta della siringa rientri nella fase liquida nella camera di reazione.
  4. Contrassegnare l'iniezione nel programma software e attendere
    1. Verificare che l'iniezione causi un cambiamento verso l'alto nel segnale (Figura supplementare 1) (verso il basso nel consumo di NO mediante test Hb senza cellule) e digitare il nome del campione facendo clic sulla casella grigia in Nomi campione, quindi fare clic su Segna iniezione.
      NOTA: sospetta ostruzione della siringa se l'iniezione del campione non genera un segnale.
    2. Attendere che il segnale elettrico raggiunga nuovamente la linea di base (questo di solito richiede 3-4 minuti). Questa volta può essere utilizzato per eseguire il passaggio 7.3.1.
  5. Ripetere tutti i passaggi indicati nei passaggi 7.3 e 7.4 durante e dopo ogni iniezione fino alla fine dell'esperimento. Ricordarsi di eseguire un campione della soluzione di conservazione (se utilizzata)
  6. Interrompere l'esperimento
    1. Fare clic su STOP per interrompere l'acquisizione del segnale, arrestare il CLD e spegnere il bagno d'acqua (se viene misurato NO3-).
    2. Interrompere il flusso di gas, aprire la valvola a spillo, rimuovere il tappo dal recipiente di spurgo, posizionare un contenitore per i rifiuti sotto lo scarico e aprire il rubinetto di scarico.
      NOTA: se l'esperimento richiede l'acquisizione dei dati per più di 60 minuti, è necessario riavviare l'acquisizione dopo 60 minuti di tempo di esecuzione (ripetere il passaggio 7.1.3) e creare un nuovo file.

8. Misurazioni e calcoli

NOTA: le misurazioni e i calcoli vengono effettuati offline e possono essere eseguiti in un momento diverso.

  1. Avvia il programma di acquisizione della chemiluminescenza per l'analisi dei dati offline
    1. Avviare il programma e fare clic su Processo.
    2. Seleziona il file dell'esperimento, quindi fai clic su Apri.
  2. Calcola l'area sotto la curva per ogni somministrazione
    1. Il software traccia automaticamente sullo schermo la linea di base (Figura supplementare 2A, linea gialla orizzontale) e l'asse di picco di ogni onda generata da ciascuna somministrazione del campione (linee gialle verticali): verificarne la posizione corretta (o regolarla cliccando su ogni linea e spostandola con il mouse o le frecce) e cliccare su Soglia OK (Figura supplementare 2B).
      NOTA: nel consumo di NO mediante test di misurazione Hb senza cellule, il software in genere non riesce a catturare correttamente la forma d'onda generata dall'iniezione del campione. Zoomando su ogni forma d'onda, l'operatore può facilmente assistere il software nel calcolo dell'area (Figura supplementare 2).
    2. Il software rappresenta automaticamente l'inizio (linea verde verticale) e la fine (linea rossa verticale) di ogni picco causato da ciascuna somministrazione del campione: verificarne la corretta posizione (o regolarla cliccando su ogni linea e spostandola con il mouse o le frecce) e cliccare su Integra (Figura supplementare 2C).
      NOTA: alcune aree della traccia possono essere erroneamente definite come iniezioni a questo punto e alcuni picchi possono essere contati automaticamente due volte. Entrambi gli errori possono essere nuovamente identificati e rimossi durante il passaggio 8.2.2
    3. Il software abbina automaticamente ogni area del segnale a seguito di un'iniezione segnata durante l'esperimento e il suo nome assegnato: naviga ogni picco (indicato da una linea verticale gialla) con il nome assegnato cliccando su Next Peak e Previous Peak, quindi clicca sul pulsante All OK per ottenere finalmente il calcolo per tutte le aree sullo schermo.
    4. Al fine di correggere tutti gli errori di denominazione o di corrispondenza commessi dall'utente o dal programma, utilizzare secondo necessità i pulsanti indicati nel file supplementare 1.
  3. Trasferire i valori della curva di calibrazione in un foglio di calcolo e generare un'equazione di regressione lineare (Figura supplementare 3)
    1. Trasferire i dati dal programma CLD a un nuovo foglio di calcolo tramite copia-incolla. Disporre le due colonne del foglio dati come Concentrazione campione e Area sotto la curva e aggiungere un valore corrispondente pari a zero su entrambe le colonne.
    2. Selezionare le due colonne, fare clic su Inserisci > Dispersione, quindi nel menu Progettazione grafico selezionare Aggiungi elemento grafico > linea di tendenza > lineare.
    3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea di tendenza generata, fare clic su Formato linea di tendenza, quindi fare clic sulle opzioni Visualizza equazioni sul grafico e Visualizza valore R-quadrato su Grafico nel menu Formato linea di tendenza per ottenere una semplice equazione di calibrazione lineare.
  4. Trasferire l'area calcolata di ciascun campione per calcolarne la concentrazione (Figura supplementare 3)
    1. Segnala ogni valore sul foglio di calcolo. Nella colonna successiva, applicare l'equazione ottenuta dal punto 8.3.3 per ottenere la concentrazione di ciascun campione iniettato, dove y è la concentrazione (valore della nuova colonna) e x è l'area sotto la curva misurata dopo l'iniezione.
      NOTA: Ricordarsi di prendere in considerazione la concentrazione misurata nella soluzione di conservazione (se utilizzata) e sottrarre i valori di conseguenza.

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Representative Results

Il consumo di NO mediante il saggio hb senza cellule è stato utilizzato in campioni contenenti concentrazioni note di ossiHb privo di cellule (Figura 4). Poiché un eme di oxyHb rilascia stechiometricamente una molecola NO nel test, l'oxyHb privo di cellule purificate viene utilizzato per costruire la curva di calibrazione per il test (Figura supplementare 3).

La relazione dose-risposta tra Hb senza cellule (misurata con un test colorimetrico) e consumo di NO nei pazienti che escono dal bypass cardiopolmonare (CPB) durante la cardiochirurgia è mostrata nella Figura 5. Si può presumere che dopo CPB ci sia una maggiore concentrazione di gruppi eme nello stato Hb-Fe2+-O2 (Figura 5, rosso) rispetto ai pazienti che ricevono NO durante CPB da cui solo una minoranza di gruppi eme di Hb senza cellule consuma NO (Figura 5, verde).

Il protocollo per la valutazione del consumo di NO da parte di Hb senza cellule è stato precedentemente applicato per testare campioni di plasma di 50 pazienti sottoposti a cardiochirurgia e che richiedono CPB. Il sangue è stato raccolto al basale e 15 minuti, 4 ore e 12 ore dopo CPB. Lo scopo dello studio era quello di indagare la relazione esistente tra resistenza vascolare sia polmonare che sistemica e l'aumento dell'emolisi osservato dopo la CPB. La concentrazione di Hb senza cellule è stata valutata con un saggio colorimetrico Hb. L'emolisi ha raggiunto il picco 15 minuti dopo CPB. L'Hb libero accumulato è stato lentamente eliminato dal plasma entro 12 ore18 (Figura 6A). Il consumo di NO, invece, ha raggiunto il picco a 15 minuti e ha raggiunto i valori basali in sole 4 ore (Figura 6B). Le curve di regressione lineare del consumo di NO da parte di Hb senza cellule hanno mostrato una relazione stechiometrica al timepoint post-CPB di 15 minuti rispetto al basale, 4 h e 12 h post-CPB (Figura 6C). La spiegazione della differenza osservata nella cinetica risiede nell'abbondanza di Hb libero appena rilasciato che non ha ancora incontrato NESSUNA molecola rilasciata dall'endotelio del paziente. La concentrazione di oxyHb (scavenging NO e conseguente consumo nel test) era, infatti, più alta a 15 minuti rispetto a qualsiasi altro punto temporale. Il plasma raccolto al basale e su altri timepoint aveva un componente relativamente più alto di metHb, che era già stato ossidato da NO, non legava NO e non causava consumo nel test. Le resistenze vascolari polmonari e sistemiche sono state misurate in modo invasivo e hanno raggiunto il picco a 15 minuti. Per la prima volta in questa specifica popolazione di pazienti, il consumo di NO da Hb libero è stato osservato essere temporaneamente accoppiato con vasocostrizione, che ha confermato precedenti osservazioni in modelli animali e in pazienti con anemia falciforme18.

La somministrazione di gas NO durante cpb e dopo l'intervento chirurgico aumenta la quantità relativa di metHb circolante rispetto a oxyHb. Quando i pazienti sottoposti a cardiochirurgia sono stati trattati con NO-gas intra-operatoriamente e post-operatoriamente, l'aumento osservato di Hb libero dopo CPB (Figura 7A) non è stato accoppiato con alcun aumento del consumo di NO, come misurato con il suddetto protocollo (Figura 7B). Il gas NO somministrato esogenamente converte la maggior parte dell'oxyHb in metHb, che a sua volta non elimina l'NO in vivo né consuma NO in vitro (dati non pubblicati).

Figure 4
Figura 4: Consumo di ossido nitrico da parte di ossiemoglobina purificata priva di cellule. Saggio di consumo di ossido nitrico eseguito iniettando campioni di concentrazioni note di ossiemoglobina priva di cellule purificate. La linea di regressione è mostrata in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. Consumo di ossido nitrico e concentrazione di emoglobina senza cellule da pazienti sottoposti a cardiochirurgia con bypass cardiopolmonare. Il livello di emoglobina privo di cellule di ciascun paziente, misurato con un kit colorimetrico, è stato tracciato con il consumo di ossido nitrico (NO) misurato attraverso la chemiluminescenza. I campioni di sangue sono stati prelevati 15 minuti dopo la fine del CPB. Le linee di regressione sono mostrate per i pazienti cardiochirurgici che non ricevono (in rosso) o ricevono (in verde) NO durante il bypass cardiopolmonare (CPB). L'emoglobina è espressa in μM di gruppi eme. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Consumo di ossido nitrico ed emoglobina cell-free nei pazienti cardiochirurgici. (A) La concentrazione di emoglobina (Hb) priva di cellule nel plasma dei pazienti sottoposti a cardiochirurgia con bypass cardiopolmonare (CPB) (N = 50) è stata determinata in diversi momenti con l'uso di un kit di determinazione colorimetrica disponibile in commercio. I dati sono stati analizzati adattando un modello misto con l'evidenza di un effetto fisso tra i punti temporali. La concentrazione plasmatica in diversi punti temporali è stata confrontata con il basale con il test di confronto multiplo di Tukey. (B) Consumo di ossido nitrico (NO) da parte del plasma ottenuto dagli stessi campioni utilizzati per la quantificazione dell'Hb libero. I dati sono stati analizzati adattando un modello misto con evidenza di un effetto fisso tra i punti temporali. La concentrazione plasmatica in diversi punti temporali è stata confrontata con il basale con il test di confronto multiplo di Dunnett. (C) Linee di regressione per il contenuto plasmatico di Hb privo di cellule abbinato al consumo di NO. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns non significativo. I dati sono presentati come mediani ±interquartile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Effetti della somministrazione di gas di ossido nitrico sul consumo di ossido nitrico in pazienti sottoposti a cardiochirurgia. (A) Concentrazione di emoglobina priva di cellule nel plasma di pazienti sottoposti a cardiochirurgia con bypass cardiopolmonare (CPB) che ricevono un gas placebo (N = 28) o ossido nitrico (NO) (N = 22) per 24 ore dall'inizio della CPB. La concentrazione è stata determinata in diversi punti temporali con l'uso di un kit colorimetrico disponibile in commercio. I dati sono stati analizzati dal test di Friedman, indicando la presenza di un effetto tra i punti temporali in entrambi i gruppi. La concentrazione plasmatica in diversi punti temporali è stata confrontata con il basale con il test di confronto multiplo di Dunn. (B) CONSUMO DI NO da parte del plasma ottenuto dagli stessi campioni utilizzati per la quantificazione di Hb privo di cellule. I dati sono stati analizzati dal test di Friedman, indicando la presenza di un effetto tra i punti temporali in entrambi i gruppi. La concentrazione plasmatica in diversi punti temporali è stata confrontata con il basale con il test di confronto multiplo di Dunn. ** p < 0,01, *** p < 0,001. I dati sono presentati come mediani ±interquartile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Saggio Miscela di reagenti Target di riferimento (mV)
VCl3 in HCl 5 mL di VCl3 in soluzione satura di HCl + 100 μL di antischiuma 0–5 mV*
I3– in acido acetico 5–7 mL di I3– reagente 0–5 mV*
CONSUMO DI NO da parte dell'emoglobina senza cellule 5–7 mL di PBS a pH 7,4 + 100 μL di agente antischiuma + 20 μL di soluzione espansa di DETA-NONOato 70–100 mV**
*valore ideale: la linea di base potrebbe essere più alta a causa della qualità dell'aria nell'ambiente dell'esperimento
**garantire la stabilità per 20 minuti prima di iniziare l'esperimento.

Tabella 1: Composizione del reagente del recipiente di spurgo e linea di base target per vari saggi di chemiluminescenza. Composizione del reagente del recipiente di spurgo per ciascun test descritto. NO = Ossido Nitrico; PBS = Soluzione salina tampone fosfato; DETA-NONOato: (Z)-1-[2-(2-amminoetil)-N-(2-ammonioetil)ammino]diazen-1-ium-1,2-diolato. *valore ideale: la linea di base potrebbe essere più alta a causa della qualità dell'aria nell'ambiente dell'esperimento. **garantire la stabilità per 20 minuti prima di iniziare l'esperimento. Per eseguire il test di consumo di NO, la scala deve essere modificata sul software per acquisire valori compresi tra 70 mV e 100 mV (ad esempio, 0-100 mV), che è la tensione di base target. Questa regolazione è suggerita per avere il pieno controllo sull'iniezione del campione, che consente di documentare il segnale che si muove dal basale dopo l'iniezione di un campione e di osservare il segnale che ritorna al basale. La registrazione dei dati non è influenzata né limitata alla scala visualizzata.

Figura supplementare 1: Picchi successivi al rilevamento di NO nel VCl3 nel test HCl. I picchi che seguono l'amministrazione del campione nel VCl3 in HCl sono mostrati sul software del bundle CLD. Il calcolo dell'area sotto il picco per ogni iniezione è mostrato per comodità e spiegato nella Figura supplementare 2. In questo esperimento, sono stati somministrati standard di diverse concentrazioni per la curva di calibrazione, seguiti da campioni di plasma. La diluizione è una soluzione utile per calcolare i metaboliti da campioni che producono NO nella fascia alta o anche al di fuori della curva di calibrazione. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Calcolo automatizzato assistito dall'utente dell'area sotto il picco. Quando si esegue il test di consumo di NO mediante emoglobina senza cellule, potrebbe essere necessario impostare manualmente i picchi per fornire al software i limiti più precisi per misurare l'area al di sotto del picco generato da ciascuna iniezione di campione. (A) Visione rappresentativa completa di un esperimento registrato. Si raggiunge cliccando su Elabora nel menu principale e selezionando e aprendo il file registrato di interesse. La linea gialla rappresenta la soglia del segnale (mV) che costituisce il segmento rettilineo dell'area sotto il picco. Facendo clic su di esso, l'utente può trascinarlo verso l'area del segnale. Gli assi x e y possono essere modificati per ingrandire il picco di interesse per una misurazione precisa facendo clic sui pulsanti in basso a sinistra o digitando il valore minimo e massimo desiderato per ciascuno. (B) Posizionamento della soglia. L'utente può selezionare la soglia di base ottimale trascinando la linea gialla sul punto medio del segnale a destra prima dello slittamento del segnale causato dall'iniezione del campione. Per continuare a limitare l'area, l'utente deve fare clic sul pulsante Imposta picchi manualmente . (C) Posizionamento dei cursori di inizio e fine. Facendo clic sul pulsante Imposta cursore start , sullo schermo viene visualizzata una linea verde. La linea verde deve essere posizionata (trascinando e rilasciando) all'inizio dello scorrimento verso il basso causato dall'iniezione del campione. Lo stesso pulsante cambia la sua etichetta in Imposta cursore finale facendo clic su cui appare una linea rossa sullo schermo. La linea rossa deve essere posizionata nel punto in cui il segnale raggiunge nuovamente la linea di base dopo la deflessione causata dal consumo di NO dal campione iniettato. Complessivamente, la linea di soglia (gialla, B), la linea verde e la linea rossa delineano con precisione l'area generata dall'iniezione del campione. (D) Cedendo l'area sotto il picco. Facendo clic sul pulsante Integra (C), l'area calcolata sotto il picco viene visualizzata in alto a destra dello schermo. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Foglio di calcolo rappresentativo con curva di calibrazione e risultati. Le aree calcolate sotto i picchi generati dal consumo di ossido nitrico (NO) per iniezione di campioni con una concentrazione nota di emoglobina priva di cellule (espressa come [μM] di eme) sono mostrate in alto a sinistra (su sfondo giallo). I valori vengono tracciati per costruire la curva di calibrazione e la sua equazione lineare risultante y = mx + q. La pendenza (m) è il numero di gruppi eme oxyHb (μM) necessari per diminuire il segnale rilevato dal tubo fotomoltiplicatore di 1 mV. I valori calcolati dalle iniezioni di triplice copia (Run N 1,2,3) di campioni di un paziente ottenuti in quattro diversi punti temporali (contrassegnati da diversi colori di sfondo) sono stati inseriti nel foglio di calcolo. La media di ogni triplice copia è stata utilizzata per ottenere il valore del consumo di NO causato da ciascun campione risolvendo l'equazione lineare: fare clic qui per scaricare questo file.

Equation 1

File supplementare 1: Revisione dei picchi utilizzando il software in dotazione. Questo file include uno screenshot preso dal software in bundle e le azioni consentite per ciascun pulsante. Per ogni picco (inclusi i falsi picchi causati da artefatti), l'utente può utilizzare i pulsanti indicati nel file per confermare, ignorare, eliminare o nominare un picco specifico, a seconda delle esigenze. L'utente può anche registrare un picco che non è stato precedentemente rilevato. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

A causa dell'elevata sensibilità, i saggi basati sulla chemiluminescenza per la determinazione dell'NO e dei composti correlati hanno un alto rischio di contaminazione da NO2-. Ogni reagente (in particolare la soluzione che blocca l'NO2) e il diluente (incluso il ddH2O) utilizzati nell'esperimento devono essere testati per il suo contenuto di NO2- per correggere il segnale di fondo. Il nitrito è estremamente reattivo con un'emivita nel sangue intero intorno ai 10 minuti e genera rapidamente NO3-. Il tempo che intercorre tra la raccolta del sangue e la centrifugazione, o il blocco NO2-, può quindi causare errori preanalitici e deve essere ridotto al minimo15. In un test con campioni di plasma, raccogliere il sangue preferibilmente in provette di eparina e centrifugare a 750 x g per 5 minuti a 4 °C dopo il blocco del gruppo tiolo con 40 μL di 200 nM NEM prodotti sciogliendo 250 mg di NEM in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). La soluzione madre può essere conservata a 4 °C. Composti come nitroarginina, nitroprussiato e nitroglicerina che inibiscono la NO sintasi (NOS) subiscono una lenta conversione non quantitativa in NO, con conseguente aumento del basale. Se l'uso di inibitori NOS fa parte dell'indagine, si consiglia di utilizzare bloccanti che non contengono gruppi nitro43. La pressione di ingresso nel recipiente di spurgo deve corrispondere alla pressione negativa continua prodotta dal CLD per il campionamento. Se la pressione di ingresso è bassa, la distillazione sotto vuoto del mezzo può portare a contaminare le linee e le camere di spurgo del gas, con conseguente distorsione del segnale. Inoltre, piccoli volumi d'aria possono entrare nel recipiente di spurgo e reagire con la soluzione per generare un eccessivo NO. Al contrario, una pressione eccessiva causata da una portata superiore al flusso di prelievo del campione potrebbe rilasciare NO nell'atmosfera portando a una sottostima del segnale15. Inoltre, sia il protocollo VCl3 in HCl che il protocollo I3- in acido acetico richiedono diluizioni multiple durante la preparazione e calcoli multipli per produrre concentrazione del campione. Ogni passaggio dovrebbe essere accuratamente registrato poiché le diluizioni e i calcoli sono riconosciuti da molti gruppi come la principale fonte di errore44.

L'aggiunta di soluzione che blocca l'NO2 (fase 2.1.2) provoca la lisi dei globuli rossi, riducendo tutto OxyHb a MetHb. Evita la rapida riduzione delle proteine contenenti ferro (principalmente OxyHb) da NO2- con successiva generazione di NO3-. Il trattamento dei campioni con questa soluzione al momento della raccolta è necessario per misurare correttamente NO2 e/o NO3-. Al contrario, la soluzione non deve essere utilizzata quando si pianifica il consumo di NO mediante il saggio hb senza cellule. Le aliquote della soluzione bloccante NO2 devono essere conservate insieme ai campioni e utilizzate per rimuovere la porzione di segnale causata dalla soluzione stessa. Infine, i fattori di diluizione devono essere presi in considerazione per calcolare la concentrazione finale del metabolita misurato. Nel saggio I3- in acido acetico, la concentrazione di NO2- si ottiene sottraendo la concentrazione dell'aliquota contenente AS senza HgCl2 (S-NO e Fe-NO) da quella di aliquota contenente solo PBS (NO2-, S-NO, Fe-NO). Per calcolare la concentrazione di S-NO (proteine mercurio-labili), la concentrazione dell'aliquota trattata con AS con HgCl2 (Fe-NO o nitroso-proteine mercurio-stabili) deve essere sottratta da quella dell'aliquota trattata con AS senza HgCl2. Prima di sottrarre, l'utilizzatore deve ricordare di moltiplicare la concentrazione di ciascuna aliquota per 0,8181 (270/330) per tener conto del fattore di diluizione utilizzato durante i preparativi del campione (Figura 3). Lo stesso concetto si applica alla misurazione di S-NO-Hb e Hb-NO, dove le concentrazioni assolute sono una frazione di Hb22 misurato. A seconda del tipo di campione, un conteggio preciso della concentrazione di NO3- può richiedere l'esecuzione sia del protocollo VCl3 in HCl che del protocollo I3- in acido acetico per sottrarre infine la concentrazione di NO2- da quelle di NO3- e NO2-. Questo non è sempre necessario nei campioni di sangue intero e plasma, ad esempio, dove NO3- in genere supera di gran lunga NO2-.

È molto importante ricordare che il CLD sarà danneggiato se la trappola NaOH non è in posizione corretta quando si esegue un test VCl3 in HCl a causa della corrosività di HCl. La soluzione di NaOH da 1 M utilizzata per riempire la trappola NaOH può essere acquistata o preparata sciogliendo 4 g di sale NaOH in 100 mL di ddH2O o diluendo 5 mL di NaOH al 50% in 100 mL di ddH2O. Quando ulteriormente diluito a 10 μM con ddH2O, il NaOH è molto utile per rimuovere i detriti proteici mediante iniezione nel vaso di spurgo.

Il segnale di base rilevato dal CLD deve essere stabile ed entro 0-5 mV. Un segnale di base più elevato potrebbe essere causato dall'inquinamento atmosferico (da NO e derivati), e questo può essere verificato lasciando l'ingresso all'aria aperta. Se si osserva una tensione più elevata solo nel recipiente di spurgo, mentre si deve considerare la contaminazione del serbatoio con gas inerte, è più spesso dovuta alla persistenza di resti organici o alla presenza di NO2- nel tubo. Lavare il recipiente di spurgo più volte con ddH2O può aiutare a ridurre al minimo la tensione di base. In caso di insuccesso, l'incubazione del vaso di spurgo con 100 mM NaOH per 24-48 ore seguita da lavaggi multipli con ddH2O aiuta a eliminare gli inquinanti. Nel consumo di NO da parte del saggio Hb senza cellule, il segnale CLD richiesto è di 70-100 mV per almeno 20-30 minuti. Se il segnale non è stabile (cioè la tensione diminuisce), una dose extra di 10 μL di DETA NONOate può essere aggiunta al recipiente di spurgo. Questo può essere ripetuto secondo necessità. È essenziale ricordare che sia la polvere non utilizzata che il DETA NONOate già espanso devono essere mantenuti a -80 °C. Questo reagente decade rapidamente nonostante la conservazione ottimale e forse sottoperformante quando non appena preparato, richiedendo più iniezioni nel vaso di spurgo e portando a un segnale isoelettrico meno stabile. Ancora più importante, dovrebbe essere espanso in PBS con pH 7,4 in quanto ciò ottimizza la sua emivita (56 ore a pH 7,4 a temperatura ambiente contro dissociazione quasi istantanea a pH di 5,0) 45. La siringa utilizzata per l'iniezione di DETA NONOate deve essere dedicata esclusivamente a tale azione e non utilizzata per l'iniezione di campioni.

Se l'iniezione di un campione genera un picco superiore al punto superiore della curva di calibrazione, soprattutto se genera una tensione superiore a 700 mv, si consiglia di diluire il campione (2x o 4x) per ridurre al minimo l'errore. Ciò vale anche per il saggio di consumo di NO se l'immersione causata dall'iniezione del campione è più profonda di quella causata dall'iniezione del campione più concentrato utilizzato nella curva di calibrazione. L'evidenza di un picco (o di un passaggio) nel segnale dopo l'iniezione che è inferiore al previsto o assente può indicare l'intasamento della siringa di precisione utilizzata per l'iniezione. A causa dei piccoli volumi utilizzati (10-20 μL/campione), in particolare se vengono eseguiti saggi al plasma o nelle urine, può essere difficile distinguere tra una siringa riempita e l'assenza del campione a causa dell'intasamento della siringa. Si consiglia di prestare attenzione alla resistenza prodotta dallo stantuffo. Dopo la conferma mediante ispezione della siringa, la rimozione dell'ostruzione può essere tentata lavando ripetutamente la siringa con ddH2O e strofinando la siringa su una delicata salvietta se l'ostruzione è visibile esternamente. In caso di dubbio, si consiglia di espellere il volume del campione su una salvietta da attività e tornare a lavare la siringa con ddH2O e provare a ripetere la somministrazione del campione. La formazione di schiuma è una complicazione comune e costringe l'esperimento a terminare una volta che l'altezza della colonna liquida supera quella della colonna di reazione, causando instabilità del segnale. Il superamento della dose di agente antischiuma indicata nel protocollo può portare ad un aumento del segnale basale e deve essere evitato. Il numero di campioni che causano la formazione di un'eccessiva formazione di schiuma diventa prevedibile quando vengono eseguiti test ripetuti, un fenomeno che dovrebbe informare su come l'esperimento può essere pianificato in modo ottimale. Un passo opzionale per ridurre la formazione di schiuma consiste nel miscelare plasma o surnatante tissutale con metanolo freddo (rapporto 1:1) e centrifuga per 15 min, 13000 x g a 4 °C. Va considerato che il metanolo provoca la precipitazione delle proteine. Vengono misurati solo S-NO leggeri e Fe-NO che non sono di natura proteica. Pertanto, questa opzione non può essere adottata in studi su sangue intero o in qualsiasi altro caso in cui vi sia interesse per le proteine S-NO e Fe-NO.

Sono state descritte e adottate con successo più soluzioni di reagenti diverse da VCl3 in HCl e I3- in acido acetico. L'acido ascorbico riduce specificamente l'NO2-, non reagisce con NO3- né S-NOs e può essere utilizzato per ridurre la maggior parte dei campioni iniettati e dei calcoli in situazioni in cui NO2- è l'unica molecola di interesse. L'insidia principale è la limitata stabilità del reagente, che richiede cambi più frequenti della soluzione del reagente e, quindi, calibrazioni ripetute46. Un test che utilizza monossido di carbonio e cisteina satura di cloruro cuprous (CuCl) (metodo 3C) può rilevare specificamente S-NO con una sensibilità paragonabile a I3- ma richiede comunque un trattamento con e senza HgCl2 per evitare reazioni non specifiche47. Per ottenere una maggiore precisione nell'analisi del segnale, gli esperimenti vengono registrati nel formato .data in modo che l'analisi della forma d'onda offline possa essere completata con software diversi dal programma bundle mostrato nel protocollo.

Una volta effettuata la prima iniezione, l'esperimento non può essere interrotto. Se è necessaria una pausa e/o se viene modificata una condizione (composizione del mezzo del recipiente di spurgo, flusso di gas di spurgo, tensione di base), l'esperimento è valido solo per i campioni iniettati fino a quel punto. Una nuova curva standard dovrebbe essere eseguita prima di misurare più campioni. La precisione consentita dai saggi basati sulla chemiluminescenza ha un prezzo. I test richiedono molto tempo per una serie di motivi: 1) l'automazione non è possibile poiché l'iniezione manuale del campione è richiesta nei duplicati; 2) la maggior parte dei reagenti utilizzati non può essere immagazzinata per lunghi periodi; 3) ogni esperimento deve essere avviato eseguendo campioni standard a concentrazioni note per la calibrazione e non può essere sospeso a meno che la calibrazione non venga ripetuta; 4) ogni campione è suddiviso in aliquote contenenti diverse miscele di reagenti per bloccare reazioni specifiche al fine di calcolare infine la concentrazione di metaboliti specifici sottraendone altri.

Questo lavoro è focalizzato sul dispositivo Zysense NOA 280i, che ha una soglia di rilevamento di <1 ppb NO in fase gassosa (corrispondente fino a 1 pM di NO in fase liquida) e un flusso di campionamento di 10-300 ml / min. Altri CLD sono disponibili con un sistema di tubi a fascio per la misurazione dei metaboliti in fase liquida. I CLD di ecofisica hanno una soglia di sensibilità più elevata, 1 ppb nel loro modello più sensibile ma il vantaggio di non richiedere un serbatoio di ossigeno per la generazione di ozono. D'altra parte, il loro flusso di campionamento riportato è di 1000 ml / min, il che implica un maggiore consumo del serbatoio di gas inerte utilizzato per il recipiente di spurgo. Altre macchine CLD sono dedicate all'analisi dell'NO espirato per uso clinico.

La chemiluminescenza è il metodo più sensibile e convalidato per valutare specificamente il consumo di NO da parte di Hb senza cellule nel campo dell'emolisi. Sono disponibili altre tecniche per misurare NO, NO2-, NO3-, S-NOs e composti nitroso mercurio-labili. La misura diretta del gas NO può essere ottenuta sia per chemiluminescenza che con l'utilizzo di elettrodi dedicati che vanno dalla misurazione del gas espirato agli elettrodi monocellulari. Questi misurano solo NO gas, sono meno costosi (ma più deperibili), richiedono una calibrazione più spesso e sono meno precisi rispetto a un CLD31. Nitriti e NO3- sono stati storicamente misurati con la reazione di Griess, una tecnica colorimetrica che nella sua versione originale rileva entrambe le molecole senza la possibilità di distinguere la loro concentrazione relativa nel campione. Le varianti moderne della tecnica prevedono la cromatografia in fase inversa che impiega la separazione del campione in due colonne, consentendo due reazioni indipendenti con NO3- e NO2-. La sensibilità di questi metodi è micromolare o leggermente inferiore, rispetto a 1 nM con CLD. Le principali insidie sono il consumo di tempo e l'incompatibilità con campioni pretrattati con mercurio e/o ferricianuro14. Gli S-NO possono essere rilevati anche con tecniche colorimetriche e fluorometriche con una sensibilità fino a 0,5 μM rispetto ai 100 fM descritti utilizzando la chemiluminescenza come mostrato nel protocollo I3- in acido acetico 14,41,42. Il saggio di biotina-switch, nonostante non riesca a rilevare S-NO nell'intervallo picomolare, ha il vantaggio di generare proteine marcate con biotina che possono essere purificate e identificate con l'analisi proteomica48. Se esaminata in dettaglio, ogni tecnica condivide un'insidia comune, che è l'estrema reattività dell'NO e dei suoi derivati che impongono il blocco delle reazioni ai fini della misurazione in vitro. Il pre-trattamento dei campioni è fondamentale e rispondere alla domanda se un determinato pretrattamento blocchi completamente una reazione o lo faccia meglio di un'altra è stata finora una forza trainante verso un aumento degli studi metodologici. Mentre l'estrema reattività in vivo dell'NO è stata certamente una spinta alla ricerca di metodi sensibili per il rilevamento dei suoi metaboliti, la misurazione diretta dell'NO ha incontrato progressi significativi negli ultimi tre decenni da quando il primo rivelatore amperometrico è stato sviluppato nel 1990. Da allora sono state descritte più di venti diverse sonde, compresi i nanosensori utilizzati per studiare il contenuto di NO a singola cellula49. I sensori elettrochimici sono i principali strumenti in grado di rilevare l'NO sia in vivo che in tempo reale. In medicina polmonare, diversi studi hanno confrontato macchine basate su elettrodi con CLD. La misurazione dell'NO espirato è più semplice di altri saggi per il rilevamento dei metaboliti, richiedendo il collegamento diretto della linea del gas (tramite filtro IFD) a un'aggiunta respiratoria a sistema chiuso o alcuni respiri in una sacca per l'analisi offline, ma il costo e la minore portabilità dei CLD si fermano. Un certo numero di dispositivi elettrochimici attualmente soddisfano i criteri per l'uso clinico, sebbene abbiano una sensibilità e una riproducibilità inferiori rispetto ai CLD. Inoltre, la concordanza in termini di valori assoluti misurati non è ottimale tra i dispositivi, quindi si raccomanda che i pazienti siano sempre seguiti con lo stesso dispositivo elettrochimico50. L'uso di CLD in contesti come la misurazione nasale espirato NO e in contesti di ricerca come l'NO inalato terapeutico a basso e alto dosaggio è ancora necessario.

Misurazioni precise di NO, dei suoi derivati e delle proteine leganti il NO sono necessarie a molti livelli per comprendere un meccanismo di segnalazione trascurato e ancora per lo più sconosciuto. I campi di applicazione abbracciano la biologia e la patologia sia a livello preclinico che clinico con aree target specifiche, tra cui immunobiologia, neuroscienze, scienze cardiovascolari e malattie infettive. Studi preclinici e studi clinici stanno studiando l'uso di gas NO inalato come agente terapeutico. Saranno necessarie conoscenze più approfondite su come il gas NO esogeno influenza la concentrazione di metaboliti NO e proteine legate all'NO ad ogni livello, dal plasma ai compartimenti cellulari. L'implementazione di proteomica ad alto rendimento può probabilmente aumentare il numero di mediatori noti che sono influenzati dall'NO e dai suoi derivati e può richiedere nuove indagini meccanicistiche che richiedono misurazioni precise dei metaboliti dell'NO.

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Disclosures

L.B. riceve supporto salariale da K23 HL128882 / NHLBI NIH come ricercatore principale per il suo lavoro sull'emolisi e l'ossido nitrico. LB riceve sovvenzioni da "Fast Grants for COVID-19 research" presso il Mercatus Center della George Mason University e da iNO Therapeutics LLC. B.Y. è supportato da sovvenzioni di un NHLBI/#R21HL130956 e DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. ha ricevuto brevetti presso MGH sulla generazione elettrica di ossido nitrico.

L.B. e B.Y. hanno depositato la domanda di brevetto per NO delivery nel numero di domanda PCT della malattia COVID-19: PCT / US2021 / 036269 depositato il 7 giugno 2021. RWC riceve sostegno salariale da Unitaid come ricercatore principale per lo sviluppo tecnologico finalizzato alla diagnosi decentralizzata della tubercolosi nei bambini situati in contesti a basso consumo di risorse.

Acknowledgments

I protocolli riportati in questo manoscritto sono stati resi possibili dai contributi accumulati di precedenti borsisti del laboratorio di ricerca sull'anestesia in terapia intensiva del Dr. Warren Zapol, Dipartimento di Anestesia presso il Massachusetts General Hospital. Riconosciamo il contributo dei dottori Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli ed Emanuele Rezoagli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

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References

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Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi
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Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

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