Summary
ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスの中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコルが記載されている。この角膜創傷治癒モデルは非常に再現性が高く、現在、疾患の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。
Abstract
角膜は視力に不可欠であり、眼の屈折力の約3分の2を占める。視力における角膜の役割に不可欠なのは、その透明性です。しかし、その外的位置のために、角膜は角膜の透明度の喪失および最終的な失明につながる可能性のある多種多様な傷害に非常に敏感である。これらの傷害に応答した効率的な角膜創傷治癒は、角膜恒常性を維持し、角膜透明度および屈折能力の保存にとって極めて重要である。角膜創傷治癒が損なわれた場合、角膜は感染症、潰瘍形成、および瘢痕化に対して脆弱になる。角膜の透明性および視力の維持に対する角膜創傷治癒の基本的な重要性を考えると、正常な角膜創傷治癒プロセスのより良い理解は、感染および疾患に関連する角膜創傷治癒障害を理解するための前提条件である。この目標に向けて、角膜創傷のマウスモデルは、正常な生理学的条件下で作動する角膜創傷治癒機構の理解を促進する上で有用であることが証明されている。ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスにおける中央角膜上皮擦過傷を作成するためのプロトコルが記載されている。このモデルでは、角膜を中心とする直径2mmの円形トレフィンを使用して、創傷領域を区切る。ゴルフクラブのスパッドは、上皮をデブライドし、角膜上皮基底膜を損傷することなく円形の創傷を作成するために注意して使用される。結果として生じる炎症反応は、効率的な創傷治癒に不可欠な細胞および分子事象の十分に特徴付けられたカスケードとして進行する。この単純な角膜創傷治癒モデルは非常に再現性が高く、よく知られており、現在、疾患の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。
Introduction
角膜は、眼の3分の1の透明な前部である。角膜は、眼の内部構造を保護し、感染から眼を保護する構造障壁を形成することを含むいくつかの機能を果たす1。さらに重要なことに、角膜は視力にとって重要であり、眼2,3の屈折力の約3分の2を提供する。視力における角膜の役割に不可欠なのは、その透明性です。しかし、その外側の位置のために、角膜は、その障壁機能の破壊、透明性の喪失、および最終的な失明につながる可能性がある日常的に多種多様な傷害にさらされる。角膜透明度の喪失は、世界中の視覚障害の主な原因である4,5。角膜擦過傷は、緊急治療室(ER)への訪問の一般的な理由であり、ER6で提示された眼関連症例の半分を占める。米国では、毎年100万人以上の人々が眼に関連する怪我に苦しんでいると推定されています7。これらの傷害に応答した効率的な角膜創傷治癒は、角膜恒常性を維持し、その透明性および屈折能力の維持にとって極めて重要である。角膜創傷治癒が損なわれた場合、角膜は感染症、潰瘍形成、および瘢痕化に対して脆弱になる8,9。また、屈折矯正手術の人気が高まっているため、角膜10に独特の外傷性課題が課せられています。角膜の透明性および視力の維持に対する角膜創傷治癒の基本的な重要性を考えると、正常な角膜創傷治癒プロセスのより良い理解は、感染および疾患に関連する角膜創傷治癒障害を理解するための前提条件である。
そのために、角膜創傷治癒のいくつかの動物モデルが開発されている11、12、13、14、15。角膜創傷治癒のマウスモデルは、正常な生理学的条件下で作動する角膜創傷治癒機構の理解を促進する上で有用であることが証明されている。異なるタイプの角膜創傷が角膜創傷治癒の研究に用いられており、それぞれが創傷治癒プロセスの異なる側面を調査するのに適している。角膜創傷治癒研究に使用される創傷モデルの一般的なタイプは、機械的および化学的創傷モデルである。化学的角膜創傷は、主に角膜上のアルカリ性火傷の生成を伴い、角膜潰瘍、不透明化、および新生血管形成の研究に有用である13。機械的角膜創傷は、デブリードマン(abrasion)創傷およびケラテクトミー創傷14、15、16を含む。無傷または破れた角膜上皮基底膜は、それぞれデブリードマンおよびケラテクトミー創傷を定義する。デブリードマン創傷では、上皮基底膜は無傷のままであり、一方、ケラテクトミー創傷では、基底膜は主に前間質への浸透で破られる。デブリードマン創傷は、再上皮化、上皮細胞増殖、免疫応答、および角膜創傷後の神経再生を研究するのに最も有用である。一方、ケラテクトミー創傷は、角膜瘢痕の研究に最も有用である14,15。
ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスの中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコルが記載されている。この単純な角膜創傷治癒モデルは、再現性が高く、よく公表されており、現在、疾患17の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。
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Protocol
すべての動物プロトコルは、ヒューストン大学とベイラー医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。視覚および眼科研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究のための協会(ARVO)の声明に概説されたガイドラインは、マウスの取り扱いおよび使用において従った。
1. 準備
- フルオレセイン溶液の調製
- 1mLの滅菌生理食塩水または滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に10mgのフルオレセインナトリウム塩を溶解して1%フルオレセイン溶液を調製する。
注:微生物汚染を避けるために、使用日またはその前日にフルオレセインナトリウム溶液を調製してください。使用前日に調製した場合は、フルオレセイン溶液を光から4°C離れた場所で保存してください。チューブをアルミ箔で包み、フォトブリーチングを防ぎます。 - 溶液を1回の実験での使用に適したアリコートに分割します。1-1.5 μLのフルオレセイン溶液を、マウス1匹当たり、時点ごとに使用する。次の式を使用して、1 回の実験に適したアリコートの量を計算します。
注: たとえば、6 匹のマウスを 1 回の実験で研究し、創傷の大きさを 5 つの時点で監視した場合、その 1 回の実験に適したアリコートの量は次のようになります。
- 1mLの滅菌生理食塩水または滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に10mgのフルオレセインナトリウム塩を溶解して1%フルオレセイン溶液を調製する。
- マウスの麻酔のためのケタミン/キシラジンカクテルの調製。
- 10 mLのカクテルを調製するには、2.0 mLのケタミン(100 mg/mL)と1.0 mLのキシラジン(20 mg/mL)を混ぜ合わせ、7.0 mLの滅菌PBSを加える。ケタミン/キシラジンカクテルを手術の前日または当日に準備する。
メモ:特に明記されていない限り、すべての溶液は室温で使用してください。
- 10 mLのカクテルを調製するには、2.0 mLのケタミン(100 mg/mL)と1.0 mLのキシラジン(20 mg/mL)を混ぜ合わせ、7.0 mLの滅菌PBSを加える。ケタミン/キシラジンカクテルを手術の前日または当日に準備する。
2.麻酔
- マウス(8~12週齢のC57BL/6野生型マウス)の体重を秤量し、投与する麻酔薬の適量を決定した。両手マウス拘束技術を使用して、麻酔薬18の注射のためにマウスを拘束および取り扱います。ケタミン/キシラジンカクテルを腹腔内(i.p.)にケタミン80mg/kgおよびキシラジン8mg/kgの最終濃度で投与する。
- マウスに角膜創傷を行う前に、完全な麻酔が達成されるまで待つ。つま先のピンチ後のペダル反射を評価することによって麻酔の深さを評価する。適切な麻酔が達成されると、マウスはつま先のピンチで動くべきではありません。
注:マウスは麻酔中に体温をすぐに失うため、低体温症を防ぐためにマウスに暖かさの源を提供することが重要です。麻酔および回復段階の間にマウスを熱源(加熱パッド)上に置く。
3. 角膜創傷の作成
- 右目または左目のみに傷をつけます。マウスからマウスに移動するときに傷ついた目(すなわち、左または右)との一貫性を維持する。
注:擦過傷は角膜神経を損傷し、視力を低下させるため、両眼を傷つけると重大な不快感や障害を引き起こす可能性があります。鎮痛薬は炎症反応を抑制する可能性があるので、それらの使用は角膜炎症を理解することを目的とした特定の実験における交絡物であり得る。角膜創傷実験における鎮痛薬の回避は、当社の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。 - 上皮角膜創傷を作成するには
- 解剖顕微鏡下で、直径2mmのトレフィン( 図1参照)を使用して角膜の中心を区切り、親指と人差し指でまぶたを握って目を大きく開いたままにします。トレフィンを優しく回して角膜上皮に印象を与えます。
注:トレフィンを使用するときは、角膜の穿孔を引き起こす可能性があるため、過度の圧力をかけないように注意する必要があります。また、トレフィンを中央に配置するように注意する必要があります。瞳孔は、角膜の中心を見つけるためのランドマークとして使用することができます。 - 解剖顕微鏡下で、鈍いゴルフクラブのスパッド( 図1参照)を角膜の表面から約45°、トレフィンで区切られた領域内に保持する。上皮をデブライドするために、スプッドで区切られた領域内の上皮を慎重にかつ継続的にこすります。
注:デブリードマンに過度の力を加えないでください。マウスの目は、創傷プロセス中に乾燥し、デブリードマンを困難にする可能性がある。このような場合は、滅菌PBSを眼の表面に塗布して、最適な水分補給を維持してください。
- 解剖顕微鏡下で、直径2mmのトレフィン( 図1参照)を使用して角膜の中心を区切り、親指と人差し指でまぶたを握って目を大きく開いたままにします。トレフィンを優しく回して角膜上皮に印象を与えます。
図1:2mmトレフィンと鈍いゴルフクラブスパッド トレフィンは角膜中心の円形領域を画定するために使用され、ゴルフクラブのスパッドは画定領域内の上皮を除去するために使用される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. 創傷閉鎖および再上皮化のモニタリング
- 創傷面に1%フルオレセイン溶液1〜1.5μLのピペットを、青色光源を有するデジタル顕微鏡を用いて角膜を画像化した。
- フルオレセイン溶液の最初の1分以内に画像を取得し、創傷サイズの過大評価につながる周囲の上皮への拡散を避ける。創傷角膜は、創傷後の特定の時間(すなわち、0時間、12時間、18時間、24時間、および30時間)に画像化される。
注:すべての時点で、イメージングは麻酔下で行われます。ケタミン/キシラジンは創傷時に使用され、イソフルランはその後の時点で使用される。マウスは、創傷閉鎖モニタリングの期間中、別々のケージに個々に収容される。一緒に飼育されると、マウスは同腹仔の目をなめる傾向があり、この行動は、異なる組織における創傷治癒に影響を及ぼすことが示されている19、20。 - 撮影した画像を解析し、画像解析ソフトを用いて創傷領域をトレースする。各時点の創傷面積は、0時間における元の創傷面積に対する百分率として表される。
5. 免疫蛍光イメージングと解析
- 創傷後の所望の時点で、IACUC承認法(この場合、二酸化炭素の過剰摂取に続いて子宮頸部脱臼)によってマウスを安楽死させる。
- 虹彩湾曲したはさみを使用して眼球をずらすために横のカンサスを優しく押すことによって眼球を収穫する。眼球の後ろのはさみを引いて視神経をしっかりつかみ、神経を切って眼球を外すことができます。
- 各眼球を2%パラホルムアルデヒドを含む1 mLの1x PBSで室温で1時間固定し、その後、1 mLの1x PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
- 解剖顕微鏡下で、外科用ブレードを使用して、辺縁部までの遠位約500μmの強膜に切開を行い、その後、地球を切断する。鉗子を使用して、角膜から虹彩物質を静かに取り除き、強膜組織を慎重にトリミングして、辺縁部をそのまま残すようにします。
- 角膜が平坦になるように、角膜末梢から伸び、中心の手前で止まる4つの部分的な放射状の切断(それぞれ長さ約1mm)を行います。
- 角膜を透過処理し、1 mL の 2% ウシ血清アルブミン (BSA) および 0.01% TritonX -100 を 1x PBS で 15 分間ブロックした後、1x PBS 中の 2% BSA で室温でさらに 45 分間ブロッキングします。
- 角膜を、2%BSAを含む1x PBS中で調製した直接標識されたユニークな蛍光色素結合抗体のカクテル中で4°Cで一晩インキュベートする。
注:抗体は、目的の特定の細胞および組織を標識するために標的とされる。例えば、内皮、好中球、および血小板は、それぞれ抗CD31 21、22、抗Ly−6G 23、24、および抗CD4125、26抗体で標識される。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を抗体カクテルに添加して核を可視化する。 - インキュベーション後、角膜を1x PBSで3回、それぞれ15分間洗浄する。
- 角膜を退色防止蛍光マウント媒体の滴で顕微鏡スライド上にマウントし、カバースリップで覆い、蛍光光学顕微鏡を用いて所望の倍率(対物レンズ4倍~100倍)で画像化する。 図2Aに示すように、異なる領域にわたる角膜のフル厚み画像を撮影する。
注: 図2A に示す顕微鏡分析のパターンは、炎症および細胞分裂における特定の局所変化を分析するために使用される。DAPI染色とLy-6G染色の両方が血管外好中球を同定するために使用されます。DAPI染色では、球状好中球は明確な馬蹄形またはドーナツ型の核を有する(図2B)。
図2:角膜イメージング戦略と中央擦過傷後の好中球浸潤。 (A)角膜の直径を横切る9つの顕微鏡視野を示す角膜ホールマウントの概略図。灰色の領域は、元の創傷領域を表す。各領域の幅は500μmである(B)DAPI染色による好中球核の明確な馬蹄形またはドーナツ形状に注意する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
図3 は、鈍いゴルフクラブスパッドで作成された角膜創傷の透過型電子顕微鏡写真を示し、上皮基底膜が損傷後に実際に無傷であることを実証する。
図3:上皮基底膜は角膜擦過後も無傷のままである。 鈍いゴルフクラブスパッドで作成した角膜創傷の透過型電子顕微鏡写真。矢印は創傷を囲む残りの上皮の下の基底膜を指し、矢印はむき出しの領域の基底膜を指す。これは、未擦過傷から角膜の擦過部分までの基底膜の連続性を示し、基底膜がデブリードメント後に無傷のまま残ることを示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
角膜創傷のためのこのプロトコールは、2mm上皮擦過傷27、28、29、30、31、32、33についての創傷治癒力学を広範囲に特徴付けるために用いられてきた。インビボでの創傷閉鎖および再上皮化の速度を監視する能力は、このモデルの中心的な部分である。図4Aに示すように、フルオレセイン溶液と青色光源を備えたデジタル顕微鏡を用いることで、創傷サイズの可視化が可能になる。このモデルでは、創傷時(0時間)、12時間、18時間、24時間、および創傷後30時間で創傷閉鎖モニタリングが行われる。図4Bは、30時間にわたる創傷閉鎖の動態を示す。8~12週齢のC57BL/6野生型マウスでは、図4Bに例示されているように、創傷閉鎖および再上皮化は、典型的には創傷後24時間で完了し、十分に調節された炎症反応は、効率的な創傷治癒の基本である34、35、36。
図4:上皮創傷閉鎖をフルオレセイン染色を用いて評価した 。 (A)0時間、12時間、18時間、24時間、および30時間における角膜創傷のフルオレセイン染色の代表的な画像。このモデルにおいて、創傷閉鎖は、典型的には、創傷後24時間で完了する。(B)創傷後24時間による完全な創傷閉鎖を示す創傷閉鎖動態。各時点における値は、元の創傷面積(すなわち、0時間における創傷面積)に対する百分率(n≥6)として表される。データは標準偏差の平均±して表した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
このモデルにおける創傷に対する炎症反応は、十分に特徴付けられる。上皮擦過傷創は、主に血管拡張、辺縁部37、38、39に限定された血小板溢血および角膜の中心への遊走を伴う好中球溢血を特徴とする角膜辺縁系血管系において迅速な炎症反応を惹起する40。図5は、血管外好中球を有する創傷されていない角膜(図5A)および血管外血小板および好中球を有する創傷角膜(図5B)の四肢血管系を示す。
図5:辺縁部における炎症性細胞イメージング。 抗CD31抗体(赤で示す)、抗Ly-6G抗体(緑で示す)による好中球、および抗CD41抗体(青で示す)による血小板の四肢血管の染色を示す角膜辺縁の顕微鏡写真。(A)擦過無及び(B)擦過30時間後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
このモデルでは、角膜への好中球浸潤は、 図2Aに例示されるように5つの異なる領域にわたって評価される。これらの別個の領域を決定するために、完全な角膜ホールマウントの画像をキャプチャし、抗CD31染色で四肢血管系を視覚化する。各花弁上の辺縁の辺縁は、四肢血管系を目安としてマークされる。辺縁領域の最内縁から水平(x)または垂直(y)方向における一方の花弁から他方の花弁までの距離は、各角膜全体マウントについて測定される。8~12週齢のC57BL/6野生型マウスの場合、この距離は約3.7mmです。この距離は、周辺領域から周辺領域をカバーします。次に、角膜全体マウントの中心は、全体マウントの水平または垂直直径の半分に対応する点として計算される。準中央領域は、計算された中心から左、右、上、または下500μmである。その他のフィールドはすべて、前のフィールドから 500 μm 離れています。DAPI染色とLy-6G染色の両方が血管外好中球を同定するために使用されます。4つの象限から各角膜領域における好中球数は平均化され、フィールド当たりの好中球として表される。
このモデルにおける血小板評価は、辺縁部でのみ行われる。角膜創傷治癒の間、血小板は溢血し、辺縁部に局在する27,37。辺縁部における血小板の総数をカウントし、カウントは辺縁部の血小板/mm2として表される。4枚の花びらからのカウントを合計または平均化することができます。
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Discussion
この方法論文の目的は、トレフィンおよび鈍いゴルフクラブスパッドを用いてマウスにおいて中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコールを記述することであった。このマウスモデルは、角膜炎症および創傷治癒へのその寄与を研究するために使用されている。このタイプのモデルは、正常な生理学的条件下でおよび病状における角膜創傷治癒機構を研究するために使用することができる17、28、29、41、42。このモデルは、食事誘発性肥満のマウスモデルにおける角膜創傷治癒障害に関する研究によって証明されるように、病理学的条件下での角膜創傷治癒を調査するために用いられてきた17。このモデルの明確な利点は、基底膜を破ることなく正確な中央位置を有する正確な(2mm)再現可能な上皮創傷サイズを作り出すことである。角膜創傷のこのモデルは、簡単で迅速に実行できます。鈍いゴルフクラブスパッド29、39、43、44、45に加えて、回転バリ(Algerbrush)38、46、47、およびダイヤモンドブレード32、37、40、48、49、50、51 このモデルで摩耗創傷を作成するために両方を使用できます。経験豊富なユーザーの手では、どちらのツールによっても作成された摩耗傷に大きな違いはありません。トレーニング目的で、初心者の手の中では、回転するバリやダイヤモンドブレードと比較して、鈍いゴルフクラブのスパッドで再現可能な結果を達成する方が簡単であることがよくあります。回転バリ(Algerbrush)は繊細なタッチを必要とし、さもなければ回転バリは上皮基底膜を損傷する可能性があります。これは他の研究者52,53人によっても報告されている。一方、鈍いゴルフクラブのスパッドは、一貫して上皮基底膜を無傷のままにする。
この角膜創傷プロトコルを首尾よく再現し、その後の再上皮化および炎症動態を観察するためには、マウスの同じ系統および年齢範囲を使用しなければならず、創傷のサイズおよび深さを上記のように作成しなければならない。このプロトコルに記載されている角膜創傷治癒ダイナミクスおよびタイムラインは、C57BL/6マウス株のためのものであり、異なる系統のマウスが使用される場合、共有されない可能性がある。Pal-Ghosh et al.54は 、角膜上皮デブリードマン創傷を治癒するC57BL/6およびBALB/cの能力の変動を報告した。同じ角膜創傷サイズの場合、BALB/cマウスでは角膜創傷閉鎖および再上皮化が遅くなる。創傷閉鎖の完了のタイムラインおよびここで記載される特徴的な炎症反応は、直径2mmサイズの円形創傷に対するものである。創傷直径が2mmを超える場合、創傷閉鎖完了時間が長くなると予想され、創傷直径が2mm未満の場合、より短い時間が予想される。また、より大きな角膜創傷、特に辺縁に近いものは、より多くの白血球が角膜16に動員されるにつれて、より誇張された炎症反応を誘発すると予想される。さらに重要なことに、創傷は角膜上皮に制限されるべきである。上皮基底膜を破ったり、角膜間質を貫通したりする創傷は、治癒に長い時間がかかります。これらの創傷はまた、炎症反応の変化、新生血管形成、筋線維芽細胞形成、および瘢痕化55、56と関連している。
擦過角膜の微生物感染を防ぐために、すべてのステップで注意が必要です。微生物感染は炎症反応を変化させ、潰瘍化、瘢痕化、および視力喪失をもたらし得る57。創傷の微生物感染を防ぐために、滅菌ツールおよび溶液を常に使用すべきである。複数のマウスが一度に負傷している場合は、各マウスに滅菌トレフィンを使用する必要があります。マウスの間では、ゴルフクラブのスパッドを滅菌PBSで洗浄し、続いて70%エタノールで消毒し、滅菌PBSで再度洗浄する必要があります。創傷が数日間にわたって追加のマウスに対して行われる場合、それは一日の同じ時間に行われるべきである。これは、創傷治癒および炎症に対する概日効果を制御するためである。C57BL/6マウスでは、創傷が作られる時刻は、角膜創傷治癒の速度および質に影響を及ぼす。マウスが午前中に創傷された場合、午後または夕方の創傷と比較して、より速い創傷閉鎖およびより大きな細胞分裂が観察される42。創傷治癒に対する概日効果は、皮膚58、59を含む他の組織において報告されている。このモデルでの創傷は、常に午前中に行われる。
このモデルにおける創傷に対する結果として生じる炎症反応は、効率的な創傷治癒に重要な細胞および分子事象の十分に特徴付けられたカスケードとして進行する。このモデルにおける擦過傷誘発性炎症において最も特徴付けられる細胞プレーヤーは、好中球および血小板である。好中球は、角膜擦過傷部位に対する最初の応答者である。有意なレベルの好中球が創傷から6時間以内に角膜間質に検出される。好中球は、炎症および創傷修復に内因するプロセスである細胞破片を除去する役割を担っている60。それらの貪食活性に加えて、好中球は血管内皮増殖因子(VEGF)61などの成長因子を含む。VEGFは、創傷62、63後の角膜神経再生のための重要な神経再生因子であり、角膜上皮細胞分裂45、63にとっても重要である。リンバスでの好中球浸潤は、創傷後18時間で第1のピークおよび30時間で第2のピークを有する2つの波で起こる40。好中球減少マウス37、40を用いて、好中球溢血およびその後の角膜の中心への遊走が角膜創傷治癒に重要であることが示されている。止血および血液凝固の維持において極めて重要であることが伝統的に知られているが、血小板はまた、角膜創傷治癒において認識された重要な役割を有する37。血小板は、炎症および組織分解能に寄与する多数のメディエーターを含む64,65。血小板減少症を有するマウスにおいて、このモデルは、血小板が効率的な角膜創傷治癒に重要であることを示すために用いられてきた37。
好中球および血小板がこのモデルにおいて最も特徴付けられる細胞であるが、ガンマデルタT細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞などの免疫細胞も、このモデルを用いた創傷に対する免疫応答に関与することが示されている27,48。間質28、29におけるナチュラルキラー細胞溢血および治癒上皮27へのガンマデルタT細胞の遊走が報告されている。このモデルは、角膜創傷治癒中の免疫細胞溢血に鍵を握る接着分子を同定するためにも使用されている。リンパ球機能抗原-1(LFA-1)32、CD1851、および細胞間接着分子-1(ICAM-1)47,49はすべて、このモデルを用いて好中球溢血および効率的な角膜創傷治癒に重要であることが示されている。創傷に応答した上皮細胞分裂は、創傷閉鎖後の上皮再層別化に重要であるが、有糸分裂図を用いて評価される。細胞分裂の異なる段階における染色体凝縮は、核に有糸分裂図形として知られる特徴的な外観を与える。核のDAPI染色は、これらの有糸分裂図形の可視化を可能にする。
マウス角膜擦過傷創法モデルは、著しく再現性があることが証明されており、効率的な創傷治癒に寄与する細胞および分子機構についてかなりの洞察を提供している。しかし、その臨床的適用性に関してモデルには限界があることは注目に値します。このモデルとその結果は、単純で非貫通性の上皮擦過傷にのみ適用可能である。先に述べたように、物理的または化学的侮辱によって引き起こされる貫通創傷から生じる角膜損傷は、特に創傷がヒト角膜への傷害の場合にしばしば起こるように感染した場合、異なる創傷治癒動態および転帰を誘発するであろう。そうは言っても、マウス角膜擦過傷創モデルは、角膜創傷治癒を調節する炎症の基本原理を研究するための優れた基盤を提供する。
ここで説明する角膜創傷プロトコルは簡単で、容易に再現できる。これは、角膜創傷治癒プロセスおよびそれに関連する炎症反応に関する基本的な質問を調査するための有用なツールを提供する。創傷治癒合併症に関連する角膜病理の理解を助けるその可能性は、ほんの始まりにすぎません。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
資金提供: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., および R.E.R., P.R.E.), P30EY007551 (A.R.B.), および Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.) の後援:コンテンツは著者の責任であり、国立衛生研究所(Sigma Xi)の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD31 antibody | BD Bioscience, Pharmingen | 550274 | |
| Anti-CD41 antibody | BD Bioscience, Pharmingen | 553847 | |
| Anti-Ly6G antibody | BD Bioscience, Pharmingen | 551459 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher scientific | B14 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D8417 | |
| DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope | GE Life Sciences | ||
| Dissecting microscope | Leica microsystems | ||
| Electronic Toploading Balances (Weighing scale) | Fisher Scientific | ||
| Ethanol | ThermoFisher scientific | T038181000CS | |
| Golf-club spud | Stephens instruments | S2-1135 | |
| Iris curve scissors | Fisher Scientific | 31212 | |
| Isoflurane | Patterson veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Patterson veterinary | 07-890-8598 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | ThermoFisher scientific | AM9624 | |
| Sodium fluorescein salt | Sigma Aldrich | 46970 | |
| Surgical blade (scapel blade) | Fine Science tools | 10022-00 | |
| Trephine | Integra Miltex | 33-31 | |
| TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
| Forcep | Fine Science tools | 11923-13 | |
| Xylazine | Patterson veterinary | 07-808-1947 |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T.
- Meek, K. M., Knupp, C.
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
- McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
- Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
- Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
- Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
- Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
- Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
- Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
- DeLisser, H. M., et al.
- Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
- Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
- Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M.
- Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
- Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
- Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
- Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
- Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
- Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
- Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
- Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
- Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
- Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
- Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
- Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
- La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
- Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
- Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
- Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
- Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
- Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
- Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
- Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
- Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
- Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
- Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
- Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
- Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
- Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
- Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
- Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
- Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
- Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
- Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
- Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Thomas, M. R., Storey, R. F.
- Margraf, A., Zarbock, A.
